Presentación de PowerPoint · 2018-11-08 · corteza ovárica, para inducir un aumento de la...
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¿Ciencia o ficción? Nuevas técnicas de preservación de la fertilidad en
escenarios “difíciles”
Sonia Herraiz PhD
- Criopreservación de ovocitos
- Criopreservación de embriones
Existen distintas estrategias para la preservación de la fertilidad (PF) en pacientes oncológicas:
Requieren un período de estimulación hormonal
No implica un retraso en el inicio del tratamiento
Técnica de elección en pacientes pediátricas
Re-establecimiento función endocrina
Riesgo de re-introducir células malignas con el tejido trasplantado(elevado en el caso de leucemias)
- Criopreservación de corteza ovárica y posterior orto-trasplante (CCO-OT).
TÉCNICAS PARA PF
Reducir riesgo reintroducción células tumorales en pacientes
con leucemia.
Mejora seguridad CCO-OT en cáncer mama.
Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar.
Alternativas para pacientes que no han accedido a PF.
DESARROLLO DE NUEVAS ALTERNATIVAS CLÍNICAS
• Gran prevalencia en prepúberes.
• LLA trasplante de médula ósea: Agentes alquilantes, irradiación total.
LEUCEMIA
Riesgo de reintroducción de células malignas
Courbiere et al. 2010; Rosendahl et al. 2010; Dolmans et al. 2010; Greve et al. 2012; Abir et al. 2014
RIESGOS DE CCO-OT
AGENTES ANTI-LEUCÉMICOS
Evaluación del efecto anti-leucémico de la dexametasona en corteza ovárica criopreservada de
pacientes con leucemia.
ALTERNATIVAS
Cesar Diaz-Garcia, Sonia Herraiz, Esperanza Such, Mara Andrés, Eva Villamón,Empar Mayordomo-Aranda, José V. Cervera, Miguel A. Sanz and Antonio Pellicer
OBJETIVOS
DESCONGELACIÓN
CRIOPRESERVACIÓN
INCUBACIÓNM199+DXM 0,4mM
INCUBACIÓNM199
XENOTRASPLANTE (n=22)
6 mesesHISTOLOGÍA
PCR
OOFORECTOMÍA
HISTOLOGÍAPCR
n= 6 pacientes LLA
DISEÑO EXPERIMENTAL
MÉTODO
Paciente Diagnóstico EdadQuimioterapia
previaMarcadores Estado Actualidad
Fragmentos
(C + DXM)
1 ALL Sí IgH RC RC 1+1
2 ALL 5 Sí IgHRC
Fallecida 4+4
3 ALL 3 Sí IgH/EA2-PBX1 EMR+ Fallecida 2+2
4 ALL 3 Sí IgHRC
RC 1+1
5 ALL 7 Sí IgHRC
RC 2+2
6 ALL 15 Sí None RC RC 1+1
EMR: Enfermedad mínima residualRC: Remisión completa de la enfermedad
CARACTERÍSTICAS DE LAS PACIENTES
Paciente Diagnóstico
Previo al xenotrasplanteCorteza ovárica Enfermedad
macroscópica
Post-xenotrasplanteCorteza Hígado Otras
muestrasHistología PCR Histología PCR Histología PCR
1 ALL - - - - - - -
2 ALL - - - - - - - -
3 ALL - + - - + - -
4 ALL - - - - + - -
5 ALL - - - - + - + -
6 ALL - N.A. - - N.A. - N.A.
RESULTADOS POR PACIENTE
Tratamiento Enfermedad clínica Histología PCR PCR hígado PCR corteza
CONTROL (n=11) 0/11 0/11 2/11 1/11 2/11
DXM (n=11) 0/11 0/11 3/11 0/11 3/11
Paciente Tratamiento RATÓN PCR CORTEZA PCR HÍGADO
4 C RATÓN 1 - -
4 DXM RATÓN 2 + -
3 C RATÓN 3 + -
3 C RATÓN 4 - -
3 DXM RATÓN 5 + -
3 DXM RATÓN 6 ND -
3 DXM RATÓN 7 ND -
5 C RATÓN 8 - -
5 C RATÓN 9 + +
5 DXM RATÓN 10 + -
5 DXM RATÓN 11 ND -
RESULTADOS TRAS LA INCUBACIÓN
• No hay enfermedad clínica pero sí presencia de células malignas.
• No podemos confiar en la dexametasona para evitar el riesgo de transmisión de células leucémicas.
MANTENER LA CAUTELA Y CONTINUAR INVESTIGANDO EL USO DE POSIBLES AGENTES ANTI-LEUCÉMICOS
CONCLUSIONES
Reducir riesgo reintroducción células tumorales en pacientes
con leucemia.
Mejora de la seguridad en CCO_OT cáncer mama
Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar
Alternativas para pacientes que no han accedido a PF
Desarrollo de nuevas alternativas clínicas
Resultadospreliminares
Análisis inmunohistoquímico
Ninguna expresó los marcadores seleccionados para la detección de Metástasis
A B
D
FE
C
Metástasis CO CO PF
Análisis molecular
DETECCIÓN PRECOZ DE CÁNCER DE MAMA EN CORTEZA OVÁRICA
Rodriguez-Iglesias et al., F&S 2015
Reducir riesgo reintroducción células tumorales en pacientes
con leucemia.
Mejora de la seguridad en CCO_OT cáncer mama
Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar
Alternativas para pacientes que no han accedido a PF
Desarrollo de nuevas alternativas clínicas
• El crecimiento y maduración de folículos dentro del fragmento de tejido ovárico, es una técnica experimental en desarrollo.
• Opción para PF en pacientes pre-púberes y con enfermedad hematológica.
• Existen varias líneas de investigación trabajando en:• Cultivos en placa.
• Cultivo en corteza ovárica.• Cultivos en matrices 3D: alginato, fibrina, matriz de colágeno…
MADURACIÓN IN VITRO DE FOLICULOS PRIMORDIALES
MADURACIÓN IN VITRO DE FOLICULOS PRIMORDIALES
En ovocitos, la ruta PTEN controla el desarrollo del folículo inmaduro. Reddy et al,
2008; John et al., 2008.; Castrillon et al., 2003; Li et al., 2010, Hsueh 2014.
Activación masiva de todo el pool de
folículos primordiales durmientes.
PTEN
PI3K
Fox03a
ACTIVACIÓNIVM
IVMbpV(pic):Dipotassium bisperoxo (picolinato) oxovanadate (V).
En humanos, la molécula inhibidora de PTEN bpV(pic), ha sido utilizado a 100mM encorteza ovárica, para inducir un aumento de la activación. Li et al. PNAS; 2010.
MADURACIÓN IN VITRO DE FOLICULOS PRIMORDIALES
En ovario de ratón, el tratamiento especifico con un inhibidor de PTEN y un activador de PI3K, incrementa activacion de ovocitos primordiales-
Los ovocitos activados y madurados in vitro capaces de generar crías sanas tras FIV (Li
et al., 2010).
ALTERNATIVA
Activación in vitro de foliculos primordiales mediante el uso de inhibidores de PTEN en tejido
ovárico de pacientes oncológicas
Sonia Herraiz; César Díaz-García; Anna Buigues Monfort; Ana García Belda; Edurne Novella y Antonio Pellicer.
Comprobar la eficacia de la inhibición de PTEN mediante el uso debpv(pic) para la IVA de foliculos durmientes en corteza ováricapreviamente criopreservadad de pacientes oncológicas, pues estapoblación podria ser una de las prinicpales beneficiarias de laaplicación clínica de los protocolos IVA.
OBJETIVOS
PTEN pathwaygenes
Densidad Estradiol
AMH
Foxo3Phospho-Foxo3
AktPhospho-Akt
CO frescon=18
CO criopreservadan=14
1h 24h
Medio basal+ 100µM bpV(pic)
Medio basal
ACTIVADA (A)
24h
CONTROL (C)
Medio basal +100µM bpV(pic)+ 0.3IU/ml FSH
Medio basal + 100µM bpV(pic)
+ 0.3IU/ml FSH
1h
Medio basal: alpha-MEM+10%HSA
G1. Fresco-IVAG2.Fresco- Ctrl
G3 Criopreservado-IVA
G4.Criopreservado-Ctrl
DISEÑO EXPERIMENTAL
Fox03 TUNELH&EG
1 A
ctiv
ado
G2
co
ntr
ol
0,34
0,12
0,46
0,26
0,03
0,29
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Primordial/Primary Secondary Total
Fo
llic
le
s/m
m2
El tratamiento con inhibidor de PTEN a 100µM triplica el porcentaje de folículos primordiales activados in vitro (p=0.03) sin inducir ningún efecto deletéreo en los folículos o el estroma ovárico.
59,55
23,69
0
10
20
30
40
50
60
70
Act
ivac
ión
fol.
pri
mo
rdila
es
G1 Fr. Activado G2 Fr. Control
*9,5
12,8
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
16,0
18,0
% T
UN
EL +
en
est
rom
a
EFECTOS DEL TRATAMIENTO IVA EN TEJIDO FRESCO.
H&E
G3
act
ivat
edG
4 c
on
tro
l
Fox03 TUNEL
0,28
0,1
0,380,34
0,05
0,39
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Primordial/Primary Secondary Total
Folli
cle
s/m
m2
La criopreservación produce el anillamiento del citoplasma a consecuenciade la congelación lenta en < 5% de los folículos primordiales (Oktem et al. Fertil.
Steril 2011)..
63,68 36,8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Act
ivac
ión
fo
l.p
rim
ord
iale
s **16,1
13,1
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
% T
UN
EL+
Stro
mal
are
a
EFECTOS DEL TRATAMIENTO IVA EN TEJIDO CRIOPRESERVADO.
76,32
53,35 54,54
25,68
0
20
40
60
80
100
% F
olli
cle
s A
MH
+
G1 G2 G3 G4
§
§§
98,6
84,9
40,833,6
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
Estr
adio
l (p
g/m
l)
G1 G2 G3 G4
*
**
FUNCIÓN HORMONAL
IVA mediante una única incubación con concentración reducida de bpV(pic) promueve la activación de folículos primordiales durmientes, la secreción hormonal y preserva la viabilidad folicular
La eficiencia de los protocolos de IVG-IVM sigue siendo baja y por tanto seguimos lejos de la aplicación clínica de esta técnica.
CONCLUSIONES.
Novella et al. Plos One, 2014
DISEÑO DE UN OVARIO ARTIFICIAL?
Reducir riesgo reintroducción células tumorales en pacientes
con leucemia.
Mejora de la seguridad en CCO_OT cáncer mama
Pacientes pediátricas sin óvulos maduros para criopreservar.
Alternativas para pacientes que no han accedido a PF.
DESARROLLO DE NUEVAS ALTERNATIVAS CLÍNICAS
IVA + fragmentación ovárica para activación folicular
Kawamura et al. PNAS 2013; Zhai et al., JCEM 2017
Rescate foliculos durmientes en el ovario de pacientes con fallo ovárico (POI) han dado lugar al nacimiento de niños sanos.
Foliculos remanentes en el ovario son capaces de madurar y ser competentes en el nicho ovárico adecuado.
Ovarian fragmentation for follicular activation (OFFA)
César Díaz-García, Loida Pamplona, Sonia Herraiz, Alicia Marzal, Carlos Simón and Antonio Pellicer.
ALTERNATIVA
Drug-free Intervenncion quirurgica única.
OFFA (n=11)
Time to IVF 101 ± 48
Doses of FSH 2340 ± 397
Follicles>17mm 26
Oocytes (total) 20
Oocytes (MII) 14
Fertilization (%) 6/9 (66%)
PR (%) 3/13 (23%)
OPR/LBR (%) 3/13 (23%)
Values are expressed as medians (IQR), means ± standard deviations or percentages
• 8 IVF cycles
• Pregnancies <37 years-old
• 5 Patients >41• No embryos
• Caotic embryos
POI Patients
Veitia et al., Stem Cells 2007
NO GENETIC RELATIONSHIP DAUGHTER-DONOR
Sterility after Chemo-and radiotherapy
Fertility restoration
(6yr after BMT)
Nuclear polymorphisms analysis
Bone marrow transplant
- Hershlag A, and Schuster MW. Return of fertility after autologous stem cell
transplantation. Fertil Steril. 2002.
- Salooja N, et al. Pregnancy outcomes after peripheral blood or bone marrow
transplantation: a retrospective survey. Lancet. 2001.
- Sanders JE, et al. Pregnancies following high-dose cyclophosphamide with or
without high-dose busulfan or total-body irradiation and bone marrow
transplantation. Blood. 1996.
- Salooja N, at al.,. Successful pregnancies in women following single
autotransplant for acute myeloid leukemia with a chemotherapy ablation
protocol. Bone marrow transplantation. 1994.
Recuperación de la fertilidad tras trasplante médula ósea
Rejuvenecimiento ovárico mediante infusión de células madre derivadas de médula ósea en tejido
ovárico dañado por quimioterapia
Sonia Herraiz, Anna Buigues, Mónica Romeu, César Díaz-García, Aaron J Hsueh and Antonio Pellicer.
Herraiz et al, SRI 2016, 2017; ESHRE 2016
ALTERNATIVA
Evaluar el efecto regenerativo del trasplante de células madre derivadas de médula ósea en ovario de ratón previamente dañado por quimioterapia.
Bone Marrow Derived Stem Cells (BMDSC)
OBJETIVOS
DISEÑO EXPERIMENTAL
1. Aislamiento BMDSC.
2. Marcaje BMDSC.
Isolation of mononuclear cells
MIRB nanoparticles
Cell labeling with Molday Ion Rhodamine B (MIRB)
• BMDSC were mobilized to peripheral blood by a 5-days treatment with G-CSF.
CD34+ circulating cells <1 ≥10.000 cel/ml
• Recovery of BMDSC by apheresis.
Diseño experimental
14
d
Standard Cht treatment (1xChT)Bu 12 mg/kg, Cy 120 mg/kg
Reduced Cht treatment (0.1xChT)Bu 1.2 mg/kg, Cy 12 mg/kg
7 d
D -7
D0
D+14
D+19
10IU PMSG 48h+ 10IU hCG
Mating (n=4/group)16h after hCG
Sacrifice (n=3/group) 72h after hCG
MII and D2 embryos recovered from the oviduct
PBS
1x106
human BMDSC
Experimentalgroups (n=7)
0.1xChT- Control
0.1xChT- BMDSC
1xChT- Control
0.1xChT- BMDSC
NOD/SCID mice
Ciclo estral y secreción estradiol.
1xChT-Control
1xChT-BMDSC
D-7 D-6 D-5 D-4 D-3 D-2 D-1 D0 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14
0.1xChT-Control
0.1xChT-BMDSC
ChT BMDSC infusion
✓
✓
✓✓
✓
✓
✓✗
✗✗✗✗
✗
✗✗
?
BMDSC recupera ciclo estral regular en el 75% de los animales tratados
P E M D
A
Estrous (E)Proestrous (P) Metestrous (M) Diestrous (D)
100 μm 100 μm 100 μm 100 μm
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Proestrus
Estrus
Diestrus
Metestrus -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13
-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13
1xChT-BMDSC
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Proestrus
Estrus
Diestrus
Metestrus -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13
0.1xChT-BMDSC
-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13-7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Proestrus
Estrus
Diestrus
Metestrus -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13 -7 -5 -3 -1 1 3 5 7 9 11 13
0.1xChT-Control
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Proestrus
Estrus
Diestrus
Metestrus
1xChT-Control
Estrous cycle
Peso ovario
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
0,1xChT 1xChT
Ovarian / b
ody w
eig
ht (m
g/g
) Control
BMDSC
*
**
Peso ovario desciende de forma dosis-dependiente con la quimioterapia.
La administración de BMDSC recupera peso ovario tras estimulación con gonadotropinas.
Control BMDSC
1xC
hT
0.1
xCh
T
1xC
hT
0.1
xCh
T
CONTROL BMDSC
Labeled-human-BMDSC llegan al ovario y se detectan en todos los animales de los grupos infundidos mediante tinción Prussian Blue.
BMDSC se localizan en la capa de células de la teca y cerca de los vasos.
BMDSC engraftment en ovario
Molday ION-Rhodamine B labeled-human-BMDSCs
Crecimiento y desarrollo folicular
***
Numero total de foliculos y de preantrales no varia entre tratamientos
* **
% A
ntr
alfo
llicl
es
El trasplante de BMDSC aumenta el numero total de ovocitos MII recuperados y la cantidad de embriones 2-céls obtenidos
Ovulación y desarrollo embrionario
0
2
4
6
8
10
12
0.1xChT 1xChT
2-c
ell
em
bry
os
Control
BMDSC
1xC
hT
0.1
xCh
T
Control BMDSC
*
0
10
20
30
40
0.1X ChT 1xChT
MII
ovu
late
d o
ocy
tes
Control
BMDSC*
**
La infusión de BMDSC reduce la tasa de apoptosis en folículos y estroma incluso en las dosis más elevadas de ChT.
Viabilidad estroma ovárico
*p<0.05
TUNEL assay
1xC
hT
0.1
xCh
T
CONTROL BMDSC
**
Ovarian stroma
Céls Ki67-positivas en estroma y folículos de todos los grupos.
BMDSC aumenta el porcentaje de células en proliferación en estroma.
Proliferación en estroma ovárico
Ki67 immunostaining
BMDSC
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0.1xChT 1xChT
Prolifera
vecells(%)
CONTROL BMDSC
CONTROL
1xC
hT
0.1
xCh
T
*p=0.03
*p=0.04
Ovarian stroma
BMDSC mejora la vascularización en tejido ovárico, especialmente en la dosis elevada de Cht donde el tejido está
más dañado.
Vascularización
Immunofluorescent staining (Isolectin B4Green; anti α-SmaRed)
* p=0.012CONTROL BMDSC
1xC
hT
0.1
xCh
T
Tis
sue
Sam
plin
g
Ovariectomized NOD-SCID
mice
Control group (n=9)
PBS
D-7
CD133 group (n=9)
3x105
CD133
BMDSC group (n=9)
1x106
BMDSC
D0
OC grafts
D+1
D+7
D+14
Xe
no
trag
raft
Ce
llin
jectio
n
Human ovarian
cortex graft
Blood Other organs
7d
Diseño experimental: ovario humano
J L
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
D1 D7 D14
nº
seco
nd
ary
folli
cles
s/m
m3
*
*
**
Ki6
7P
russ
ian
Blu
eH
&E
CD
31
Control CD133BMDSC
A B C
E F G
I K
M N O
D
H
P
J
El trasplante de BMDSC:
Restaura la ciclicidad y la secreción de estradiol en ovarios dañados.
Mejora desarrollo folicular
Recupera capacidad ovulación
Aumenta numero MII recuperados
Mejora desarrollo embrionario temprano
Regenera nicho ovárico: reduce apoptosis y mejora proliferación células del estroma.
Aumenta la vascularización
Conclusiones
Herraiz et al., submitted
1. Mobilization of BM derived stem cells by 5-days G-CSF treatment (10 ug/kg/ day).
2. Recovery of BM derived stem cells by apheresis.
3. CD133+ cells quantification (no cell selection).
4. Infusion of whole aphaeresis containing 50x106 CD133+ cells in ovarian artery.
Clinical Trial Nº: NCT02240342Herraiz et al, ESHRE 2016
SCOT: Pilot study in PR
Pilot study with 20 PR patients based on the ESHRE criteria. Patients are considered as their own control as only one ovary received SCOT.
STUDY GROUP
•Maternal age ≤40 years.•Two episodes of PR after COS (≤3 oocytes obtained).•AFC> 2 follicles with at least 1 follicle in the ovary that will be perfused. •AMH > 0.5 - ≤3pmol/L.•Serum FSH levels ≤20IU/l.•Regular menses.
Herraiz et al, ESHRE 2016
Stem Cell Ovarian auto-Transplantation (SCOT)
Herraiz et al, ESHRE 2016,; Romeu et al., SRI 2017
Stem Cell Ovarian auto-Transplantation (SCOT)
12 PACIENTES
Herraiz et al, ESHRE 2016,; Romeu et al., SRI 2017
Stem Cell Ovarian auto-Transplantation (SCOT)
3 embarazos: 2 ET+ 1gestación espontánea 2 recien nacidos sanos
11 PACIENTES
Agradecimientos
Antonio Pellicer
César Díaz-García
Anna Buigues
Mara Andrés
Esperanza Such
Eva Villamón
Mónica Romeu
Susana Martínez
Aaron Hsueh
Vicente Mirabet
Daniela Galliano
Carlos Simón
Beatriz Rodriguez
Edurne Novella