Presentación · apoyo decidido al progreso de la investigación biotecnología y la educación...

Encuentro 2006/ Año XXXVIII, N° 75

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PresentaciónEncuentro 75Biotecnología y calidad de vidaNo. 75 / 2006 • 111 páginas 500 ejemplares

La actual dinámica de crecimiento del mundo globalizado cuenta con un apoyo fundamental en el desarrollo científico, la biotecnología. En su concepción más amplia es entendida como un conjunto de tecnologías claves para la competitividad y el desarrollo sostenible. En esta oportunidad la revista Encuentro, en calidad de plataforma para la divulgación académica y científica, asume el compromiso con la biotecnología al hacer de sus páginas la memoria histórica del III Congreso Nicaragüense de Biotecnología gestado y organizado por el Centro de Biología Molecular de la UCA.

Hoy la biotecnología no es únicamente signo del avance científico. Es ciencia que garantiza rápidos cambios en la prevención y conquista de la salud, propone nuevas opciones de alimentos, establece fuentes alternativas de energía y propicia el uso sostenible del medioambiente. Todo ello con la finalidad de ser un agente de desarrollo y bienestar económico, con la intención de combatir el hambre, la desnutrición, incrementar la eficacia de los sistemas productivos industriales, entre otros. Y es así que el número 75 de Encuentro presenta una colección de artículos dirigidos a escudriñar las componendas a los problemas previamente introducidos.

En otro aspecto, la biotecnología nos remite a la defensa de la vida pero también a las inquietudes sobre las consecuencias imprevistas de sus aplicaciones. A la defensa de la vida se une el debate sobre lo posible y lo imposible, sobre lo necesario y lo inconveniente, sobre lo legítimo y lo prohibido. Y es entonces, cuando por encima del miedo y de la ideología, la Universidad debe profundizar su aporte, uniendo a su apuesta por el desarrollo científico la reflexión sobre los riesgos que pudiera conllevar para la libertad y la dignidad humana. Sin tabúes ni prejuicios, la Universidad comparsa la verdad que se descubre en sus laboratorios, con el descubrimiento de la responsabilidad ética, tanto respecto a los temas filosóficos y humanamente inquietantes, como respecto a aquéllos que de alguna manera abren amplias perspectivas, como es el caso de las investigaciones sobre las enfermedades del ser humano y las nuevas formas de producir alimentos.

Para los países como Nicaragua, la importancia de la biotecnología se relaciona de manera directa con la premura de cubrir las necesidades básicas de la sociedad y mejorar su calidad de vida. Es por ello que el apoderamiento por las nuevas ciencias, profundiza la necesidad de contribuir a mejorar el nivel de desarrollo de nuestros países, sujetos por razones históricas y culturales a un ritmo de cambios dificultoso y lento. Esta misma conciencia ha propiciado que varios países latinoamericanos hayan creado con perspectiva estratégica, nuevos centros de referencia en biotecnología, los cuales a su vez han estimulado la creación de pequeñas empresas que han generado un impacto económico significativo.

Nicaragua también ha venido avanzando en este caminar, acrecentando el número de académicos e investigadores. Sin embargo, necesitamos articular muchos vigores dispersos que cuentan con débiles infraestructuras apenas sostenidas por una mínima inversión en el ámbito científico y tecnológico. La propuesta de un programa nacional de investigación que permita potenciar las fortalezas de los diversos grupos, es un asunto crucial para la implementación de una Agenda Nacional Biotecnológica.

Encuentro 2006/ Año XXXVIII, N° 75, 9-19

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Encuentro

Tendencias actuales de la biotecnología en Nicaragua1

Ian M. Roustan-Espinosa 1, Fernando Quezada 2 y Jorge A. Huete-Pérez 1

1. Investigadores del Centro de Biología Molecular UCA. Pista Juan Pablo II. Apto. 69. Managua, Nicaragua. E-mail: [email protected]

2. Director del Centro de Excelencia de Biotecnología de Massachussets, EEUU.

Recibido: julio 2006 / Aceptado: octubre 2006

ESTE TRABAJO ABORDA LAS TENDENCIAS DE LA INVESTIGACIÓN biotecnológica en Nicaragua. Se destaca el reciente auge de esta área del conocimiento basándose en información obtenida de los tres Congresos Nicaragüenses de Biotecnología (2002, 2004 y 2006). Se describen, en particular, las actividades y temáticas abordadas en el tercer Congreso, resaltando las ponencias más sobresalientes. Al mismo tiempo, se discute la potencialidad de este sector para la economía nacional. Esta revisión del tema, a manera de diagnóstico de la situación actual, podría contribuir a la toma de decisiones sobre el desarrollo de políticas de promoción de la investigación científica.

Palabras clave: biotecnología-Nicaragua-investigaciones / biotecnología congre-sos, conferencias, etc. / investigación científica

Introducción

A nivel mundial, la biotecnología representa una amplia área de disciplinas que se desarrollan a un paso acelerado, provocando tremendo impacto en la economía, la ciencia y la educación. También en Nicaragua se están desarrollando con firmeza estas ciencias: durante los últimos 10 años, se ha destacado una incipiente pero creciente comunidad científica determinada a su avance, al uso de sus aplicaciones y el mejoramiento de la educación científica en el país. Actualmente, varios grupos de investigadores y centros de investigación están ayudando a solucionar problemas concretos, principalmente en las áreas de biomedicina y biotecnología agrícola.

En un esfuerzo por impulsar estas áreas del conocimiento el Centro de Biología Molecular de la Universidad Centroamericana (UCA), ha organizado los Congresos Nicaragüenses de Biotecnología que se han convertido en una plataforma de divulgación y debate de los temas más apremiantes de la comunidad investigadora del sector biotecnológico. Este artículo es una revisión sobre los avances de la investigación científica en biotecnología teniendo como base los resultados y Memorias de los tres Congresos (2002, 2004, 2006); se abordan la historia, objetivos y alcances de estos Congresos; se describen, en particular, las actividades y temáticas abordadas en el tercero, resaltando las ponencias más sobresalientes. Al mismo tiempo, se discute la potencialidad de este sector para la


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economía nacional y las tendencias actuales más relevantes de la investigación biotecnológica del país.

Historia de los Congresos Nicaragüenses de Biotecnología

Los Congresos Nicaragüenses de Biotecnología surgieron como iniciativa del Centro de Biología Molecular de la Universidad Centroamericana en 2002. Dado el notable desarrollo de la biotecnología moderna en Nicaragua en los últimos años, y la importancia de la investigación científica para el desarrollo de una economía sólida basada en el conocimiento, se consideró necesaria la creación de un espacio para la divulgación de los trabajos que habían realizado algunos grupos de especialistas en el amplio espectro de la Biotecnología, con el propósito de promover el desarrollo y utilizar la innovación biotecnológica en Nicaragua. Dentro de estos objetivos, se ha planteado congregar, enlazar y generar sinergia entre los grupos de investigadores nacionales, a la vez que se tienden puentes de cooperación con otros sectores pertinentes (privado, público y gobierno).

Los Congresos han contado con la participación de destacados científicos de otros países, invitados por la UCA con el doble propósito de adquirir de primera mano conocimiento sobre los más recientes avances de la ciencia mundial; y fomentar colaboraciones de investigadores nacionales con extranjeros que se encuentran trabajando en áreas relacionadas. Algunos de los participantes de destacada trayectoria son Torsten Weisel (Nóbel 1983), Ricardo Miledi (Premio Príncipe de Asturias de Neurociencia), Marc van Montagú (Barón de Bélgica, miembro de la Academia de Ciencias de EEUU) y Richard Roberts (Nóbel 1993).

A la fecha se han efectuado tres Congresos nacionales, realizados cada dos años, para dar seguimiento continuo a proyectos de larga duración, y para conocer nuevas líneas de investigación. Los Congresos han sido posibles gracias al apoyo financiero del Banco Interamericano de Desarrollo, la Fundación Pew Charitable Trusts, SIDA-SAREC, Food and Agriculture Organization, Fundación New England Biolabs y fondos propios de la UCA. Además, algunas organizaciones han financiado algunas actividades parciales: CYTED-CONICYT y Ministerio del Ambiente (proyecto GEF-Biotecnología). También la Embajada de Estados Unidos en Managua ha apoyado la visita de algunos científicos estadounidenses.

El formato de los Congresos costa de cuatro grandes bloques que agrupan los principales sectores de aplicación de la biotecnología en el país: biomedicina, biotecnología agrícola, industrial y ambiental. Se incluye, además, un foro de discusión de diversos temas de importancia nacional y mundial que varía dependiendo del enfoque del evento. En estos foros se han abordado temas relacionados con bioseguridad, políticas científicas, desarrollo económico a través de ciencia y tecnología, vinculación gobierno-industria-sector académico. El tema del foro del tercer Congreso fue, precisamente, la vinculación intersectorial (3).

Tercer Congreso Nicaragüense de Biotecnología

El tercer congreso se realizó en Managua los días 20-21 de abril de 2006, con 110 participantes que representaron a diversos grupos de investigación de todo el país, incluyendo por primera vez a una representación de la Región Caribe (Universidad BICU). En el primer y segundo


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Congresos hubo 120 y 95 participantes, respectivamente. Científicos extranjeros incluyendo Brasil, Venezuela, Uruguay, Dinamarca, México y Estados Unidos formaron parte del elenco de expositores del evento. Igualmente, participaron representantes del sector gobierno (CONICYT y los ministerios de Agricultura, Finanzas, del Ambiente y Recursos Naturales y de Salud), junto con diversos empresarios y emprendedores líderes del país. Uno de los grandes logros es la creciente participación de las autoridades universitarias, en particular de la UCA, cuya participación, a su máximo nivel con la rectora Mayra L. Pérez, expresa un compromiso frente al reto de desarrollar la investigación biotecnológica. El mensaje dirigido a los congresistas por Juan Bautista Arríen, asesor de la UNESCO, representó también apoyo decidido al progreso de la investigación biotecnología y la educación científica, en general.

Biomedicina. José Felix Espinoza y Filemón Bucardo, del Departamento de Microbiología de la UNAN-León, presentaron una ponencia sobre su trabajo en rotavirus. Se trata de un estudio sobre una mutación en la posición 77 del gen VP7 de la cepa G4P[8] de rotavirus, que fue la que se determinó como la más predominante durante una epidemia de diarrea aguda en niños menores de cinco años durante febrero y marzo del 2005. El análisis filogenético del gen VP7 demostró que la cepa pertenece al linaje lc y que está distantemente relacionada con las cepas ST3 y VA70.

Jorge Huete, director del Centro de Biología Molecular de la UCA, presentó los resultados de un estudio sobre el tráfico vesicular de la más abundante cisteino proteasa (Cruzaína) en Tripanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas. Previamente se estableció que los efectos de inhibidores sobre el parásito eran debido a la inhibición en el procesamiento de precursores de cisteino proteasas, resultando en su acumulación en el aparato de Golgi y posterior muerte de los parásitos. En el nuevo estudio, se utilizó la técnica de yeast-two-hybrid para identificar proteínas que potencialmente interactuaran con Cruzaina, con el fin de ser utilizadas como dianas moleculares de agentes quimo-terapéuticos. Igualmente, se presentaron los avances realizados en el estudio de tráfico intracelular y mecanismos de reconocimiento celular en T. Cruzi.

Los expositores Eduardo Brandt de Oliveira, de la Universidad de Sao Paulo, Brasil, y Luis Brieva, del Departamento de Bioquímica del CINVESTAV, México, abordaron métodos modernos en la síntesis de péptidos y la bioquímica estructural del metabolismo de ácidos nucleicos, respectivamente. El expositor brasileño presentó métodos de secuenciación modernos pero apropiados, para la investigación en países como los latinoamericanos, en donde la creatividad para la innovación tecnológica es un bien muy preciado. El expositor mexicano, en cambio, discutió la potencialidad y usos de métodos cristalográficos para el estudio de variados tipos de ácidos nucleicos y proteínas.

Biotecnología Agroindustrial. Con el tema de biotecnología agrícola, Edgardo Jiménez, de la Universidad Nacional Agraria (UNA), presentó un estudio sobre los efectos de transgénesis para resistencia a virus de trigo en las interacciones de planta-vector-virus. Se presentaron datos sobre los efectos de los transgenes en la longevidad, comportamiento y eficiencia de transmisión viral del áfido R. Padi. Guillermo Reyes, también de la UNA, presentó resultados de un estudio sobre cocoyam (Xanthosoma spp.) en Nicaragua,


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haciendo énfasis en el Virus del Mosaico Dasheen (Dasheen Mosaic Virus). Representando a la prestigiosa Pennsylvania State University, Mark Guiltinan presentó datos sobre el trabajo que realizan en el mapa genético del Cacao, además del desarrollo de plataformas en PCR de tiempo real y microarreglos para el estudio de la expresión génica en de esta especie. Por otra parte, Carolina Vega, de la UNA, presentó avances de varios proyectos del área de cultivo de tejidos.

Otras aplicaciones biotecnológicas. En la última sesión de presentaciones científicas, bajo el tema de Aplicaciones Biotecnológicas, Eduardo Flores realizó un resumen de las investigaciones realizadas por el Centro de Investigaciones de Ecosistemas Acuáticos (CIDEA) de la UCA. Se presentaron datos de estudios nacionales para determinar la prevalencia de múltiples virus (WSSV, TSV, YHV e IHHNV) en camarones silvestres de Nicaragua y Panamá, al igual que diversos vínculos y beneficios mutuos obtenidos con la industria privada. El tema de biorremediación, enfocado en la degradación de toxafeno en medio líquido, fue tratado en la presentación de Martha Lacayo del Centro de Investigaciones para los Recursos Acuáticos (CIRA) de la UNAN-Managua. En el estudio, se ensayaron diversos sustratos y variables para obtener las condiciones óptimas para la degradación del plaguicida toxafeno utilizando hongos producidos por la descomposición de la madera (Bjerkandera spp. BOL13).

Universidad-Empresa. Es sabido que las economías de países como China, India y Corea se encuentran en continuo ascenso. Estos tres países han adoptado y apoyado el desarrollo en ciencias biológicas modernas como la biotecnología y han sabido acoplar los avances realizados en investigación con sus aplicaciones en el sector industrial. Para generar este repunte económico, se han establecido diálogos y nexos entre el sector académico y el industrial. Considerando lo anterior, la temática central del Foro del tercer Congreso fue la vinculación entre el sector privado y el sector académico. En una sesión adicional, se desarrolló el tema de colaboración Universidad-Industria para el desarrollo de la biotecnología a cargo de Fernando Quezada, director ejecutivo del Centro de excelencia en Biotecnología de Massachussets, Estados Unidos.

Fernando Quezada se refirió a la necesidad que presenta Latinoamérica de establecer efectivas relaciones de trabajo entre los sectores académicos (instituciones de investigación) y las industrias tradicionales, para obtener mayor competitividad por parte de la empresa privada en el mercado mundial (globalización) y para satisfacer las crecientes demandas de los diversos tratados de libre comercio. Igualmente, se trataron los beneficios que pueden ser obtenidos mediante estas vinculaciones en el sector académico. Ejemplos de vinculaciones en Estados Unidos, Europa y Latinoamérica fueron presentados, además de múltiples factores que contribuyen con el éxito de este tipo de esfuerzos. La participación de empresarios como Ricardo Terán fue de singular importancia para alimentar la discusión desde la perspectiva empresarial y del sector privado.

Simposio sobre los retos de la biotecnología en Nicaragua. Niels Thygesen, de la Technical University of Denmark, presentó un modelo de un plan de desarrollo de la biotecnología en Nicaragua. Abordó los factores y acciones necesarios para generar un plan nacional, contemplando los recursos humanos y financieros, así como equipamiento, proyectos y


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actividades específicas. Esta ponencia sirvió de introducción a la discusión del simposio. Por su parte, los panelistas tuvieron la tarea de debatir el tema de retos y perspectivas de la biotecnología en Nicaragua.

El panel estuvo integrado por representantes de los sectores académico y gubernamental: Jorge Huete, director del Centro de Biología Molecular de la UCA; Aldo Roja, del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA); Ernesto Medina, antiguo Rector de la UNAN-León; y Fernando Quezada, expositor del extranjero, quien también actuó como moderador del simposio.

Los panelistas ofrecieron sus puntos de vista sobre las áreas que representan grandes retos para los sectores productivos del país y el papel de las tecnologías emergentes para aportar soluciones. Los miembros del panel concordaron en la necesidad de un diálogo continuo entre todos los sectores y actores relevantes al tema, haciendo énfasis en la comunidad agrícola. Hubo coincidencia en cuanto a la importancia de unir fuerzas (crear alianzas) y la urgencia de organizar un plan nacional. Fue generalizado el sentimiento de crear un comité o comisión de trabajo encargada del desarrollo a largo plazo de la biotecnología en Nicaragua, identificando fortalezas y debilidades, además de definir prioridades. Se reconoció que el apoyo a la investigación básica aumentará la excelencia y competitividad de la comunidad científica nicaragüense. En el área de ciencia aplicada, se propusieron múltiples temas para estimular las aplicaciones científicas con relevancia industrial y comercial.

Después de los comentarios de los panelistas, la audiencia participó activamente en la discusión de diversos aspectos que fueron percibidos como prioritarios para Nicaragua. Parte de la audiencia expresó la necesidad de ampliar la definición de biotecnología para incluir todos los aspectos de metodologías biológicas modernas para un mejor estudio de los recursos naturales en agricultura y salud humana y animal. Otra parte mencionó la carencia de una base de datos de recursos humanos, dada la importancia de esta área como un factor en el éxito de la construcción de una plataforma biotecnológica viable. La participación de la comunidad rural (sector campesino) será fundamental en este proceso. Se señaló que las instituciones universitarias en Nicaragua están en la mejor posición para tomar iniciativas de colaboración con los sectores privado y gubernamental. Se recomendó la selección de ciertos nichos y áreas de relevancia. Las áreas de investigación de especial interés incluyen acuacultura, conservación de recursos naturales y mejoramiento de cosechas, entre otras. La formulación de una legislación adecuada y un marco regulatorio será de particular importancia para sentar las bases que aceleren el desarrollo de la biotecnología agrícola. Varios miembros mencionaron que se deben estudiar con especial atención las experiencias de otros países como México, en cuanto al modelo de desarrollo biotecnológico.

Tendencias y perspectivas de la biotecnología en Nicaragua

Durante la última década, el avance experimentado en biotecnología a nivel mundial ha sido intenso. Los ejemplos van desde el arroz dorado, organismo genéticamente modificado con mayor cantidad de beta-caroteno (provitamina A); pasando por la secuenciación de genomas incluyendo al humano, chimpancé, y varias plantas modelo; hasta llegar al desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación automática, PCR de tiempo real y los microarreglos.


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En Nicaragua, durante el mismo período, se han experimentado avances en el desarrollo de ciencia y tecnología, principalmente en las áreas biomédicas y de biotecnología agrícola. La fundación del Centro de Biología Molecular de la UCA en 1999 y del Laboratorio de Biología Molecular de la UNA tres años después, son claro ejemplo del enorme interés suscitado en las universidades principales del país. Se ha calculado que existen unas 150-200 personas ligadas al tema de la Biotecnología, de los cuales entre 25-30 son investigadores de las universidades. El presupuesto anual de estos grupos oscila entre 20-50 mil dólares. Lamentablemente, estas iniciativas son apenas esfuerzos aislados surgidos por iniciativa de investigadores entusiastas, pero que carecen del respaldo financiero continuo del gobierno o la empresa privada.

Nichos propicios. Múltiples estudios se han realizado para la caracterización molecular de patógenos tanto de humanos y de importantes cultivos, el desarrollo de métodos moleculares de diagnóstico para enfermedades infecciosas, el uso de marcadores moleculares para identificación humana y su extensión al uso de marcadores para enfermedades hereditarias. En el Cuadro 1 se presenta un muestrario de las líneas de investigación actualmente en desarrollo.

Uno de los sectores de investigación que demanda más desarrollo, dada la base agrícola en que descansa la economía nicaragüense, es la biotecnología agrícola, que incluye la biotecnología de cultivos importantes para la agricultura local. Una meta urgente consiste en desarrollar capacidades de infraestructura y facilitar la transferencia tecnológica y la capacitación de recursos humanos. Dados los problemas serios de plagas y limitantes en la productividad agrícola nacional podrían visualizarse algunos programas de mejoramiento por transgénesis. Los OGMs han demostrado en países como India, China y Brasil todo su potencial para simplificar su manejo y para aumentar significativamente las ganancias económicas, no únicamente del sector privado que los comercializa, sino también de los productores y consumidores. Es importante recalcar que es necesario el desarrollo de estas líneas de investigaciones in situ para la producción de eventos que reúnan las características necesarias para satisfacer las necesidades internas del país. Conociendo nuestros problemas, nuestros especialistas deberían acceder a estas tecnologías para plantear soluciones apropiadas a nuestra realidad. Por otra parte, la selección asistida por marcadores moleculares puede ser implementada para mejorar ciertos rasgos de interés agroindustrial en cultivos vegetales y en animales.

Dentro del área de biotecnología ambiental, ya se están dando los pasos necesarios para el desarrollo de técnicas de bioremediación, la utilización de plantas, bacterias, hongos u otros organismos vivos para la limpieza de ambientes contaminados. Esta es otra área que, sin duda, tendrá un desarrollo acelerado durante las próximas décadas.

Otras dos líneas de investigación interesantes, dada la gran biodiversidad con que cuenta el país, son la bioprospección de compuestos de interés industrial y médico, y la caracterización de la biodiversidad usando técnicas moleculares. La identificación de especies de insectos, plantas y/o animales endógenos de Nicaragua o la región pueden conllevar por interés comercial, académico o de conservación, al desarrollo de iniciativas para la secuenciación de genomas específicos, para su utilización.


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El desarrollo de infraestructura de investigación en la región para la secuenciación de genomas de importancia nacional o regional conllevará al desarrollo de otro grupo de áreas de investigación que serán fundamentales para el avance de ciencia en Nicaragua. Tanto la Genómica, con todas sus denominaciones: funcional, comparativa, evolutiva, computacional, así como la proteómica y la bioinformática tendrán gran oportunidad desarrollo, siendo esta última la de más fácil acceso a la comunidad científica nacional debido a que no se necesita mucha inversión para su desarrollo, puesto que todos los procesos son realizados in sílico. Además, hay que considerar que una ventaja adicional es que se cuenta ya con un buen número de jóvenes expertos en informática y no costaría mucho entrenarlos en bioinformática.

Transferencia Tecnológica y Comercialización. Es importante hacer énfasis en que el desarrollo de la transferencia de tecnologías y aplicaciones de la ciencia tienen que ir a la par del desarrollo de la investigación y ciencia básica. La generación de conocimiento y el estudio meramente académico, aunque no genera dividendos a corto plazo, es sumamente necesaria para fomentar la creación de una base científica sólida y para que, a largo plazo, la ciencia nicaragüense se transforme de receptora en transmisora y generadora de información y tecnologías. Las áreas básicas de genética, biología del desarrollo y biomedicina deberán ser priorizadas y su avance se verá acelerado cuando se tenga identificado un número selecto de organismos modelo propios del país o la región. Tal es el caso del maíz, cuyo genoma lo han venido trabajando, en parte, grupos norteamericanos y mexicanos.

Un área que dará inicio cuando se establezca la base en ciertas áreas de investigación y ciencia será la de “bioemprendedurismo”. Surgirán investigadores que, a través de sus proyectos, pueden iniciar independientemente, o formando alianzas estratégicas con profesionales de otras áreas, el desarrollo de empresas biotecnológicas. A la fecha no existen empresas que realicen investigación en biotecnología. Estas empresas proveerían no solamente de empleos, sino también aumentarían el nivel económico del país y la región. En países desarrollados, el capital de negocio generado por las empresas biotecnológicas es multimillonario.

A la par del desarrollo investigativo y empresarial, el desarrollo de una educación científica en todos sus niveles tiene que ser consolidado. La introducción temprana de ciencia, sus aplicaciones y avances, dentro del currículo en las escuelas primarias y secundarias debe de ser una prioridad. A nivel de universidades, tiene que irse gestando el desarrollo de programas nacionales de postgrados, maestrías y doctorados.

Coordinación y Liderazgo. Hace falta una cohesión de los grupos de investigadores y, más que crear nuevos grupos e institutos, convendría concentrar esfuerzos en la consolidación de los ya existentes. La planeación de nuevos proyectos con fondos de la cooperación internacional debería tomar en cuenta la participación de varios grupos a la vez de integrar a los productores y beneficiarios. Para el desarrollo de todas estas áreas y líneas de investigación, es necesario un trabajo organizado y sinérgico entre los miembros de la comunidad científica nacional.

Dando un paso para la creación de estas condiciones, un grupo de científicos tuvieron la


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iniciativa de crear la Sociedad Científica Nicaragüense (4), que se convirtió en un núcleo de conexión de los científicos nacionales y extranjeros interesados en el avance de la ciencia nicaragüense. Esta organización independiente y sin fines de lucro promoverá el desarrollo de la investigación y la educación científica en el país (5). Mediante iniciativas como ésta, se pretende crear una plataforma para la optimización de los recursos presentes en el país, a la vez que se busca promover el diálogo entre todos los sectores que son partes fundamentales para mejorar el estado de la ciencia, causando un impacto positivo en el estado socio-económico de Nicaragua. Al organizar al gremio de científicos, se podrá elaborar una agenda (plan estratégico nacional) en ciencia y tecnología con subprogramas en sectores prioritarios como el de biotecnología.

La participación multidisciplinaria e intersectorial será de fundamental importancia. El triángulo de vinculación y alianzas entre el sector privado, el sector gobierno y el sector académico es clave para el desarrollo de la investigación y la educación científica, al igual que para el desarrollo de una agenda nacional en dichas áreas. Eventos como los Congresos Nicaragüenses de Biotecnología representan un espacio propicio para el debate sobre las políticas y estrategias de desarrollo sectorial. Mientras más divulgación del quehacer científico, tanto al público en general como a los sectores privado y gobierno haya, más clara será la visión de la necesidad profunda que tiene la sociedad nicaragüense del auge en ciencia y tecnología. Asimismo, esto contribuiría a una mejor comprensión del público y facilitaría la participación ciudadana en el debate sobre diversas temáticas.

Ha sido un consenso de la comunidad interesada en la biotecnología que, para que este sector pueda tener un impacto duradero, hace falta trazar políticas científicas respecto al tema de la biotecnología, que promuevan la superación del recurso humano existente; políticas de estímulo y soporte, con fondos competitivos para el avance de investigaciones de alta prioridad e interés nacional; políticas que permitan la creación de oficinas que promuevan la educación continua de científicos jóvenes. Estos jóvenes formarían una necesaria masa crítica de pensadores que podrían llegar a concretar metas cada vez mayores y promoverían la consolidación de la ciencia Nicaragüense.

En el Cuadro 2 se resumen algunas de las principales necesidades y limitaciones que actualmente afronta el sector biotecnológico del país. Un plan nacional de biotecnología como el planteado por los asistentes del tercer Congreso deberá transformar estas dificultades en metas y objetivos prácticos. El que estas metas lleguen a ser realidad es responsabilidad de múltiples sectores y de la capacidad de integración que éstos generen. Las tendencias de la biotecnología en Nicaragua, según se desprende de los trabajos de los investigadores nacionales aquí discutidos, apuntan hacia un posible impacto sólido en lo económico y social, en la investigación básica y la educación científica. La loable tarea de estos grupos de investigación es digna de ser estimulada •


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Agradecimientos

El Centro de Biología Molecular de la UCA agradece el apoyo continuo de la Fundación y compañía New England Biolabs, Inc. Especial agradecimiento a Regina Lacayo del PAIT-MIFIC y Silvia Montano de la Fundación Pew Charitable Trusts.

Notas

1 Este artículo está basado en las Memorias de los tres Congresos Nicaragüenses de Biotecnología.

Referencias bibliogràficas

-Memorias del Primer Congreso Nicaragüense de Biotecnología, UCA (2002)-Memorias del Segundo Congreso Nicaragüense de Biotecnología, UCA (2004)-Memorias del Tercer Congreso Nicaragüense de Biotecnología, UCA (2006)-HUETE-PÉREZ, J. A., (2006). “New scientific society in Nicaragua”. Science, Jun 2; 312 (5778) -HUETE-PÉREZ, J. A. & OROZCO-GONZÁLEZ, D. (2001). “Percepciones sobre biotecnología en Nicaragua”. Encuentro 58: 83-90.


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Encuentro 2006/ Año XXXVIII, N°75 20-32

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Encuentro

Aplicaciones de la biología molecular en la acuicultura

Eduardo Flores Coca1 1. Investigador del Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos (CIDEA-UCA). Apto. 69. Managua, Nicaragua. E-mail: efcoca@

ns.uca.edu.ni

Recibido: agosto 2006 / Aceptado: octubre 2006

LA BIOTECNOLOGÍA ES UNA ESPECIALIDAD RECIENTE. A mediados de los años 80 se logró aplicar la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa como herramienta eficaz en la investigación científica. En la acuicultura, las herramientas moleculares se aplican en la investigación de nuevas especies útiles para el consumo, en investigaciones de determinación de relaciones filogenéticas de diferentes especies, para el mejoramiento genético de los organismos de cultivo como peces, camarones y algunos moluscos; además, en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades de los organismos acuáticos, pues también sirven como herramientas de diagnóstico eficaces y rápidas. En la actualidad, se utilizan sondas genéticas para hibridación in situ, para dot blot y diferentes tipos de PCR para detección de virus en organismos de cultivo. En el Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos de la Universidad Centroamericana (UCA), se aplican técnicas moleculares para la detección de los virus WSSV, TSV, YHV e IHHNV y de la bacteria que produce NHP. Entre 2003 y 2004, se realizó un trabajo de monitoreo de los virus WSSV, TSV e IHHNV en los camarones silvestres del Estero Real y se determinó que la prevalencia en la época lluviosa fue de 1.97% para WSSV, 8.55% para TSV y 16.45% para IHHNV; en la época seca, la prevalencia fue de 15.33 %para WSSV, 13.33% para TSV y 0.67% para IHHNV. La prevalencia total en todo el año de WSSV es de 8.67%, 11% para TSV y 8.67% para IHHNV. Finalmente, el total de prevalencia en todo el año, sumando los tres virus, es de 28.33%.

Palabras clave: acuicultura-investigación / mejoramiento de las especies-investigación / polimerización

Introducción

La Biotecnología, entendida como la aplicación en procesos industriales de organismos vivos o parte de ellos para la producción de bienes, es antigua en términos históricos. Pero como especialidad de las Ciencias Biológicas, sus aplicaciones son más recientes.

Los hallazgos científicos de la segunda mitad del siglo XX dieron el empuje necesario para el desarrollo de la biotecnología como especialidad científica. Como punto de partida, se menciona la definición de la estructura de doble hélice y replicación del ADN


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propuesta por James Watson y Francis Crick en 1953 (Stryer, 1995:80); la composición del código genético propuesto por Crick, Brenner, Nirenberg y otros entre 1961 y 1965 (Stryer, 1995: 100-111); la clonación del ADN en 1973 (Lewin, 1994:51), anticuerpos monoclonales en 1975, secuenciación del ADN y clonación de genes humanos entre 1975 y 1977; aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa en 1984; y la clonación de la oveja Dolly en 1997.

De todos esos hallazgos, el que más aceleró los avances científicos fue la aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), herramienta ideada y aplicada por Kary Mullins a mediados de los años 80, que consiste en multiplicar exponencialmente secuencias específicas de ADN de manera mecánica a partir de un par de secuencias iniciadoras o primers, de una enzima polimerasa termo resistente, sintetizada a partir de una bacteria llamada Thermus acuaticus; y de una mezcla de nucleótidos y mezclas tampón para producir la reacción.

Aplicaciones diagnósticas en la acuicultura

Todas las áreas de la vida humana han sido influidas por esta corriente de avances científicos y la acuicultura es una actividad económica que los ha aprovechado intensamente. Muchas especies adecuadas para consumo humano han sido determinadas a partir de la aplicación de métodos moleculares que contribuyen a determinar los aportes nutricionales de estas especies a la alimentación humana. Recientemente, se aplicaron las técnicas de PCR-RFLP en camarones brasileños para determinar si eran aprovechables comercialmente (Gusmao y Solé-Cava, 2003).

Para la conservación y explotación racional de los recursos marinos, es necesario determinar claramente las especies endémicas de cada región. La aplicación de estudios de relaciones filogenéticas de diferentes especies ha determinado el origen y distribución de una gran cantidad de especies marinas comercialmente explotables, como se refleja en la Ilustración 1, donde se determina las relaciones filogenéticas de algunas especies de carpas en Europa y América del Norte. (Gonzáles, J., 2002).


��Ilustración 1. Relaciones filogenéticas de algunas especies de carpas en Europa y América del Norte.

Las herramientas moleculares se han aplicado en el mejoramiento genético en diferentes organismos acuáticos. Algunos laboratorios productores de larvas de camarón han mejorado genéticamente algunas especies para que soporten las enfermedades, principalmente virales, que les afectan. Esto se consigue aplicando marcadores moleculares para la activación de genes específicos que permiten al organismo superar las infecciones virales, como la producida por el virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) (Curie, D. J., 1994; Hasson, K., 2003).

Ilustración 2. Fotografía donde se muestra el virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) en sus diferentes etapas de infección.

Una de las principales aplicaciones que se da a las herramientas moleculares en acuicultura es en el área de diagnóstico y tratamiento de enfermedades que atacan a los especimenes de cultivo. Esta área es vital en la industria porque la aparición de brotes de enfermedades


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produce enormes pérdidas que merman la producción. Los principales agentes patógenos presentes en la industria son los hongos, bacterias y, principalmente, los virus, sobre los que, en muchos casos, se carece de información y tratamientos (Chu-Fang Lo, 1996; Lightner, D. V. y Pantoja, C. R., 2001).

Entre las técnicas moleculares más aplicadas en la acuicultura se encuentran la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) o amplificación exponencial de secuencias de ADN específicas; Dot Blot, que es la utilización de sondas genéticas específicas que se complementan a sus secuencias homólogas de ADN fijado en membranas, principalmente nitrocelulosa; e Hibridación in situ, que es también el uso de sondas genéticas, pero en este caso fijadas en el tejido infectado propiamente dicho, tratado previamente con técnicas histológicas (Lightner, D. V., 1996).

Ilustración 3. La Hibridación in situ utiliza sondas genéticas marcadas con anticuerpos que, al ser revelados, permiten observar los antígenos marcados con Dioxigenina.

Ilustración 4. En la técnica Dot Blot, el ADN molde se fija en una membrana, generalmente de nitrocelulosa, en la que se aplica la sonda genética y los anticuerpos marcados con dioxigenina.


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En la camaronicultura, estas herramientas se usan ampliamente para el diagnóstico de patógenos bacteriológicos y virales: bacterias del tipo ricketsia y virus como el del Síndrome de la Macha Blanca, Síndrome de Taura (TSV), Cabeza Amarilla (YHV) y el virus de la Necrosis Muscular Infecciosa o Mionecrosis IMN.

La diferencia en la aplicación de estas técnicas en las labores de diagnóstico está en la sensibilidad y el tiempo para emitir resultados. Está comprobado que la aplicación del PCR para el diagnóstico de patógenos garantiza una mayor sensibilidad en la detección, porque se identifican cantidades más pequeñas de partículas infecciosas por unidad de análisis, en comparación con las anteriores técnicas de diagnóstico. Está debidamente comprobado que el PCR tiene la ventaja que se puede tener resultados en menos tiempo que con las otras técnicas descritas.

La aplicación del diagnóstico de patógenos a tiempo ha disminuido drásticamente las pérdidas por mortalidades y ha aumentado la producción de organismos de cultivo.

En la actualidad, en el Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos de la UCA, se aplica el diagnóstico molecular de los Virus del Síndrome de la Macha Blanca (WSSV), Virus del Síndrome de Taura (TSV), Virus de la Necrosis Hematopoyética e Hipodermal Infecciosa (IHHNV), Virus de la Cabeza Amarilla (YHV) y de la bacteria tipo ricketsia que produce la Hepatopancratitis Necrotizante (NHP). Todos estos análisis han sido debidamente validados, confirmando la repetibilidad, exactitud y robustez de los resultados, además de la pureza de los reactivos que se utilizan, con lo que se logra que estos análisis sean acreditados con la Norma Técnica Nicaragüense, homóloga de la Norma Internacional ISO 17025. Con esto, se provee a los acuicultores nicaragüenses, de diagnósticos moleculares confiables y de laboratorios debidamente acreditados.

Herramientas moleculares en la investigación acuícola

La investigación científica es determinante para el desarrollo de la acuicultura y la aplicación de herramientas moleculares está ampliamente difundida.

Los temas de investigación son muy amplios. Incluyen genética de poblaciones, mejoramiento genético, modificaciones genéticas de organismos para garantizar resistencia a enfermedades y patógenos específicos, y producción de vacunas, medicamentos o métodos de diagnóstico rápidos, sensibles y sencillos.


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��Ilustración 5. En los laboratorios del CIDEA-UCA, se aplican técnicas moleculares para la detección rápida de virus que afectan a la industria del camarón en Nicaragua.

En Nicaragua, el estado no tiene políticas ni estrategias para desarrollar la acuicultura. Por lo tanto, tampoco desarrolla los esfuerzos necesarios de investigación. Por lo tanto, estos esfuerzos se realizan por particulares, sean instituciones o empresas. La consecuencia es que hay muy pocos investigadores y muy pocas investigaciones.

En los años 2003 y 2004, se hizo una investigación cuyos resultados han ayudado a la industria acuícola a prevenir las principales enfermedades que atacan al camarón. Los resultados de esa investigación se presentan a continuación.

El tema de la investigación es “Monitoreo de los virus WSSV, TSV e IHHNV en camarones pendidos silvestres de Puerto Morazán en época seca y época lluviosa de los años 2003 y 2004”. El trabajo se llevó a cabo entre las temporadas secas y lluviosas de los años 2003 y 2004, con camarones silvestres que se distribuyen en la zona camaronera de Puerto Morazán, ubicada en el centro del Estero Real, la principal zona de producción camaronera de Nicaragua y Honduras.

Los sistemas estuarinos como el Estro Real son importantes para gran número de especies marinas, entre ellas los camarones Litopenaeus que son el objeto de estudio, y las especies de cultivo en Nicaragua. Después de que los camarones adultos copulan y desovan, arrojan los huevos en mar abierto; cuando eclosionan, pasan unas tres semanas en aguas oceánicas; para continuar su desarrollo, las larvas alcanzan los sistemas estuarinos que sirven como áreas de crianza para muchas especies marinas, ya que las raíces de los árboles en el manglar les protegen y proporcionan abundante alimento. Los camarones permanecen dentro o cerca de los sistemas estuarinos hasta alcanzar la talla de 4 a 10 cm (Martínez Córdova, 1999).


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Ilustración 6. Ubicación del punto de muestreo en Puerto Morazán, Estero Real.(SIG-CIDEA, 2005).

Se monitorearon tres virus: el Virus del Síndrome de Mancha Blanca (WSSV), que es un baculovirus de ADN de cadena doble, clasificado como Nimaviridae; el Virus del Síndrome de Taura, que es un virus icosahedrico de ARN de una sola hebra lineal positiva, clasificado como Picornaviridae; y el Virus de la Necrosis Hematopoyética e Hipodermal Infecciosa, que es un virus icosahedrico de ADN de una cadena lineal, clasificado como Parvoviridae.

Para este estudio se recolectaron 150 muestras en cada una de las estaciones climáticas y se calculó la prevalencia de cada uno de los tres virus estudiados en cada muestra y estación climática. La prevalencia se calcula de esta manera: P= (Nº de individuos afectados/Nº total de individuos)*100 (Lightner, 1996).

Durante la toma de muestras, se utilizaron artes de pesca como atarrayas, chayos, tinas plásticas, coladores y panas. La colecta se hizo en diferentes puntos de la ribera del río en el poblado de Puerto Morazán. Las muestras vivas se identificaron y se fijaron en etanol 95% en una proporción de 1:10 de tejido contra fijador, se rotularon debidamente y se enviaron al laboratorio.

Para los análisis de los virus se usaron los kit de reactivos siguientes:• Para el virus WSSV, se usó el kit IQ-2000 (Manual, 2002).• Para el Virus TSV, se usó el kit IQ-2000 (Manual, 2003).• Para el Virus IHHNV, se usó el kit IQ-2000 (Manual, 2002).

Los resultados para cada prueba, son los siguientes:


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Para WSSV

Los resultados positivos y negativo se aprecian en la Ilustración 7:

Ilustración 7. Foto del gel de agarosa 2% con todos los resultados posibles del análisis del Virus de Mancha Blanca.

Simbología: Línea 1 Positivo Severo WSSV; Línea 2 Positivo Medio WSSV; Línea 3 Positivo Leve WSSV; Línea 4 Positivo Muy Leve Línea 5 Negativo; Línea 6 ddH20; Línea 7 Std. 103; Línea 8 Std. 102; Línea 9 Std. 101; M: Marcador

Las muestras positivas presentan bandas de ADN de 296 pb únicamente, o bien 296 pb y 550 pb; también pueden presentar bandas de 296 pb, 550 pb y 910 pb, como se aprecia en las líneas 1, 2 y 3 de la Ilustración 7.

Las muestras negativas presentan una banda de ADN de 848 pb, correspondiente al ADN del genoma del camarón, como se aprecia en la línea 5 de la Ilustración 7.

Para TSV

Los resultados positivos y negativo se aprecian en la Ilustración 8:

Ilustración 8. Foto del gel de agarosa 2% con todos los resultados posibles del análisis del Virus Taura.

-848 pb-630 pb

-333 pb

-848 pb-630 pb-333 pb


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Simbología: Línea 1 positivo IHHNV; Línea 2 pos medio IHHNV; Línea 3 pos leve IHHNV; Línea 4 negativo; Línea 5 ddH2O; Línea 6 Std 103; Línea 7 Std 102; Línea 8 Std 101; M: MarcadorLas muestras con bandas de ADN de 284 pb y 476 pb son positivas; las muestras con bandas de ADN de 284 pb son positivas. Como se aprecia en las líneas 1, 2 y 3 de la Ilustración 8, y las muestras con bandas de ADN de 680 pb, son negativas, correspondiente al ADN del genoma del camarón como se aprecia en la línea 4 de la Ilustración 8.

Para IHHNVLos resultados positivos y negativo se aprecian en la Ilustración 9:

Ilustración 9. Foto del gel de agarosa 2% con todos los resultados posibles del análisis de IHHNV.

Simbologìa: Línea 1 Severo TSV; Línea 2 Medio TSV; Línea 3 Leve TSV; Línea 4 NegativoLínea 5 Std 103; Línea 6 Std 102; Línea 7 Std 101 ; Línea 8 control +; Línea 9 ddH20M: Marcador

Las muestras positivas presentan bandas de 438 pb o bandas de 438 pb y 644 pb. Como se aprecia en las líneas 1, 2 y 3 de la Ilustración 9, las muestras negativas presentan bandas de 243 pb. Correspondiente al ADN del genoma del camarón como se aprecia en la línea 4 de la Ilustración 9.

Resultados

En la época de lluvia, las muestras positivas para WSSV fueron 3 para una prevalencia de 1.97%; las muestras positivas de TSV fueron 13 para una prevalencia de 8.55%; y las muestras positivas de IHHNV fueron 25 para una prevalencia de 16.45% (Cuadro 1).

Cuadro 1. Número de muestras positivas y prevalencia de los tres virus en la época lluviosa.

-848 pb-630 pb-333 pb


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La prevalencia total de los tres virus en la época lluviosa fue de 27.33 %.

Ilustración 10. Prevalencia en época lluviosa.

En la época seca las muestras positivas para WSSV fueron 23 para una prevalencia de 15.33 %; las muestras positivas de TSV fueron 20 para una prevalencia de 13.33%; y las muestras positivas de IHHNV fue 1 para una prevalencia de 0.67% (Cuadro 2).

Cuadro 2. Número de muestras positivas y prevalencia de los tres virus en la época seca.

La prevalencia total de los tres virus en la época seca fue de 29.33%

Ilustración 11. Prevalencia en época seca.


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El total de muestras positivas para WSSV en ambos períodos fue de 26 para una prevalencia de 8.67%; el total de muestras positivas para TSV en ambos períodos fue de 33 para una prevalencia de 11 %; y el total de muestras positivas para IHHNV en ambos períodos fue de 26 para una prevalencia de 8.67%.

La prevalencia total de los tres virus en los camarones silvestres en ambos períodos estudiados fue de 28.33%, resultando un total de 85 muestras infectadas con alguno de los tres virus de las 300 recolectadas.

Ilustración 12. Prevalencia en ambas épocas del año y prevalencia total.

Discusión

Los resultados demuestran que los tres virus estudiados, -Virus del Síndrome de la Mancha Blanca, Virus del Síndrome de Taura y Virus de la Necrosis Hematopoyética e Hipodermal Infecciosa-, están presentes en los camarones pendidos silvestres que se mueven en las aguas del Estero Real. Esto es una amenaza permanente de brotes epidémicos de cualquiera de esas enfermedades en las granjas camaroneras asentadas en ese cuerpo de agua, teniendo en cuenta que hay un 28.33% de prevalencia de los tres virus en todo el año.

Las estaciones lluviosa y seca manifestaron comportamientos diferenciados en la prevalencia de los virus en los camarones pendidos silvestres. El virus de IHHNV aparece de manera más frecuente en la época lluviosa y, en segundo lugar, el virus TSV. En cambio, en la época seca,


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se manifiesta de manera más frecuente el virus WSSV seguido del virus TSV. Esto podría explicar la presencia de brotes en las granjas en algunas épocas del año. Las causas de este comportamiento no se investigaron en este trabajo, por lo que es necesario encontrar la explicación en trabajos futuros.

El virus TSV es el que más prevalencia presentó en promedio en ambas épocas: su prevalencia fue mayor del 10%, lo que puede explicarse porque este virus tiene más tiempo de haberse asentado en el país. Esto explicaría por qué en las granjas camaroneras se dan brotes epidémicos durante todo el año, si no se aplican las medidas de bioseguridad adecuadas.

Las autoridades reguladoras de la actividad acuícola deben tener en cuenta las regulaciones fitosanitarias necesarias para evitar la aparición de brotes epidémicos en las granjas camaroneras, producto de malas prácticas de manejo. Estas medidas deberán incluir los análisis de laboratorio de manera obligatoria de estos tres virus (actualmente se exige para WSSV y TSV) a todas las postlarvas que se vayan a sembrar, tanto silvestres como de laboratorio, porque alguno de estos virus no presentan altas mortalidades necesariamente y, por lo tanto, las postlarvas pueden ser portadoras de dichos patógenos. Esto es necesario porque la prevalencia total de los tres virus durante todo el año, que es de 28.33%, es alta para organismos silvestres y demuestra que hay un gran potencial para que se produzcan brotes epidémicos.

Es necesario realizar estudios similares en todo el cuerpo de agua del Estero Real durante varias temporadas consecutivas para tener más clara la situación de los organismos silvestres. Asimismo, elaborar un plan de manejo adecuado para ese cuerpo de agua con el fin de evitar que la fauna marina de crustáceos disminuya drásticamente a consecuencia de brotes de enfermedades virales y asociadas.

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Encuentro

Insectos plagas y benéficos asociados al cultivo de mora

(Rubus glaucus, benth) en La Sabana, Madriz, Nicaragua

Edgardo Jiménez-Martínez1, Fernando Amador Martínez2 y Norlan Tijerino Cantillano2 1 Investigador y especialista en entomología, Universidad Nacional Agraria (UNA), Managua, Nicaragua. Km 12½ Carretera Norte.

E-mail: [email protected], Telefax. 263-2609.2 Investigador agrícola en Protección Agrícola y Forestal. Universidad Nacional Agraria (UNA). Managua, Nicaragua.

Recibido: agosto, 2006 / Aceptado: octubre, 2006

LA MORA (RUBUS GLAUCUS, BENTH) ES UNA PLANTA en proceso de domesticación que se cultiva en pequeñas parcelas. Es hospedera de muchos insectos plaga y enfermedades. En Nicaragua se establecieron plantaciones de mora desde hace unos tres años, como alternativa de diversificación de fincas cafetaleras en los departamentos de Madriz y Nueva Segovia. Hasta ahora no hay información formal sobre los principales insectos plaga y benéficos presentes en este cultivo, que está tomando gran importancia. Por ello, se hizo una investigación para describir la fluctuación poblacional de los insectos plaga y sus depredadores naturales, asociados a este cultivo. El estudio se realizó en la finca La Patasta, municipio La Sabana, departamento de Madriz, entre septiembre de 2004 y abril de 2005. El monitoreo se realizó semanalmente en cinco sitios específicos, mediante capturas manuales de especimenes, con ayuda de bolsas de plástico y vasos de vidrio con alcohol. Como resultado, se identificó y describió la fluctuación poblacional de insectos de las principales familias Scarabaeidae, Chrysomelidae, Curculionidae, Cantharidae, y de los órdenes Hemíptero (Cicadellidae, Pentatomidae, Miridae) y Orthóptero (Acrididae y Tettigonidae). Igualmente, se identificó y describió la fluctuación poblacional de depredadores naturales de insectos de la familia Staphilinidae, Coccinelidae, Vespidae y Aracnidae, presentes en este cultivo.

Palabras clave: plagas agrícolas-investigaciones / mora-cultivo-Sabana, Madriz (Nicaragua) / insectos alimentación y alimentos

Introducción

La mora es una planta que pertenece a la familia Rosaceae y al género Rubus Spp., pariente muy cercano a la frambuesa (Picha, 2003). La mora de castilla (Rubus glaucus) fue descubierta por Hartw y descrita por Benth. Es originaria de las zonas altas tropicales


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de América; se cultiva principalmente en el Ecuador, Colombia, Panamá, El Salvador, Honduras, Guatemala, México y los Estados Unidos (Franco y Giraldo, 1999).

La mora, en América del Norte, es cultivada en Oregón, Washington, British Columbia, California, Michigan y Texas. Casi toda la mora cultivada en el Pacífico Noroeste (Oregón, Washington, British, Columbia), se vende a los procesadores como fruta congelada para la fabricación de gelatinas, jaleas, conservas, jugos, compotas, néctares y concentrados (Picha, 2003).

En la actualidad, en Nicaragua hay plantaciones establecidas desde hace aproximadamente unos tres años, en zonas altas de los departamentos de Madriz y Nueva Segovia. Según información de la FAO, la producción mundial de mora alcanzó las 260.000 toneladas en 1996. Europa produce el 67.4% del total mundial, siendo Alemania el principal productor con el 31.9%, seguido de Polonia con el 16.2%, Rusia con el 13.5%, Checoslovaquia con el 5.8%. En el Continente americano, destacan Colombia con el 15.4%, Estados Unidos con el 5.4%, Chile con el 3.5% y otros países, que suman un 6.3%. La producción centroamericana de mora encuentra su principal mercado es Estados Unidos, donde el consumo per cápita ha crecido desde un promedio de 0.05 libra en los años 80 a 0.11 libra durante los últimos tres años. Las importaciones provienen de Chile, con 54%; México, con 18.2%; y Guatemala, con 19%. Estos países han desplazado las importaciones procedentes de Yugoslavia y Canadá (IICA, 1999).

Económicamente, la mora es una de las frutas más valiosas cultivadas en el mundo entero: el valor de su producción, para los productores de los Estados Unidos y Canadá, puede variar entre $ 2,000 hasta más de $ 20,000/ha.

El rendimiento de mora, para Guatemala, es de 10,000 lbs de fruta por manzana (Picha, 2003). Técnicos del organismo no gubernamental Instituto de Promoción Humana (INPRHU) en Nicaragua, informan que los productores de la zona alta de la Sabana, Madriz, obtienen rendimientos de 17,500 libras de fruta por manzana, y se vende a 0.59 dólares la libra en el mercado local.

A pesar de la poca experiencia que se tiene con el cultivo de mora, los productores de la zona alta de La Sabana, Madriz, han mostrado interés en cultivarla por sus beneficios: es rica en vitamina “C”, tiene alto contenido de agua y excelente sabor, además de ser una fuente de ingreso económico alternativo y de diversificación de las fincas cafetaleras de la Sabana. Por todo ello, puede tener un gran potencial de explotación en el futuro (Gutiérrez, Y., 2005, comunicación personal).

Sin embargo, la mora no es fácil de cultivar, pues la atacan muchos insectos y enfermedades que afectan su desarrollo y reducen de manera sustancial el rendimiento, haciendo la explotación del cultivo poco rentable. Según productores de mora de La Sabana, se han encontrado plagas y enfermedades asociadas al cultivo de mora tales como: picudos (Anthonomus spp), afidos (Aphis spp), mosca de la fruta (Anastrepha spp), gallina ciega (Phyllophaga spp) y chinches chupadores (Hemípteros) (Sánchez, H., 2005, comunicación personal).


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Picha (2003) reporta que, en Honduras, las principales plagas del cultivo de mora son: gorgojos (Otiorhynchus sp.), palomilla de la frambuesa (Lampronia sp), escarabajo de la frambuesa (Byturus sp.), saltahojas (Macropsis sp.), ácaros (Phyllocoptes sp.), afidos (Amphorophoras sp. y Aphis sp.), vaquitas (Diabroticas sp.) y chinches chupadoras (Hemípteros) entre otros. Franco y Giraldo (1999) reportan que en Colombia las plagas más comunes en el cultivo de mora son: perla de la tierna (Margarodes sp), barrenador del cuello de la planta (Zascelis sp), pasador de raíces, tallos y ramas (Hepialus sp), gusano Santamaría (Antarctia sp), la burrita de la virgen (Compsus sp), áfidos o pulgones (Aphis sp), arañita roja (Tetranychus sp), mosca de la fruta (Anastrepha spp), chinches chupadoras de hojas y frutos, trips o bichos de candela (Thrips sp) y cucarroncitos de follaje.

Debido a la crisis económica y social por la que atraviesan los sectores productivos de Nicaragua y, concretamente los productores cafetaleros de La Sabana, es necesario diversificar los cultivos con otros que sean complementarios al café, como la mora (Rubus glaucus, Benth), que ha sido introducido e impulsado por las organizaciones no gubernamentales (ONGs) Auxilio Mundial e INPRHU en las zonas altas de dicho Municipio.

Considerando la problemática por la que atraviesan los sectores productivos de Nicaragua y en especial los productores de este Municipio, es necesario conocer las principales plagas insectiles que se asocian a este cultivo, ya que no se conoce hasta la fecha un reporte oficial científico que informe sobre taxonomía, dinámica e incidencia de plagas del cultivo para determinar el verdadero papel de estos organismos en este cultivo y optar a estrategias de manejo más eficientes y sostenibles. El objetivo de este estudio es identificar y describir la fluctuación poblacional de las principales familias de insectos plaga y benéficos asociados al cultivo de mora.

Materiales y métodos

Ubicación del estudioLa investigación se llevó a cabo en la finca La Patasta, municipio de La Sabana, departamento de Madriz, entre septiembre de 2004 y abril de 2005, en dos parcelas de mora ya establecidas por el organismo no gubernamental AUXILIO MUNDIAL. El estudio consistió, en la realización de un monitoreo, recolectando muestras en sitios específicos mediante capturas manuales.

El municipio de La Sabana, Madriz El Municipio de La Sabana se encuentra en las coordenadas 13°20' latitud norte y 86°17' longitud oeste; cuenta con una extensión territorial de 69 kms2, y con 4,732 habitantes, de los que el 80.5% habitan en el área rural, y el 19.5% en el casco urbano. El Municipio se encuentra a una altura de 1,260 hasta 1,500 msnm. El clima se caracteriza por ser tropical seco, con temperaturas promedio de 26-27 oC, con precipitaciones entre 1,200 a 1,400 mm anuales, y una humedad relativa promedio anual de 90 a 100%. Los suelos son areno-arcillosos y pedregosos, pendientes de 20 a 50%, con un average de pendiente agudo de 35%.

El Municipio cuenta con una vegetación variada por las características semi-húmedas del territorio: árboles de pino, guácimo, café, roble, eucalipto, carbón y cedro, entre otros. La


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fauna de este Municipio incluye venados, palomas, cusucos, conejos, zopilotes, zanates, gatos de monte, tigres, garrobos y mapachines (municipios).

Actividades socioeconómicas del departamento de MadrizLas principales actividades económicas del Departamento son: forestales, agrícolas, pecuarias, trabajos artesanales, semi-industriales y de patio: crianza de aves, cerdos, etc., esta última desarrollada principalmente por mujeres (municipios).

Selección y descripción del sitio de muestreo de plagas insectilesSe seleccionó el municipio de La Sabana porque es ahí donde el cultivo de mora fue introducido e impulsado por las ONGs Auxilio Mundial e INPRHU como una alternativa para la diversificación productiva y económica complementaria al café; además, este Municipio presenta las mejores condiciones edafo-climáticas para el establecimiento y desarrollo del cultivo; por último, presenta las áreas sembradas de mora más importantes. Para el establecimiento del monitoreo se realizó un recorrido general de la zona o del área de estudio en el municipio de La Sabana, en conjunto con los técnicos de los organismos antes mencionados. Posteriormente, se escogieron dos parcelas ubicadas en la finca experimental La Patasta, a las que en todo el trabajo se denominará Parcela 1 (Patasta Arriba) y Parcela 2 (Patasta Abajo). De igual forma, en las Parcelas 1 y 2 se seleccionaron cinco sitios específicos; cada sitio con 10 plantas que se tomaban como punto fijo de muestreo.

Descripción de la Parcela 1 (Patasta Arriba)

La Parcela 1 se ubica a 1500 msnm, y tiene una extensión de 14x45 m con de 2 m de ancho por 1.5 m entre plantas, para un total de 210 plantas, cuya edad de seis meses: se encontraba en su primera cosecha al momento del estudio. Alrededor de la parcela, se cultivan frambuesa, durazno y pasto Taiwán, utilizado como cortina rompe viento, seguido de una vegetación densa de árboles de diferentes especies como: guanacaste, madroño, cedro y roble, entre otros.

Descripción de la Parcela 2 (Patasta Abajo)

La Parcela 2 se encuentra a una altura de 1356 msnm y tiene una extensión de 30x60m, con una distancia poblacional de 2 m entre surcos por 1.5 m entre plantas, para un total de 600 plantas de tres años. A esta plantación se le extrajo material vegetativo para reproducir aproximadamente 10,000 plantas.

Monitoreo y colectas de muestras de insectos en el campo

El monitoreo se realizó semanalmente entre agosto 2004 a abril 2005. La toma de muestras de insectos se realizó capturando el espécimen de forma manual. Posteriormente, se depositaron en vasos de cristal de 10 cm., a los que se agregó alcohol al 75%. Los vasos con las muestras de insectos se rotularon con la fecha, el sitio y el número de parcela donde se recolectaron. Para evitar equivocaciones al momento de la colecta y procesamiento de los insectos, la etiqueta de los vasos no debía contener ninguna otra información a la previamente señalada. Una vez terminada la colecta de los insectos, se depositaban en un termo para


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llevarlos al Laboratorio de Plagas Forestales de la Universidad Nacional Agraria (UNA), donde eran almacenados, preservando las muestras, hasta su posterior identificación.

Procesamiento de muestras e identificación de insectos en el Laboratorio de Plagas Forestales de la UNAEl procesamiento de las muestras consistió en extraer los insectos de los vasos colectores y depositarlos individualmente sobre papel absorbente. Posteriormente, con un pincel se realizó la separación de los insectos capturados. No todos los insectos capturados eran de las mismas parcelas, ni del mismo sitio de recolección, por lo que no se juntaban insectos de vasos diferentes en el mismo papel; de esta manera, se evitaron errores y mezcla de muestras al momento de la identificación.

En la identificación de los especimenes de insectos, se usaron estereoscopios (CARL ZEISS, modelo 475002 y 475002-9902 de 4x, 6.3x y 2.5x), para examinar las características morfológicas de las familias de los insectos colectados. La identificación de los insectos colectados fue únicamente hasta la jerarquía de familia. Para la identificación de estas familias, se hizo utilizaron claves taxonómicas descritas por los siguientes autores: Borror & Triplehorn, 1970; Castaño & Mendoza, 1994; Franco &. Giraldo, 1999; Nunes & Dávila, 2004; Picha, 2003; Saunders, J. Coto, D. King, 1998; Sáenz & Llana, 1990. También se compararon los especimenes recolectados con especimenes de insectos de referencia del Museo Entomológico de la UNA. Posteriormente, estos insectos se montaron en alfileres entomológicos (MORPHO de 3.7 y 4 cm de largo) y se ordenaron en cajas entomológicas. A cada insecto se le pusieron dos etiquetas, la primera con los siguientes datos: País, Municipio, Departamento y colector; la segunda, orden y familia. Por último, los insectos se registraron en la base de datos.

Análisis de los datos

Los datos de cada variable fueron comparadas usando un análisis de varianza (ANDEVA) (PROC GLM en SAS), seguido de un análisis de diferencia mínima significativa (SAS instituto, 1990), si se encontraba diferencia significativa en el ANDEVA. El nivel de Significancia usado en el análisis fue al (P = 0.05).

Resultados

Fluctuación poblacional de insectos Coleópteros de la familia Scarabaeidae, Cantharidae, Chrysomelidae y Curculionidae

Se comparó la fluctuación poblacional de los insectos de la familia Scarabaeidae, Cantharidae, Chrysomelidae y Curculionidae en las parcelas Patasta Arriba y Patasta Abajo en La Sabana, Madriz, en el periodo comprendido desde septiembre 2004 a abril 2005. La fluctuación poblacional de la familia scarabaeidae fue significativamente mayor (P = 0.0174) en la parcela Patasta Arriba que en la parcela Patasta Abajo (Cuadro 1).


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Cuadro 1. Análisis de la fluctuación poblacional de insectos Coleópteros de las familias Scarabaeidae, Cantharidae, Chrysomelidae y Curculionidae encontrados en la finca La Patasta, La Sabana, Madriz, en el periodo comprendido entre septiembre 2004 a abril 2005.

¹ SE = Error estándar.; ² DMS = Diferencia mínima significativa.; * Media seguida por la misma letra no son significativamente diferentes a P < 0.05 ; ** NS = No significativo.

Esta familia de insectos se presentó mayormente entre los meses de septiembre a enero en la parcela Patasta Arriba, encontrándose los mayores picos poblacionales en octubre; en la parcela Patasta Abajo, estos insectos se encontraron solamente entre octubre y diciembre, pero en menores cantidades.

Se comparó la fluctuación poblacional de los insectos de la familia Cantharidae en ambas parcelas muestreadas. Las poblaciones de insectos de esta familia resultaron estadísticamente similares en ambas parcelas (Cuadro 1), aunque los mayores picos poblacionales se dieron en la parcela Patasta Abajo en septiembre, mientras que en la parcela Patasta Arriba, los mayores picos poblacionales se dieron entre octubre y noviembre. Se comparó, también, la fluctuación poblacional de los insectos de la familia Chrysomelidae en ambas parcelas muestreadas. No se encontró diferencia significativa al comparar las poblaciones de estos insectos en ambas parcelas (Cuadro 1), pero los mayores picos poblacionales de esta familia se encontraron entre los meses de febrero a abril.

Familia de insectos Parcela Media ± SE¹ Scarabaeidae Patasta Arriba 19.94 ± 3.39 a Scarabaeidae Patasta Abajo 06.25 ± 1.52 b DMS² 11.08 F; df; P 6.48; 25; 0.0174

Cantharidae Patasta Arriba 03.14 ± 0.65

Cantharidae Patasta Abajo 02.00 ± 0.55 DMS NS F; df; P NS

Chrysomelidae Patasta Arriba 12.28 ± 3.53 Chrysomelidae Patasta Abajo 06.40 ± 1.19 DMS NS F; df; P NS

Curculionidae Patasta Arriba 14.08 ± 3.53

DMS NS F; df; P NS

Curculionidae Patasta Abajo 08.06 ± 2.80


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De igual forma, se comparó la fluctuación poblacional de insectos de la familia Curculionidae, encontrándose que sus poblaciones, en ambas parcelas, resultaron estadísticamente similares (Cuadro 1). Las poblaciones de estos insectos fueron muy similares a las poblaciones de los insectos de la familia Chrysomelidae. Estos Curculionidae tuvieron sus mayores picos poblacionales entre febrero y abril.

Fluctuación poblacional de insectos Hemípteros de las familias Cicadellidae, Pentatomidae y Miridae

Se comparó la fluctuación poblacional de los insectos Hemípteros de las familias Cicadellidae, Pentatomidae y Miridae en las parcelas Patasta Arriba y Patasta Abajo en el periodo muestreado: septiembre 2004 a abril 2005. La fluctuación poblacional de la familia Cicadellidae fue significativamente mayor (P = 0.0060) en la parcela Patasta Abajo que en Patasta Arriba (Cuadro 2). Esta familia de insectos se presentó durante el periodo de muestreo en dos picos poblacionales en la parcela Patasta Abajo. El primer pico poblacional se dio entre octubre y noviembre de 2004; el segundo, entre marzo y abril de 2005. Por el contrario, los insectos de esta familia, se presentaron en menor número durante todo el periodo de muestreo en la parcela Patasta Arriba.

Cuadro 2. Análisis de la fluctuación poblacional de insectos Hemípteros de las familias Cicadellidae, Pentatomidae, Miridae, y Orthóptero encontrados en la finca La Patasta, La Sabana, Madriz, en el periodo comprendido entre septiembre 2004 a abril 2005.

Familia de insectos Parcela Media ± SE¹Cicadellidae Patasta Arriba 04.70 ± 0.74 bCicadellidae Patasta Abajo 18.28 ± 4.50 aDMS 9.45F; df; P 8.45; 39; 0.0060

Pentatomidae Patasta Arriba 02.16 ± 0.34Pentatomidae Patasta Abajo 02.20 ± 0.41DMS NSF; df; P NS

Miridae Patasta Arriba 01.62 ± 0.37Miridae Patasta Abajo 04.53 ± 1.03DMS NSF; df; P NS

F; df; P NSDMS NS

Orthoptera Patasta Abajo 01.50 ± 0.37Orthoptera ³ Patasta Arriba 03.42 ± 0.89


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¹ SE = Error estándar.; ² DMS = Diferencia mínima significativa. ; ³ Orthóptera: Acrididae y Tettigonidae.; * Media seguida por la misma letra no son significativamente diferentes a P < 0.05; ** NS = No significativo.

También se comparó la fluctuación poblacional de los insectos de las familias Pentatomidae y Miridae durante todo el periodo de muestreo. Se encontró que las poblaciones de ambas familias fueron estadísticamente similares en ambas parcelas muestreadas (Cuadro 2). En el caso de la familia Pentatomidae, sus poblaciones se encontraron en casi todas las fechas de muestreo, aunque el mayor pico poblacional fue en febrero de 2005. Las poblaciones de los insectos Miridae se encontraron mayoritariamente entre febrero y abril de 2005.

Fluctuación poblacional de insectos del orden Orthoptera (Acrididae y Tettigonidae)

Se comparó la fluctuación poblacional de insectos del orden Orthoptera (Acrididae y Tettigonidae). Ambas familias fueron totalizadas para su análisis. Las poblaciones de insectos de este orden resultaron estadísticamente similares en ambas parcelas muestreadas (Cuadro 2), donde las poblaciones de estos insectos se encontraron esporádicamente. Los mayores picos poblacionales de estos insectos se encontraron entre septiembre y noviembre de 2004.

Fluctuación poblacional de Depredadores Naturales de las familias Vespidae, Staphilinidae, Coccinelidae y Arácneidae

Se comparó la fluctuación poblacional de los Depredadores Naturales de las familias Vespidae, Staphilinidae, Coccinelidae y Aráneidae en las parcelas Patasta Arriba y Patasta Abajo en La Sabana, Madriz, en el periodo comprendido septiembre 2004 a abril 2005. Se encontró que la fluctuación poblacional de los insectos de la familia Vespidae fue significativamente mayor (P = 0.0037) en La Patasta Abajo que en La Patasta Arriba (Cuadro 3). Esta familia de insectos Hymenópteros fue encontrada mayoritariamente en la parcela Patasta Abajo y sólo en cinco fechas de muestreo fue encontrada en la parcela Patasta Arriba. Los mayores picos poblacionales de estos insectos fueron encontrados en la parcela Patasta Abajo entre septiembre y octubre de 2004.


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Cuadro 3. Análisis de la fluctuación poblacional de Depredadores Naturales de insectos de las familias Vespidae, Staphilinidae, Coccinelidae, Araneidae encontrados en la finca La Patasta, La Sabana, Madriz, en el periodo comprendido entre septiembre 2004 a abril 2005.

¹ SE = Error estándar; ² DMS = Diferencia mínima significativa. ; * Media seguida por la misma letra no son significativamente diferentes a P < 0.05 ; ** NS = No significativo.

Se comparó la fluctuación poblacional de los depredadores de la familia Staphilinidae, Coccinelidae y Arácnidae. Las poblaciones de estas tres familias de artrópodos fueron estadísticamente similares en ambas parcelas muestreadas (Cuadro 3). Las poblaciones de Stahilinidae y Coccinelidae se encontraron mayoritariamente entre enero y abril de 2005. Las poblaciones de arañas se encontraron mayoritariamente en dos periodos del muestreo: entre septiembre y noviembre de 2004; y entre enero y abril de 2005. Entre noviembre de 2004 y enero 2005, las arañas se encontraron solamente en la parcela Patasta Arriba.

Discusión

La mora (Rubus glaucus, Benth) es una planta en proceso de domesticación que se cultiva en pequeñas huertas o parcelas, siendo hospedera de un sin número de insectos plaga y enfermedades. Debido a estos problemas fitosanitarios, se realizó un estudio para conocer e identificar cuáles son las principales familias de insectos plaga e insectos benéficos

Familia de insectos Parcela Media ± SE¹Vespidae Patasta Arriba 01.75 ± 0.21 aVespidae Patasta Abajo 18.28 ± 4.50 b DMS 3.85F; df; P 9.88; 31; 0.0037

Staphilinidae Patasta Arriba 32.96 ± 7.58Staphilinidae Patasta Abajo 12.66 ± 4.45DMS NSF; df; P NS

Coccinelidae Patasta Arriba 01.50 ± 0.37Coccinelidae Patasta Abajo 02.33 ± 0.33DMS NSF; df; P NS

F; df; P NSDMS NS

Araneidae Patasta Abajo 02.30 ± 0.43Araneidae Patasta Arriba 02.00 ± 0.24


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asociados al cultivo de mora en la finca La Patasta, en La Sabana, Madriz.

Se comparó la fluctuación poblacional de los insectos de la familia Scarabaeidae. Estos insectos se encontraron mayormente atacando al cultivo de mora en la época vegetativa y en la época de mayor lluvia (postrera). Se supone que la fluctuación poblacional de estos insectos coincidió en este momento, probablemente debido a que las plantas de mora tenían mayor material vegetativo para alimento de los insectos.

Los insectos de la familia Scarabeidae se pueden introducir con mayor facilidad en el plantío de mora porque se alimentan de estiércol, follaje, raíces, etc. La mayor población de insectos fue encontrada en la parcela Patasta Arriba, posiblemente porque se ubica en la zona más elevada de la finca. Esta parcela cuenta con cortina rompe viento (Taiwán), está contigua a una parcela de frambuesa y cuenta con vegetación arbórea densa en su contorno, por lo que se supone que estos insectos fueron atraídos por la mayor disponibilidad de alimentos y/o nichos ecológicos favorables.

También se comparó la fluctuación poblacional de los insectos de la familia Cantharidae. Estos insectos no fueron encontrados en todas las fechas de muestreo. Su mayor concentración poblacional se presentó entre septiembre y noviembre, coincidiendo con la etapa de floración del cultivo. Probablemente, estos insectos fueron atraídos por la alta disponibilidad de polen y néctares en esta etapa del cultivo. Los Cantharidae son insectos generalmente polinívoros (Sáenz & De la Llana, 1990).

Otras familias de insectos comparadas fueron Chrysomelidae y Curculionidae. Estos insectos se comportaron de manera bastante similar en cuanto a su ocurrencia poblacional: se encontraron en casi todas las fechas de muestro, aunque entre septiembre y enero sus poblaciones fueron bajas. Las poblaciones de insectos crecieron en número desde febrero hasta abril. Se cree que estos insectos prefieren colonizar el cultivo de mora cuando hay flores y frutos. Los insectos de estas familias tienen hábitos alimenticios similares: por lo general, casi todas las especies de estos insectos son fitófagas y en su etapa adulta atacan frutos, tallos hojas, flores y raíces (Andrews & Caballero, 1989).

Otros insectos muestreados y comparados fueron los Hemípteros de las familias Cicadellidae Pentatomidae y Miridae. Los insectos de la familia Cicadellidae y Miridae tuvieron un comportamiento bastante similar. Ambas familias se encontraron en ambas parcelas, aunque en la parcela Patasta Abajo, sus poblaciones fueron un poco más altas. Con respecto a la fluctuación poblacional de estas dos familias, tuvieron sus mayores picos poblacionales entre febrero y abril, cuando el cultivo de mora está en floración y fructificación. Solamente los insectos de la familia Cicadellidae tuvieron otro pico poblacional entre octubre y noviembre, cuando la mora está en pleno desarrollo vegetativo.

Los insectos de la familia Pentatomidae se presentaron mayoritariamente en los meses de enero a abril, coincidiendo con la floración y fructificación del cultivo de mora.

Otros insectos muestreados y comparados fueron los insectos del orden Orthóptero, familias Acrididae y Tettigonidae que, en su mayoría, fueron encontrados esporádicamente en


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ambas parcelas muestreadas, entre septiembre y noviembre, coincidiendo con la etapa de crecimiento vegetativo del cultivo de mora. Se les atribuye esta dinámica debido a que les atrae material vegetativo en crecimiento fresco (brotes tiernos). Casi todas las especies de estos insectos son fitófagos que se alimentan de hojas y tallos de plantas (Nunes & Dávila, 2004).

Algunas familias de depredadores naturales de insectos fueron también comparados: Vespidae, Staphilinidae, Coccinelidae y Arácnidae. Estos depredadores naturales, por lo general, pueden ejercer algún tipo de acción para mantener el balance ecológico en el cultivo de mora. Los insectos de la familia Vespidae se encontraron en mayor número entre septiembre y octubre y, en menor número, entre noviembre y febrero. En estos últimos meses, sus poblaciones fueron esporádicas. Estos insectos se encontraron en época de crecimiento vegetativo del cultivo. Probablemente, en este momento del cultivo, muchos insectos presa tienen su mayor rol como fitoplagas y son presa fácil para insectos como los Vespidae, que juegan un papel importante como especies depredadoras de huevos, larvas y pupas de otros insectos que pueden ser o no dañinos en el cultivo de mora (Sáenz & De la Llana, 1990).

Los insectos de la familia Staphilinidae son, por lo general, depredadores de insectos muy pequeños como mosca blanca, trips y áfidos (Nunes & Dávila, 2004). Estos depredadores se encontraron en casi todas las fechas de muestreo, aunque mayormente en la parcela Patasta Arriba, en cuyos alrededores había mayor disponibilidad de material vegetal y era una parcela de cultivo joven. La fluctuación poblacional de estos insectos empezó baja desde las primeras fechas de muestreo, pero a medida que el muestreo avanzaba, las poblaciones se incrementaron hasta alcanzar los mayores picos poblacionales en los meses de enero a abril, coincidiendo con la época de floración y fructificación del cultivo de mora. En la época de floración es cuando insectos como trips y áfidos tienen una mayor presencia en un cultivo, aunque no hay datos de estos insectos pequeños. Pero sí se observó a los Staphilinidae alimentándose de ellos. Los insectos de la familia Coccinelidae son, por lo general, depredadores de áfidos y mosca blanca (Sáenz & De la Llana, 1990). Estos insectos se encontraron mayoritariamente entre enero y abril, cuando el cultivo está en floración y fructificación, probablemente a consecuencia de a la mayor presencia de presas de áfidos y trips en esta época del cultivo.

Además de comparar las fluctuaciones poblacionales de las familias de insectos arriba mencionadas, también se comparó la fluctuación poblacional de arañas presentes durante el muestreo en el cultivo de mora. Las arañas son, por naturaleza, depredadoras de larvas e insectos inmaduros pequeños. En el caso del cultivo de mora, su número fluctuó durante todo el periodo del muestreo.

No se encontró un patrón específico con respecto a su aparición en el cultivo, pero se observó un mayor número de arañas en la parcela Patasta Arriba. Se presume que esta mayor presencia fue producto de una mayor presencia de material vegetal que, probablemente, atrajo a más presas para estos artrópodos. Se considera que determinar el verdadero papel que juegan los depredadores naturales en el sistema y relacionarlo con los aspectos técnicos, ayudaría a disminuir brotes de plagas y, de está forma, hacer manejos más eficientes y sostenibles.


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Conclusiones

1. Se identificó y describió la ocurrencia poblacional de insectos de la familia Scarabaeidae, Cantharidae, Chrysomelidae, Curculionidae, Cicadellidae, Pentatomidae, Miridae, Acrididae y Tetigonidae.

2. Se identificó y describió la ocurrencia poblacional de los depredadores naturales de las familias Sthapilinidae, Coccinelidae, Vespidae y Aracneidae.

Agradecimiento

Agradecemos de manera muy especial al Dr. Jean Michel Maes por haber tomado las fotos de los insectos y haber colaborado en su identificación; al FAITAN-FUNICA a través del proyecto UNA-FAITAN-MORA por su colaboración económica para que esta investigación se llevara a cabo; a la Universidad Nacional Agraria por su apoyo a la investigación agrícola; al señor Alex Cerrato por su colaboración técnica en la identificación preliminar de los insectos en el Museo Entomológico del DPAF-UNA.


-ANDREWS K. L. y CABALLERO, R. (1989). Guía para el estudio de órdenes y familias de insectos de Centroamérica, Escuela Agrícola Panamericana, El Zamorano, Honduras.-ANTHIA G. A., y TORRES J. F. (1999). Manejo post-cosecha de la mora, Programa post-cosecha, convenio SENA-Reino Unido, CD-ROM.-AGRIOS, G. N., (2004). Fitopatología, México, 2ª ed..-ALFARO, E. J., y LAZO U. J. (2005). Insectos descortezadores y fauna insectil asociadas a los pinos, en dos Municipios del departamento de Nueva Segovia, Tesis, Managua, Nicaragua. Universidad Nacional Agraria (UNA).-BARNETT, H. et al., (1972). Illustrated genera of imperfect fungi, Burguess publishing company, Minneapolis, Minnesota. 3ª ed.-BAUTISTA, D. (1976). Efecto de las distancias de siembra sobre la producción de la mora (Rubus glaucus Benth). Agronomía tropical, Colombia.-BORROR, D. et al., (1970). An Introduction to the study of insects, Printed in the United State of America, Sixths Edition.CASTAÑO-ZEPEDA, J., DEL RIO MENDOZA, L. (1994). Guía para el diagnóstico y control de enfermedades en cultivo de importancia económica, Zamorano, Honduras, Zamorano Academic press, 3ª ed.-CENTRO AGRONÓMICO TROPICAL DE INVESTIGACIÓN Y ENSEÑANZA (1998). Plagas invertebradas de cultivos anuales alimenticios en América Central, Costa Rica, CATIE, 2ª ed..-FAO (2005). Producción y Comercialización, (En línea), Colombia, Consultado el 16 de agosto del 2005, Disponible en Internet: www.angelfire.com/ingenieriaagricola/mora.htm.-FRANCO, G. y GIRALDO, C. (1999). El cultivo de la mora, Pereira, corpoica-federación nacional de cafetaleros de Colombia-Comité de cafetaleros de Risaralda, 2 ed..-FRANCO, G. y GIRALDO, M. (1999). El cultivo de mora, Colombia, 2ª ed..


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Encuentro

Degradación de toxafeno en medio líquido por

Bjerkandera sp BOL13 utilizando diferentes sustratos Martha Lacayo1,3, Enrique Terrazas1,4 , Bert van Bavel 2 y B. Mattiasson1

1 Department of Biotechnology, Center of Chemistry & Chemical Engineering. Lund University. P.O. Box 124, SE-221 00 Lund, Sweden. E-mail: [email protected]

2 MTM Research Centre, Örebro University, 701 82 Örebro, Sweden. E-mail: [email protected] 3 Centro para la Investigación en Recursos Acuáticos de Nicaragua - Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua - CIRA – UNAN,

P.O. Box: 4598, Managua Nicaragua. E-mail: [email protected] and [email protected])4 Instituto de Investigaciones Fármaco-Bioquímicas Fac. de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas - Universidad Mayor de San

Andrés - La Paz-Bolivia. E-mail: [email protected]


ESTE TRABAJO INVESTIGA LA DEGRADACIÓN DEL PLAGUICIDA toxafeno utilizando hongos producidos por la descomposición de la madera (white-rot fungus) Bjerkandera sp BOL13. La especie Bjerkandera sp BOL13 degradó el toxafeno al utilizar tres diferentes sustratos (virutas de madera, cáscara de trigo y melaza de caña) en medio líquido por un período de 38 días. Aproximadamente el 85% del toxafeno fue degradado cuando se utilizó la cáscara de trigo como sustrato principal. La producción de lignina peroxidasa (LiP) fue solamente estimulada cuando la cáscara de trigo estuvo presente en el medio líquido. Aunque la enzima xilanasa se encontró en todos los sustratos, la cáscara de trigo soportó la más alta producción de xilanasa. Una cantidad insignificante de ß-glucosidasa y celulasa fueron encontradas en las muestras del medio líquido. Según la literatura, éste es el primer trabajo de investigación referente a la degradación de toxafeno con hongos Bjerkandera sp producidos por la descomposición de la madera.

Palabras clave: plaguicidas-investigación / lignina-biodegradación-hongos des-tructores de la madera

Introducción

El toxafeno es un plaguicida organoclorado integrado por una mezcla de más de 277 compuestos. Este plaguicida fue principalmente utilizado contra las plagas de insectos en los cultivos del algodón, cereales, frutas, nueces y vegetales. El uso de este compuesto ha sido de gran importancia para mejorar la productividad de la agricultura, pero la falta del conocimiento sobre su impacto ambiental produjo severa contaminación en el ambiente (Swackhamer, 1998). Durante los años 80, el uso del toxafeno fue restringido


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y eventualmente prohibido en países del primer mundo. Sin embargo, muchos países en vías de desarrollo mantienen almacenadas grandes cantidades de toxafeno, DDT y otros plaguicidas. Estos plaguicidas todavía se utilizan en algunas partes del mundo (Voldner y Li, 1993). En el período de 1974 hasta 1988 fueron producidas en Nicaragua 79,000 toneladas de toxafeno (Beck, 1997). Una alternativa para los procesos convencionales de degradación bacteriológica del toxafeno consiste en el uso del hongo degradador de la lignina. Los bioreactores con hongos son ventajosos porque permiten llevar a cabo la degradación del toxafeno en una simple etapa del proceso, y los costos operacionales y de construcción son reducidos. Las enzimas como la lignina peroxidasa (LiP), manganeso peroxidase (MnP) y laccase están involucradas en la biodegradación de lignina y de contaminantes orgánicos persistentes (Hatakka 1994; Pelaez et al., 1995). Los hongos de madera necesitan de un sustrato fácilmente biodegradable para desencadenar la producción de enzimas extracelulares, las cuales incrementan significativamente los costos de operación. El uso de desechos de biomasa supera esta limitación al proveer un sustrato barato y confiable.

El objetivo de este estudio fue determinar la capacidad de los hongos Bjerkandera sp BOL13 para degradar el toxafeno en medio líquido utilizando diferentes sustratos.


Todos los solventes orgánicos y los reactivos utilizados en los análisis eran definidos para análisis de residuos. El estándar de toxafeno fue comprado en LGC Promochem de Alemania.

Bjerkandera sp BOL13, DSM 16531 (con el número de acceso en el GenBank AY633927) creció en medio líquido, conteniendo glucosa con una concentración de 1 g l-1 y extracto de levadura con una concentración de 5 g l-1. Los experimentos fueron inoculados con una porción de micelio del hongo Bjerkandera sp de 10 mm de diámetro y fueron incubados a una temperatura de (22° C) en la oscuridad.

La composición química de los sustratos utilizados durante los experimentos se encuentra en el Cuadro 1. El contenido de cada uno de los sustratos fue de 1 g l-1.

Cuadro 1. Composición de minerales y nutrientes de sustratos utilizados


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Experimentos de la degradación del toxafenoLos experimentos se realizaron para investigar la habilidad de los hongos para degradar el toxafeno en un medio líquido con tres diferentes fuentes de carbono. El toxafeno fue agregado en cada frasco de vidrio (600 µl) de la solución patrón de toxafeno (1 g l-1). También se adicionó a los frascos una alícuota de 30 ml de medio de cultivo y las virutas de madera, cáscara de trigo y melaza de caña a una concentración de 1 g l-1 .y. Posteriormente, los frascos se inocularon con 10 mm de diámetro del hongo Bjerkandera sp, que habían crecido previamente en platos petri conteniendo levadura. Dos grupos de control fueron preparados: uno contenía el medio de cultivo y el toxafeno; y el otro contenía el medio de cultivo y los hongos, sin el toxafeno. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los frascos fueron incubados a temperatura ambiente en la oscuridad en condiciones estériles.

Métodos analíticos

Las muestras fueron captadas cada cuatro días por un período de 38 días. Los análisis que se llevaron a cabo durante todo el experimento fueron: demanda química de oxígeno (DQO), Cl-, NO-3, NH+4, pH, celulasa, b-glucosidasa, xilanasa, MnP, LiP, lacasa, toxafeno total y los isómeros del toxafeno (Cuadro 2).

Cuadro 2. Isómeros estudiados de toxafeno. El sistema de nomenclatura utilizado fue el de Parlar como el que se describe en Burhenne et al., 1993.


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La DQO fue determinada utilizando el Standard Métodos (Standard Métodos para la el examen de agua y aguas de desecho 1999). Los Cloruros, NO-3 y NH+4 fueron analizados utilizando el equipo FIAStar 5000 (FOSS TECATOR AB).

Análisis de Toxafeno

El análisis de toxafeno fue realizado utilizando cartuchos C18 (Supelco Park, Bellefonte, PA., USA). Los cartuchos fueron condicionados con hexano, acetona, metanol y agua respectivamente. Se agregó la muestra de agua; cuando el agua fue eluída, se incrementó el vacío por un período de 10 a 15 minutos, hasta que la columna quedara completamente seca. El toxafeno fue eluído con hexano. El toxafeno total fue analizado por CG-ECD. Los isómeros del toxafeno y la confirmación del toxafeno total fueron analizados por GC/MS, de acuerdo a investigaciones realizadas con anterioridad por Lacayo et al., 2004.

Enzimas ligninolíticas

La enzima Manganeso peroxidasa (MnP) se midió utilizando el método de acuerdo a Castillo et al., 1994. La actividad de la enzima lacasa fue medida utilizando la metodología descrita por Wolfenden y Wilson, 1982. La lignina peroxidasa (LiP) fue medida con la metodología descrita por Bampus et al., 1985.

Enzimas celulolítica y xilanolítica (b-glucosidasa, celulasa y xilanasa)

Los sustratos para la determinación de xilanasa, b-glucosidasa y celulasa fueron xilano 0.1 % (w/v), p-nitrofenil- b-D-glucopiranosida (PNPG) 0.02% (w/v) y papel filtro en tiras de 0.5x2.5 cm, respectivamente. Para los análsis de b-glucosidasa y celulasa, la reacción fue llevada a cabo en 1 ml de citrato con una concentración de 50 mM y con un pH de 4.8. La xilanasa fue determinada utilizando 200 mM de fosfato con un pH 6. En todos los casos, 0.5 ml de sustrato fue agregado al blanco, al control y a la muestra. Para determinar la actividad de la enzima, 0.5 ml de la muestra fue también agregado a la mezcla de reacción. Los tubos fueron incubados a 50bC por 60 minutos en un baño de agua. Después de la incubación, 3ml de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) fueron agregados a todos los tubos. Después, los tubos fueron hervidos a 100bC por 10 minutos y fueron agregados 5 ml de agua ultra pura. Luego de dejarlos enfriar a temperatura ambiente, los tubos fueron agitados vigorosamente por 30 segundos y se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm (Miller, 1959).

Resultados y discusiòn

Los hongos Bjerkandera sp BOL13 fueron capaces de crecer con los sustratos utilizados (virutas de madera, cáscara de trigo y melaza de caña), habiendo sobrevivido en condiciones tóxicas con el toxafeno. Un resumen de los resultados se presenta en el Cuadro 3.


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Cuadro 3. Porcentaje de toxafeno total y los isómeros degradados en lotes de cultivos con los hongos Bjerkandera sp BOL13 en presencia de diferentes sustratosa

aEl experimento se realizó durante un período de 38 días. Los valores corresponden al resultado mayor de remoción, después de 30 días de incubación con Bjerkandera sp BOL13. Los datos fueron analizados por dos vías ANOVA (p = 0.05). En el control abiótico no se detectó eliminación de los compuestos estudiados. bEl toxafeno total fue determinado utilizando Cromatografía de Gases con detector de captura de electrones. cLos isómeros del toxafeno fueron analizados por GC/MS-NCI.

Aproximadamente el 85% del toxafeno total fue degradado después de 30 días de incubación con la Bjerkandera sp BOL13. Todos los isómeros estudiados fueron susceptibles a los hongos, aunque el isómero P32 resultó más recalcitrante, ya que solamente se removió el 53%. Los isómeros que contienen más átomos de Cloro en sus moléculas fueron mas susceptibles a la oxidación (ilustración 1).


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�1Ilustración 1. Degradación del toxafeno por la especie Bjerkandera sp BOL13 con cáscara de trigo (a). Los isómeros son representados por símbolos: P11 representado por rombos, P32 por cuadrados, P31 por triángulos, P50 por círculos abiertos y P69 por círculos negros. La degradación del toxafeno fue seguida durante 38 días de incubación. Los valores graficados representan los valores medios de los datos obtenidos de los lotes de cultivos realizados por duplicado.

Cuando fueron utilizados los sustratos virutas de madera o melaza de caña de azúcar la degradación del toxafeno claramente disminuyó en comparación con la cáscara de trigo. El 52% y el 49% del toxafeno total fueron removidos con virutas de madera y melaza de caña, respectivamente. La degradación del toxafeno con el tiempo mostró que los isómeros P11 y P15 fueron removidos en un 44.5% y 42.4% respectivamente cuando las virutas de madera fueron utilizadas como fuente de carbono (ilustración 2).

Ilustración 2. Degradación del toxafeno por la especie Bjerkandera sp BOL13 con virutas de madera (b) y (c) melazas de caña. Los isómeros son representados por símbolos: P11


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representado por rombos, P32 por cuadrados, P31 por triángulos, P50 por círculos abiertos y P69 por círculos negros. La degradación del toxafeno fue seguida durante 38 días de incubación. Los valores graficados representan los valores medios de los datos obtenidos de los lotes de cultivos realizados por duplicado.

Los isómeros altamente clorados, P50 y P69 fueron más susceptibles a la degradación por los hongos Bjerkandera sp BOL13, ya que el 70% y 77% de estos isómeros fueron removidos. La degradación del toxafeno no presentó diferencias significativas cuandose utilizaron melazas de caña como sustrato, en comparación con los resultados obtenidos cuando se usaron virutas de madera. Sin embargo los isómeros P12 y P50 fueron más recalcitrantes (ilustración 3).

Ilustración 3. Degradación del toxafeno por la especie Bjerkandera sp BOL13 con melazas de caña (c). Los isómeros son representados por símbolos: P11 representado por rombos, P32 por cuadrados, P31 por triángulos, P50 por círculos abiertos y P69 por círculos negros. La degradación del toxafeno fue seguida durante 38 días de incubación. Los valores graficados representan los valores medios de los datos obtenidos de los lotes de cultivos realizados por duplicado.

La oxidación del toxafeno fue asociada con la producción de la enzima LiP por el hongo Bjerkandera BOL13. Aproximadamente 70 U l-1 de actividad enzimática fue registrada cuando se utilizó la cáscara de trigo como sustrato principal. Sin embargo, se detectaron valores bajos de actividad enzimática cuando se utilizaron los sustratos virutas de madera o melazas de caña (ilustración 4A).


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Ilustración 4A Ilustración 4B

Cuando se usó cáscara de trigo como sustrato para la degradación del toxafeno, se detectó una actividad significante de la enzima xilanasa. Después de 25 días de crecimiento de los hongos Bjerkandera BOL13, se registró una actividad enzimática de 74 U l-1. Se registró baja actividad de la xilanasa cuando se utilizaron virutas de madera o melaza de caña (ilustración 4B).

Las enzimas b-glucosidasa y la celulasa también fueron detectadas en el cultivo de los hongos. Cuando los tres sustratos fueron investigados, la actividad fue muy baja.

La demanda química de oxígeno disminuyó con los tres sustratos. Sin embargo, la reducción mas evidente se observó cuando se suministraron las melazas de caña al medio de cultivo. La producción de CO2 se incrementó cuando la cáscara de trigo se utilizó como sustrato principal. Cuando las virutas de madera y las melazas de caña se utilizaron como sustrato, la producción del CO2 fue no significante. Las concentraciones de los cloruros se mantuvieron constantes con todos los sustratos estudiados durante todo el período de la investigación (Cuadro 4). En los controles abióticos no se registró ningún cambio en los parámetros estudiados de COD, CO2 y Cl-.


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Cuadro 4. Resultados de la oxidación de los sustratos mineralizaciòn y cloruros en cultivos de Bjerkandera sp de BOL13

aAl inicio del experimento, la demanda química de Oxígeno fue de 0.6 g l-1 para la cáscara de trigo, 1 g l-1 para las virutas de madera y 0.7 g l-1 para la melaza de caña. bLa concentración inicial de cloruro fue de 150 mg l-1.

Discusión

Los sustratos utilizados (cáscara de trigo, virutas de madera y melaza de caña) suministran sustratos baratos y eficientes para la degradación del toxafeno. Los resultados mostraron que el uso de la cáscara de trigo fue más efectivo en la eliminación del toxafeno que las virutas de madera y la melaza de caña. Se observaron porcentajes de degradación mayores del 85% en el sistema en donde se utilizaron las cáscaras de trigo (Cuadro 3). Esto puede ser explicado como un resultado en las diferencias de la composición química (rica en celulosa, proteínas y minerales, Cuadro 1). El hecho de que el toxafeno total y los isómeros fueron degradados sugiere que ellos estuvieron disponibles para los hongos. Los isómeros que contienen más átomos de cloro fueron más susceptibles a la degradación del toxafeno. Efectivamente, el isómero P69 fue removido con las tres diferentes fuentes de carbono utilizadas. Sin embargo, cuando los hongos crecieron en las virutas de madera y en las melazas de caña, la eliminación de los isómeros con menos átomos de cloro fue menos efectiva si se compara con la cáscara de trigo (Cuadro 3).

Una actividad significante de LiP fue encontrada en el cultivo de hongos conteniendo la cáscara de trigo. Probablemente, la alta concentración de manganeso en la composición química de la cáscara de trigo fue determinante para inducir la producción de LiP en los hongos. En la literatura ha sido reportado que el sistema LiP/H2O2 producido por algunas especies de Bjerkandera es responsable para la oxidación de tintes y compuestos recalcitrantes. Cuando las virutas de madera se utilizaron como sustrato en los cultivos con los hongos, se encontraron muy bajas actividades de la LiP y MnP. Esto pudiera ser porque las enzimas ligninolíticas son mejor estimuladas en medios ricos en nitrógeno que en medios que contienen solamente lignina (Kotterman et al., 1996).


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La eliminación de compuestos recalcitrantes no está siempre relacionada a las enzimas peroxidasas, ya que otras especies de oxígeno reactivo pueden ser producidas por los hongos (Soares et al., 2005). Las melazas de caña no estuvieron disponibles para la degradación del toxafeno.

De hecho, solamente el 49% del toxafeno total fue reducido en los cultivos de los hongos con melaza de caña como fuente de carbono. Sin embargo, el grado de degradación fue específico para este isómero. En cuanto a la actividad de las enzimas LiP y la MnP, tampoco fueron inducidas cuando se usó la melaza de la caña. La concentración de la sucrosa en la melaza de caña era relativamente alta y se conoce que la cantidad de azúcar en el sustrato es un factor determinante en la regulación de las enzimas ligninolíticas por la represión catabólica en los hongos.

También se estudiaron las enzimas de hidrolización de la celulosa y del xilano. La xilanasa fue significativamente inducida por los tres sustratos utilizados en el estudio. La cáscara del trigo indujo una actividad de la xilanasa de 74 U l-1 comparados con 30 o 45 U l-1 alcanzado con las virutas de madera o la melaza de caña, respectivamente. En la literatura se ha encontrado que el género Bjerkandera produce la enzima xilanasa (Koker et al., 2000). La alta actividad de la enzima xilanasa encontrada se relaciona con la concentración alta de la enzima LiP, de este modo, el producto de xilanasas podría ser una fuente de H2O2 (Cameron et al., 2000). No se detectaron cantidades significativas de b-glucosidasa o de celulasa cuando se utilizaron los sustratos en estudio.

La DQO disminuyó en los cultivos en lote con los tres sustratos utilizados en el estudio. Cuando se usó la cáscara de trigo como sustrato, la DQO disminuyó significativamente en los medios de cultivo después de 38 días. Fue correlacionado bien con la producción del CO2 y la degradación del toxafeno utilizando la de trigo como sustrato. No se registró ninguna producción del CO2 con la viruta de madera o la melaza de caña. Sin embargo, se observo una disminución significativa de la concentración del toxafeno. La DQO y el CO2 fueron buenos indicadores de la actividad metabólica de los hongos.

En todos los casos, las concentraciones del cloruro fueron constantes durante la oxidación del toxafeno. Esto se podría explicar porque la especie de los hongos Bjerkandera puede también catalizar la reacción de clorinación de compuestos aromáticos (Swarts et al., 1998). Así, cuando el toxafeno se oxidó, los átomos de los cloruros pudieran ser liberados al medio y pudieran ser rápidamente utilizados por los hongos para clorar otras moléculas (Ilustración 5). Esta situación se debe tomar en consideración como el producto transformado podría ser aún más tóxico que el compuesto original (Lacayo et al. 2004).


��Ilustración 5. Cromatogramas de los isómeros del toxafeno analizados y metabolitos no identificados obtenidos en lotes de cultivo con Bjerkandera sp BOL13, después de 30 días de incubación. (a) Isómeros del toxafeno en los controles abióticos preparados con cáscara de trigo y sin hongos. (b) Isómeros de toxafeno en los medios de cultivos preparados con cáscara de trigo e inoculados con hongos Bjerkandera sp BOL13.

Leyendas: P-11, P-12 y P-15: Designación de los compuestos. El sistema de nomenclatura utilizado fue el de Parlar como el descrito en Burhenne et al., 1993 (Cuadro 3).rt: tiempo de retención

Los números que están encima de cada tiempo de retención son las áreas detectadas de los compuestos estudiados.

Conclusión

La degradación del toxafeno se logró al utilizar la especie de hongos Bjerkandera sp strain BOL13, proporcionando de esta forma un método rentable para la degradación del toxafeno debido al bajo costo de los sustratos utilizados. Sin embargo, deben realizarse otros estudios para clarificar los mecanismos verdaderos que realizan durante la degradación de compuestos orgánicos persistentes. Además, deben realizarse algunas pruebas de toxicidad antes de aplicarlos en casos reales •

Referencias bibliografícas

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Encuentro

Bioquímica estructural del metabolismo de ácidos

nucleicos: mecanismos de la fidelidad en las polimerasas

de ácidos nucleicosLuis G. Brieda1

1. Departamento de Bioquímica, Cinvestav. Av. Instituto Politécnico Nacional # 2508 Col. San Pedro Zacatenco, México, D.F., México CP 07360. e-mail: [email protected]


LAS POLIMERASAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS LLEVAN A CABO REACCIONES clave como la replicación y transcripción del material genético con gran exactitud. En esta revisión se explican en términos estructurales, los fundamentos de la elevada fidelidad de las polimerasas de ácidos nucleicos y se da énfasis a la excepción a la regla, la incorporación de nucleótidos usando como substrato la lesión 8-oxoguanosina (8oG). T7 ADN polimerasa es una enzima modular, que consiste en un dominio con actividad de exonucleasa o de edición y un dominio de polimerización. La fidelidad durante la inserción de nucleótidos ocurre por un mecanismo de enlace inducido y la rigidez del dominio de polimerización. Esta fidelidad puede ser mayor debido a la actividad de edición, por la cual, una base erróneamente incorporada, se traslada del dominio de polimerización al de edición para ser removida. Así, T7 ADN polimerasa comente en promedio solamente un error por cada millón de bases replicadas. Sin embargo esta polimerasa se “equivoca” en uno de cada cuatro intentos (incorporación de dATP en lugar de dCTP) cuando replica la lesión 8oG. La inserción, fiel o infiel, teniendo como substrato 8oG, se relaciona con la rigidez del sitio activo de la enzima y modificaciones pequeñas en el sitio activo alteran su grado de fidelidad. Un evento de inserción mutagénico 8oG·dATP, “engaña” el sistema de edición al formar un par que asemeja el par normal Thy·dATP. Entender el fenómeno de la fidelidad en polimerasas replicativas esta directamente asociado a poder combatir enfermedades como el cáncer.

Palabras clave: bioquímica / ácidos nucleicos / polimerización / cáncer-investigaciones


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Introducción

Una de las características que definen a un ser vivo es la capacidad de transmitir información hereditaria. Por lo tanto, la presencia de material genético en los organismos vivos hace que existan enzimas involucradas en la replicación de los genomas. Estas enzimas se conocen como ADN polimerasas y se encuentran en la mayoría de las formas de vida, desde los bacteriófagos a los organismos eucariontes desarrollados. Dos eventos clave marcan la historia del estudio de la replicación de ácidos nucleicos: 1) El modelo de la doble hélice propuesto por Watson y Crick, que predice que la replicación del material genético puede ser llevada a cabo utilizando una de los dos cadenas del acido nucleico como templado (Watson: 1953); y, 2) la identificación y caracterización, en el laboratorio de Arthur Kornberg, de la ADN polimerasa I de Escherichia coli, como la primera enzima con capacidad de polimerizar ácidos nucleicos (Lehman, 1958:163).

Evidentemente, la principal función de las ADN polimerasas es replicar genomas. Sin embargo, se ha visto que existen nuevas familias de polimerasas, como la familia Y, que tienen un papel en la replicación fiel a través de lesiones de ácidos nucleicos o la ADN polimerasa beta, que está involucrada en rutas de reparación del ADN. Las polimerasas de ácidos nucleicos varían en su composición. Por ejemplo, la ADN polimerasa beta es una enzima de 20 kDa (aproximadamente 230 amino ácidos), mientras que las polimerasas replicativas usualmente son proteínas de multisubdominios y en muchos casos de polipéptidos y contienen miles de amino ácidos. Por ejemplo, la ADN polimerasa delta, enzima encargada de replicar genomas de organismos eucariontes como el Homo sapiens, es una enzima compuesta de cinco proteínas y de un peso de aproximadamente 475 kDa y la ADN polimerasa III de E. coli se compone de 10 proteínas y tiene un peso molecular de aproximadamente 791kDa (cerca de 8000 amino ácidos). En estos complejos, la actividad replicativa se encuentra en una subunidad denominada “coraza”, pero las demás subunidades están involucradas en funciones accesorias (Johnson, 2005:283).

En los últimos 10 años se ha dado una explosión en el descubrimiento de polimerasas de ácidos nucleicos. Actualmente, las polimerasas se dividen en siete familias A, B, C, D, X, Y y Reversa Transcriptasas (RT) (Ohmori, 2001:7). En humanos, se han encontrado a la fecha 14 polimerasas de ácidos nucleicos pertenecientes a cada una de estas familias. A pesar de la divergencia entre las funciones y la complejidad de las ADN polimerasas, la química de la reacción de polimerización se encuentra conservada. Durante el proceso de replicación, el DNA de doble cadena que contiene la cadena templada y la cadena de ADN naciente es translocado al sitio activo de la polimerasa, donde una base del templado es expuesta y el nucleótido complementario se aparea con un ella. La incorporación del nucleótido involucra el ataque nucleofílico por el fosfato alfa del nucleótido que se encuentra en el sitio activo al 3’OH del azúcar del nucleótido final de la cadena naciente. Este ataque nucleofílico es asistido por dos metales que se encuentran coordinados por dos ácidos carboxílicos conservados en todas las polimerasas de ácidos nucleicos.

A pesar de la conservación de la química de la reacción, las polimerasas de ácidos nucleicos también son variables en propiedades bioquímicas, como la fidelidad (entendiendo por fidelidad la capacidad de reconocer un par de bases de tipo Watson-Crick: Adenina-Timidina,


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y Guanina-Citocina-). Por ejemplo, la mayoría de las polimerasas replicativas son sumamente fieles. Estas polimerasas comenten, en promedio, solamente un error por cada millón de bases replicadas, mientras que polimerasas como la reversa transcriptasa del VIH-1 comete un error cada 10,000 bases replicadas y polimerasas de la familia Y cometen un error por cada 100 bases replicadas. Otra propiedad bioquímica, conocida como la procesividad (la cantidad de pares de bases replicadas durante un solo evento de unión a la cadena molde), es sujeta a gran variación en diversas ADN polimerasas. Por ejemplo, tanto la DNA polimerasa delta como la DNA polimerasa III se unen a factores procesivos conocidos como el PCNA (“Proliferating Cellular Nuclear Antigen”) o la abrazadera beta. Estos factores procesivos tienen una forma cilíndrica lo cual les permite formar una abrazadera alrededor del acido nucleico e impedir el desprendimiento de las polimerasas del templado, en marcado contraste con polimerasas como la Reversa Transcriptasa del HIV-1, que replica en promedio ~200 pares de bases por evento o la ADN polimerasa eta de humano, que replica en promedio ~5 pares de bases antes de desprenderse del templado. A pesar de que la replicación de ácidos nucleicos ha sido ampliamente estudiada desde los años 50, todavía hay muchos vacíos en el entendimiento de su función. Históricamente, diversas polimerasas se han usado como sistemas modelo para estudiar el fenómeno de la replicación. Desde los estudios iniciales de Arthur Kornberger con la DNA polimerasa I y, después, con el Fragmento Klenow de E. coli, a la ADN polimerasa beta, la Transcriptasa Reversa del VIH-1 o la ADN polimerasa delta de Saccharomyces, por ejemplo.

T7 ADN polimerasa como modelo de estudio de la replicación

Uno de los sistemas clásicos de estudio es la ADN polimerasa del bacteriófago T7, conocida como T7 ADN polimerasa. Esta polimerasa pertenece a la familia A y contiene 704 amino ácidos y, debido a una fuerte interacción con la enzima tioredoxina de E. coli, tiene una gran afinidad por el ADN de doble cadena, así la procesividad de esta enzima es comparable a las polimerasas replicativas de organismos mas evolucionados. Igual que la mayoría de las ADN polimerasas, T7 ADN polimerasa es una enzima modular y se compone de dos dominios: un dominio con actividad 3’-5’ exonucleasa y un dominio con actividad de polimerización de nucleótidos. El dominio de polimerización se compone a su vez de tres subdominios conocidos como palma, pulgar y dedos, por su semejanza a una mano derecha (ilustración 1). T7 ADN polimerasa es una enzima con una fidelidad exquisita, experimentos cinéticos han demostrado que T7 ADN polimerasa se equivoca, en promedio, una vez por cada millón de bases replicadas. Mas aún, si la enzima incorpora una base errónea, la adición del próximo nucleótido se vuelve mas lenta, lo cual permite que la cadena que contiene el nucleótido erróneamente incorporado se transporte al sitio de actividad exonucleasa y se lleve a cabo la reacción edición (ilustración 1). Es entonces importarte recalcar la presencia de dos actividades enzimáticas que confieren la propiedad global de la fidelidad: la incorporación y la edición.


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�1Ilustraciòn 1. T7 ADN polimerasa es una enzima modular. Esta polimerasa se compone de dos dominios: 1) de edición o de exonucleasa (amarillo) y de 2) polimerización. El dominio de polimerización resembla una mano derecha y se compone de tres subdominios, denominados pulgar (verde), palma (rojo) y dedos (azul). La asociación con thioredoxina (gris) aumenta la procesividad de la polimerasa. La reacción de incorporación de nucleótidos implica la rotación de la alfa hélice O del subdominio del los dedos para formar el sitio activo de la polimerasa.

La incorporación se refiere a la reacción de adición de un nucleótido a la cadena líder utilizando un molde; y la edición es el fenómeno por el cual la DNA polimerasa reconoce que durante la incorporación, se ha cometido una incorporación errónea y se procede a remover esta base y repetir el ciclo de incorporación. La estructura cristalográfica de la T7 ADN polimerasa con dNTP en el sitio activo fue la primera evidencia que la reacción de polimerización de ácidos nucleicos se lleva a cabo mediante un mecanismo de enlace inducido, en donde una de las alfa hélices del subdominio de los dedos, conocida como alfa hélice O, se mueve >60° para formar el sitio activo. De esta manera, las polimerasas tienen dos conformaciones: una denominada “abierta”, en la cual el sitio activo se encuentra vacío (sin nucleótido); y una denomina “cerrada”, que corresponde a la forma física de la polimerasa antes de llevar a cabo la reacción de adición de nucleótidos. En la conformación cerrada se forma un sitio activo apretado, en el cual tanto el nucleótido a ser incorporado como el templado, son coordinados por residuos de los dominios de la palma y de los dedos, y se observa la presencia de dos metales que pueden coordinar el ataque en línea del grupo 3’OH por el fosfato alfa del nucleótido a ser incorporado.

Estos estudios cristalográficos concuerdan con estudios cinéticos en donde se postula que el paso limitante de la reacción de la polimerización es un cambio conformacional en la polimerasa y no la química de la reacción. La exquisita fidelidad de las ADN polimerasas parece ser llevada a cabo por un mecanismo de efecto estérico, donde los pares de bases de tipo Watson-Crick, que tienen una geometría similar entre ellos, pueden ser acomodados en un sitio activo relativamente rígido. Estudios utilizando nucleótidos sin capacidad de formar


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puentes de hidrógeno, pero con una geometría similar a los pares de bases de Watson-Crick, pueden servir como templados y como substratos de la reacción de polimerización y conservar la propiedad de la fidelidad. Este experimento argumenta la importancia de la forma y no de la capacidad de formar puentes de hidrogeno como determinante de la fidelidad durante la incorporación. Sin embargo, si la polimerasa ha cometido una equivocación durante la incorporación de nucleótidos, el sitio de elongación no es tan rígido en comparación con el sito de incorporación, ni parece que sufra cambios conformacionales.

¿Cual es el mecanismo por el cual se reconoce una equivocación? La clave se encuentra en los estudios clásicos de Seeman y Rich, los cuales indican que los pares de bases de tipo Watson-Crick tienen una disposición espacial idéntica de los grupos que pueden ser donadores y aceptores de puentes de hidrógenos en el surco menor del ADN (Seeman: 1976). En las polimerasas de ácidos nucleicos de la familia A, dos aminoácidos conservados en el subdominio de la palma, una Arg y una Gln, están en una posición optima para contactar los grupos donadores y aceptores del par de bases recién incorporado. Estos amino ácidos se conocen como “sensores del surco menor”(Double, 1998:251).

Estudios cinéticos postulan que, si se lleva a cabo una incorporación errónea, la disposición espacial de los grupos en el surco menor es distinto y los aminoácidos Arg y Gln no podrían posicionar el grupo 3’OH en una posición óptima para continuar la catálisis. Estudios cristalográficos demuestran que las doce posibles combinaciones erróneas de pares de bases producen cambios sutiles en la posición del grupo 3’OH, lo cual explica que la catálisis de la reacción sea más lenta y pueda efectuarse la transferencia entre los dominios de polimerización y de edición (Johnson, 2004:803). El transporte entre los dos sitios activos de la polimerasa es posiblemente asistido por el subdominio del pulgar. El dominio de edición lleva a cabo la hidrólisis del nucleótido recién incorporado por un mecanismo que también involucra dos metales coordinados por dos carboxilatos. A pesar de que existen mecanismos para evitar las mutaciones, se sabe que la fuerza de la evolución hace que existan cambios en el genoma de los organismos y, a pesar de que se entiende cómo se lleva a cabo una reacción de polimerización fiel, no se entienden los fundamentos por los cuales ocurren las mutaciones.

Oxo Guanosina una lesión y agente mutagénico

El ADN puede ser considerado como el guardián de la información genética. A pesar de su relativa estabilidad, este material puede ser sujeto a reacciones de oxidación, de metilación, o de entrecruzamiento. Uno de los agentes que más dañan a los ácidos nucleicos son las especies reactivas de oxígeno, formadas durante la respiración celular. Las especies reactivas de oxígeno pueden reaccionar con nucleótidos como la guanosina y llevan a cabo su oxidación. Una de las lesiones mas estudiadas, es el producto de la oxidación en el grupo 8 de la guanosina, lesión conocida como 8-oxoguanosina (8oG). En marcado contraste con bases que no han sido modificadas y tienen una preferencia por la conformación anti, la presencia del oxígeno en la posición 8 de la guanosina hace que la 8-oxoguanosina tenga una preferencia hacia una conformación de tipo syn. Así, esta base tiene un potencial de código doble, puede formar una interacción de tipo Watson-Crick con citosina, pero en su conformación de tipo syn puede formar una interacción estable de tipo Hoogsten con dATP


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(Ilustración 2). De este modo, cuando las polimerasas de ácidos nucleicos encuentran esta lesión e incorporan dATP en lugar de dCTP, el resultado puede ser un evento mutagénico y, eventualmente, una transversión en el genoma de GgT (Shibutani, 1991:431). La acumulación de la lesión 8oG se ha asociado con enfermedades y fenómenos diversos como la vejez, la muerte celular programa, enfermedades neurodegenerativas, fibrosis cística y cáncer.

Ilustraciòn 2. La lesión 8oG tiene un potencial de codigo doble. a) 8oG puede formar un par de bases de tipo Watson-Crick, 8oG·dCTP, utilizando su conformación anti, en esa conformación los grupos N7 y O8 se localizan en el surco mayor b) 8oG puede formar un par mutagénico apareándose con dATP al utilizar su conformación syn (flecha azul). En esta conformación, el grupo N7 se aparea con timina y el grupo O8 se ubica en el surco menor. Numerosos experimentos cinéticos han demostrado que las ADN polimerasas de diversas familias tienen diversos grados de preferencia de incorporación fiel (dCTP) o infiel (dATP) cuando replican la lesión 8oG, por ejemplo la T7 DNA polimerasa perteneciente a la familia A es fiel en un 75% de los eventos replicativos, la Reversa Transcriptasa del VIH en un 25%, ADN polimerasa delta de la familia B en un 85%, y la DNA polimerasa eta de S. cerevisae, de la familia Y, en un 90 %. Una explicación razonable de las diferencias observadas en la fidelidad de cada polimerasa puede radicar en diferencias estructurales en el sitio activo de cada una de ellas. Estas polimerasas son también diferentes en el reconocimiento de esta lesión como equivocación: todas las polimerasas estudiadas a la fecha con la excepción de polimerasas de la familia Y, como la ADN polimerasa eta no se detienen una vez que han cometido una incorporación infiel del producto 8oG·dATP. Las polimerasas replicativas distinguen entre una incorporación mutagénica, G·dATP y una incorporación fiel G·dCTP, con un decremento de aproximadamente 100,000 veces en su actividad catalítica y la elongación de una par de bases errónea es 20,000 mas ineficaz que la elongacion de un par de bases de tipo Watson-Crick. En cambio, la incorporación mutagénica 8oG·dATP y la incorporación fiel 8oG·dCTP tiene un decremento de solamente tres veces en su actividad catalítica y muchas polimerizas prefieren elongar una equivocación 8oG·dATP, en lugar de un par fiel 8oG·dCTP. Con el objeto de entender como se lleva a cabo la incorporación fiel e infiel teniendo como templado la lesión 8oG, se han llevado numerosos estudios cristalográficos con esta lesión. Uno de los más detallados es el estudio utilizando como modelo a la enzima T7 ADN polimerasa.


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Inserción fiel o infiel teniendo como templado la 8oG

Numerosos estudios estructurales han establecido que el tamaño y la forma del sitio activo son cruciales en la fidelidad. El doble potencial de código de la lesión 8oG la hace un candidato ideal para elucidar el fenómeno de la infidelidad. Estudios cristalográficos usando como modelo la 7 ADN polimerasa revelan que la estructura del complejo 8oG·dCTP, en comparación del complejo G·dCTP, es casi idéntica. La única diferencia es el movimiento del amino acido Lys536 de la alfa hélice O1 del subdominio de los dedos para formar un puente de hidrogeno con el grupo O8 del 8oG (ilustración 3a) (Breiba, 2004:3452). Estos resultados son similares a la estructura del complejo de 8oG·dCTP utilizando la ADN polimerasa del bacteriófago RB69, en el cual el complejo 8oG·dCTP es idéntico, dentro de los limites experimentales, al complejo G.dCTP.

Ilustración 3. Bases estructurales de la incorporación fiel e infiel. a) Estructura cristalográfica del complejo 8oG·dCTP en el sitio activo de la T7 ADN polimerasa. El par 8oG·dCTP es estabilizado por los puentes de hidrógeno entre el residuo Lys536 y el grupo O8 del templado 8oG. b) Estructura cristalográfica del complejo 8oG·dATP en el sitio activo de la T7 ADN polimerasa. La remoción del grupo epsilón amino de Lys536 en la mutante Ala536 evita un choque estérico entre el par 8oG·dATP. El residuo Lys536, observado en el complejo 8oG·dCTP, se observa de color gris. En ambas estructuras se observa la posición de los dos Mg++ que coordinan la química de la reacción.

En esta polimerasa, el grupo O8 del templado 8oG se mueve hacia un sitio activo sin impedimentos estéricos (Freisinger, 2004:1494). La situación del par 8oG·dCTP contrasta en la ADN polimerasa beta, en la que se observa que el fosfato alfa del templado 8oG sufre una rotación de 180° con respecto a templados canónicos. El sitio activo de la ADN polimerasa beta es diferente en la posición de la cadena templada 5’, y esta rotación del fosfato alfa es necesaria para impedir un choque entre los grupos PO4 y el O8 del 8oG. La razón por la cual el fosfato alfa del templado es rotado en la ADN polimerasa beta es por que al base siguiente del templado tiene un doblez que no es tan pronunciado como en el caso de la T7 ADN polimerasa o la polimerasa RB69. Estos estudios indican que la única razón para la baja eficiencia catalítica de la incorporación de 8oG debe de ser que esta base existe en un equilibrio entre las dos conformaciones anti y syn. Estudios cinéticos indican que, en el caso de la T7 ADN polimerasa, la incorporación fiel tiene un paso limitante que se asocia con el cambio conformacional de la alfa hélice O. Es, entonces, congruente pensar que la incorporación de dCTP teniendo como substrato la lesión 8oG se lleva a cabo por un mismo


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mecanismo cinético, similar al de una base normal. La rotación del fosfato alfa en el caso de la ADN polimerasa beta puede ocasionar una pérdida en la eficiencia catalítica y hacer que esta polimerasa sufra una pausa antes de la incorporación de nucleótidos cuando encuentra la lesión.

Entender el fenómeno de la incorporación de un evento mutagénico 8oG·dATP ha sido mucho más complicado. Durante el intento de cristalizar a la enzima T7 ADN polimerasa, teniendo como sustrato un par 8oG·dATP, se obtuvo un cristal en que el subdominio de los dedos se encontraba en una conformación abierta y no contenía nucleótido en el sitio activo (Breiba, 2004:3452). Esta conformación “abierta” de la enzima corresponde a un estado no catalítico de la polimerasa. Similares resultados se obtuvieron al resolver las estructuras cristalográficas utilizando las polimerasas RB69 (Freisinger, 2004:1494) y beta (Krahn 20031:121), aunque en el caso de la ADN polimerasa beta se observa una densidad electrónica muy débil en el sitio activo de la polimerasa que puede corresponder a dATP. Estudios cinéticos indican que, en el caso de la T7 ADN polimerasa, el paso limitante de la incorporación de dATP teniendo como templado 8oG es la química de la reacción y no un cambio conformacional en la polimerasa (Einolf, 1998:13300), indicando que la incorporación infiel podría ser llevada por un mecanismo diferente al de la incorporación fiel (por ejemplo que no necesite el cambio conformacional).

Dentro de la misma familia A de las ADN polimerasas, existen polimerasas que tienen rangos de inserción muy variados al tener como templado 8oG. Por ejemplo, la T7 DNA polimerasa incorpora aproximadamente ~30% de dATP (Breiba, 2004:3452, Freisinger, 2004:1494) y la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus ~90% (Hsu, 2004:217). En el caso de la T7 ADN polimerasa, un modelaje inicial propone que el residuo Lys536 podría hacer interacciones electrostáticas y estéricas con un par de bases 8oG·dATP. Un dato interesante es que el residuo correspondiente a la Lys536 en la ADN polimerasa de Bacillus es una glicina. De este modo, se propuso realizar una mutante en la que el grupo epsilon amino de la Lys se eliminara y observar las propiedades cinéticas de incorporación de dATP con esta mutante. La mutante Lys536Ala incorpora preferentemente dATP en lugar de dCTP cuando tiene 8oG como templado y esta mutación no altera la fidelidad global de la polimerasa con otros substrato (Breiba, 2005:1653). Sorprendentemente, al cristalizar esta mutante con un templado 8oG y dATP, se obtuvo un complejo cerrado en el cual se observa clara densidad electrónica para el nucleótido dATP y el templado 8oG, siendo éste el primer ejemplo de una incorporación mutagénica observado en una polimerasa de ácidos nucleicos.

En este complejo, se observa al templado 8oG en una conformación de tipo syn y claramente apareado con el dATP. Kool y colaboradores han propuesto que el sitio activo de las ADN polimerasas es “rígido” y tiene cabida para la geometría de un par de bases de tipo Watson-Crick. La estructura del par 8oG(syn) dATP en el sitio activo de la T7 ADN polimerasa revela que el sitio activo de las ADN polimerasas puede ser modificado (ilustración 3b) (Guo, 2005:256). Este ejemplo de ingeniería de proteínas concuerda con los datos de que polimerasas típicamente fieles como RB69, ADN polimerasa beta, o ADN polimerasa delta, prefieren incorporar dCTP y polimerasas infieles como la reversa transcriptasa del VIH-1 prefieren incorporar dATP y hay una relación entre lo relajado del sitio activo y la fidelidad. Así, polimerasas con un sitio activo más relajado son más propensas a ser mutagénicas. Sin


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embargo, las polimerasas infieles pero especializadas en negociar lesiones, como la DNA polimerasa eta, tienen el sitio activo mas relajado en comparación de todas las polimerasas, pero prefieren incorporar dCTP con una fidelidad exquisita cuando encuentran la lesión 8oG.

En este caso se ha cristalizado a la ADN polimerasa IV (Dpo4) con un par 8oG·dCTP y se observa que dos residuos de la Dpo4 (Arg331 y Arg332) forman una red de puentes de hidrógeno con el templado 8oG en la conformación anti que hace que esta conformación sea favorecida en el sitio activo de la polimerasa (Rechkoblit, 2006 y Zang, 2006:2358). Los amino ácidos Arg331 y Arg332 se encuentran en un subdomonio conocido como “dedos pequeños”, que no está presente en todas las polimerasas de la familia-Y. así es posible que modificaciones en este subdominio cambie el equilibrio de las forma anti o syn del templado 8oG y diversas polimerasas de la familia Y sean diversas en su incorporación fiel o infiel al replicar la lesión 8oG. Mutaciones en el subdominio de los dedos han previsto que afecten el equilibrio de la forma abierta o cerrada de las polimerasas (Huang, 2000:11571). Así, una polimerasa que disponga de una barrera energética menor para cambiar de la forma abierta a la cerrada, será en principio más mutagénica. En el caso de la T7 DNA polimerasa, esta barrera energética está dada por el residuo Lys536 y al eliminar la cadena lateral se disminuye la barrera energética y, por lo tanto, la catálisis se puede llevar a cabo de forma eficiente.

Extensión fiel e infiel

Una vez que las polimerasas incorporan una mutación, en la mayoría de los casos esta incorporación errónea es editada por el dominio exonucleasa. Estudios estructurales revelan que el grupo 3’OH que va a ser extendido es posicionado erróneamente, lo cual disminuye la capacidad del el ataque nucleofílico del fosfato alfa para continuar la catálisis (Johnson, 2004:803). Este posicionamiento erróneo del grupo 3OH hace que pueda trasladarse hacia el dominio de exonucleasa donde la base es editada y, posteriormente, devuelta al domino de polimerización. En las ADN polimerasas de la familia A, se observa que la extensión de un incorporación infiel es mas favorecida (8oG·dATP) que la de una extensión fiel (8oG·dCTP).

La estructura cristalográfica de los complejos de elongación fiel e infiel, revela que los grupos aceptores y donadores de los pares de bases 8oG·dCTP y 8oG·dATP son contactados por residuos Arg429 y Gln615 del “sensor del surco menor” sin sufrir ninguna distorsión (Breiba, 2004:3452) (Ilustración 4a). Estructuras cristalográficas de la T7ADN polimerasa (Breiba, 2004:3452) y de Bacillus ADN polimerasa (Hsu, 2004:217) revelan que el par 8oG·dATP es similar al par canónico Thy·dATP, en el sentido que el grupo O8 del 8oG(syn) ocupa la misma posición que el O2 de la Thy. El sitio de elongación no es tan ajustado como el sitio de inserción y permite que la base 8oG(syn) se acomode libremente sin ningún impedimento estérico. A pesar del mayor tamaño del par 8oG. dATP de bases con respecto al Thy·dATP, el evento mutagénico no es reconocido porque el sitio de elongación no es “apretado” como el sitio de inserción y la base 8oG(syn) no ejerce ninguna interacción negativa con la polimerasa.


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Ilustración 4. Bases estructurales de la elongación a partir de la lesión 8oG. A) Superposición entre el complejo 8oG·dCTP (naranja) y el complejo 8oG·dATP (azul). Estos dos complejos, una vez insertados en el sitio de elongación, son reconocidos por los residuos Gln615 y Arg429. B) Superposición entre el complejo 8oG·dATP (azul) y el par canónico Thy·dATP(gris). La posición del grupo O8 es idéntica al grupo O2 de la Timina. Esta disposición espacial engaña el sistema de edición de las polimerasas de ácidos nucleicos.

La perdida de eficiencia catalítica del par 8oG·dCTP puede ser debida a que el fosfato alfa rota aproximadamente 180° para evitar una colisión con el grupo O8 que afectaría la posición del grupo 3’OH del dCTP. Así, el evento mutagénico 8oG dATP engaña a los “sensores del surco menor” de las polimerasas de la familia A al mimetizar la disposición de aceptores-donadores de puentes de hidrogeno de un par Thy·dATP (ilustraciòn 4b).

Conclusiones

La lesión 8oG ha sido utilizada para entender cómo se llevan a cabo los eventos mutagénicos en las polimerasas de alta fidelidad. Este trabajo demuestra que la incorporación de un evento mutagénico 8oG. dATP se da por un mecanismo que es similar al de una incorporación fiel y se comprueba que el evento mutagénico 8oG. dATP puede engañar al sistema de edición de una polimerasa replicativa al mimetizar un par normal Thy dATP. La lesión 8oG se encuentra principalmente en mitocondria y se estima que una de las posibles causas el envejecimiento es la acumulación de mutaciones originadas por polimerasas mitocondriales, al tener como substrato 8oG en lugar de Guanosina. Es interesante comprobar que diversas DNA polimerasa gamma tienen amino ácidos como His o Phe, en el lugar correspondiente a Lys635 de la T7 ADN polimerasa. Estudios cinéticos han demostrado que las polimerasas mitocondriales tienen una preferencia por ser fieles (incorporación de dCTP) cuando encuentran la lesión 8oG, pero incorporan dATP en un 20% de los eventos replicativos. Entender fenómenos básicos como la fidelidad, está implicado en eventualmente diseñar herramientas de terapia génica, dado que se conoce que mutaciones de la DNA polimerasa gamma de humano son causales de enfermedades hereditarias.

Agradecimientos

LGB agradece el apoyo de la beca Fulbright-CONACYT durante su etapa doctoral; al “Pew Latinamerican Program”, por la beca posdoctoral y los fondos iniciales como investigador independiente en México; y a los Doctores Rui Sousa y Tom Ellenberger por sus invaluables enseñanzas


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Encuentro

Estudio preliminar de la diversidad genética en procedencias de Sabal

mexicana de Nicaragua aplicando marcadores

molecularesDomingo Guido1 y Verónica Díaz2

1. Tesista de la Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León)2. Docente-Investigador de la Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León).

Recibido: julio 2006 / aceptado: octubre 2006

PARA EVALUAR DE FORMA PRELIMINAR LA VARIABILIDAD GENÉTICA de 12 procedencias de Sabal mexicana Mart. en el Occidente de Nicaragua, se aplicó la técnica Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD). De las 42 bandas generadas por seis cebadores en una muestra de 44 individuos, 92.8% resultaron polimórficas. El mayor polimorfismo lo presentaron las procedencias en las cuales se analizó un mayor número de muestras (5), destacándose El Limonal (82.78%) y Santa Rosa (78.82%). El agrupamiento de las muestras en un dendrograma refleja alta diversidad genética entre ellas (25% de similitud). La mayoría de las muestras se ubican independientemente de la procedencia a la que pertenecen y de su localización geográfica, lo que puede ser debido principalmente al pequeño número de muestras (máximo 5) por procedencia, aunque también puede ser el resultado del pequeño número de cebadores (6) y a que, probablemente, la mayor diferencia genética se encuentre dentro y no entre las procedencias.

Palabras clave: genética-Nicaragua-evaluación / polimorfismo (zoología).

Introducción

La palma de techo (Sabal mexicana Mart.) es una planta no maderable que, desde tiempos inmemoriales, ha estado asociada a la actividad antropogénica, mediante el uso de sus hojas para techar construcciones y casas rurales (Ramos y Quezada, 1980). Actualmente representa un recurso económico importante especialmente para muchas familias nicaragüenses que la utilizan en el mercado artesanal, y en el sector turístico


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para el techado de ranchos rústicos (Armas y Canales, 2003), además del valor ornamental y paisajístico de la especie.

Durante años, las poblaciones de S. mexicana han sufrido serias perturbaciones ocasionadas por actividades como el incremento de la industria turística, avance de la frontera agrícola, etc., lo que ha provocado la rápida destrucción de las poblaciones de esta especie. Las consecuencias ecológicas de estas perturbaciones son evidentes; sin embargo, la pérdida y reducción de su diversidad genética deben evaluarse ya que puede tener graves consecuencias para la sobrevivencia de la especie. Se ha comprobado que, en muchas especies, la pérdida o baja diversidad genética, se relaciona con la reducción en su capacidad de reproducción y sobrevivencia (fitness reproductivo). Además, es precisamente la diversidad genética la que confiere a las poblaciones el potencial para evolucionar y adaptarse a los cada vez más acelerados cambios ambientales (Frankham y col., 2002).

Dada la creciente demanda de este recurso, es necesario realizar actividades de conservación y recuperación de palmares para un uso sostenible de la especie. Para ello, se requiere, entre otras acciones, detectar y estimar la diversidad genética presente en las diferentes poblaciones. La importancia del estudio sobre los niveles y distribución de la diversidad genética en poblaciones naturales para diseñar eficaces estrategias de conservación y manejo ha sido reconocida por diferentes autores (Hogbin y Peakall, 1999; Hamrick, 1994; González y Sosa, 2002); y por instituciones internacionales como el Programa de Medio Ambiente de las Naciones Unidas (PNUMA) y la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), que consideran los recursos genéticos como prioridad en los programas de conservación de la biodiversidad (Frankham y col., 2002).

Desde los años 80, se han desarrollado diferentes técnicas para detectar la variabilidad genética a nivel del ADN basadas en la PCR; entre ellas, RAPD, que se ha utilizado desde el inicio de los años 90 en una serie de estudios de caracterización y evaluación de la diversidad genética de diferentes especies (Soliman y col., 2003, entre otros).

Este trabajo tiene por objetivo realizar un estudio preliminar de la diversidad genética de 12 procedencias de palma (Sabal mexicana Mart.) de los departamentos de León, Chinandega y Masaya de Nicaragua, para determinar el nivel de diversidad genética (polimorfismo) y establecer el índice de similitud genética en las muestras analizadas. Esta información facilitaría la toma de decisiones acertadas para la conservación, reforestación y manejo de la palma paceña, en beneficio de los productores que disponen de este recurso y de los sectores populares que lo utilizan, haciéndolo sostenible de acuerdo a su demanda y en beneficio del medio ambiente.


Obtención del material vegetal. El material vegetal (semillas) utilizado en este estudio proviene de 44 individuos pertenecientes a 12 procedencias de los departamentos de León, Chinandega y Masaya (Ilustración 1). Las semillas fueron proporcionadas por el Proyecto "Dinámica Ecológica del Bosque Seco y Fomento del Cultivo de la Palma Paceña (Sabal mexicana Mart) en el Occidente de Nicaragua". Las muestras fueron recolectadas de


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palmares en sitios naturales, considerando una distancia mínima entre plantas de 50 a 100 m (Dávila, 2003).

Ilustración 1. Mapa sobre la ubicación geogràfica de las procedencias de Sabal mexicana utilizadas en este estudio (INETER 1998, ArcView 3.2 1996).

Extracción de ADN. Para la extracción del ADN, se utilizó el procedimiento de Möller y col. (1992) con pequeñas modificaciones. El ADN se aisló a partir de un polvo fino obtenido del embrión de cada semilla. El proceso de obtención de ADN se inició con 0.02 g de tejido, que se incuba inicialmente en un buffer de extracción TES (Tris 100mM, pH=8.00, EDTA 10 mM y SDS 2%) en presencia de proteinasa K (20 mg/ml) a 60ºC por 1 hora y posteriormente 10 min con NaCl 5M y CTAB al 10% para lograr la lisis celular. Para separar los ácidos nucléicos de otros compuestos y restos celulares, el homogenado se trata primeramente con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y luego, se centrifuga para recuperar el sobrenadante. Los ácidos nucléicos se precipitan en isopropanol a –20ºC; el sedimento se lava con etanol al 70%, se deja secar a temperatura ambiente y se resuspende en Buffer TE (Tris 10mM y EDTA 1mM). Para eliminar el ARN, se trata con ARNasa (10mg/ml) y, finalmente, el ADN se conserva a -20ºC. Se realiza un chequeo del ADN cualitativo por electroforesis y cuantitativo por espectrofotometría.

Proceso de amplificación por PCR. Las amplificaciones se llevaron a cabo básicamente por el procedimiento descrito por Williams y col., (1990), utilizándose un termociclador (Gene


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Amp PCR System 2700). Las reacciones se llevaron a cabo en un volúmen final de 25 ml y la mezcla consistió de agua, Buffer de PCR 10X, cebador 0.2mM, dNTPs 200mM, 5ng/ml de ADN y 1U de Taq polimerasa (Sigma). El programa se inició con una desnaturalización a 92ºC por 3 min seguidas por 45 ciclos de 30 seg a 92ºC, 1 min a 42ºC y 30 seg a 72ºC con una extensión final de 8min a 72ºC. Los productos de la amplificación se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 1.4% teñidos con bromuro de etidio (0.5ug/ml) y fotografiados sobre una lámpara UV.

Selección de cebadores. Se ensayaron 41 cebadores (OPERON) de secuencia arbitraria en tres muestras elegidas al azar, del total de 44 muestras y de ellos se seleccionaron seis que produjeron bandas de mayor intensidad, reproducibles y que detectaban polimorfismo, para analizar el total de las muestras.Análisis de datos. Con los marcadores obtenidos de la amplificación, se calculó el porcentaje de bandas polimórficas y se realizó un análisis de agrupamiento de las muestras por sus similitudes genéticas con el paquete estadístico NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versión 1.5 (Rohlf, 1993).

Resultados y discusión

Patrones de bandas. Los cebadores que produjeron mayor número de bandas fueron AE-16 y N-12 con 11 y 9 bandas respectivamente, teniendo los restantes cebadores un promedio de 4.7 bandas. Del total de 42 bandas obtenidas, 39 resultaron polimórficas (92.8%) lo que podría indicarnos la posible cantidad de variabilidad genética presente en estas procedencias.

Los cebadores que generaron mayor polimorfismo en el conjunto de la muestra analizada fueron AE-16 y E-12 (ambos con un 72%). A partir de la frecuencia de bandas polimórficas, se obtuvo el porcentaje de polimorfismo generado en las 16 procedencias con todos los cebadores y por cebador con cada una de las procedencias (Cuadro 1). Se puede observar que la frecuencia de bandas polimórficas es, por lo general, diferente en cada una de las procedencias con el conjunto de los cebadores, debido posiblemente, a la variabilidad presente dentro de las procedencias como a la diferencias en el tamaño de las muestras de cada procedencia: las procedencias que presentaron mayor porcentaje de polimorfismos fueron las representadas en este estudio con cinco individuos, destacándose entre ellas El Limonal (82.78%) y Santa Rosa (78.82%). Sin embargo, la procedencia de Aguas Calientes, a pesar de estar representada sólo por dos individuos, se encuentra entre las que presentaron polimorfismos aproximados al 65%, al igual que las otras tres procedencias con mayor número de muestras analizadas, lo que permite inferir una alta diversidad genética presente en esa procedencia. Con los cebadores utilizados no se obtuvieron bandas que diferenciaran una determinada procedencia, puesto que todas las procedencias compartían las bandas, pero en diferentes frecuencias.


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Cuadro 1. Porcentaje de bandas polimórficas obtenidas con RAPD. Número y porcentaje (de bandas polimórficas obtenidas con cada cebador en cada procedencia analizada, con sus respectivas medias).

Agrupamientos de procedencias de acuerdo a su similitud genética. En el análisis de agrupamiento de acuerdo a la similitud genética, obtenida a partir del método de análisis UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average), (Ilustración 2), todas las muestras se relacionan con un bajo porcentaje de similitud genética (25%) lo que significa que hay una alta diversidad genética entre ellas (75%). Las muestras se ubican en un total de ocho grupos principales, indistintamente de su procedencia y se disgregan a través del dendrograma, aunque pertenezcan a una misma procedencia, se puede observar una ligera


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tendencia a agruparse por procedencia en las muestras de El Limonal y Santa Olivia. Por lo tanto, tampoco se puede inferir alguna relación entre los agrupamientos generados y las localizaciones geográficas de las distintas procedencias.

Ilustración 2. Dendograma obtenido con el método de agrupamiento UPGMA, a partir de las distancias genéticas de Sabal mexicana Mart en las 12 procedencias analizadas.

Estos resultados se deben, probablemente a diversos factores. El primero y principal, es el pequeño número de muestras analizadas por procedencia: el máximo es de cinco en El Limonal, Santa Olivia, Santa Rosa, Santa Teresa y La Picota. El número de muestras en estudios para determinar diversidad genética en poblaciones naturales, generalmente se efectúa con poblaciones de más de cien individuos, con un promedio entre 15 y 20 individuos por procedencia o poblaciones (ejemplo, Bartish y col., 2000); en estudios con menor número de muestras, de seis a 13 por población, representan más del 50% del total de números de plantas por población (Nebauer y col. 1999). En otros trabajos consultados, el que presenta el menor número de muestras por población es de cinco en Gliricidia sepium aplicando la PCR (Dawson y col., 1995) y en Vitellaria paradoxa (Fontaine y col., 2004), número que es

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el máximo de muestras en el estudio de la palma, pero sólo en cinco procedencias, por lo que constituye un estudio preliminar.

En un trabajo reportado por Nybom y Bartish (2000), se concluye que, a pesar de la gran variación en el número de plantas por población (de 10 a 30 plantas), no se encontró ninguna asociación entre el parámetro No. de muestras con los parámetros de diversidad. En ese estudio, el menor número de muestras es de 10. Otro autor, Bussell (1999) no encontró cambios en la diversidad genética cuando incrementó el tamaño de las muestras de ocho a 14 y 30 plantas en dos poblaciones de Isotoma petrea. Sin embargo, experimentos de simulación han demostrado que la diversidad entre poblaciones decrece considerablemente de dos a cinco plantas (similar al número de muestras en este estudio de Sabal mexicana), pero se vuelve estable de 10 a 15 plantas (Isabel y col., 1999).

Otro factor que podría influir en estos resultados (pero en mucha menor medida), es que tan sólo se utilizaron seis cebadores que produjeron 39 marcadores polimórficos. Son pocos para tener resultados concluyentes de la extensión y distribución de la diversidad genética en la palma. En el estudio citado de Nybom y Bartish (2000), se reporta que no encontraron asociación entre el número de marcadores y los parámetros genéticos; sin embargo, recomiendan usar al menos de 50 a 100 marcadores polimórficos. Por lo tanto, serían suficientes pocos cebadores cuando éstos generan gran cantidad de marcadores polimórficos. Se reportan varios trabajos realizados con pocos cebadores; entre éstos, uno con tan sólo cinco cebadores (Chalmers y col., 1994) y con seis cebadores (Nebauer y col., 1999). Sin embargo, la mayoría de los trabajos publicados en los que se utiliza RAPD para análisis y estimaciones poblacionales, incluyen un promedio de 10 cebadores: en un estudio en P. oocarpa (Díaz y col., 2001) se utilizan 12 cebadores y Fontaine y col., (2004) usaron 15. Un mayor número de cebadores quizás habría generado bandas únicas en determinadas procedencias que permitieran la agrupación por procedencia. Un tercer factor a considerar en el resultado de este estudio es la posible cantidad de variación genética presente en estas procedencias. Debido a que, en general, el nivel de diversidad genética de las especies depende de muchos factores, incluyendo el tipo de cruzamiento (Gonzáles y Sosa, 2002), se realizó una intensa búsqueda bibliográfica para tratar de determinar el tipo de cruzamiento (autogamia o exogamia) de Sabal mexicana. No se encontró ningún reporte sobre esta información. El Doctor Brunell (2005), del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad del Pacífico (USA), que está realizando un estudio con esta especie utilizando el marcador AFLP, manifestó que tampoco ha podido obtener esa información.

En general, las plantas autógamas presentan menor diversidad genética que las alógamas debido a una gran influencia de la deriva genética. En este estudio de las 42 bandas generadas por los seis cebadores, 39 son polimórficos en el total de muestras analizadas. Es decir, un 92.8%, lo que indica la gran cantidad de polimorfismo presente en estas procedencias y la efectividad de los marcadores RAPD para detectar variación genética. Con esta técnica, se amplifican principalmente regiones del ADN no codificantes y repetidas que constituyen la mayor parte del genoma de los eucariotas, en las cuales las tasas de sustitución nucleotídica son el doble que en las regiones codificantes (Nei, 1987).


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La distribución de las diferentes muestras de las 12 procedencias en el dendrograma parece indicar que hubiera poca diferenciación entre las distintas procedencias, ya que algunas muy distantes geográficamente se agrupan más cercanamente. Esto podría ser debido a que la mayor variación genética esté dentro de las procedencias más que entre procedencias. Resultados similares se han reportado en diversos estudios utilizando RAPD. Por ejemplo, en la palmera canaria (Phoenix canariensis) con reproducción cruzada, en la que el 75.9% de la diversidad genética se encuentra dentro de las poblaciones y tan sólo el 24.1% entre poblaciones (González y Sosa, 2002). En Licuala glabra (Palmae), la partición de la varianza molecular usando AMOVA revela que la mayoría de la varianza total puede ser atribuida a la variación dentro de las poblaciones (68.4%), comparada con un 31.5% de diferenciación entre poblaciones (Loo y col., 1999). Resultados similares se obtienen también en otras especies alógamas con diferentes tipos de marcadores. Por ejemplo, con isoenzimas (Hamrick y Godt, 1989). Sin embargo, en este estudio, hay que considerar que experimentos de simulación han demostrado que la diversidad entre poblaciones decrece considerablemente de dos a cinco plantas, como se señaló anteriormente.

Estos resultados preliminares obtenidos en las procedencias de Sabal mexicana, sugieren que esta especie pudiera ser alógama, ya que la reproducción cruzada genera mayor diversidad genética intrapoblacional (González y Soza, 2002). Sin embargo, se requeriría hacer un estudio de polinización manual controlada o con marcadores alozímicos para determinarlo de forma definitiva. Tampoco existe reportado un estudio de variabilidad morfológica, ni en estas ni en otras poblaciones de Sabal mexicana presentes en Nicaragua que permitiera comparar los dos tipos de marcadores. A pesar de las pocas muestras analizadas por procedencia, se logró determinar un alto nivel de polimorfismo presente en ellas, y una gran eficiencia de los marcadores RAPDs para detectarla. Pero para obtener resultados más concluyentes de la diversidad genética presente en las procedencias de Sabal mexicana, es necesario aumentar tanto el número de muestras por procedencia como el número de cebadores para obtener mayor cantidad de marcadores moleculares y poder realizar estimaciones de sus frecuencias génicas • Agradecimientos

Los autores manifiestan su agradecimiento a la MSc. Rebeca Pastora y MSc. M. Inés Dávila por suministrar las semillas a través del proyecto Dinámica Ecológica del Bosque Seco y Fomento del Cultivo de la Palma Paceña (Sabal mexicana Mart) en el Occidente de Nicaragua. (MAGFOR-PROFOR, UNAN-León). Este trabajo fue apoyado por la Comunidad Autónoma de Madrid (CAM) y la Universidad de Alcalá de Henares en el marco de la Cooperación Española con la UNAN-León.


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Encuentro

Evaluación de la variabilidad genética en un ensayo de

progenies de Pachira quinata usando marcadore moleculares

Claudia Dolmus1, Ileana García1, Lourdes Callejas2

1. Tesista Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León).2. Docente investigador Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua (UNAN-León )

Recibido: julio 2006 / aceptado: octubre 2006

ESTE ESTUDIO EVALUO LA VARIABILIDAD GENÉTICA ENTRE y dentro de progenies de Pachira quinata (Pochote), procedente de la localidad de Ñámbaras, Boaco, en un ensayo de progenies en el Centro de Mejoramiento Genético–Banco de Semillas Forestales de León, por medio de marcadores RAPDs. Un 100% de las bandas polimórficas entre progenies y un 97.2% dentro de las progenies fueron generadas usando siete cebadores. Los dendrogramas obtenidos por UPGMA, tanto entre como dentro de progenies, demuestran una alta variabilidad (75%) e, inclusive, diferencias entre genotipos provenientes de semillas de la misma planta madre. Estos resultados muestran también que existe una alta variabilidad dentro de la población de P. quinata.

Palabras clave: genética forestal- Nicaragua-evaluación / mejoramiento selectivo de árboles / semillas de árboles / Pochote-mejoramiento de la especie.

Introducción

Pachira quinata (Pochote) es una especie forestal que, por su alto valor comercial, ha sido sometida por años a una explotación severa. Esta especie se estableció en 1992 en el Centro de Mejoramiento Genético–Banco de Semilla Forestal (CMF–BSF), ubicado en el kilómetro 79, carretera Managua–León, como ensayo de progenies con semillas de árboles procedentes de Ñámbaras en Boaco (Ampié, 1992), junto con otros ensayos con otras especies como roble, eucalipto, etc., con el fin desarrollar programas de obtención de semillas mejoradas genéticamente para la producción forestal y reforestación de especies económicamente importantes. En la actualidad, el ensayo de Pachira quinata es considerado como prioridad por el CMG–BSF, ya que es uno de los primeros a evaluar para establecerlo como huerto semillero.

Debido a que los árboles de Pachira quinata establecidos en el CMG–BSF se pueden


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considerar una reserva genética de esta especie, es necesario conocer el grado de variabilidad genética que existe entre estos árboles, para garantizar la conservación de la variación genética existente, al momento de hacer la selección del material que será eliminado por raleo en el proceso de establecimiento del huerto semillero.

El desarrollo de la Biología Molecular permite métodos moleculares potentes como el RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), que detecta secuencias polimórficas amplificadas al azar, útiles como marcadores moleculares para determinar variaciones entre genotipos. Este estudio se realizó con el objetivo de evaluar la variabilidad genética del ensayo de progenies de Pachira quinata establecido en el CMG–BSF por medio de marcadores RAPDs.

Los resultados de la evaluación de la variabilidad genética entre los árboles establecidos en el ensayo de Pachira quinata del CMG–BSF que se obtengan mediante este estudio, permitirá garantizar que, en la selección de árboles para la creación del huerto semillero, se contará con árboles con características fenotípicas deseables y con la suficiente variación genética. De esta manera, se conservará su actual variabilidad, que es la fuente genética que garantizará la producción de semillas con una base de genes que capacite a los futuros árboles adaptarse a cambios en las condiciones ambientales, contribuyendo así a que el CMG–BSF produzca semillas de alta calidad para el sector forestal.


Colecta de muestra

Se colectaron muestras de 62 árboles del ensayo de Pachira quinata establecido en el CMG–BSF. Los árboles fueron seleccionados al azar de cada fila del ensayo, colectándose muestras pertenecientes a 35 progenies distintas. Se utilizó un individuo por progenie (35) para determinar la diversidad genética entre progenies. En 17 de las 35 progenies se colectó más de un individuo hasta un máximo de cuatro, para determinar variabilidad genética dentro de progenies (44 muestras). Las muestras de cada árbol consistieron en hojas jóvenes que se dejaban en hielo mientras se trasladaban al Laboratorio de Genética Molecular del Departamento de Biología de la Facultad de Ciencias, de la Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua-León (UNAN-León), donde se mantenían a -20?C por un período no mayor de 15 días antes de ser utilizadas para la extracción de ADN.

Extracción de ADN

Se modificó el protocolo propuesto por Möller et al. (1992), con el fin de extraer el ADN de Pachira quinata a partir de aproximadamente 60 mg de tejido fresco, equivalente a 3 discos foliares realizados con la tapa del tubo eppendorf de 1.5 ml. Una vez triturado el tejido en 100 ml de buffer de extracción (Tris 100 mM pH =8, EDTA 10 mM, SDS 2% y PVP 2%) se le adiciona otros 400 ml de buffer de extracción y 4ml de m-mercaptoetanol 14.4 M para incubar por 30 min a 65 mC; luego se añade 140 ml de NaCl 5M y 65 ml de CTAB 10% y se continúa incubando por 10 min más.

Antes de separar el ADN de las proteínas y demás restos celulares por centrifugación a


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12,000 rpm por 10 min a 4°C con un volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se incuba el homogenizado en hielo por 20 min con 250 ml de acetato de amonio 5M.

El ADN se concentra y precipita con un volumen de isopropanol y luego el sedimento obtenido por centrifugación, es lavado dos veces con etanol 70%, secado a temperatura ambiente y resuspendido en un volumen adecuado de TE (Tris 10 mM y EDTA 1mM) para conservarlo a -20 °C, después de ser tratado con ARNasa 10 ng/ml.

Amplificaciones RAPDs

Basándose en la técnica descrita por Williams et al., (1990), 25 ng de ADN fue amplificado en un volumen final de 25 ml conteniendo buffer PCR 1X (50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl2, 10 mM de Tris–HCl pH =9), MgCl2 1.5 mM, dNTPs a 200 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, cebador o primer 0.2 mM y 1 unidad de Taq polimerasa. Las reacciones se realizaron en un termociclador modelo MiniCyclerTM M.J. Research programado para una desnaturalización inicial de 3 min a 92 °C, seguida por 45 ciclos de desnaturalización 30 seg a 92 °C, hibridación 1 min a 37 °C, elongación 1 min 72 °C y elongación final de 8 min a 72 °C.

Selección de cebadores

Se utilizaron cuatro muestras distintas de ADN de Pachira quinata para ensayar 45 cebadores pertenecientes al Laboratorio de Genética Molecular, con el fin de seleccionar los cebadores que, además de amplificar un patrón de bandas bien definido, generen mayor cantidad de polimorfismos entre las muestras ensayadas, definiendo así el poder usar un número menor de cebadores en las amplificaciones RAPDs con el total de las muestras de ADN a analizar en este estudio.

Análisis de datos

Utilizando el paquete estadístico NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analisys System) versión 1.5 (Rohlf, 1993), se construye con los marcadores RAPDs generados en las amplificaciones realizadas entre y dentro de progenies, una matriz presencia-ausencia, la cual se utiliza para obtener la matriz de similitud utilizando el coeficiente de Jaccard. A la matriz de similitud se le aplica un análisis de agrupamiento por medio del método UPGMA (Unweighted Pair Group Method Average). La agrupación resultante se representa gráficamente en una estructura arborescente o dendrograma a través del cual se estima la variabilidad genética de las muestras analizadas.

Resultado y discusión

Debido a que existe un gran número de cebadores oligonucleótidos cortos de secuencia arbitraria, se debe realizar una cuidadosa selección de los cebadores a utilizar (Loo et al., 1999), ensayando para cada nueva especie a analizar por la técnica RAPD, una prueba piloto en unos cuantos genotipos con diferentes cebadores bajo las condiciones de reacción óptima, para asegurar la obtención de productos de amplificación que generen patrones de bandas identificables, en los cuales se detecten los polimorfismos (Khasa et al., 1996).


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Del total de 45 cebadores ensayados en este estudio, 12 amplificaron : G-05, I-06, K-03, S-07, R-02, B-10, N-09, F-01, U-16, H-07, K-12 y B-05, utilizándose los últimos siete para las amplificaciones de todas las muestras de Pachira quinata . En la Ilustración 1 se muestran los resultados de la amplificación ensayada con N-09.

Ilustración 1. Patrones de bandas RAPDs generadas con el cebador N-09 en cuatro muestras de Pachira quinata (líneas 1 a 4). Línea M es el Marcador Ladder 1 ug/ml.

Con los siete cebadores utilizados en este estudio, se generaron un total de 82 bandas entre 35 progenies (35 muestras) y 72 bandas dentro de 17 progenies (44 muestras), con un rango de peso molecular entre 200 a 3,000 pb, lo cual corresponde a las distancias límite de los cebadores, citado por autores como Whitkus et al. (1994).

Todos los cebadores generaron un alto número de bandas polimórficas siendo el mínimo siete con H-07 y N-09, dentro de progenies y el máximo 14 con F-01 entre progenies. Esta alta cantidad de polimorfismos en las muestras y el hecho de casi todas las bandas fueron polimórficas (100% entre progenies y 97.2% dentro de progenies) refleja una alta variabilidad entre y dentro de progenies (Cuadro 1).


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Cuadro 1. Cantidad de bandas producidas de las amplificaciones RAPDs con siete cebadores entre 35 progenies (familias) y dentro de 17 progenies de Pachira quinata

Estos resultados coinciden con lo que menciona Nesbitt et al. (1997), quienes afirman que después de un rastreo inicial para seleccionar los cebadores que detectan polimorfismo entre individuos cercanamente relacionados, parece que no es necesario utilizar un gran número de ellos para evaluar la variabilidad.

Existen algunos estudios RAPD que han utilizados pocos cebadores (< 7) para estimar la variabilidad genética de especies forestales, como el realizado con cuatro cebadores en Ceratitis capitata obteniendo 74 bandas polimórficas (Baruffi et al., 1995); con seis cebadores en Licuala glabra se generaron 87 polimorfismos (Loo et al., 1999); y con seis cebadores en Sabal mexicana resultaron 39 bandas polimórficas (Guido, 2005), aunque este último estudio efectuado en el Laboratorio de Genética Molecular (UNAN–León) que realizó una estimación preliminar de la variabilidad en la palma de techo, recomienda usar al menos 50 a 100 o más marcadores polimórficos, según cita Nybom et al., (2000), para obtener estimaciones fiables de la variabilidad genética.

El dendrograma (Ilustración 2) obtenido de las muestras analizadas entre progenies (35) diferenció todas las progenies entre sí (ninguna de las muestras presentan 100% de similitud) y a la vez las relaciona en un solo grupo con un 25% de similitud genética, lo que significa que existe un alto porcentaje de variabilidad genética entre progenies de 75%. Al separarse estas progenies en dos subgrupos principales, mantienen siempre alta variación genética dentro de los subgrupos, siendo las progenies 55 y 58 las que más cercanamente se relacionan, con un 58%, lo que significa que la diferencia entre las dos muestras más cercanamente relacionadas, es mayor del 42%.


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Ilustración 2. Dendrograma generado con el análisis de agrupamiento por similitud genética entre 35 progenies de Pachira quinata. (Las muestras con decimal indican el número de individuo utilizado en el análisis entre progenies, para aquellas muestras con más de un individuo).

Los resultados de variabilidad detectada con el análisis de agrupamiento de los marcadores RAPDs entre las 35 progenies utilizadas en este estudio, no sólo determinan la existencia de una alta variabilidad en los árboles de Pachira quinata establecidos en el CMG–BSF, sino también, de manera indirecta estima que existe una alta variabilidad dentro de la población de la cual provienen, ya que tomando en cuenta la información brindada por el Ingeniero Eduardo Ampié (2005), según la cual los árboles de Pachira quinata establecidos en el CMG–BSF son individuos que proceden todos de semillas colectadas de una misma población natural de Ñámbaras (Boaco), donde fueron seleccionados de árboles a distancia mínima de 100 metros entre árboles, se puede considerar las 35 progenies como una muestra de dicha población.

Debido a la utilidad de la técnica RAPD para detectar variación dentro de poblaciones cuando ésta existe (Vicario et al., 1995), algunos investigadores la han utilizado para demostrar que las poblaciones naturales de especies de árboles tropicales mantienen un alto nivel de variación genética dentro de las poblaciones (Chalmers et al., 1992), al aplicar esta técnica en estudios de diferenciación genética en poblaciones como Theobroma cacao (Russell et al., 1993), Abies alba y Abies nebrodensis (Vicario et al., 1995).

Además, estos resultados están en concordancia con lo señalado por Hamrick (1990), en el sentido de que las plantas maderables perennes de larga vida y fecundación cruzada exhiben gran variabilidad dentro de las poblaciones (citado por Chalmers et al., 1992) lo cual ha sido demostrado en estudios como los realizados en poblaciones de Ilex paraguariensis


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(Gauer & Molina, 2000) y en Pinus oocarpa (Díaz, 2001), donde encontraron una positiva asociación entre estas características con la alta variabilidad detectada por RAPD dentro de estas poblaciones naturales.

Las flores hermafroditas pero altamente incompatibles de Pachira quinata (Stevens et al., 2001) permiten un sistema de reproducción por fecundación cruzada lo que, al parecer, causa un alto grado de variación, inclusive entre individuos muy cercanamente relacionados como las progenies provenientes de semillas de la misma planta madre, lo que se determinó en este estudio a través del análisis de agrupamiento dentro de progenies, donde se diferenciaron los genotipos analizados de una misma progenie con un considerable porcentaje de variabilidad genética.

En el dendrograma (Ilustración 3) que analiza la relación dentro de 17 progenies (con un total de 44 muestras), siempre se relacionan todas las muestras en un solo grupo con aproximadamente un 25% de similitud y, a la vez, se separan también en dos subgrupos principales en donde cada subgrupo mantiene la tendencia de agrupar individuos pertenecientes a una misma progenie, a excepción de una muestra de la progenie 20 (20.3), aunque la agrupación es de forma disgregada en cada subgrupo.

Ilustración 3. Dendrograma generado con el análisis de agrupamiento por similitud genética dentro de 17 progenies de Pachira quinata.


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La falta de asociación en un solo grupo de los individuos pertenecientes a una misma progenie (a excepción de las progenies 10 y 25) se debe a que ninguno de los cebadores utilizados presentó un patrón de bandas que unificara a los genotipos como miembros de una misma progenie, ya que no se generaron bandas que estuvieran presentes en una única progenie y bandas presentes en individuos de una progenie, a veces se presentaban en individuos de otras progenies distintas. Esto puede ocurrir porque, como individuos de una misma especie, comparten secuencias de bandas. Además, es bien sabido que bandas de diferentes individuos que se presentan en la misma posición en el gel no son necesariamente homólogas; o sea, no necesariamente provienen del mismo locus, ya que pueden ser originados por diferentes secuencias, pero con igual peso molecular, por lo que aparecen en la misma posición en el gel de electroforesis (Baruffi et al., 1995). Por la técnica Southern Blott se puede detectar si las bandas monomórficas generadas por un cebador son del mismo locus o no (Loo et al.,1999).

También, en las amplificaciones con la técnica RAPD, puede suceder que bandas de un mismo individuo que no son homólogas, pueden coemigrar en la misma posición en el gel. En el caso de las especies con grandes genomas, tienen mucho ADN repetitivo y, por eso, los cebadores simples que se usan en la técnica RAPD pueden amplificar muchos fragmentos, los cuales pueden migrar cerca uno del otro y probablemente también coemigran. Usar largos tiempos de corrida para separar los fragmentos durante la electroforesis puede reducir la posibilidad de visualizar un fragmento no homólogo como homólogo (Hurme and Savolainen, 1999). A pesar de estas limitantes, los polimorfismos que genera la técnica RAPD por presencia y ausencia la hacen una herramienta muy utilizada para cuantificar la variabilidad genética entre individuos o especies (Williams et al., 1990).

La variabilidad genética permite a los genotipos reaccionar y adaptarse a los cambios del medio ambiente (FAO, DFSC e IPGRI, 2002). Los resultados de este estudio demuestran que existe una gran cantidad de variación genética entre y dentro de las progenies del ensayo de Pachira quinata del CMG–BSF, lo que garantiza que se pueden seleccionar los mejores fenotipos y, a la vez, mantener entre ellos suficiente variabilidad genética en el huerto semillero que se establezca en este ensayo. Para ello, se deben contrastar los resultados de este estudio con las características morfológicas de interés comercial.

Tomando en cuenta que en programas de conservación de recursos genéticos se deben incluir también árboles con características fenotípicas no deseadas para la producción, como por ejemplo árboles de menor altura, porte defectuoso etc., que pueden constituir una reserva genética valiosa que les confiera características como resistencia a la sequía, plagas y enfermedades, etc., se recomienda considerar los resultados de este estudio para conservar la valiosa reserva de Pachira quinata existente en el ensayo del CMG–BSF manteniendo al menos una representación por progenie y cierta cantidad de individuos dentro de las progenies al momento de realizar el raleo en el establecimiento del huerto semillero. Además, se debe considerar la realización de futuros análisis RAPDs con muestras de Pachira quinata de diferentes orígenes geográficos, ya que se desconoce la distribución de la variación genética entre las poblaciones de esta especie en el país.


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Agradecimientos

Agradecemos a la Comunidad Autónoma de Madrid (CAM) por financiar este estudio desarrollado dentro del Programa de Genética Molecular del trienio 2003-2005, perteneciente al hermanamiento con la Universidad Alcalá de Henares (UAH)-Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua-León (UNAN-León). Damos las gracias también, al Ingeniero Eduardo Ampié, de la Dirección de Semillas Forestales del Ministerio Agropecuario Forestal (MAGFOR), por la información brindada sobre el establecimiento del ensayo de Pachira quinata donde se realizó este estudio, y al Centro de Mejoramiento Genético–Banco de Semillas Forestales, especialmente a la Licenciada Esperanza Toruño y a Raúl Castro por darnos acceso al ensayo para realizar la colecta de muestras. Además, agradecemos la colaboración brindada por David Cerda durante el tiempo de la colecta de muestras para este estudio.


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Encuentro

Control ecológico de malezas mediante el uso de las

propiedades alelopáticas de la flora nicaragüense: el inicio de

la experiencia en NicaraguaCarolina Vega-Jarquín1, Rosana Salgado2, Rodolfo Munguía3, Marvin Fornos3, Osman Espinoza4 y Carlos Mendoza4 1 Programa de Recursos Genéticos (REGEN), Universidad Nacional Agraria (UNA), Managua, Nicaragua. E-mail: carolina.vega@una.

edu.ni2 Departamento de Protección Agrícola y Forestal, Universidad Nacional Agraria (UNA), Managua, Nicaragua.3 Departamento de Producción Vegetal, Universidad Nacional Agraria (UNA), Managua, Nicaragua.4 Tesistas del Departamento de Producción Vegetal, Universidad Nacional Agraria (UNA), Managua, Nicaragua.


LAS INTERCCIONES BIOLÓGICAS MEDIANTE SEÑALES QUÍMICAS (alelopatía) tienen aplicaciones prácticas en la agricultura. Actualmente son un amplio campo de investigación agrícola de vanguardia. El Programa de Recursos Genéticos (REGEN) tiene como meta efectuar estudios de bioprospección de la flora nicaragüense y, paralelamente, contribuir al desarrollo de estrategias de control biológico y manejo sostenible, orientadas a la reducción de las densidades poblacionales de arvenses problemáticas identificadas en el país. La estrategia metodológica del proyecto consta de dos grandes fases: 1) estudiar la biología y ecología de la germinación de diferentes especies de malezas; y 2) evaluar en laboratorio y, posteriormente, escalar el estudio sobre el efecto alelopático de diversas especies de la flora nicaragüense sobre arvenses reconocidas como problemáticas y de alta incidencia nacional e internacional, como Rottboellia cochinchinensis y Echinochloa colona L. Paralelamente, implementar un sistema modelo utilizando variedades apropiadas de arroz (que se cultivan en Nicaragua) para los estudios de alelopatía. Resultados preliminares de los ensayos de germinación en condiciones de laboratorio, indican que los factores ambientales (humedad, temperatura) y diferentes mecanismos de dormancia podrían regular la germinación y la sobrevivencia de semillas de malezas; por lo que para efectuar cualquier estudio de control ecológico de malezas, se debe profundizar en el estudio de la biología y ecología de la germinación de las especies problemáticas.

Palabras clave: control de malezas / germinación / ecología vegetal / arroz-variedades-Nicaragua / alelopatìa


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Introducción

Las malezas son causa de grandes pérdidas en los ecosistemas agrícolas (Singh et al., 2003). Los rendimientos del cultivo pueden descender entre 45-95%, dependiendo de las condiciones ecológicas y climáticas (Moody, 1991); Stephenson (2000) reporta que en el mundo se utilizan aproximadamente 3 mill de ton/año de herbicidas para el control de malezas; sin embargo, actualmente se realizan grandes esfuerzos para reducir la dependencia de herbicidas sintéticos y limitar su uso, por la urgente necesidad de minimizar los serios problemas que generan los sistemas de producción agrícola convencionales: contaminación ambiental, daños a la salud humana, descenso de la agrobiodiversidad, efectos negativos sobre la salud de los suelos y reducción de la productividad del cultivo (Khanh et al., 2005). En este sentido, la alelopatía se ha sugerido como una de las posibles alternativas para alcanzar un manejo sostenible de malezas. Por ello, la investigación en torno a este fenómeno se considera estratégica (Duke et al., 2003) por la gran cantidad de problemas ambientales que presionan para que las actividades de desarrollo de la sociedad se sustenten en procesos y tecnologías limpios, amigables con el ambiente y que contribuyan a la permanencia de los ecosistemas.

El concepto de alelopatía y regulación biosintética de los aleloquímicos

Las plantas que crecen juntas compiten unas con otras física y químicamente. La competencia entre plantas ha sido definida como rivalidad por los recursos de espacio, luz, agua y nutrientes; mientras la alelopatía se refiere al efecto de las interacciones químicas. El término alelopatía proviene de la palabra griega allelon, que significa “uno al otro” y pathos, “afectado”. El creador del concepto de alelopatía fue Hans Molisch, fisiólogo vienés; por su parte, Elroy Rice (1984) definió el término como el efecto de una planta sobre otra a través de la liberación de compuestos químicos al ambiente. Esta definición amplia de alelopatía incluye los efectos negativos (inhibición del crecimiento) y positivos (promoción del crecimiento). Sin embargo, en la actualidad se ha sugerido que la alelopatía se estudie en el contexto de la ecología-química de los suelos y podría considerarse como una interacción química directa entre planta y planta.

Lambers et al. (1998), definieron el término alelopatía como la eliminación o disminución del crecimiento de una especie de planta debido a la liberación de compuestos tóxicos provenientes de otra. Los avances recientes en las técnicas cromatográficas han permitido encontrar compuestos biológicamente activos que pueden explicar el comportamiento alelopático (Duke et al., 1998); terpenos y compuestos aromáticos (fenoles, taninos, quinonas) son los dos principales grupos químicos implicados como agentes alelopáticos. Estos compuestos naturales se conocen como aleloquímicos y diversos autores han mencionado que su producción es un fenómeno que depende de la interacción gen-ambiente (Olofdotter et al., 2002; Inderjit and Duke, 2003), diferentes tipos de estreses incrementan la producción de aleloquímicos y algunos estudios ilustran claramente que la síntesis de éstos pueden ser controlada, al nivel transcripcional, por medio de factores ambientales (N fertilización); compuestos usados como herbicidas podrían también influir en la síntesis de los aleloquímicos (Lydon y Duke, 1993). El-Khawas y Shehata (2005) reportaron también que la síntesis de estos compuestos alelopáticos producidos por las plantas está


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regulada por factores ambientales abióticos como luz, temperatura, humedad, nutrientes y microorganismos del suelo. De todo ello se deduce que la regulación de la biosíntesis de estos compuestos naturales es altamente compleja. Los mecanismos que intervienen son de gran interés científico y, probablemente, entenderlos contribuirá a aplicarlos en el manejo sostenible de los cultivos, al permitir un control de malezas y plagas con un muy bajo o ningún efecto negativo sobre el ambiente y que contribuye a reducir el uso de herbicidas sintéticos.

Inderjit y Duke (2003) enfatizan que el término aleloquímico se relaciona con el papel que un compuesto desempeña en una situación dada y no con la identidad química de dicho compuesto. Por tanto, para considerar un compuesto químico como un agente alelopático, debe analizarse: la forma en que es liberado al ambiente, su acción fitotóxica (sitio “blanco”), su concentración bioactiva, su persistencia y su destino en el ambiente. Por otro lado, aunque las características alelopáticas de determinadas especies o cultivos pueden ser consideradas como un rasgo genético que incrementa la capacidad competitiva de dichas especies (Olofsdotter, 2001) el entendimiento de los componentes genéticos, fisiológicos y ecológicos de este complejo mecanismo químico natural tienen una importancia creciente en la investigación científica. Actualmente hay opiniones concontrapuestas acerca del potencial alelopático de diferentes compuestos químicos liberados por las plantas, porque numerosos investigadores coinciden en que es difícil documentar pruebas de esta actividad en condiciones de campo (Inderjit y Nilsen, 2003).

Perspectivas de la alelopatía como un componente del manejo sostenible de los agroecosistemas

Los plaguicidas sintéticos no sólo afectan a las plagas y los cultivos. También actúan negativamente sobre el suelo, especies benéficas, reservas de agua, alimentos y la salud humana. Sin embargo, compuestos de origen biológico como los que intervienen en la interacción entre plantas a través de señales, tienen aplicación práctica en la agricultura y constituyen un campo de investigación agrícola de vanguardia. Adicionalmente, un gran número de arvenses y árboles presentan propiedades alelopáticas con efectos inhibitorios sobre el crecimiento de las especies vegetales, pero ha sido reconocido que la alelopatía juega también un papel importante en la inhibición del crecimiento de especies consideradas como malezas (Chung et al., 2003) y se postula que los factores que pueden influenciar la actividad de un compuesto aleloquímico son producto de interacción genética-ambiente (Olofsdotter et al., 2002). Por ello, el uso de la alelopatía para controlar malezas puede realizarse utilizando directamente las interacciones alelopáticas naturales, particularmente de las plantas cultivadas, o usando los aleloquímicos como herbicidas naturales. Este uso de la alelopatía debe ser estudiado para cada situación. En el primer caso, las plantas cultivadas que presentan potencial alelopático al ser usadas como cobertura (mulch, abonos verdes, en sistemas de rotación o en cultivos en asocio) sirven para reducir el efecto de las malezas y de patógenos de plantas, mejoran la calidad del suelo y los rendimientos de los cultivos. En el segundo caso, los aleloquímicos presentes en las plantas superiores, incluyendo especies no cultivadas, podrían ser usados directamente para el manejo de malezas, contribuyendo al desarrollo de herbicidas biológicos.


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Actualmente, es de importancia estratégica global el desarrollo de sistemas de cultivo en que se investiguen y aprovechen estrategias de manejo de los agroecosistemas, basadas en el manejo adecuado de las interacciones biológicas, en su estabilidad y en la búsqueda y uso de tecnologías limpias y amigables con el ambiente. Las investigaciones en agricultura orgánica y sostenible están enfocadas en el mejoramiento genético, la fertilidad de los suelos, las labores culturales, la protección de los cultivos y en los sistemas de cultivo. La alelopatía y la ecología química están directamente involucradas en cada uno de estos aspectos y pueden jugar un papel importante en la productividad del cultivo, en la conservación de la diversidad genética y en el mantenimiento de la estabilidad de los ecosistemas. De manera que en el diseño de estrategias apropiadas para conseguir una producción sostenible con el mínimo deterioro ambiental, el estudio de la alelopatía podría contribuir con el manejo general de las especies en tiempo y espacio, ya que podría ser la base para el control biológico de plagas y malezas y para el descubrimiento de nuevas drogas, herbicidas, plaguicidas y reguladores de crecimiento biodegradables.

Compuestos alelopáticos y bioensayo

Los bioensayos o pruebas de toxicidad son herramientas analíticas biológicas para cuantificar la toxicidad de un contaminante o de una muestra ambiental utilizando organismos específicos (Renoux y Sunahara, 2002). Los bioensayos son usualmente diseñados para probar una hipótesis. Rimando et al. (2001) señalan que cuando el objetivo de una investigación es la búsqueda de un compuesto activo cuya identidad química es desconocida, la mejor elección son los bioensayos de exploración que integran los resultados de las pruebas de actividad biológica con el proceso de separación de compuestos en una mezcla. La mayoría de los estudios sobre aleloquímicos o ecotoxinas se efectúan inicialmente en el nivel de laboratorio, aunque estos experimentos tienen muchas limitaciones porque, en condiciones de campo y dada la complejidad biosintética de estas señales químicas naturales, podrían combinarse diferentes componentes para originar el efecto alelopático.

Sin embargo, los bioensayos constituyen una herramienta importante para entender un particular componente de la alelopatía. Son muchos los fenómenos que se pueden estudiar mediante bioensayos: la presencia y liberación de aleloquímicos, el efecto de los aleloquímicos, la inhibición del crecimiento de la “especie blanco”, o la interferencia de éste sobre procesos fisiológicos, la destoxificación e incluso la interacción de promotores, inhibidores, y el efecto de los aleloquímicos sobre la dinámica de nutrientes o sobre la ecología microbiana; pero los parámetros de crecimiento a evaluar deben ser cuidadosamente seleccionados en el diseño de los bioensayos. Además, los resultados negativos no deben tomarse como prueba definitiva de que los aleloquímicos no están presentes. Por ello, la realización de bioensayos in situ es una de las mejores formas de asegurar que cualquier prueba de alelopatía refleje las condiciones de los ecosistemas naturales o agrícolas.

La Ilustración 1 justifica por qué el uso de compuestos naturales en la protección de cultivos es una tendencia actual de la agricultura, debido al interés mundial por disminuir el uso de agroquímicos; asimismo, la necesidad de diseñar y desarrollar investigaciones que permitan comprender las interacciones biológicas-químicas entre plantas. Estas investigaciones contribuirán a crear los fundamentos teóricos del manejo sostenible de malezas y plagas.


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Por ello, el estudio de las propiedades alelopáticas de determinadas especies de la flora nicaragüense y posterior identificación de los aleloquímicos constituye una prioridad en la búsqueda de estrategias de control ecológico y del establecimiento de sistemas agrícolas sostenibles y amigables con el ambiente.

Ilustración 1. Aplicación de plaguicidas en campos de arroz (Sébaco, Nicaragua)

Estrategia metodológica

La estrategia metodológica del proyecto consta de dos grandes etapas: 1) estudio de la biología y ecología de la germinación de diferentes especies de malezas; y, 2) evaluación a nivel de laboratorio y, posteriormente, escalar el estudio sobre el efecto alelopático de diversas especies de la flora nicaragüense sobre arvenses reconocidas como problemáticas y de alta incidencia nacional e internacional. Paralelamente, se implementará un sistema modelo utilizando variedades apropiadas de arroz que se cultivan en Nicaragua, para los estudios de alelopatía.


La primera etapa se inició con el estudio de la biología y ecología de Rottboellia cochinchinensis y Echinochloa colona L. Cada especie fue investigada por separado. Las semillas de Echinochloa colona L fueron colectadas en Malacatoya, departamento de Boaco (12° 35' 60N/85° 43' 0W) y las de Rottboellia cochinchinensis, en el departamento de Managua, hacienda Las Mercedes y en el departamento de Masaya, hacienda El Plantel. Las semillas se colectaron en octubre en fincas de experimentación de la UNA. Las semillas de las dos especies se colectaron y limpiaron manualmente y se secaron a temperatura ambiente (uno u once días); o se almacenaron en bolsas en cuarto de conservación de germoplasma (8º C) del Programa de Recursos Genéticos (REGEN), para las que se utilizaron para estudios de interrupción de dormancia.


��Ilustración 2. Planta completa (izquierda) y semillas de Echinochloa colona

En cada caso, el diseño experimental utilizado fue un DCA y cada estudio tuvo dos fases: a) pruebas preliminares de germinación; y, b) estudio de interrupción de dormancia. Las pruebas preliminares consistieron en germinar semillas de ambas especies a iguales condiciones de temperatura y luz: 25 semillas de cada especie se pusieron a germinar sobre o entre papel filtro Whatman No. 4 o sobre humus (abono orgánico proveído por BIO-GREEN) esterilizado previamente, o no; y humedecido a capacidad de campo con agua destilada en placas petri. Posteriormente, las placas fueron trasladadas a una cámara de germinación en las que permanecieron durante un mes a 26º C en condiciones de oscuridad. Los ensayos de germinación de las pruebas preliminares fueron realizados después de uno u once días de almacenamiento a temperatura ambiente (aproximadamente 36º C) de las semillas colectadas. Cada placa tuvo cuatro réplicas.

Cuadro 1. Tratamientos evaluados en la fase a) Pruebas preliminares de germinación


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Posteriormente, se realizó un segundo experimento para la fase b de ambas semillas y se utilizaron dos métodos de escarificación de la semilla: 1) química (H2 SO4 , 60 % v/v); y 2) mecánica (papel lija) y tratamientos con calidad de luz (roja), como métodos de interrupción de dormancia. En este caso, se evaluó la repuesta de germinación a 26º C y 20º C.

Ilustración 3. Montaje y distribución de placas en la cámara de germinación

Resultados y discusión

Las pruebas preliminares realizados con Rottboellia cochinchinensis y Echinochloa colona L, en iguales condiciones de temperatura y luz, mostraron algunas diferencias entre ambas especies, ya que únicamente las semillas de R. cochinchinensis respondieron positivamente a los tratamientos (T1) y (T2). Sin embargo, los porcentajes de germinación obtenidos mediante estos tratamientos fueron bajos: 18% y 5% respectivamente. En los tratamientos de la fase a no germinó ninguna semilla de E. colona. En cuanto a las pruebas de germinación con las semillas que fueron secadas a temperatura ambiente durante 11 días, la germinación de R. cochinchinensis fue aún menor (8%) y las semillas que germinaron fueron únicamente las del tratamiento (T1). En este ensayo, se observó la germinación de una semilla de E. colona con el tratamiento (T1). Por otro lado, pruebas de viabilidad realizadas sumergiendo las semillas de ambas especies en una solución al 2% de 2, 3, 5 cloruro de trifeniltetrazolium (TTC) mostraron viabilidad entre 80-90% para ambos tipos de semilla (Ilustraciones 4 y 5). Milberg (1994), señaló que existe un amplio espectro en el comportamiento de la germinación de especies herbáceas vegetales y destacó la importancia de esta diversidad de estrategias biológicas para mantener las poblaciones y prevenir la extinción de dichas especies. Adicionalmente, Noronha et al. (1997), mencionaron que la capacidad de las malezas para acumular semillas en el suelo es uno de los más importantes medios de supervivencia y la persistencia de estas semillas en el suelo depende de sus mecanismos para evitar la germinación de las semillas enterradas; sin embargo, los resultados de este experimento son preliminares y no son aún suficientes para diferenciar qué mecanismos o factores controlan la germinación de las semillas de R. cochinchinensis y E. colona que crecen en Nicaragua.


��Ilustraciòn 4. Semillas viables de Rottboellia cochinchinensis teñidas con TTC (2%)

Ilustración 5. Semillas viables de Echinochloa colona teñidas con TTC (2%)

El desarrollo de la fase b está actualmente culminando y los datos preliminares de los resultados muestran que la dormancia de estas semillas podría ser producida por impermeabilidad de la testa o cubiertas seminal al agua o a los gases, puesto que la germinación de ambas especies alcanzó valores arriba del 50% al utilizar los métodos de escarificación para interrumpir la dormancia. Sin embargo, se deben concluir los análisis estadísticos para postular con mayor certeza si la dormancia de estas especies es mecánica (cubierta seminal endurecida), primaria (semilla dormante desde el momento que es liberada por la planta) (Crocker, 1914; Tayz y Zeiger, 2002) o una combinación de ambas.


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La realización de estos primeros experimentos acerca de la biología y ecología de la germinación de malezas, ha sido un paso necesario para buscar la especie de maleza que, de manera más idónea, pueda ser utilizada como blanco o especie receptora de los bioensayos. Adicionalmente, se ha detectado que hay muy pocos datos en la literatura científica acerca de aspectos relacionados con la germinación de malezas, aunque recientemente ha surgido gran interés al respecto, probablemente debido a la necesidad de generar información sobre el manejo sostenible de malezas, que tiende a reducir el uso de plaguicidas sintéticos.

Conclusiones y perspectivas

Resultados preliminares de los ensayos de germinación en condiciones de laboratorio, indican que los factores ambientales (humedad, temperatura) y diferentes mecanismos de dormancia podrían regular la germinación y la sobrevivencia de semillas de malezas; por lo que, para efectuar cualquier estudio de control ecológico o estrategia de manejo sostenible de malezas, deberá inicialmente profundizarse en el estudio de la biología y ecología de la germinación de estas especies problemáticas. Adicionalmente, las investigaciones para manejar malezas o plagas mediante el uso de productos naturales biodegradables, como los compuestos con propiedades alelopáticas, es de importancia estratégica para los países en vías de desarrollo, dond el uso de modernas técnicas biotecnológicas (genómica, proteómica) esta característica puede contribuir al desarrollo de herbicidas y plaguicidas “biológicos”. Simultáneamente, la adecuación, por la generación de información y conocimiento, de prácticas agrícolas que potencien el uso de la alelopatía de acuerdo a las condiciones y metas de los agricultores en Nicaragua es una de las aplicaciones prácticas más importantes de este proyecto de investigación que apenas inicia. Agradecimientos

Los autores agradecen al Programa de Apoyo al Consejo Investigativo (PACI) de la Universidad Nacional Agraria (UNA) por el apoyo financiero que nos ha permitido abrir esta área de investigación.


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Encuentro

Genómica del Trypanosoma cruzi. Nuevas oportunidades para tratar el mal de Chagas

Jorge A. Huete-Pérez1

1. Centro de Biología Molecular de la Universidad Centroamericana (UCA). Apto. 69 Managua, Nicaragua. E-mail: [email protected]


LA SECUENCIACIÓN DEL GENOMA HUMANO PUBLICADA EN FEBRERO de 2001 ha sido considerada como el hito científico más importante del siglo XX. La secuenciación, cuatro años más tarde, de tres parásitos tripanosmatidas, entre ellos el Trypanosoma cruzi, podría ser también catalogada como uno de los acontecimientos científicos más importantes para la salud publica del continente americano. Aquí se presenta un panorama general sobre los resultados más significativos del estudio geonómico del T. cruzi, se abordan los trabajos realizados por nuestro laboratorio en la Universidad Centroamericana, finalizando con una discusión sobre las perspectivas del uso de la genómica en Nicaragua1.

Palabras clave: Tripanosomiasis americana-diagnóstico / genoma humano-análisis.

Introducción

Con el advenimiento de la era genómica comenzando por el desciframiento del genoma humano (Venter, 2001; Lander 2001), se afianza la noción de que buena parte de las enfermedades podrán tener cura algún día. Se ha pensado en particular de enfermedades, hasta ahora incurables o hereditarias, como el cáncer o el alzheimer. Esta esperanza también se ha extendido a las enfermedades infecciosas como el mal de Chagas, especialmente ahora que, además del genoma humano, se cuenta con la secuencia completa del parásito, T. cruzi (El-Sayed, 2005a), así como también las secuencias de otros parásitos similares, Tripanosoma brucei (Berriman, 2005) y Leishmania (Ivens, 2005), causantes de grandes sufrimientos en el mundo.

Desafortunadamente, el enorme impacto que causan las enfermedades parasitarias no ha sido hasta ahora razón de suficiente peso para interesar a los tomadores de decisiones sobre estos temas urgentes de la salud pública. A pesar de toda la tragedia causada en los países en vías de desarrollo, la enfermedad de Chagas, la leishmaniasis y la enfermedad del sueño o tripanosomiasis africana, han sido ignoradas por la gran industria farmacéutica y la investigación moderna, acaso por la poca rentabilidad económica que se esperaría lograr de los tratamientos modernos. Estas enfermedades se conocen como dolencias de pobres,


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porque su transmisión vectorial está ligada a las condiciones de pobreza, malnutrición y viviendas insalubres.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS-OPS), más de 20 millones de personas en América Latina están afectados por el mal de Chagas (World Health Report, 2002), y unas 50.000 personas mueren cada año por esa enfermedad, que es endémica en América del Sur y Centroamérica.

El mal de Chagas o tripanosomiasis americana, se transmite por picadura del chinche, insecto vector también llamado vinchuca y chipo en varios países, que se esconde en grietas y rendijas de casas construidas de madera o adobe y techos de paja. Con la picadura, el T. cruzi, parásito causante de la enfermedad, penetra en la herida. Pero la forma de entrada no es el pinchazo, sino na forma más repugnante. Este parásito unicelular se introduce en las células epiteliales por las heces que el insecto defeca mientras extrae sangre de sus víctimas. Una vez en el sistema sanguíneo, el parásito se encamina hacia los órganos vitales. También ocurre la transmisión del parásito por transfusión sanguínea o por vía congénita: de madre a hijo durante la gestación.

Por el torrente sanguíneo, el parásito se dirige a órganos los vitales conllevando a “mega síndromes” que deforman el esófago o el colon y, en ocasiones, puede afectar también al sistema urinario y nervioso. En muchos casos, sin embargo, el parásito radica en los músculos del corazón, en donde puede causar infarto y paro cardiaco.

La persona afectada puede ser portadora durante 15 ó 20 años sin manifestar ningún síntoma. Actualmente no existe tratamiento para los adultos y la única terapia disponible (Nifurtimox y Benznidazole) sólo es eficaz en menores de 15 años y durante la fase aguda, cuando aún no se expresan los trastornos.

En esta revisión bibliográfica, se presenta un panorama general sobre los resultados del proyecto genómico del T. cruzi, cuya secuencia final se publicó en la revista Science del 15 de julio de 2005. Se discute también el trabajo que se efectúa sobre el tema en el laboratorio de la Universidad Centroamericana y se finaliza con una discusión sobre las perspectivas del uso de la genómica en Nicaragua.

Genética y genómica

El T. cruzi (protozoario flagelado, orden Kitoplastida) tiene un ciclo de vida complejo que alterna cuatro etapas principales en dos hospederos. En el insecto vector se encuentra en forma de epimastigota y trypomastigota cíclico; mientras que en el vertebrado, los estados son tripomastigotas sanguíneo y amastigota intracelular. La transcripción del ARN es policistrónica, el ARNm sufre procesamiento de tipo trans-splicing y los genes no presentan intrones.

Mediante el uso de marcadores polimórficos, se ha demostrado que las cepas de T. cruzi se agrupan en dos grandes bloques taxonómicos: T. cruzi I y II (Brisse S, 2000). Se ha encontrado que el grupo II es más heterogéneo y que puede clasificarse en más detalle en los


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subgrupos II-a hasta II-e. El Tc I se ha asociado con la transmisión selvática en marsupiales, mientras que el Tc II con el ciclo domiciliar y en mamíferos.

T. cruzi tiene una estructura clonal (Tibayrenc 1990; Tibayrenc, 2002) siendo que cada linaje se replica asexualmente. La reproducción clonal se evidencia a partir de estudios que muestran la ausencia de genotipos segregacionales y la drástica desviación de Hardy-Weinberg en regiones geográficas particulares. Otras evidencias incluyen la asociación significativa entre conjuntos separados de caracteres genéticos por RAPD y marcadores de microsatélites. El T. cruzi no condensa cromosomas durante la división mitótica y presenta gran heterogeneidad en el número de cromosomas entre cepas y clones, además de polimorfismo entre cromosomas homólogos.

El genoma total fue secuenciado usando una metodología conocida como de “shotgun” (Whole Genome Shotgun, WGS). La cepa utilizada en la secuenciación fue la Cl-Brener, una cepa de laboratorio que genéticamente es un híbrido resultante de un cruce entre T. cruzi II-b y II-c. Esta selección creó controversia entre los investigadores porque el análisis de una cepa híbrida puede presentar mayores dificultades de entendimiento que un clon puro. Sin embargo, la razón de peso predominante fue que la cepa Brener era la que mejor se había estudiado.

Como resultado de la secuenciación, el genoma se presenta como un listado completo del “código” (secuencia) del parásito, que encierra información relativa a sus características de virulencia, mecanismos de reparación, reproducción, ciclo de vida y metabolismo, entre otras. A partir del descifrado de la secuenciación del ADN genómico presente en el núcleo de los parásitos, utilizando equipos secuenciadores de alta tecnología, se identificaron los genes, se dilucidó su estructura y se determinó su función. Inmediatamente, la principal tarea consistió en el análisis y comparación de los genomas de los tres parásitos utilizando múltiples herramientas bioinformáticas y programas sofisticados para elaborar mapas genéticos.

El genoma final consta de un total de 8740 contigs para un total de 67 Mb. De estos, 4087 contigs representan la mayoría de la parte codificante del genoma. El resto representa principalmente regiones repetitivas. Puesto que el parásito es diploide, el análisis se complica por estarse considerando información doble. El genoma diploide se estima en cerca de 110 Mb.

La secuenciación del genoma de T. cruzi ha permitido determinar un total de 12000 genes, de los cuales hay un conjunto de 1300 genes nuevos o nunca antes encontrados. Se supone que la acción de estos genes nuevos podría explicar la capacidad del parásito de pasar inadvertido durante años en el organismo y eludir la acción del sistema inmune del paciente. Junto con la descripción del genoma de T. cruzi también se ha presentado una descripción de las proteínas que están presentes cuando el parásito infecta el organismo humano. Se espera que muchas de estas proteínas sean buenas candidatas a vacunas contra el parásito, por lo cual se han abierto nuevas líneas de investigación. En el Cuadro I se recopilan los hallazgos más significativos.


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Cuadro 1. Resultados más sobresalientes del estudio genómico y su ámbito de repercusión y aplicación.

Las familias de proteínas que representan los grupos más abundantes son proteínas de superficie: mucinas y proteínas asociadas a mucinas (MASP), el grupo de las Trans-sialidasas, las Glycoproteínas de superficie Gp63 proteasas, que pueden constituir hasta el 18% del total. Además, un grupo importante de proteínas abundantes son las Beta-Galacto-Furanosil-Transferasas.

Algunas cepas de T. cruzi contienen hasta 130 copias del gen “cruzain” (también conocido como cruzipain o glicoproteína gp57/51) que codifica la cisteíno-proteasa “cruzaína”. Otras cepas contienen apenas 5-6 copias, como el caso de la cepa Y. Estos genes están acomodados en repeticiones subsecuentes y, aunque existe polimorfismo, la secuencia es bien conservada. La cruzaína juega un rol crítico en el desarrollo y supervivencia del parásito a nivel intracelular en el hospedero, lo cual ha sido un atractivo para los investigadores que buscan nuevos fármacos (McKerrow, 1999). Incluso se han llegado a identificar algunas regiones importantes de la proteína en los procesos de tráfico intracelular y su relevancia en el procesamiento de la proteasa (, Engel, 2000; Huete-Pérez, 1999).

Genómica comparativa. A partir de la secuenciación del genoma de T. cruzi se sabe que éste es un poco mayor que el de sus parientes cercanos, T brucei y Leishmania, los parásitos que causan la enfermedad del sueño en África y la leishmaniasis. Sin embargo, a pesar de las diferencias, los tres parásitos comparten 6.200 genes y esto ha llamado la atención sobre las posibilidades de encontrar estrategias comunes para una nueva generación de medicamentos que combatan los tres parásitos (El-Sayed, 2005b). Por otra parte, un propósito alternativo sería identificar los genes diferentes que estén relacionados con las patologías específicas de cada enfermedad.

Vacuna contra el mal de Chagas. El uso de las nuevas tecnologías moleculares ha permitido también descartar la vieja teoría que consideraba la cardiomiopatía chagásica


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como una respuesta auto inmune, mientras ahora se le considera más bien como respuesta a la presencia latente del parásito en los distintos órganos. Por lo tanto, una implicación terapéutica inmediata es que todo paciente chagásico, incluyendo el crónico, podría beneficiarse con el tratamiento de rutina para evitar daños al tejido cardíaco. Por lo tanto, habiéndose identificado nuevos genes y posibles proteínas, valdría la pena retomar e intensificar los esfuerzos para la formulación de vacunas contra el mal de Chagas (Garg, 2005).

En ese sentido, los estudios sobre vacunas para leishmaniasis están más avanzados. Ya está prevista la realización de un nuevo ensayo de protección contra L. amazonensis, L. major y L. infantum. En el caso de T. brucei, a diferencia de los otros dos parásitos secuenciados, los científicos consideran que será más complicado desarrollar una vacuna por su capacidad para eludir la acción del sistema inmune. En este aspecto, los estudios genómicos pusieron en evidencia la existencia de un vasto arsenal de genes “dormidos” que permiten al parásito escapar a la respuesta inmune del hospedador.

Genoma del chinche. Los chinches (hematófagos del orden Hemíptera), son los vectores de transmisión del mal de Chagas. Recientemente se han empezado estudios para decodificar su genoma, lo cual puede dar la clave para que la ciencia devela totalmente cómo se origina y transmite el mal de Chagas y combatir este terrible mal. La decodificación de este genoma aportará conocimientos en la búsqueda de soluciones.

Este mapa genético lo realizarán científicos de varios países como Argentina, Brasil, Uruguay, Paraguay y Chile, con el apoyo del Instituto Pasteur de Francia y de la fundación Argentina “Conicet”. Esta iniciativa regional también empleará el método de secuenciación llamado "shotgun". Se fraccionará el genoma de los insectos a estudiar y se secuenciarán los extremos de esos fragmentos. Finalmente, se ensamblarán todas las lecturas hasta rearmar el conjunto de sus genes. Según los planes, se trabajará con ejemplares de tres de las especies triatominas que transmiten el parásito del Chagas: Triatoma infestans, Triatoma dimidiata y Rhodnius prolixus, todas las cuales existen en Centroamérica.

Todos estos insectos triatominos se establecieron primeramente en medios silvestres, pero con el tiempo se fueron adaptando a residir dentro de las viviendas humildes de paredes de adobe y techos de paja y también peri-domiciliarmente, en gallineros y establos. De esta forma, los insectos se convirtieron en la principal vía de transmisión del Chagas. Algunos tipos de triatominos son principalmente domésticos o bien silvestres, pero pueden alternarse cuando se perturba su hábitat natural. Estas observaciones deben tomarse en consideración en las estrategias de eliminación del vector y reducción de la transmisión vectorial.

Investigaciones en la UCA

El mal de Chagas constituye una de las mayores causas de morbi-mortalidad entre los habitantes de las regiones pobres de América Latina. En Nicaragua no se tiene datos definitivos sobre la magnitud real del problema, los datos preliminares indican una situación preocupante. En lo que respecta a Nicaragua, a pesar del enorme esfuerzo de profesionales y técnicos, el país no cuenta con estudios científicos suficientes que permitan


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una valoración confiable de la magnitud real de la situación epidemiológica. Sin embargo, una encuesta de 2000 realizada por el Ministerio de Salud (MINSA), entre escolares de 7 a 14 años, refleja la gravedad del asunto: la mitad de los Municipios endémicos se consideran de “alta transmisión activa”, mientras la sero-positividad anda cerca del 10-20 por ciento en muchos de esos Municipios. En otros lugares esta cifra podría pasar del 40 por ciento. El Chagas presenta un curso clínico variable que oscila desde casos asintomáticos a casos crónicos. La variabilidad genética de T. cruzi puede es determinante para el tropismo diferencial a tejidos y, consecuentemente, para las formas clínicas de la enfermedad.

Las más recientes investigaciones conllevan a proponer una consideración importante: las distintas cepas del parásito muestran diferencias en la virulencia, distinción que puede deberse a características genéticas propias de cada cepa. Las observaciones experimentales muestran que hay personas infectadas con el parásito, pero que nunca desarrollan la patología; mientras en otras, la enfermedad es fulminante. Para abordar correctamente el problema del mal de Chagas, se requiere conjugar dos factores que intervienen en la manifestación de la enfermedad: paciente y parásito. La información disponible, tanto acerca del hospedero humano como del parásito causante de la enfermedad, deberá ser estudiada no aisladamente sino en conjunto.

Gracias a una colaboración entre la Universidad de California, UCSF, y el Centro de Biología Molecular de la Universidad Centroamericana, UCA, se valoran aspectos moleculares del parásito concernientes a su variabilidad genética. Puesto que las cepas del parásito se propagan de manera clonal, dando lugar a numerosas variantes, un objetivo de esta investigación es conocer la variación de la información genética contenida en cada cepa del parásito para definir sus implicaciones a nivel epidemiológico. Un ejercicio inicial del grupo de trabajo dio lugar a una revisión bibliográfica (Huete-Pérez, 2005) publicada en colaboración con la Universidad de California y el Instituto de Investigaciones Genómicas de Estados Unidos (TIGR), grupo participante de la secuenciación genómica de los tres parásitos tripanosomatidas.

El Centro de Biología Molecular se ha propuesto desarrollar una línea de investigación pionera en el país, para estudiar la eco-epidemiología, la biología y la genética de tripanosomas, así como de los vectores de transmisión. En el Cuadro 2 se presentan detalles de los objetivos de estos estudios correlacionados con su metodología y área del conocimiento.


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Cuadro 2. Líneas de investigación relativas a la descripción molecular y aspectos relativos al mal de Chagas

Perspectivas

Al igual que ha ocurrido con los demás organismos secuenciados, incluyendo a los seres humanos, la descripción total del genoma de T. cruzi es apenas el inicio, que marca la pauta para seguir buscando nuevas rutas metabólicas y moléculas nuevas que parecen ser muy importantes para el parásito. La secuencia será una gran herramienta y guía del contenido genético por la cual se podrá saber qué moléculas usan estos patógenos para establecer la infección en humanos, y qué moléculas se pueden empezar a utilizar para formular nuevas quimioterapias y preparar vacunas. La descripción del genoma de los parásitos que provocan estos trastornos abre una nueva etapa en la investigación de estas patologías, particularmente a nivel de diagnóstico y la clínica. En particular, se piensa que las nuevas investigaciones post-genómicas habrán de destinarse a la búsqueda de nuevas moléculas que sirvan de diana de nuevas terapias y vacunas. El hecho de confirmarse la abundancia de genes de cruzain en el genoma de T. cruzi reafirma la importancia de su proteína en todo el ciclo celular y la infección del parásito. Sin embargo, se prevé que en los próximos años se definan nuevas moléculas como diana de más investigaciones en el diseño de fármacos.

En la secuenciación del genoma de T. cruzi participó un equipo de investigación formado por científicos latinoamericanos (de Argentina, Brasil, y Venezuela) y de otros países industrializados. Aunque lo que motivó este ambicioso proyecto fue la necesidad de


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encontrar nuevas formas de combatir el mal de Chagas, con la información obtenida se podría, además, descubrir nuevos mecanismos biológicos hasta ahora insospechados, que eventualmente podrían tener alguna aplicación más allá del tratamiento del mal de Chagas. De este modo, queda demostrada la validez de estas redes que crean sinergias de impacto indiscutible en el entendimiento de estos problemas de salud pública y que, además, crean un gran valor adicional para el desarrollo científico de la región.

Dado que resulta muy costoso el equipamiento de un laboratorio de biología molecular y de genómica, se presentan enormes dificultades para echar a andar la ciencia genómica en países como Nicaragua. Acaso la manera mas adecuada sea la de crear redes nacionales que permitan cooperar científicamente y compartir recursos. Además, el trabajo de proyectos conjuntos con laboratorios genómicos de alto nivel de América Latina como Chile, México y Brasil, permitirían un abordaje mas completo de las problemáticas existentes. La existencia de un buen número de jóvenes expertos en programas informáticos podría significar una buena oportunidad para incursionar y promover el desarrollo de la bioinformática en el país. Esto, sumado al auge creciente de la biotecnología en Nicaragua, debería repercutir en un progreso considerable de las ciencias biomoleculares y genómica.

Por otra parte, las cifras alarmantes que maneja el Ministerio de Salud deberían obligar al Estado y la sociedad a tomar medidas drásticas y apremiantes, y movilizar fondos que estimulen y promuevan la definición del problema en el ámbito del tratamiento de la niñez enferma y la sanidad pública.

NOTAS

1 Artículo basado parcialmente en la intervención del autor en el Tercer Congreso Nicaragüense de Biotecnología, el 20 de abril de 2006.


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Publicaciones

Maras y pandillas en Centroamérica Vol. IV. Las respuestas de la sociedad civil organizadaPor IUDOP; INTRAPAZ;DIRINPRO-UCAUCA-editores: 2006, 350 páginasISBN 99923-49-52-2

La presente publicación es el cuarto y último tomo de la serie “Maras y pandillas en Centroamérica”, y representa el producto final de una investigación que ha elegido como objeto fundamental de estudio el fenómeno de las pandillas juveniles centroamericanas, las popularmente llamadas “maras”. Este libro, por tanto, no sólo representa la conclusión del cuarto estudio de la serie, sino que en términos más amplios, constituye el punto final de un esfuerzo académico que dio inicio algunos años atrás y en el cual han participado diversas instituciones, agencias y personas. Esta última fase del proyecto fue posible gracias a la iniciativa particular y el oportuno apoyo de la Organización Católica para Ayuda de Emergencia y Desarrollo (CORDAID), de Holanda.

Los trabajos que se presentan en estas páginas forman parte de un esfuerzo por dimensionar las respuestas que tiene la sociedad civil organizada, con todas sus luces y oscuridades, en el complicado y dinámico fenómeno de las maras callejeras en Centroamérica. Esto ha implicado hacer un repaso de las experiencias de intervención que desarrollan las organizaciones no gubernamentales locales en los países del área y un análisis sobre las posibilidades de que dichas organizaciones formen parte de redes o de movimientos sociales, que busquen responder, de forma alternativa, a los desafíos que plantean las maras en los países centroamericanos. Por lo tanto, no se trata de un inventario de programas o de planes de organizaciones privadas, sino un estudio sobre los aportes potenciales que puede ofrecer la sociedad civil organizada centroamericana para resolver el problema de las pandillas, en un contexto caracterizado por la falta de políticas públicas integrales y efectivas por parte de los Estados .


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Revista Wani Nº 45CIDCA; UCA: 2006, 89 páginasISBN 1813-369X

Es una revista especializada en la Costa Caribe de Nicaragua. Sus artículos abordan el estudio de la sociedad, la cultura, la economía, la historia y los recursos naturales del caribe nicaragüenses. En su número 45 Wani nos presenta un informe sobre las elecciones regionales y la situación actual del padrón electoral en la región. Además, retoma elementos históricos del informe Fellechner. En sus últimas páginas Wani nos ilustra sobre la situación actual de los humedales en la bahía de Bluefields y sobre las fortalezas y debilidades en una asociación agrícola indígena.

Arenas políticas alrededor del acceso a la tierraPor Johan Bastiaensen, Ben D'Exelle y Cécile FameréeNitlapán-UCA: 2006, 52 páginasISBN 99924-0556-2

El cuaderno de investigación No. 26 de Nitlapán, titulado “Arenas políticas alrededor del acceso a la tierra” nos recuerda que el tema de la propiedad de la tierra permanece en la agenda de desarrollo de Nicaragua. La reforma agraria revolucionaria, seguida de una adicional redistribución de la tierra y de una pronta liberación de los mercados de tierra, ha creado un substancial caos institucional, el cual se considera la causa de muchos conflictos, devenido en inseguridad sobre la tenencia de la misma.

Pymes, competitividad y SDE en NicaraguaPor Rick Van der KampNitlapán UCA: 2006, 89 páginasISBN 99924-0-538-4

El Instituto de Investigación y Desarrollo (Nitlapán) de la UCA presenta la publicación “Pymes, competitividad y SDE en Nicaragua”. Nicaragua recibe millones de dólares al año para el desarrollo de varios programas y financiamiento para el sector Pymes, sin embargo, nadie en el país es capaz de determinar el impacto de todos estos programas. El propósito del presente estudio es generar una visión completa del estado actual del sector, y de los mayores problemas y oportunidades que éste enfrenta.


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La Contraloría General de la República y el control externo en el estado democrático nicaragüensePor Omar García PalaciosColección Facultad de Ciencias Jurídica, UCA: 2006, 251 páginasISBN 99924-0-547-3

La obra tiene como objeto de estudio la Contraloría General de la Repùblica (CGR) y su papel como órgano de control externo del dinero público en el Estado democrático nicaragüense. La justificación del tema de estudio radica en la necesidad de aportar a la doctrina nicaragüense un trabajo desde la perspectiva del Derecho Constitucional que aborde el estudio de una institución de carácter central en el Estado. La CGR es el órgano superior de fiscalización de los bienes y recursos del Estado y rector del sistema de control de la Administración Pública. En el estado democrático los ciudadanos demandan la realización de un control efectivo sobre dinero que ellos aportan a las arcas del Estado.

Desigualdad, desprotección ambiental y democracia sin ganasPor Welvin Romero Jirón Nitlapán, UCA: 2006, 53 páginasISBN 99924-0-565-1

El informe presenta los resultados de un análisis sobre la ubicación y validación de las principales tendencias políticas y económicas de la región. El documento está dividido en tres partes: la primera destinada a la discusión de las tendencias políticas, la segunda aborda el crecimiento económico basado en el sector externo, y en los productos primarios y manufactura débil. La tercera parte, analiza las posibilidades de que el crecimiento económico se traduzca en beneficios para la mayoría de la población, lo que no pareciera posible dada la enorme desigualdad en la distribución del ingreso existente en los países.


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Instructivo y normas editorialesde la revista Encuentro

La Revista Encuentro fundada en 1968 es una publicación trimestral de la Universidad Centroamericana(UCA). Es una publicación con un perfil académico y científico, destinada a profesionales, consultores, investigadores, profesores y estudiantes.Los autores deben de presentar sus trabajos con base en las siguientes normas técnicas establecidas por la dirección de la revista:1. Se aceptan artículos que sean el resultado de investigaciones, trabajos empíricos o reflexiones teóricas o filosóficas sobre cualquier aspecto de la realidad latinoamericana. El tema de cada número por lo general es pluritemático, pero también se aceptan publicaciones monotemáticas cuando estos sean solicitados por instancias en particular.2. Los trabajos presentados deben contener coherencia lógica interna.; relación entre el tema, objetivos, metodología y desarrollo; originalidad del producto o tema presentado; relevancia de los datos presentados; abordaje analítico mostrado en el material presentado. Los trabajos presentados deben ser inéditos.3. Los artículos tendrán una extensión mínima de 3,000 palabras y máxima de 10,000 palabras (incluyendo las referencias bibliográficas y los anexos de cualquier tipo). El tamaño de la letra deberá ser de 12 puntos y exclusivamente utilizar Times New Roman.4. Los trabajos deben de ser preparados en Word para Windows. Éstas deberán ser remitidas por correo electrónico o la dirección: [email protected] o [email protected]. Los trabajos deberán ser preferiblemente inéditos, pero la revista podrá hacer excepciones con artículos publicados en revistas internacionales de prestigio y cuyo calidad amerite su difusión, especialmente si han sido publicados previa-mente en medios cuyo segmento de lectores no coincide con el de la revista Encuentro. Todos los artículos podrán ser publicados posteriormente en cualquier medio, siempre y cuando el autor brinde su consentimiento y se suministren los datos de su primera publicación en la revista Encuentro.6. Los artículos expresan las opiniones de sus autores y no necesariamente la opinión editorial de la revista. Asimismo, se asumirá que todos los autores del trabajo participaron en la elaboración y autorizaron someterlo a publicación en la revista Encuentro.7. Los artículos antes de ser aprobados por el Comité Editorial de la revista, anónimamente, son remitidos a Pares Evaluadores cuya función es valorar /recomendar la publicación del artículo. Si el artículo es aceptado, el autor con el que se tiene establecida la comunicación debe hacer las correcciones solicitadas por el editor, y enviar de nuevo el trabajo con las correcciones incorporadas. Su no cumplimiento en un plazo de 20 días implico el rechazo del trabajo para su publicación. Cuando se finalice el trabajo de diagramado con las correcciones del autor, se le facilitará una copio electrónica para que el autor avale la versión final o indique cualquier otra observación de forma.8. Los autores recibirán en calidad de cortesía dos ejemplares impresos y una versión electrónica en disco compacto en el caso que sea solicitada.9. Los trabajos investigativos debe de incluir las siguientes secciones:- Titulo: debe de ser conciso y no exceder de 15 palabras. Debe describir adecuadamente el contenido del artículo.- Autores: debe de indicarse el nombre completo y apellido de los autores. Coloque al inicio el nombre de quien más aportó al trabajo. El número total de autores no deberá ser mayor de seis. Identifique plenamente a la institución a la que representan. No incluya los grados académicos. Suministre el e-mail del autor principal como fuente de posible contacto.- Resumen: este debe de contener no más de 250 palabras.- Palabras clave: incluir de tres a cinco palabras clave.- Abstract: traducción al inglés del título y el resumen.- Introducción: esta sección debe incluir el propósito, los antecedentes y el objetivo más relevante del trabajo. Enuncia la importancia del problema dentro del marco de estudio y limitaciones. La información tendrá que estar respaldada con referencias bibliográficas.- Materiales y métodos: es una sección de detalles. Incluye el diseño experimental. Indica las herramientas que se utilizaron para recolectar la información. - Resultados y discusión: se presenta y analiza la información obtenida. Muestra la falta de correlación y delimita los aspectos no resueltos. Expone las consecuencias teóricas y sus posibles aplicaciones prácticas. Esta sección incluye la formulación de conclusiones o recomendaciones.

- Agradecimientos: no son obligatorios. El objetivo es reconocer la ayuda técnica o financiera que facilitó el desarrollo del trabajo.- Notas bibliográficas: estas van a final del texto. No deben de constituir el cuerpo principal de la consulta.- Referencias bibliográficas: aborda el estilo bajo el cual debe presentarse la bibliografía consultada. Las referencias bibliográficas que formen parte del cuerpo del artículo serán escritas entre paréntesis, colocando en primer lugar el apellido del autor, seguido del año de publicación y del número de página (p.ej.: Haber-mas, 1996:125). Tanto las notas como las referencias bibliográficas y los anexos figurarán al final del artículo. Los autores citados deben colocarse en orden alfabético, según su apellido.-Libros: primer apellido y primero letra del nombre del autor en mayúscula, año de publicación entre paréntesis, título de la obra en letra cursiva, lugar de publicación, casa editora y número de edición. ¡p. Ej.: ROCHA, J. L. y BELLANGER, W. (2004). Martas y pandillas en Centroamérica. Managua, UCA Publicaciones, 1 ra. Edición.-Revistas: primer apellido y primera letra del nombre del autor en mayúsculas, año de publicación entre paréntesis, título del artículo entre comillas, nombre de la revista en letra cursiva, volumen, número, páginas y lugar de publicación (p. Ej.:ROSS, M. et al (2005). “The DNA sequense of the human X chromosome” Nature, Vol. 434, 325-337. London.-Tesis: primer apellido y primera letra del nombre del autor en mayúscula, año de elaboración entre paréntesis, título de la obra en letra cursiva, indicación de monografía o tesis de maestría, lugar e instancia donde se elaboro el trabajo, número de páginas (p. Ej.: MARTÍNEZ, C. (2005). Monitoreo de los parámetros fisicos-químico del agua en los barrios marginales del distrito V de la Ciudad de Managua durante el 2004. Tesis de monografía. Managua, Universidad Centroamericana, 102 pág.-Comunicaciones personales: no deben de constituir la fuente principal de información. Se coloca el primer apellido y primera letra del nombre de la persona consultada en mayúscula, año de la consulta entre paréntesis, temo de la consulta seguida de la palabra entrevista entre paréntesis, lugar de la consulta (P.Ej.: PAVON, R. (2005). Biotecnología agrícola (entrevista). Managua, IICA)-En línea:• Documentos completos (libros): responsabilidad principal, título, tipo de soporte (en línea, CD-Rom, banda magnética,disquette), responsabilidad secundaria, edición, lugar de publicación, editorial, fecha de edición, fecha de actualización /revisión, fecha de la consulta, serie, notas, disponibilidad y acceso, número normalizadoEjemplo: CARROLL, Lewis. Alice’s Adventures in Wondertand [en línea]. Texinfo ed. 2.1. [Dortmund, Germany]: WindSpiel, noviembre 1994 (consultado febrero de 1995]. Disponible en Worid Wide Web:http://www.germany.eu.net/books/carroll/alice.htm1>.• Publicaciones electrónicas sedadas completas: Título, tipo de soporte, edición, lugar de edición, editorial, fecha de publicación, fecha de la consulta, serie, notas, disponibilidad y acceso, número normalizado.Ejemplo: Journal of Technology Education [en línea]. Blacksburg (Va.): Virginia Polytechnic Institute and State University, 1989 [consultado 15 marzo 1995]. Semiannual. Disponible en Interne’:gopher://borg.lib.vt.edu:7011/jte.ISSN 1045-1064.• Artículos y otras colaboraciones: Responsabilidad principal, título de la colaboración, título de la revista, tipo de soporte, edición, número del fascículo, fecha de actualización /revisión, fecha de la consulta, localización dentro del documento base, notas, disponibilidad y acceso, número normalizado.Ejemplo: STONE, Nan. The Globalization of Europe. Harvard Business Review [en línea]. Mayo-junio 1989[consultado 3 de septiembre 1990]. Disponible en: BRS Information Technologies, McLean (Va.).• Cuadros, figuras, fotos, dibujos, mapas e ilustraciones: deben de tener un título independiente del texto. No deben de repetir la información ya presentada en el texto. Los cuadros se deben de presentar en formato pequeño, sencillo y condensado. La resolución mínima es de 250 dpi y en formato JPG o TIF. Estos deberán aparecer inmediatamente después que se les mencione en el texto. No se publicará ninguna imagen a color, por lo que se aconseja no enviar archivos a colores. Todo tipo de abreviaturas, con excepción de las de uso universal, deberán explicitarse al pie indicando también la fuente de elaboración u obtención. Los anexos deben de evitarse al mínimo y recomendamos no saturar esta sección con las imágenes y cuadros no incorporadas a lo largo del texto.

Puede enviar sus artículos o solicitar información a la siguiente dirección: Universidad Centroamericana. Revista Encuentro. Apartado postal 69. Managua, Nicaragua. Teléfonos: (505) 278-3923 al 27 ext.1242 ó 1239 / E-mail: : [email protected] o [email protected]

Créditos

HistoriaRevista Encuentro

Fundada en 1968, Encuentro es una publicación trimestral de la Universidad Centroamericana (UCA) de Managua, cuya edición está a cargo de la Dirección de Investigación y Proyección Social de esta misma universidad. Es una revista con un perfil académico y científico, destinada a investigadores, profesores y estudiantes de la educación superior. Los artículos expresan las opiniones de sus autores y no necesariamente la opinión editorial de la revista. Su contenido puede ser reproducido, citando la fuente y enviando copia de lo publicado a la Dirección de Encuentro.

La Universidad Centroamericana (UCA) de Managua fundada en 1960, es una universidad privada, de servicio público e inspiración cristiana y administrada por los jesuitas.

Además de la Dirección de Postgrado, la UCA posee cinco facultades: Humanidades, Derecho, Administración de Empresas y Economía, Comunicación y Ciencia, Tecnología y Ambiente.

También forman parte de la universidad, el Instituto de Investigación y Desarrollo (Nitlapán), el Instituto de Historia de Nicaragua y Centroamérica (IHNCA), el Centro de Análisis Socio-Cultural (CASC), El Instituto de Educación de la UCA (IDEUCA), el Instituto de Encuestas y Sondeos de Opinión (IDESO), el Centro de Investigación y Documentación de la Costa Atlántica (CIDCA), el Instituto de Acción Social Juan XXIII, el Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos (CIDEA), el Herbario Nacional, el Centro de Biodiversidad Animal-Malacología, la Estación Solar VADSTENA-UCA, el Laboratorio de Suelos, el Centro de Biología Molecular (CBM), el centro de Gestión Empresarial (CEGE) y el Area de Desarrollo Agrario (ADAA). Página Web de la UCA: www.uca.edu.ni

Mayra Luz Pérez DíazDIRECTORA

Iván Marín ArgüelloWendy BellangerRaquel Fernández

ASISTENTE DE EDICIÓN

Rogerio MedinaMERCADEO Y DISTRIBUCIÓN

Francis MejíaDISEÑO Y DIAGRAMACIÓN

Luna de enfrenteJorge Tablada

IMAGEN DE PORTADA

Complejo Gráfico TMCIMPRESIÓN

COMITÉ EDITORIALJosé Luis Rocha

José Malespín JirónFrances KinlochManuel OrtegaCarlos ComasJorge HueteIván Marín

Envío. Es una revista de análisis políticos, sociales, económicos, culturales, ecológicos y de género de la realidad de Nicaragua, México y Centroamérica. Aparece cada mes y se publica en español, inglés e italiano. Dirección: Revista Envío. Apdo. postal A-194, Mana-gua, Nicaragua. Tel: (505) 278-2557 Fax: (505) 278-1402 E-mail: enví[email protected] ó [email protected]

Wani. Es una revista especializada en la Costa Atlántica de Nicara-gua. Sus artículos abordan el estudio de la sociedad, la cultura, la economía, la historia y los recursos naturales del caribe nicaraguense. Es una publicación trimestral editada por el Centro de Investigación y Documentación de la Costa Atlántica (CIDCA). Dirección: CIDCA. Apdo. postal A-189, Managua, Nicaragua. Tel.:(505) 278-0854 / 278-4930. Fax: (505) 278-4089. E-mail: [email protected]

Cuadernos de investigación de Nitlapán. Recogen los resultados de las investigaciones realizadas por el Instituto Nitlapán. Es una publicación de carácter monográfico, especializada en temas económicos. Dirección: Instituto Nitlapán. Apdo. postal A-242, Mana-gua, Nicaragua. Tel.:(505) 278-0627/28 y 278-1343/44. Fax:(505) 267-0436. E-mail: [email protected]

Cuaderno de investigación de la UCA. Presentan los resultados de investigaciones llevadas a cabo por los profesores e investigadores de las Facultades y los Institutos de investigación de la Universidad Centroamericana. Es una publicación monográfica, a cargo de la Dirección de Investigación de la UCA. Dirección: Cuadernos de Inves-tigación de la UCA. Apdo. Postal No. 69. Managua, Nicaragua. Tel.:(505) 278-3923/27 Ext: 1242 ó 1239. Fax: (505) 267-0106. E-mail: [email protected]

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