UNIDADES TECNOLÓGICAS DE SANTANDER DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

PRE INFORME DE LABORATORIO DE BIOLOGIA

IDENTIFICACIÓN

NOMBRE DE LA PRÁCTICA: PROCEDIMIENTO PARA IDENTIFICAR

CELULAS ANIMALES

FECHA: 03/10/14

INTEGRANTES

NOMBRE: DANNY MANUEL RODRIGUEZ QUIÑONEZ

CÓDIGO: 67065

PROGRAMA:TECNOLOGIA EN RECURSOS AMBIENTALES GRUPO: E135 DOCENTE: HUGO CARVAJAL OBJETIVOS

Conocer diferentes procedimientos para Identificar células animales. Reconocer las caracteristicas de la tejidos animales. Identificar ciertos colorantes y soluciones en la identificación de estructuras celulares.

INTRODUCCIÓN

Las estructuras celulares son ( a excepción del cloroplasto ) bastante difíciles de observar a simple vista, esto debido a que aproximadamente el 70 y 90% de la célula es agua. Por esta razón se hace necesario hacerlas visibles, es aquí donde los diferentes tintes que existen son de utilidad. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. En estas páginas vamos a describir las tecnicas de tinción utilizadas para observar al microscopio la morfológia en muestras biológicas. La mayoría de las técnicas van encaminadas a preparar el tejido para su observación con el microscopio, bien sea éste óptico o electrónico. Ello es debido a que la estructura de los tejidos está basada en la organización de los tipos de células que los componen y, salvo contadas ocasiones, las características morfológicas de las células sólo se pueden observar con estos aparatos. Existen procedimientos rápidos y simples para la observación de tejidos y células vivas que reciben el nombre de vitales. Por ejemplo, la observación del flujo sanguíneo en capilares del sistema circulatorio. Otra forma de observar células o tejidos vivos es mediante las técnicas histológicas supravitales, en los que las células y los tejidos se mantienen o se hacen crecer fuera del organismo, como es el caso de los cultivos de células y de tejidos. Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las células mueren durante el proceso, pero las características morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se conservan mejor o peor dependiendo del tipo de técnica. Estas páginas estarán dedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son las más comúnmente usadas en los laboratorios de histología.

TINCIÓN DEFINICIÓN

Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmento como la sangre o la melanina de la epidermis. La tinción es una técnica en la que se utilizan diferentes colorantes, que son captados por las estructuras de las muestras biológicas que se observan al microscopio, siendo cada estructura a fin a un tipo determinado de colorante, por lo que se pigmentan de diferente color y se pueden diferenciar e identificar. . Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cómo teñir los tejidos para poder desentrañar sus características morfológicas. Se observó que algunos pigmentos como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a determinados componentes de las células. La expansión de la industria textil y su necesidad de colorear las telas provocó un rápido desarrollo de los tintes o pigmentos en el siglo XIX. Muchas de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histología de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y perfeccionamiento de nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se usan según las necesidades del investigador.

TINCIONES FUNDAMETOS

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La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus características morfológicas. Las tinciones generales están basadas en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue colorear a los tejidos. Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a afinidades químicas. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

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SIN TINCIÓN

No se utiliza ningún tipo de colorante es el montaje directo húmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjeto para su observación. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material.

Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

TINCIÓN SIMPLE

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad. La tinción Giemsa: Se emplea principalmente en frotis sanguíneos para observar a los agentes patógenos junto a las células sanguíneas y mostrar las diferencias entre ambos. El colorante de Giemsa es un colorante compuesto ya que es una mezcla de varios colorantes.

TINCIÓN DIFERENCIAL

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.

Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen

TINCIÓN DE GRAM

Hans Cristian Gram en l884 inventó un método de tinción diferencial es uno de los métodos más importantes en el laboratorio Se utilizan varios colorantes combinados. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico de rutina del laboratorio de microbiología las referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos y negativos) se basan en la tinción de gram. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. En lo relativo a la coloración, de microorganismos son Gram positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativo cuando se visualizan de color rojo-rosado. TINCIÓN RODAMINA-AURAMINA

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.

Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

TINCIÓN NARANJA DE ACRIDINA

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El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la tinción.

El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.

TINCIÓN ZIEHL-NEELSEN (BAAR)

Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

Se ha desarrollado una coloración de ácido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen ácidos-grasos de unos 50 átomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no ácido-alcohol resistentes). Nocardia spp son decoloradas por la mezcla ácido-alcohol estándar pero no por un tratamiento más suave con ácido sulfúrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan ácido-alcohol resistentes parciales o débiles.

El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLÚOR

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoríos ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.

TINCIÓN ROMANOWSKY

La tinción de Romanowsky es una técnica de tinción prototípica que fue predecesora de varios métodos distintos, pero basados en principios similares entre los que se incluyen las tinciones de Giemsa, Jenner, Wright, Field, y Leishman, las cuales son utilizadas para diferenciar diferentes tipos de células en especímenes patológicos. Consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

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TINCIÓN DE WRIGHT

La tinción de Wright es un tipo de tinción usada en histología para facilitar la diferenciación de los tipos de células de la sangre. Se usa principalmente para teñir frotis de sangre y punciones medulares, para ser examinadas al microscopio. En citogenética se usa para teñir cromosomas, para facilitar el diagnóstico de síndromes y enfermedades.

Lleva el nombre de James Homer Wright, su descubridor, que la obtuvo modificando la tinción de Romanowsky, en 1902.

Debido a que ayuda a distinguir fácilmente las células de la sangre se convirtió en una técnica muy usada para el conteo de los glóbulos blancos, una técnica rutinaria usada cuando hay sospecha de infecciones.

La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky.

Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B.

La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y.

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleicos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico.

La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

TÉCNICAS DE PREPARACIÓ DE MUESTRAS: FROTIS

Es una técnica en la que se utilizan diferentes colorantes, que son captados por las estructuras de las muestras biológicas que se observan al microscopio, siendo cada estructura afín a un tipo determinado de colorante, por lo que se pigmenta de diferente color y se pueden diferenciar e identificar.

FROTIS Ó EXTENDIDO

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos. Se coloca una gota sobre un portaobjetos y se extiende con un asa, con un cubre u otro portaobjetos y se observa directamente o previa fijación y coloración.

SQUASH O APLASTAMIENTO

Se coloca el material entre 2 portaobjetos y se presiona con el dedo pulgar los dos portaobjetos con fuerza para obtener la preparación por aplastamientos. Después se puede observar directamente o previa fijación y coloración

CLASIFICACIÓN DE LOS COLORANTES

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SEGÚN SU ORIGEN:

NATURALES: como la hematoxilina, el carmín y la orceína. SINTETICOS O ARTIFICIALES: como el azul de metileno, la safranina, azul de anilina, el naranja G,

etc.. SEGUN SUS PROPIEDADES QUÍMICAS: La mayoría de los colorantes empleados en histología actúan como ácidos o bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en los tejidos. Colorantes ácidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidófilos, porque tienen afinidad por los colorantes ácidos. Por ejemplo, estos colorantes se unen a grupos aminos de las proteínas. Estas proteínas pueden pertenecer al citoesqueleto de la célula o hallarse en la matriz extracelular. Debido al elevado contenido de proteínas del citoplasma la eosina es un excelente colorante citoplasmático. La eosina se une también a las membranas plasmáticas, sin embargo, se desconoce la naturaleza química de esta unión. Las células que presentan un gran desarrollo de membranas (muchas mitocondrias, mucho retículo endoplasmático liso, etc.) son sumamente acidófilas, o sea, se tiñen intensamente con la eosina. Colorantes básicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan basófilos, porque tienen afinidad por los colorantes básicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al núcleo y ciertas regiones del citoplasma. Como caso particular, la hematoxilina no tiene carga, para teñir un tejido se la une a un mordiente que junto a la hematoxilina forman una laca. La laca es básica y por lo tanto se une a cargas negativas de la célula o matriz extracelular. Colorantes neutros: son colorantes en los que la porción ácida y la básica colorean. Tiñen las partes básicas de una célula de un color y las partes ácidas de otro. Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de otro. Ej. el eosinato de azul de metileno. Colorantes indiferentes: tiñen aquellas estructuras o sustancias que los disuelven más fácilmente que el líquido en que están preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lípidos. Los colorantes más usados son:

EOSINA

Se conocen 2 compuestos con este nombre y están relacionados: la eosina Y (tetrabromofluoresceína), comúnmente conocida como eosina amarilla, y la eosina B (dibromodinitrofluoresceína), también conocida como eritrosina B azulada. Ambas, en principio, son intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellas en el resultado de la tinción, por lo que la preferencia de una sobre otra suele seguir un criterio subjetivo. A pesar de ello, la eosina Y es la más utilizada en procedimientos rutinarios histológicos, como tinción de contraste, la técnica de la Hematoxilina - Eosina. La Eosina es un Colorante amarillento – anaranjado usado comúnmente para contrastar con otros, se puede utilizar en solución acuosa al 1% o alcohólica al 5%.

SAFRANINA O

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Es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología. La safranina se usa como líquido de contraste en algunos protocolos de tinción, coloreando el núcleo celular de rojo. Este colorante se utiliza especialmente para técnicas histológicas animales y vegetales.

SUDÁN III O SUDÁN IV

Usado comúnmente en tejidos vegetales o animales para diferenciar las grasas. Los colorantes para grasas son más solubles en las propias grasas que en el medio en el que van disueltos. Así, al bañar la grasa con la solución del colorante éste tiende a disolverse en la grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en solución alcohólica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua. El Sudán IV produce una coloración progresiva, es decir, que a más tiempo de exposición al colorante mayor es la intensidad de tinción.

ORCEÍNA

Uno de los tintes más empleados, se utiliza para diferenciar núcleo. Caliente suavemente 45 mL de Ácido Acético y agregue 2 g de Orceína, deje enfriar y agregue 55 mL de agua destilada.

LUGOL

El lugol o solución de Lugol es una solución de yodo diatómico|I2 (1%) en equilibrio con yoduro de potasio KI (2%) en agua destilada. Fue nombrada en honor al médico francés Jean Guillaume Auguste Lugol. En microbiología, es empleado en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta.

AZUL DE METILENO

El azul de metileno, cuyo nombre científico es Cloruro de Metiltionina, es un colorante El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos

REFERENCIAS

http://www.danival.org/notasmicro/tincion/_madre_tincion.html http://metodolab.blogspot.com/ http://elprofedebiolo.blogspot.com/2010/01/tecnicas-de-tincion.html