ORIGINAL

PATOLOGÍA DEL APARATO LOCOMOTOR, 2005; 3 (1): 55-6359 55

Preparación de biomateriales basados en quitosano yestudios como portadores de osteoblastos en cultivo

Based on chitosan biomaterials and studies ascarrieres of cultured osteoblasts1 Departamento de Ingeniería Química Larena A. 1

Industrial y del Medio Ambiente. E. T. S. Cáceres D. A. 1Ingenieros Industriales. UPM De la Piedra C. 2Madrid Montero M. 2

2 Laboratorio de Fisiopatología Ósea. Vicario C. 3

Unidad de Investigación. Fundación Jiménez Díaz Fuentes A. 3

Madrid Ibarzábal A. 33 Servicio de Traumatología. Bernabeu E. 4

Centro de Rehabilitación y Prevención. FREMAP Ribelles P. 4Majadahonda (Madrid)

4 Departamento de Óptica.Facultad de Ciencias Físicas. UCM Madrid

Correspondencia:Larena A.Departamento de Ingeniería QuímicaIndustrial y del Medio Ambiente.E. T. S. Ingenieros Industriales. UPM MadridTlfno: +34 913363181e-mail: alarena@etsii.upm.es

RESUMENIntroducción: El quitosano es un material potencialmente

útil en el transporte de células humanas.Objetivos: Comparar los distintos materiales a base de qui-

tosano preparados para su uso como biomateriales potenciales.Materiales y métodos: Tras la preparación y esterilización

de diferentes formas de distintos materiales a base de quito-sano se procede a su adición a un cultivo primario de osteo-blastos humanos. Mediante distintas técnicas se analiza la su-perficie, homogeneidad, hinchamiento y la penetración en elbiomaterial de las células cultivadas.

Resultados: Se ha encontrado penetrabilidad osteoblásti-ca así como crecimiento superficial en distintos materiales dequitosano.

Palabras clave: quitosano, osteoblasto, penetración, bio-material.

Larena A., Cáceres D. A., De la Piedra C., Montero M.,Vicario C., Fuentes A., Ibarzábal A., Bernabeu E., Ribelles P.Preparación de biomateriales basados en quitosanoy estudios como portadores de osteoblastos en cultivoPatología del Aparato Locomotor, 2005; 3 (1): 55-63

ABSTRACTIntroduction: Chitosan is a potentially human cells car-

rier useful material.Objectives: To compare several based-on chitosan ma-

terials in several chitosan preparations or their use as po-tential biomaterials by human cultured osteoblasts.

Material and methods: Different chitosan forms wereprepared and sterilized. Then they were added to a primaryhuman osteoblasts culture. Surface, homogeneity swellingand osteoblasts penetration into the biomaterial was ana-lyzed using several techniques.

Results: Osteoblastic penetrability was found. Surfacegrowing on differents chitosan materials could be demon-strated.

Key words: chitosan, osteoblast, penetration, biomate-rial

Larena A., Cáceres D. A., De la Piedra C., Montero M.,Vicario C., Fuentes A., Ibarzábal A., Bernabeu E., Ribelles P.Based on chitosan biomaterials and studies as carrieresof cultured osteoblastsPatología del Aparato Locomotor, 2005; 3 (1): 55-63

A. Larena, D. A. Cáceres, C. De la Piedra, et al.

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INTRODUCCIÓN

El quitosano, cadenas de N-acetilglucosami-na, es un derivado desacetilado de la quitina,polímero natural que se encuentra en estructu-ras de insectos, artrópodos y caparazones decrustáceos. Su capacidad como material bio-compatible ha sido ampliamente demostrada ennumerosos estudios (1, 2).

Para la correcta regeneración ósea una de lascualidades requeridas a los biomateriales es lacapacidad para inducir la osteoinducción a tra-vés de una adecuada proliferación celular (3).En trabajo anterior (4) los autores dejaron refle-jados los resultados obtenidos en cuanto a pe-netrabilidad osteoblástica en membranas dequitosano de distintas concentraciones. En estetrabajo se estudian distintos materiales a base dequitosano. Se ha demostrado que la forma depreparación de los distintos biomateriales y susdiferentes características tanto físicas (rugosidady adhesividad superficiales, resistencia a losprocesos de esterilización) y químicas (que di-rectamente influencian sobre la biocompatibili-dad) son imprescindibles para potenciales im-plantes in vivo.

El objetivo de este trabajo consiste, pues, eninvestigar la proliferación y biocompatibilidadde distintas formas de preparación de materialesde quitosano sobre un cultivo de osteoblastos yse ha avanzado más en la investigación de losposibles métodos de esterilización para su apli-cación a la práctica clínica y que constituye unproblema poco estudiado para los biomaterialesclínicos.

MATERIALES Y MÉTODOS

El quitosano (CHI) minimum 85% deacetila-do de caparazones de cangrejo fue proporcio-nado por SIGMA.

El medio de cultivo de osteoblastos utilizadofue el Dulbecco´s Modified Eagle Medium10938, proporcionado por GIBCO InvitrogenCorporation que fue suplementado además por100 U/ml de penicilina, 6/100 µg/ml de strepto-micina, 2mM de L-glutamina, 1 mM de piruva-to y 10% de suero bovino fetal.

El resto de los reactivos utilizados fueron quí-micamente puros.

Preparación de materiales

Se han preparado diversos materiales condistintas características.

Preparación de las membranas de CHI

Hemos trabajado aquí con distintos tipos depelículas de CHI preparadas según el procedi-miento descrito por Larena et al. (4-6). Se midióel grado de hinchamiento que presentaban ensolución acuosa.

Preparación de membranas de CHI precipitadocon NH4OH

Se obtuvieron nuevas membranas de CHIaplicando el procedimiento descrito por Gó-mez-Pinedo et al. (7) con modificaciones quebásicamente consisten en la precipitación delCHI con NH4OH y posterior lavado en aguadesionizada.

Preparación de biomateriales a base de CHI y PEG

Como procedimiento de trabajo se ha segui-do el método reportado por Zhang et al. (1) conligeras modificaciones.

Así se han obtenido distintas conformacionesdel material en forma de membranas, tacos ypasta moldeable de muy buenas característicasdependiendo de la concentración de CHI y PEGy del tiempo de secado y curación de dicho ma-terial. Básicamente todos los materiales consistí-an en soluciones de CHI al 2% en 1.5% de áci-do acético al que se le añade 1g de PEG hastaconseguir la textura y sequedad deseada.

Métodos de esterilización de los biomateriales

Las esterilizaciones de los materiales se rea-lizaron en la Unidad de Esterilización del Cen-tro de Rehabilitación de FREMAP en Majada-honda y en la Fundación Jiménez Díaz. Sesiguieron varios métodos de esterilización paracomparar su posible repercusión en la biocom-patibilidad de las mismas:

– Esterilización por calor en autoclave a134-138º C durante 15-20 min. (autocla-vado rápido).

Cultivo de osteoblastos humanos

El cultivo de osteoblastos provenían de mu-jeres post-menopáusicas crecidos según proce-dimientos descritos por el Laboratorio de Fisio-patología Ósea de Fundación Jiménez Díaz.

Cultivo primario de osteoblastos humanos

Se utilizó la técnica de Nácher y col. (8) se-gún el procedimiento descrito por nuestro grupoen anteriores investigaciones (4).

Método experimental

Se colocaron, en el fondo de pocillos deplacas P96, fragmentos de la correspondientemuestra de quitosano. A continuación se sem-braron sobre la muestra de biomaterial 25.000osteoblastos procedentes del cultivo primario,se realizaron controles sin la adición de célu-las. Posteriormente se añadió 1ml de mediode cultivo D-MEM en las mismas condicionesque las descritas anteriormente. El medio decultivo se cambió cada 2 días. Al cabo de 5 dí-as, los fragmentos de muestra se sacaron delmedio de cultivo y se introdujeron en formal-dehído.

Transcurridos los diferentes tiempos, se reali-zan estudios de biocompatibilidad y bioestabili-dad de las muestras de CHI con el cultivo celu-lar de osteoblastos. Los diferentes biomaterialesfueron fijados en formaldehído.

Técnicas de observación microscópicas

Se han utilizado distintos métodos de obser-vación microscópica de osteoblastos que difie-ren en resolución, forma de preparación y trata-miento de la muestra y visualización (Matsuza-ka et al. (9), Kuznetsov et al. (10)). Dichos méto-dos, combinados, proporcionan una informa-ción relevante y complementaria.

Los procedimientos seguidos de microscopíaconfocal y electrónica utilizados en este trabajohan sido descritos en anteriores investigacionespor nuestro grupo (4).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización de materiales

Se han diferenciado los materiales en cuantoa su posible aplicabilidad para la práctica trau-matológica diaria.

Membranas de CHI

Medida del grado de hinchamiento

Se han realizado medidas del grado de hin-chamiento de distintas membranas de CHI a di-ferentes concentraciones y bajo neutralizacióno esterilización por calor a 134-138º C durante15-20 minutos obteniéndose el siguiente com-portamiento. Estas membranas se cortaron endiscos de unos 5 mm de diámetro Los resultadosvienen reflejados en la Fig. 6 (11).

Donde la composición de las membranas es:

Muestra 1: CHI 0.3 g, 20 ml AcH 1.5%, 1.6ml GLI 5%;

Muestra 2: CHI 0.7 g, 20 ml AcH 1.5%, 1.6ml GLI 5%;

Muestra 3: CHI 0.7 g, 20 ml AcH 1.5%, 1.6ml GLI 5% con un proceso de neutralización en1% de KOH.

Muestra 4: CHI 0.3 g, muestra esterilizada enautoclave, 20 ml AcH 1.5%, 1.6 ml GLI 5%.

En general, las membranas mostraron unequilibrio con el agua antes de 1 hora y perma-necieron estabilizadas. Las membranas rápida-mente se saturaban de agua con un pequeño in-cremento de peso. El comportamiento dehinchamiento de las muestras 1 y 4 eran muy si-milares en agua desionizada. La muestra 3, teníamayor capacidad de hinchamiento comparadacon la muestra 2, la heterogeneidad y el proce-so de neutralización podrían ser las causas deeste comportamiento anormal.

Métodos de esterilización

Se ha demostrado que los tratamientos térmi-cos afectan al material puesto que producen re-acciones de pardeamiento no enzimático delmaterial (6). El formaldehído también parece in-

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portantes perspectivas de uso en la práctica clí-nica traumatológica como pudieran ser el dise-ño de nuevas preparaciones de CHI para vehi-culización celular y liberación controlada desustancias desde los implantes mediante la uti-lización de distintos agentes de entrecuzamien-to tipo tripolifosfato pentabásico (TPP) y distin-tas técnicas de procesado como la liofilizaciónpara la obtención de microcápsulas, nanocáp-sulas, beads y constructos de quitosano nanoes-tructurados y su posible aplicación a sistemas invivo.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la colaboración de Doña Ma-ria José Luque del Centro de Rehabilitación yPrevención de FREMAP en la esterilización delas muestras.

Para este trabajo hemos contado con finan-ciación de Fundación MAPFRE Medicina a tra-vés de sus Becas de Investigación.

REFERENCIAS

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3. ANSELME K. Review. Osteoblast adhesion on bio-materials. Biomaterials. 2000; 21, 667-681.

4. LARENA A, CÁCERES D A, DE LA PIEDRA C, MON-TERO M, VICARIO C, FUENTES A, IBARZÁBAL A,BERNABEU E, RIBELLES P. 2004. Estudios del qui-tosano como portador de osteoblastos en cultivo.Patología del Aparato Locomotor de la FundaciónMapfre Medicina 2 (3), 199-204.

5. LARENA A, CÁCERES D A, VICARIO C, FUENTESA. Release of a chitosan/hydroxyapatite compositeloaded with ibuprofen and acetyl-salicylic acid sub-mitted to different sterilization treatments. AppliedSurface Science. 2004; 238, 518-522.

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7. GÓMEZ-PINEDO U, CHÁVEZ-DELGADO E, LÓ-PEZ-DELLAMARY F, MORA-GALINDO J, GONZÁ-LEZ-PÉREZ O, MARTÍNEZ-CONTRERAS A, et al.Utilización de prótesis de quitosana y silicona en laregeneración del nervio ciático axotomizado de ra-tas. Arch. Neurocien (Mex). 2001; 6 (4), 184-193.

8. NÁCHER et al. Rev Esp Enf Metab Óseas. 1993; 2,3-8 .

9. MATSUZAKA K, WALBOOMERS X K. The attachmentand growth behavior of osteoblast like cells on mi-crotextured surfaces. Biomaterials. 2003; 24, 2711-2719.

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11. LARENA A, CÁCERES D A. 2004. New porous scaf-folds-membranes nanomaterials formation for Tis-sue Engineering. TNT 2004 “Trends in Nanotechno-logy” (Segovia, SPAIN).

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