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INTEGRACIÓN DE LOS DATOS 341 Genes Expresados Diferencialmente (GED) El efecto antiproliferativo del ácido carnósico y del carnosol es inferior al del extracto de romero a cualquiera de las concentraciones y tiempos ensayados 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 5 10 15 20 25 30 35 Absorbancia (Relativa al control) Concentración (μg/mL) 24 h 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 5 10 15 20 25 30 35 Absorbancia (Relativa al control) Concentración (μg/mL) 48 h METABOLÓMICA Ácido carnósico μg/mL 61.4 30.7 15.4 7.7 Carnosol μg/mL 8.9 61.4+8.9 (240 μg ER/mL) 4.5 30.7+4.5 (120 μg ER/mL) 2.2 15.4+2.2 (60 μg ER/mL) 1.1 7.7+1.1 (30 μg ER/mL) A. Valdés, C. Ibáñez, C. Simó, A. Cifuentes, V. García-Cañas * Laboratorio de Foodomics, Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC), Nicolás Cabrera 9, 28049 Madrid (Spain). ([email protected]) INTRODUCCIÓN Varios estudios in vitro han demostrado el efecto antiproliferativo de extractos de romero (Rosmarinus officinalis) obtenidos mediante extracción con fluidos supercríticos. Sin embargo, dada la complejidad de los extractos, todavía no se ha podido atribuir dicha actividad antiproliferativa a uno o varios constituyentes. En este trabajo se ha estudiado el efecto antiproliferativo del ácido carnósico (AC) y del carnosol (CS) en la línea de cáncer de colon HT-29, así como el efecto aditivo, sinérgico o antagónico en las proporciones en las que se encuentran en los extractos de romero (ER). También se ha evaluado el efecto del ácido carnósico a nivel molecular empleando una aproximación foodómica, con el fin de detectar cambios transcriptómicos y metabolómicos mediante el uso de microarrays de DNA y de técnicas separativas acopladas a espectrómetros de masas de alta resolución. Disrupción celular - Polytron SOBRENADANTE Ultracentrifugación (3-kDa) Extracción de RNA MATERIAL Y MÉTODOS ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Retrotranscripción Fracción citosólica OBJETIVO Estudiar la actividad antiproliferativa del AC, CS y de la combinación de ambos frente a la línea de cáncer de colon HT-29. Investigar el efecto del ácido carnósico a nivel molecular en HT-29 aplicando una aproximación foodómica, que consiste en el análisis transcriptómico y metabolómico de la respuesta celular frente al tratamiento con el polifenol. Rosmarinus officinalis 24h 48h 72h Diseño experimental del estudio de sinergia CI > 1 Efecto antagónico CI = 1 Efecto aditivo CI < 1 Efecto sinérgico Extracción con fluidos supercríticos (CO 2 ; 7% etanol; 150 bar) ÁCIDO CARNÓSICO (AC) (0 - 61.4 μg/mL) CARNOSOL (CS) (0 - 33.0 μg/mL) EXTRACTO DE ROMERO (ER) (0 - 240 μg/mL) ESTUDIO FOODÓMICO DEL EFECTO DEL ÁCIDO CARNÓSICO Ácido carnósico 256.0 μg/mg de extracto Carnosol 37.1 μg/mg de extracto Ácido Carnósico : Carnosol 6.9:1 AFFYMETRIX HUMAN GENE 1.0ST MICROARRAY ÁCIDO CARNÓSICO 9.9 μg/mL durante 48 h RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES 1) El ácido carnósico y el carnosol tienen actividades antiproliferativas similares en la línea celular de cáncer de colon, HT-29. 2) Ambos compuestos tienen efecto antiproliferativo aditivo cuando se combinan en una proporción 6.9:1 (AC:CS). A pesar de ello, el efecto de la combinación es inferior al observado con el extracto de romero. 3) El ácido carnósico induce cambios transcripcionales en genes que codifican por enzimas detoxificantes, así como genes de transporte y biosíntesis de terpenoides y del metabolismo de ROS. 4) El tratamiento con ácido carnósico altera los niveles intracelulares de algunos metabolitos relacionados con la ruta de las poliaminas, así como los niveles de antioxidantes endógenos (GSH, GSSG). 5) La aplicación de la aproximación foodómica ha permitido establecer relaciones entre el descenso de los niveles de N-acetylputrescina y la expresión de los genes que participan en su ruta de degradación. Tiempo de incubación (h) GI50 (μg/mL) TGI (μg/mL) LC50 (μg/mL) AC 24 11.1±0.9 15.9±1.0 23.0±1.3 48 9.5±0.3 14.5±0.9 21.1±1.6 72 9.9±0.1 15.7±0.1 24.2±0.1 CS 24 13.7±0.6 17.4±1.0 23.3±1.3 48 13.4±0.4 17.0±0.4 21.5±0.5 72 12.8±0.1 16.8±0.1 22.6±0.3 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 5 10 15 20 25 30 35 Absorbancia (Relativa al control) Concentración (μg/mL) 72 h Tiempo de migración/retención Valor m/z Ion Fórmula Error (ppm) Identificación tentativa Coinyección de estándar Regulación por AC 4.21 (CE-ESI-TOF) 131.118 M+H C6H14N2O -2.9 N-acetyl-putrescine SI ↓ 6.07 (CE-ESI-TOF) 104.070 M+H C4H9NO2 -6.7 GABA SI ↓ 7.73 (CE-ESI-TOF) 298.096 M+H C11H15N5O3S -3.8 Methyl-thio-adenosine SI ↓ 8.96 (CE-ESI-TOF) 179.049 M+H C5H10N2O3S 4.5 Cysteinyl-glycine NO ↑ 8.32 (CE-ESI-TOF) 307.086 M+2H C20H32N6O12S2 8.5 Oxidized glutathione SI ↓ 8.96 (CE-ESI-TOF) 308.092 M+H C10H17N3O6S 1.8 Reduced glutathione SI ↑ 7.28 (CE-ESI-TOF) 244.094 M+H C9H13N3O5 5.5 Cytidine SI ↓ 2.38 (UHPLC-ESI-TOF) 456.246 M+NH 4 C14H22O3 5.0 Oxo-tetradecadienoic acid NO ↓ 2.64 (UHPLC-ESI-TOF) 306.059 M+K C10H13N5O4 6.5 Adenosine SI ↑ 2.70 (UHPLC-ESI-TOF) 393.194 M+NH 4 C15H25N3O8 4.2 Tripeptide (I/L, D, E) NO ↓ 2.71 (UHPLC-ESI-TOF) 161.092 M+H C6H12N2O3 -3.7 Alanyl-Alanine NO ↓ 3.21 (UHPLC-ESI-TOF) 471.171 M+H C23H26N4O5S1 -1.3 Tripeptide (C, Y, W) NO ↓ 3.28 (UHPLC-ESI-TOF) 112.041 M+H C5H5NO2 3.7 Pyrrole-carboxylic acid NO ↑ 3.40 (UHPLC-ESI-TOF) 453.168 M+Na C21H26N4O6 2.5 Tripeptide (W, E, P) NO ↓ 3.42 (UHPLC-ESI-TOF) 244.092 M+H C9H13N3O5 3.3 Cytidine SI ↓ 3.59 (UHPLC-ESI-TOF) 455.176 M+H C23H26N4O4S1 1.4 Tripeptide (F, W, C) NO ↑ 3.64 (UHPLC-ESI-TOF) 327.324 M+H C21H42O2 -6.1 Dodecyl-nonanoate NO ↓ 5.79 (UHPLC-ESI-TOF) 274.201 M+H C14H27NO4 -0.8 Heptanoyl-carnitine NO ↓ 6.48 (UHPLC-ESI-TOF) 127.123 M+H-H 2 O C7H16N2O 4.8 N-Acetyl-cadaverine SI ↓ 6.81 (UHPLC-ESI-TOF) 308.092 M+H C10H17N3O6S -0.5 Reduced glutathione SI ↑ 7.00 (UHPLC-ESI-TOF) 162.115 M+H C7H15NO3 -1.9 Carnitine SI ↓ Ruta p-valor Genes Transporte de moléculas 5.10E-04 ↓CA2, ↓CFTR, ↓CLDN2, ↓EDN1, ↓GPC3, ↓NDRG2, ↓NR4A1, ↓SLC14A1, ↓SLC16A7, ↓SLC5A1, ↓SLC7A2 Metabolismo de terpenoides 1.07E-04 ↓ADH1C, ↓EDN1,↓NR4A1, ↓PRLR Metabolismo de ROS 3.81E-03 ↓NR4A1, ↑IL18, ↓HEPH, ↓SPRY2, ↓SESN1, ↑MAOB, ↓mir-21, ↑IL8, ↑NCF1 ♦ Carnosol ▲ Ácido Carnósico ● Extracto de Romero ○ 15 μg/mL ● 30 μg/mL ● 60 μg/mL + Condiciones de separación UHPLC Agilent 1290 Columna: ZORBAX HILIC PLUS HT Gradiente (A, agua 5mM formiato amónico pH 5.8; B, ACN 0.1% ácido fórmico): 0-1 min: 100% B; 1-2 min: 100-90% B; 2-4 min: 90% B; 4-6 min: 90-80% B; 6-8 min: 80- 0% B; 8-10 min: 0% B Condiciones de detección MS Q/TOF Agilent 6540 Modo ion positivo Presión gas neb.: 40 psi Flujo gas de secado: 10 L/min T gas de secado: 200 °C Mass scan: 50-1000 m/z HILIC/ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY-QUADRUPLE TIME OF FLIGHT MASS SPECTROMETRY (HILIC/UHPLC-QTOF MS) Condiciones de separación P/ACE 5500 CE (Beckman Instruments) Capilar de sílice fundida: 90 cm, 50 μm d.i. Buffer de separación: 3 M ácido fórmico Voltaje: +27 kV Condiciones de detección MS microTOF (Bruker Daltonics) Modo ion positivo Seath liquid: IsopOH-H 2 O (1:1, v/v) Flujo seath liquid: 0.24 mL/h Presión gas neb.: 0.4 bar Flujo gas de secado: 4 L/min T gas de secado: 200 °C Mass scan: 50-600 m/z + TRANSCRIPTÓMICA ESTUDIO FOODÓMICO DEL EFECTO DEL ÁCIDO CARNÓSICO ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Combination Index para los siguientes datos experimentales μg ER/mL μg AC/mL + μg CS/mL Dosis Total μg/mL 24 h 48 h 72 h Fa Valor CI Fa Valor CI Fa Valor CI 240 61.4+8.9 70.3 0.997 0.9 0.999 0.9 0.999 1.0 120 30.7+4.5 35.2 0.986 0.7 0.998 0.6 0.999 0.5 60 15.4+2.2 17.6 0.378 1.2 0.622 1.2 0.727 1.2 30 7.7+1.1 8.8 0.163 0.9 0.351 0.9 0.463 0.8 METABOLÓMICA TRANSCRIPTÓMICA Ensayo MTT ANÁLISIS DE MICROARRAY 0.8 ≥ FC ≥ 1.3; FDR=5% p-valor < 0.05 CAPILLARY ELECTROPHORESIS-TIME OF FLIGHT MASS SPECTROMETRY (CE-TOF MS) Proporción de AC:CS en el extracto de romero Combinación (mezcla) ensayada a distintos niveles de concentración 6.9:1 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Absorbance (Relative to control) Concentración (μg/mL) 48 h ▲ Ácido Carnósico ■ Mezcla AC + CS (6.9:1) ● Extracto de Romero ○ 15 μg/mL ● 30 μg/mL ● 60 μg/mL Tabla 1. Inhibición del 50% del crecimiento (GI50), inhibición total del crecimiento (TGI), y muerte del 50% de las células (LC50) en μg/mL de AC o CS en las células HT-29. Los resultados se muestran como la media ± el error estándar de la media de tres experimientos independientes por triplicado Figura 1. Inhibición de la proliferación celular de las células HT-29 tras el tratamiento durante 24 h, 48 h, y 72 h con diferentes concentraciones de AC, CS y ER. La concentración de los puntos del ER están referidos como al contenido de AC en μg/mL. Las barras de error indican el intervalo de confianza al 95% Tabla 2. ”Combination Index” (CI) en función de la fracción afectada (Fa) de las células HT-29 por la mezcla de AC y CS (proporción 6.9:1) Figura 2. Inhibición de la proliferación celular de las células HT-29 tras el tratamiento durante 48 h con distintas concentraciones de la mezcla AC+CS, AC y ER. La concentración de los puntos del ER están referidos como al contenido de AC en μg/mL. Las barras de error indican el intervalo de confianza al 95% ANÁLISIS DE ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL - INGENUITY PATWHWAY ANALYSIS Tabla 3. Análisis de Ingenuity® de las funciones moleculares y celulares más representadas en la lista de GED por el tratamiento con AC El tratamiento con AC alteró la expresión del 1% de los genes del microarray El transporte de moléculas, el metabolismo de terpenoides y el metabolismo de ROS fueron las rutas más representadas en los genes alterados tras el tratamiento con AC Tabla 4. Identificación tentativa de los metabolitos expresados diferencialmente tras el tratamiento con AC de las células HT-29 El ácido carnósico y el carnosol tienen actividades antiproliferativas similares (dependientes del tiempo y la concentración) El efecto antiproliferativo de las mezclas entre el ácido carnósico y carnosol es inferior al efecto del extracto de romero En general, la combinación de ácido carnósico y carnosol tiene efectos aditivos en la proliferación celular de HT-29 Control de calidad Células HT-29 Células HT-29 XCMS mzMatch Procesado de datos Análisis estadístico Ingenuity Pathway Analysis Análisis estadístico Procesado de datos Procesado de datos Ingenuity Pathway Analysis Lista de genes Lista de metabolitos N-acetylputrescina 4-acetamidobutanal 4-acetamidobutanoate MAOB ALDH1A3 INTEGRACIÓN DE LOS DATOS Figura 3. Metabolitos y genes alterados en la ruta de las poliaminas tras el tratamiento con AC La inducción de genes relacionados con procesos de degradación de metabolitos endógenos podría explicar el descenso de los niveles de N-acetylputrescina tras el tratamiento con AC
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INTEGRACIÓN DE LOS DATOS
341 Genes Expresados Diferencialmente (GED)
El efecto antiproliferativo del ácido carnósico y del carnosol es inferior al del extracto de romero a
cualquiera de las concentraciones y tiempos ensayados
0.0
0.2
0.4
0.6
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1.2
0 5 10 15 20 25 30 35
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Concentración (µg/mL)
24 h
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Concentración (µg/mL)
48 h
METABOLÓMICA
Ácido carnósico µg/mL
61.4 30.7 15.4 7.7
Carnosol µg/mL
8.9 61.4+8.9
(240 µg ER/mL)
4.5 30.7+4.5
(120 µg ER/mL)
2.2 15.4+2.2 (60 µg ER/mL)
1.1 7.7+1.1
(30 µg ER/mL)
A. Valdés, C. Ibáñez, C. Simó, A. Cifuentes, V. García-Cañas* Laboratorio de Foodomics, Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación, CIAL (CSIC), Nicolás Cabrera 9, 28049 Madrid (Spain). ([email protected])
INTRODUCCIÓN Varios estudios in vitro han demostrado el efecto antiproliferativo de extractos de romero (Rosmarinus officinalis) obtenidos mediante extracción con fluidos supercríticos. Sin embargo, dada la complejidad de los extractos, todavía no se ha podido atribuir dicha actividad antiproliferativa a uno o varios constituyentes. En este trabajo se ha estudiado el efecto antiproliferativo del ácido carnósico (AC) y del carnosol (CS) en la línea de cáncer de colon HT-29, así como el efecto aditivo, sinérgico o antagónico en las proporciones en las que se encuentran en los extractos de romero (ER). También se ha evaluado el efecto del ácido carnósico a nivel molecular empleando una aproximación foodómica, con el fin de detectar cambios transcriptómicos y metabolómicos mediante el uso de microarrays de DNA y de técnicas separativas acopladas a espectrómetros de masas de alta resolución.
Disrupción celular - Polytron
SOBRENADANTE
Ultracentrifugación (3-kDa)
Extracción de RNA
MATERIAL Y MÉTODOS
ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR
Retrotranscripción
Fracción citosólica
OBJETIVO Estudiar la actividad antiproliferativa del AC, CS y de la combinación de ambos frente a la línea de cáncer de colon HT-29. Investigar el efecto del ácido carnósico a nivel molecular en HT-29 aplicando una aproximación foodómica, que consiste en el análisis transcriptómico y metabolómico de la respuesta celular frente al tratamiento con el polifenol.
Rosmarinus officinalis
24h 48h 72h
Diseño experimental del estudio de sinergia
CI > 1 Efecto antagónico CI = 1 Efecto aditivo CI < 1 Efecto sinérgico
Extracción con fluidos supercríticos (CO2; 7% etanol; 150 bar)
ÁCIDO CARNÓSICO (AC) (0 - 61.4 µg/mL)
CARNOSOL (CS) (0 - 33.0 µg/mL)
EXTRACTO DE ROMERO (ER) (0 - 240 µg/mL)
ESTUDIO FOODÓMICO DEL EFECTO DEL ÁCIDO CARNÓSICO
Ácido carnósico 256.0 µg/mg de extracto Carnosol 37.1 µg/mg de extracto Ácido Carnósico : Carnosol 6.9:1
AFFYMETRIX HUMAN GENE 1.0ST MICROARRAY
ÁCIDO CARNÓSICO 9.9 µg/mL
durante 48 h
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES 1) El ácido carnósico y el carnosol tienen actividades antiproliferativas similares en la línea celular de cáncer de colon, HT-29.
2) Ambos compuestos tienen efecto antiproliferativo aditivo cuando se combinan en una proporción 6.9:1 (AC:CS). A pesar de ello, el efecto de la combinación es inferior al observado con el extracto de romero.
3) El ácido carnósico induce cambios transcripcionales en genes que codifican por enzimas detoxificantes, así como genes de transporte y biosíntesis de terpenoides y del metabolismo de ROS.
4) El tratamiento con ácido carnósico altera los niveles intracelulares de algunos metabolitos relacionados con la ruta de las poliaminas, así como los niveles de antioxidantes endógenos (GSH, GSSG).
5) La aplicación de la aproximación foodómica ha permitido establecer relaciones entre el descenso de los niveles de N-acetylputrescina y la expresión de los genes que participan en su ruta de degradación.
Tiempo de incubación (h) GI50 (µg/mL) TGI (µg/mL) LC50 (µg/mL)
AC 24 11.1±0.9 15.9±1.0 23.0±1.3
48 9.5±0.3 14.5±0.9 21.1±1.6
72 9.9±0.1 15.7±0.1 24.2±0.1
CS 24 13.7±0.6 17.4±1.0 23.3±1.3
48 13.4±0.4 17.0±0.4 21.5±0.5
72 12.8±0.1 16.8±0.1 22.6±0.3
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Concentración (µg/mL)
72 h
Tiempo de
migración/retención
Valor
m/z Ion Fórmula
Error
(ppm)
Identificación
tentativa
Coinyección
de estándar
Regulación
por AC 4.21 (CE-ESI-TOF) 131.118 M+H C6H14N2O -2.9 N-acetyl-putrescine SI ↓
6.07 (CE-ESI-TOF) 104.070 M+H C4H9NO2 -6.7 GABA SI ↓
7.73 (CE-ESI-TOF) 298.096 M+H C11H15N5O3S -3.8 Methyl-thio-adenosine SI ↓
8.96 (CE-ESI-TOF) 179.049 M+H C5H10N2O3S 4.5 Cysteinyl-glycine NO ↑
8.32 (CE-ESI-TOF) 307.086 M+2H C20H32N6O12S2 8.5 Oxidized glutathione SI ↓
8.96 (CE-ESI-TOF) 308.092 M+H C10H17N3O6S 1.8 Reduced glutathione SI ↑
7.28 (CE-ESI-TOF) 244.094 M+H C9H13N3O5 5.5 Cytidine SI ↓
2.38 (UHPLC-ESI-TOF) 456.246 M+NH4 C14H22O3 5.0 Oxo-tetradecadienoic acid NO ↓
2.64 (UHPLC-ESI-TOF) 306.059 M+K C10H13N5O4 6.5 Adenosine SI ↑
2.70 (UHPLC-ESI-TOF) 393.194 M+NH4 C15H25N3O8 4.2 Tripeptide (I/L, D, E) NO ↓
2.71 (UHPLC-ESI-TOF) 161.092 M+H C6H12N2O3 -3.7 Alanyl-Alanine NO ↓
3.21 (UHPLC-ESI-TOF) 471.171 M+H C23H26N4O5S1 -1.3 Tripeptide (C, Y, W) NO ↓
3.28 (UHPLC-ESI-TOF) 112.041 M+H C5H5NO2 3.7 Pyrrole-carboxylic acid NO ↑
3.40 (UHPLC-ESI-TOF) 453.168 M+Na C21H26N4O6 2.5 Tripeptide (W, E, P) NO ↓
3.42 (UHPLC-ESI-TOF) 244.092 M+H C9H13N3O5 3.3 Cytidine SI ↓
3.59 (UHPLC-ESI-TOF) 455.176 M+H C23H26N4O4S1 1.4 Tripeptide (F, W, C) NO ↑
3.64 (UHPLC-ESI-TOF) 327.324 M+H C21H42O2 -6.1 Dodecyl-nonanoate NO ↓
5.79 (UHPLC-ESI-TOF) 274.201 M+H C14H27NO4 -0.8 Heptanoyl-carnitine NO ↓
6.48 (UHPLC-ESI-TOF) 127.123 M+H-H2O C7H16N2O 4.8 N-Acetyl-cadaverine SI ↓
6.81 (UHPLC-ESI-TOF) 308.092 M+H C10H17N3O6S -0.5 Reduced glutathione SI ↑
7.00 (UHPLC-ESI-TOF) 162.115 M+H C7H15NO3 -1.9 Carnitine SI ↓
Ruta p-valor Genes
Transporte de
moléculas
5.10E-04 ↓CA2, ↓CFTR, ↓CLDN2,
↓EDN1, ↓GPC3, ↓NDRG2,
↓NR4A1, ↓SLC14A1,
↓SLC16A7, ↓SLC5A1,
↓SLC7A2
Metabolismo
de
terpenoides
1.07E-04 ↓ADH1C, ↓EDN1,↓NR4A1,
↓PRLR
Metabolismo
de ROS
3.81E-03 ↓NR4A1, ↑IL18, ↓HEPH,
↓SPRY2, ↓SESN1, ↑MAOB,
↓mir-21, ↑IL8, ↑NCF1
♦ Carnosol ▲ Ácido Carnósico ● Extracto de Romero ○ 15 µg/mL ● 30 µg/mL ● 60 µg/mL
+
Condiciones de separación UHPLC Agilent 1290 Columna: ZORBAX HILIC PLUS HT Gradiente (A, agua 5mM formiato amónico pH 5.8; B, ACN 0.1% ácido fórmico): 0-1 min: 100% B; 1-2 min: 100-90% B; 2-4 min: 90% B; 4-6 min: 90-80% B; 6-8 min: 80-0% B; 8-10 min: 0% B Condiciones de detección MS Q/TOF Agilent 6540 Modo ion positivo Presión gas neb.: 40 psi Flujo gas de secado: 10 L/min T gas de secado: 200 °C Mass scan: 50-1000 m/z
HILIC/ULTRA-HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY-QUADRUPLE TIME OF FLIGHT MASS
SPECTROMETRY (HILIC/UHPLC-QTOF MS)
Condiciones de separación P/ACE 5500 CE (Beckman Instruments) Capilar de sílice fundida: 90 cm, 50 µm d.i. Buffer de separación: 3 M ácido fórmico Voltaje: +27 kV
Condiciones de detección MS microTOF (Bruker Daltonics) Modo ion positivo Seath liquid: IsopOH-H2O (1:1, v/v) Flujo seath liquid: 0.24 mL/h Presión gas neb.: 0.4 bar Flujo gas de secado: 4 L/min T gas de secado: 200 °C Mass scan: 50-600 m/z
+
TRANSCRIPTÓMICA
ESTUDIO FOODÓMICO DEL EFECTO DEL ÁCIDO CARNÓSICO ESTUDIO DE LA INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR
Combination Index para los siguientes datos experimentales
µg ER/mL µg AC/mL
+ µg CS/mL Dosis Total
µg/mL
24 h 48 h 72 h
Fa Valor CI Fa Valor CI Fa Valor CI
240 61.4+8.9 70.3 0.997 0.9 0.999 0.9 0.999 1.0
120 30.7+4.5 35.2 0.986 0.7 0.998 0.6 0.999 0.5
60 15.4+2.2 17.6 0.378 1.2 0.622 1.2 0.727 1.2
30 7.7+1.1 8.8 0.163 0.9 0.351 0.9 0.463 0.8
METABOLÓMICA TRANSCRIPTÓMICA
Ensayo MTT
ANÁLISIS DE MICROARRAY
0.8 ≥ FC ≥ 1.3; FDR=5% p-valor < 0.05
CAPILLARY ELECTROPHORESIS-TIME OF FLIGHT MASS SPECTROMETRY (CE-TOF MS)
Proporción de AC:CS en el extracto de romero
Combinación (mezcla) ensayada a distintos niveles
de concentración
6.9:1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Ab
sorb
ance
(R
elat
ive
to
con
tro
l)
Concentración (µg/mL)
48 h
▲ Ácido Carnósico ■ Mezcla AC + CS (6.9:1) ● Extracto de Romero ○ 15 µg/mL ● 30 µg/mL ● 60 µg/mL
Tabla 1. Inhibición del 50% del crecimiento (GI50), inhibición total del crecimiento (TGI), y muerte del 50% de las células (LC50) en μg/mL de AC o CS en las células HT-29. Los resultados se muestran como la media ± el error estándar de la media de tres experimientos independientes por triplicado
Figura 1. Inhibición de la proliferación celular de las células HT-29 tras el tratamiento durante 24 h, 48 h, y 72 h con diferentes concentraciones de AC, CS y ER. La concentración de los puntos del ER están referidos como al contenido de AC en μg/mL. Las barras de error indican el intervalo de confianza al 95%
Tabla 2. ”Combination Index” (CI) en función de la fracción afectada (Fa) de las células HT-29 por la mezcla de AC y CS (proporción 6.9:1)
Figura 2. Inhibición de la proliferación celular de las células HT-29 tras el tratamiento durante 48 h con distintas concentraciones de la mezcla AC+CS, AC y ER. La concentración de los puntos del ER están referidos como al contenido de AC en μg/mL. Las barras de error indican el intervalo de confianza al 95%
ANÁLISIS DE ENRIQUECIMIENTO FUNCIONAL -
INGENUITY PATWHWAY ANALYSIS
Tabla 3. Análisis de Ingenuity® de las funciones moleculares y celulares más representadas en la lista de GED por el tratamiento con AC
El tratamiento con AC alteró la expresión del 1% de los genes del microarray
El transporte de moléculas, el metabolismo de terpenoides y el
metabolismo de ROS fueron las rutas más representadas en los genes alterados tras
el tratamiento con AC
Tabla 4. Identificación tentativa de los metabolitos expresados diferencialmente tras el tratamiento con AC de las células HT-29
El ácido carnósico y el carnosol tienen
actividades antiproliferativas
similares (dependientes del
tiempo y la concentración)
El efecto antiproliferativo de las mezclas entre el ácido carnósico y carnosol es inferior al efecto del
extracto de romero
En general, la combinación de ácido carnósico y carnosol tiene efectos aditivos en la proliferación celular de HT-29
Control de calidad
Células HT-29
Células HT-29
XCMS
mzMatch
Procesado de datos Análisis
estadístico Ingenuity Pathway Analysis
Análisis estadístico
Procesado de datos
Procesado de datos
Ingenuity Pathway Analysis
Lista de genes
Lista de metabolitos
N-acetylputrescina
4-acetamidobutanal
4-acetamidobutanoate
MAOB
ALDH1A3
INTEGRACIÓN DE LOS DATOS
Figura 3. Metabolitos y genes alterados en la ruta de las poliaminas tras el tratamiento con AC
La inducción de genes relacionados con
procesos de degradación de
metabolitos endógenos podría explicar el
descenso de los niveles de
N-acetylputrescina tras el tratamiento con AC
