Preparaciones de base lquida vs. citologa convencional:Adecuacin de las muestras y coincidencia de diagnstico en lesiones oralesLiquid-based preparations versus conventional cytology:specimen adequacy and diagnostic agreement in oral lesionsFbia H Hayama(1), Ana CF Motta(2), Antonio de Padua G Silva(3), Dante A Migliari(4)(1) Profesor Asistente, Departamento de Diagnstico Oral, Escuela de Odontologa,Universidad Federal de Paran, Curitiba, PR, Brasil(2) Investigador Asociado, Departamento de Diagnstico Oral, Escuela de Odontologa,Universidad de So Paulo, SP, Brasil(3) Profesor y Presidente, Departamento de Patologa Mdica. Escuela de Medicina,Universidad Catlica de Paran, Curitiba, PR, Brasil(4) Profesor Agregado, Departamento de Diagnstico Oral, Escuela de Odontologa,Universidad de So Paulo, SP, BrasilCorrespondencia:Dante A. MigliariUniversidade de So PauloFaculdade de Odontologa,Departamento de Estomatologia, Disc. de SemiologiaAv Prof. Lineu Prestes, 2227, Cidade UniversitriaSo Paulo, SP Brasil 05508-900Telfono y Fax: + (55-11) 3864 1372E-mail:damiglia@usp.brRecibido: 5-09-2003 Aceptado: 22-02-2004Hayama FH, Motta ACF, Silva APG, Migliari DA. Liquid-based preparations versus conventional cytology: specimen adequacy and diagnostic agreement in oral lesions. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2005;10:115-22. Medicina Oral S. L. C.I.F. B 96689336 - ISSN 1698-4447

RESUMENObjetivo: Comparar la efectividad de la muestra y la coincidencia de diagnstico entre preparaciones de base lquida y frotis convencionales en lesiones orales, y probar la viabilidad de la prueba inmuno-citoqumica en preparaciones de base lquida de lesiones de carcinoma oral.Material y Mtodos: Se obtuvieron muestras de 44 pacientes. Primeramente se prepararon frotis convencionales, usando un dispositivo cytobrush. A continuacin se sumergi el cepillo que contena el material residual en un lquido conservante. La muestra en el mismo fue procesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante (AutoCyte, Inc. Elon College, North Carolina, USA). Se tieron preparaciones de ambas tcnicas de acuerdo con el mtodo de Papanicolaou. Para la prueba inmuno-citoqumica se usaron conjuntamente AE1/AE3 (Dako, CA, USA) para las lesiones de carcinoma oral, de acuerdo con el mtodo de la Estreptovidina-biotina-peroxidasa. Se us la prueba exacta de Fisher; fijndose la probabilidad significativa enp0.05.Resultados: Ambas tcnicas coincidieron en el diagnstico citolgico en todos los casos donde se us una muestra adecuada; en 3 casos el frotis convencional mostr hipocelularidad y, por lo tanto, result inadecuado para el anlisis. En el anlisis de muestras, la citologa de base lquida mostr una mejora general estadsticamente significativa), de un 41% en espesura de frotis y de un 66% en la distribucin de clulas (p0.05), adems de una reduccin en la superposicin de clulas y la presencia de sangre (p0.05). La morfologa celular se observ mejor en las preparaciones de base lquida. Las reacciones de la prueba inmuno-citoqumica fueron positivas en todos los casos de malignidad, siendo especialmente clara la observacin de clulas inmuno-marcadas.Conclusin: Tanto las preparaciones de base lquida como los frotis convencionales son dignos de confianza desde el punto de vista del diagnstico; el mtodo de base lquida mostr una mejora general en la preservacin de muestras, adecuacin de ejemplares, observacin de morfologa celular y reproducibilidad.Palabras clave: Lesiones orales, diagnstico citolgico, citologa convencional, citologa de base lquida.ABSTRACTObjective: To compare specimen adequacy and diagnostic agreement between liquid-based preparations and conventional smears in oral lesions, and to test the viability of immunocytochemical assay in liquid-based preparations from oral carcinoma lesions.Material and Methods: Samples were collected from 44 patients. Conventional smears were prepared first, using a cytobrush device. Then the brush, containing the residual material, was immersed in a preservative fluid. The sample in the preservative fluid was processed according to the manufacturer directions (AutoCyte, Inc. Elon College, North Carolina, USA). Slides of both techniques were stained by Papanicolaou method. For immunocytochemical assay, a cytokeratin pool AE1/AE3 (Dako, CA, USA) was applied in liquid-based preparations from oral carcinoma lesions following the Streptavidin-biotin-peroxidase method. Fishers exact test was used; significance was set forp0.05.Results: Both techniques agreed on cytologic diagnosis in every case they yielded an adequate specimen; in 3 cases conventional smear resulted in hypocellularity and therefore inadequate for analysis. On specimen analysis, the liquid-based cytology demonstrated a statistically significant, 41% overall improvement in smear thickness and 66% in cell distribution (p0.05), and a reduction in cell overlapping and presence of blood (p0.05). The cell morphology was better visualized in the liquid-based preparations. The immunocytochemical assay reactions were positive in all malignant cases, the visualization of the immunostained cells being especially clear.Conclusion: Both, the liquid-based preparation and conventional smear, are diagnostically reliable; the liquid-based method showed an overall improvement on sample preservation, specimen adequacy, visualization of cell morphology and reproducibility.Key words:Oral lesions, cytologic diagnosis, conventional cytology, liquid-based cytology

INTRODUCCINLa citologa exfoliativa es un proceso simple y no invasivo, que permite estudiar las clulas epiteliales de las superficies mucosas. Ese examen, conocido como frotis citolgico convencional, fue originalmente ideado para la deteccin precoz de clulas cervicales cancerosas. Su aplicacin en la prctica de la medicina oral ha sido restringida, ya que los cambios iniciales de la mucosa oral que indican malignidad se detectan preferentemente con la inspeccin oral y la biopsia. Adems, la gran variacin en la calidad tcnica de los frotis citolgicos aumenta la probabilidad de fallos de diagnstico en el examen microscpico. No obstante, el frotis citolgico se ha usado en el diagnstico de ciertos tipos de lesiones orales, la mayor parte de ellas provenientes de enfermedades causadas por virus u hongos (1). Actualmente con el progreso de la tcnica citolgica, que se ha traducido en el desarrollo de preparaciones de base lquida, el uso de esta tcnica como herramienta auxiliar en el diagnstico de lesiones de la mucosa oral ha despertado un renovado inters (2-4).En las preparaciones de base lquida, la muestra y el dispositivo de recoleccin se transportan en un recipiente que contiene un lquido conservador. Eso permite la inmediata fijacin de las clulas, con lo cual todo el material removido puede usarse. Esa tcnica permite obtener preparaciones con abundancia de clulas dispersas en una capa fina y homognea. Sangre, inflamacin y mucus quedan reducidos y distribuidos por toda la preparacin. El fondo claro que as se obtiene aumenta la sensibilidad y la calidad (5-7). Comparado con los frotis convencionales, el uso de preparaciones de base lquida ha permitido reducir considerablemente el nmero de preparaciones insatisfactorias o satisfactorias pero limitadas, debido a las caractersticas del ejemplar, lo que disminuye el nmero de resultados falsos negativos (8-10).El propsito de este estudio es comparar el empleo de las preparaciones de base lquida con el de los frotis convencionales en el diagnstico oral de rutina. Por otra parte, tambin se estudi la viabilidad de la prueba inmuno-citoqumica usando preparaciones de base lquida para lesiones cancerosas de clulas escamosas.MATERIAL Y MTODOSPacientesEl grupo de estudio estaba constituido por 44 pacientes examinados en la Clnica de Diagnstico Oral de la Escuela de Odontologa de la Universidad de So Paulo (LaTabla 1resume las caractersticas de esos pacientes). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comit de tica de la Universidad de So Paulo. Se inform a los pacientes sobre los objetivos de la investigacin, mtodos, posibles beneficios y riesgos, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes. Fue criterio de exclusin que los pacientes usaran regularmente medicacin tpica.

Inmediatamente despus de la recoleccin de material para anlisis citolgico, se hizo una biopsia de todas las lesiones, excepto de las que eran clnicamente sugestivas de infeccin por el virus de herpes simplex recurrente VHS, (con presencia de lesiones ulceradas recurrentes en mucosa queratinizada) o infeccin porCndida(lesin eritematosa del paladar duro asociada a estomatitis por dentadura o sobreinfeccin de lesiones preexistentes, tales como liquen plano oral y leucoplasia). Las biopsias fueron sometidas a un examen histolgico de rutina y, en casos con sospecha de enfermedades autoinmunes, tambin analizadas por inmunofluorescencia directa.Preparacin de muestrasLas muestras recogidas provenan de lesiones de: candidiasis (8 casos), liquen plano oral (8 casos), pnfigo vulgar (2 casos), penfigoide membrana mucosa (6 casos), carcinoma de clulas escamosas (11 casos), nevus esponjoso blanco (3 casos), leucoplasia (2 casos), lesiones de VHS recurrente (3 casos) y paracoccidioidomicosis (1 caso).Las muestras fueron obtenidas mediante el uso de un dispositivo cytobrush (Adlin, Jaragu do Sul, Brasil). Primeramente se prepar un frotis convencional pasando el cepillo a lo largo del portaobjetos de vidrio, que fue posteriormente fijado en etanol de 95%. Entonces el cepillo, conteniendo el resto de la muestra, fue sumergido en el medio de transporte, consistente en un conservante de base alcohlica (AutoCyte Inc., Elon College, North Carolina, USA) Tanto el frotis convencional como el frasco con clulas en suspensin fueron enviados al laboratorio Citopar (Curitiba, Brasil).En el laboratorio, el frotis convencional fue procesado de acuerdo con la tcnica de Papanicolaou. El material celular de base lquida contenido en el frasco fue procesado de acuerdo con las indicaciones del fabricante (AutoCyte, Inc.) El proceso inclua vrtex, centrifugacin con reactivo de densidad, decantacin y resuspensin de los grnulos de clulas seguida de sedimentacin por gravedad sobre lminas revestidas de poli-l-lisina, y seguidamente por tincin con el colorante de Papanicolaou (8-11). En el caso de lesiones sugestivas de candidiasis, las preparaciones de base lquida fueron hechas por duplicado y una de ellas teida con PAS (cido peridico-Schiff). Los frotis convencionales fueron tambin teidos con PAS despus de ser decolorados con xileno.EvaluacinTodas las preparaciones fueron examinadas por un citopatlogo que ignoraba el tipo de lesin de donde ellas haban sido extradas. Para el anlisis comparativo de ambas tcnicas se usaron cinco parmetros: a) espesura b) distribucin celular c) microbiota d) inflamacin/leucocitos e) caractersticas. Cada uno de ellos fue clasificado en las categoras de satisfactorio, satisfactorio pero limitado e insatisfactorio. Para el anlisis estadstico se us la prueba exacta de Fisher. La significancia fue fijada enp0.05.Inmuno-citoqumicaParte del material de base lquida proveniente de carcinoma de clulas escamosas tambin fue probado con respecto a su utilidad en pruebas inmuno-citoqumicas. Siguiendo una tcnica estandardizada para preparaciones de base liquida, las muestras de lmina fina as obtenidas fueron dejadas sin teir y despus procesadas por el mtodo del complejo Estreptovidina-biotina-peroxidasa, sin recuperacin del epitopo, usando anticuerpos primarios contra citoqueratinas humanas (conjunto de citoqueratinas AE1 / AE3) (12-14). La dilucin fue de 1/200 (M3515, Dako, CA, USA). Las muestras fueron primeramente fijadas en alcohol de 95%, y despus incubadas con perxido de hidrgeno 0,3%, con bloqueo de biotina endgena. Los anticuerpos primarios fueron incubados durante 30 minutos, seguidos de Link de 20 minutos (Dako, CA, USA). Las muestras fueron inmuno-marcadas con el reactivo de Estreptovidina-Biotina durante 20 minutos, y el producto de la reaccin revelado con diaminobencidina 0,5% (DAB, Dako, CA, USA). Las muestras fueron teidas con hematoxilina, deshidratadas con alcoholes, lavadas y montadas para evaluacin. Los controles negativos se hicieron usando solucin salina con fosfato tamponado (PBS), en lugar de anticuerpos primarios. Se defini como reaccin positiva la presencia de grnulos rojo-pardos por todo el citoplasma de clulas epiteliales malignas (2,15-17).RESULTADOSEn latabla 2aparecen los resultados del diagnstico obtenidos por ambas tcnicas. Una y otra llevaron al mismo diagnstico y a la misma catalogacin de clase de Papanicolaou, en todos los casos donde las muestras eran aptas para anlisis. En 3 casos (1 de leucoplasia y 2 de nevus esponjoso blanco), el frotis convencional present hipocelularidad, lo que hizo imposible el diagnstico citolgico.

En latabla 3aparecen los datos de adecuacin de las muestras. Entre los resultados satisfactorios, las preparaciones de base lquida mostraron estadsticamente una mejora en cuanto a delgadez (41%) y distribucin de clulas (66%), al compararlas con las provenientes de la citologa convencional (p0.05). En el caso de las muestras satisfactorias pero limitadas, las preparaciones de base lquida mostraron reduccin en la cantidad de clulas superpuestas (frotis grueso), distribucin irregular de clulas, y en la presencia de sangre (p> 0.05). No se hall diferencia estadstica en lo referente a inflamacin por leucocitos, microbiota, artefactos y en los resultados insatisfactorios (p> 0.05).

En el anlisis microscpico las preparaciones de base lquida mostraron mayor resolucin de las muestras. En pnfigo vulgar, carcinomas de clulas escamosas, lesiones VHS e infecciones fngicas, las preparaciones de base lquida presentaron una mejor morfologa citolgica (Figs. 1y2). En el caso de las lesiones por VHS, en particular, la observacin de caractersticas histopatolgicas indicadoras de infecciones por virus (binucleacin, clulas polinucleadas) mejor mucho con el uso de la tcnica de base lquida (Fig. 3).

La prueba inmuno-citoqumica para clulas malignas, usando una preparacin de base lquida, mostr una reaccin positiva con citoqueratina AE1/AE3 en los 11 casos experimentados, tindose las clulas con un patrn rojo pardo (Fig. 4).DISCUSINDesde que la citologa en base lquida fue introducida, en la dcada de 1990, diversos estudios comparativos mostraron que ella puede ofrecer ventajas significativas sobre la citologa exfoliativa convencional. Los resultados obtenidos en exmenes de cuello uterino, por ejemplo, han mostrado que las preparaciones de base lquida reducen los problemas de errores de muestreo, transferencia y fijacin deficientes de la muestra de clulas (8-11,18). En la investigacin de cncer uterino, las preparaciones con base lquida han mostrado tambin una reduccin significativa en la proporcin de resultados falsos-negativos, al compararlos con los frotis originales (7-10). Debido probablemente a la escasez de estudios sobre citologa de base lquida para el examen de la mucosa oral, el mtodo convencional es todava el ms usado. El propsito de este estudio fue comparar ambas tcnicas en trminos de adecuacin de la muestra y coincidencia de diagnsticos en el caso de diversos tipos de lesiones orales.La coincidencia de diagnstico entre ambas tcnicas, en el examen de 44 lesiones, fue muy elevada porque ellas coincidieron en todos los casos donde ambas permitieron obtener un preparado adecuado; en 3 casos el frotis convencional acus hipocelularidad y, por lo tanto, inadecuacin para anlisis. Con respecto a la adecuacin de la muestra, las lminas procesadas por preparaciones de base lquida presentaron ventajas, tales como una distribucin delgada y uniforme del material celular, aparte de un fondo claro, debido tanto a la reduccin de la superposicin de clulas como a la de la presencia de sangre.Debido a esos perfeccionamientos, las preparaciones de base lquida proporcionaron ejemplares donde se vea mejor la morfologa celular. Por ejemplo, detalles de los efectos citopticos provenientes de infeccin por VHS (hipercromatismo nuclear, binucleacin, clulas polinucleadas) mejoraron en las preparaciones de base lquida (19). En el caso de enfermedades autoinmunes, tales como pnfigo vulgar, aunque ambas tcnicas fueron eficientes para hacer el diagnstico, la percepcin de lminas de clulas mostrando prdida del cemento intercelular (acantlisis) fue mejor caracterizada en las preparaciones de base lquida. En el examen de lesiones producidas por carcinoma oral, ellas tambin presentaron ventajas sobre los frotis convencionales porque permitieron una mejor observacin de las anomalas citolgicas y de los cambios en la relacin nuclear-citoplasmtica.Otro propsito de este estudio fue experimentar la prueba inmuno-citoqumica en frotis de clulas escamosas de carcinoma oral procesados como preparaciones de base lquida. La reaccin de los anticuerpos frente a un conjunto de citoqueratina humana (AE1/AE3) fue positiva en todos los casos de malignidad, y la visualizacin de las clulas inmuno-marcadas fue fcilmente realizada debido al fondo claro de las lminas. La prueba inmuno-citoqumica mostr tambin importantes ventajas, tales como la cantidad relativamente pequea de anticuerpos requerida y su costo reducido. Adems, la prueba inmuno-citoqumica puede ser til para resolver casos de diagnstico problemtico, al mostrar expresiones fenotpicas peculiares en clulas epiteliales.Resulta claro que, aunque la citologa convencional es todava el principal mtodo usado para los exmenes rutinarios de frotis, este estudio demostr que, entre otras ventajas, la citologa de base lquida logra una mejor calidad en la resolucin de la morfologa celular. Su desventaja reside en que exige tanto un laboratorio con equipo ms sofisticado como personal mejor entrenado para manejar debidamente el proceso y analizar las muestras.Como todos los mtodos de citologa de base lquida permiten la obtencin de ms de una preparacin por cada muestra recogida, siempre habr material suficiente para aplicar otras tcnicas, tales como PAS y Plata Metamina, adems de la tincin de Papanicolaou. Finalmente, el material preservado en la solucin de fijacin lquida es de larga vida til y, por lo tanto, est disponible para los exmenes adicionales que sean necesarios.