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SIGLO XVIII
La diferencia entre individuos se denotaba señalando diferencias en su aspecto externo
FICHA DE IDENTIFICACION
Descripciones fenotípicas de ambos flancos y de la cabeza del animal
Presencia de manchas
Remolinos en el pelaje
Color de capa
Alguna otra particularidad
CARÁCTER FUERA INFORMATIVO
POLIMORFISMO
VARIACION
Genes asociados a caracteres fenotípicos, fáciles de identificar
visualmente
Número limitado
Poco informativos
Herencia compleja (herencia dominante/recesiva,
multigénicos, etc.)
Ambiguos y subjetivos
MARCADORES MORFOLOGICOS (AÑOS 60´)
KARL LANDSTEINNER (1868 - 1943)
DESCUBRE LOS GRUPOS SANGUINEOS CARACTERIZADOS POR ESTUDIOS SEROLOGICOS
MARCADORES GENETICOS
CARÁCTER HEREDABLE CON MULTIPLES ESTADOS
(alelos) EN CADA CARÁCTER (locus)
1965
FORD
PRESENCIA SIMULTANEA DE DOS O MAS
FORMAS DISCONTINUAS EN UNA
ESPECIE, DE TAL MANERA QUE LA
MENOS FRECUENTE DE ELLAS NO PUEDA
MANTENERSE POR MERA MUTACION.
1981
CAVALLI SFORZA
Y BODNER
EXISTENCIA EN UNA MISMA POBLACION
DE DOS O MAS ALELOS EN UN LOCI,
CADA UNO CON UNA FRECUENCIA
APRECIABLE.
POLIMORFISMO GENETICO
MARCADORES BIOQUÍMICOS
ISOENZIMAS
GRUPOS SANGUÍNEOS
INMUNOGLOBULINAS
1955 - ELECTROFORESIS EN GELES DE ALMIDON
Smithies, O. Zone electrophoresis in starch gels group variations in the
serum proteins in normal human adults. Biochem.J., 61, 629, 1955.
Gel donde se observan los
patrones de bandas de dos
variedades de trigo diferentes.
1959 - ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA
Raymond y Weintraub . Acrylamide gel as a supporting médium for zone electrophroresis.
Science, 130, 711. 1959.
MARCADORES BIOQUIMICOS
EL NIVEL DE OBSERVACIÓN ES EL FENOTÍPICO (TIPIFICAN PROTEÍNAS).
ANALIZAN SÓLO LAS SECUENCIAS CODIFICANTES DE LOCI ESTRUCTURALES, QUE CORRESPONDEN APROXIMADAMENTE AL 5% DEL GENOMA.
LA FUNCIONALIDAD DE LAS PROTEÍNAS LIMITA EL GRADO DE POLIMORFISMO.
LAS MUESTRAS TIENEN QUE SER FRESCAS YA QUE LAS PROTEÍNAS SE DETERIORAN CON FACILIDAD.
DESVENTAJAS:
NO SE EXPRESAN EN TODOS LOS TEJIDOS.
NO SE EXPRESAN EN TODAS LA EDADES.
INFLUENCIADOS POR EL AMBIENTE.
POCO POLIMÓRFICOS.
BAJA REPRESENTACIÓN EN EL GENOMA
SU AUTOMATIZACION EN OCACIONES RESULTA DIFICIL.
MARCADORES BIOQUÍMICOS
Advenimiento de técnicas moleculares en los años 80.
Métodos de detección de polimorfismos directamente a nivel de ADN
MARCADORES GENÉTICOS
MARCADOR MOLECULAR ES UN SEGMENTO DE ADN
CON UNA UBICACIÓN FÍSICA IDENTIFICABLE Y CUYA HERENCIA GENÉTICA SE
PUEDE RASTREAR
UN MARCADOR PUEDE SER UN GEN O PUEDE SER ALGUNA SECCIÓN
DEL ADN SIN FUNCIÓN CONOCIDA.
CARACTERISTICAS DE LOS MARCADORES GENETICOS
Poseer herencia mendeliana sencilla. Codominante
Estar presentes en el individuo en el momento del nacimiento
Ser informativos o sea POLIMORFICOS
Estar distribuidos por todo en genoma
El análisis de los mismos no debe conllevar riesgo para el animal
La metodología empleada debe ser repetible, automatizable y estandarizable
MARCADORES
BIOQUÍMICOS
MARCADORES
DE ADN
Sólo muestras frescasMuestras frescas, congeladas o
conservadas en acohol,
parafina, etc.
Sólo muestras de sangre Cualquier clase de tejidos:
pelo, músculo, hueso, semen
dientes, etc
Número limitado de
marcadores
Número ilimitado de
marcadores
Moderado grado de
información
Alto grado de
información
ADN nuclear
ADN codificante ADN no codificante
Copia única Copia únicaCopia múltiple
Pseudogenes
Repetitivo
Elementos heterodispersos
Elementos repetidos en tandem
Genes
estructurales
ARNr
ARNt
Histonas
SINEs
LINEs
Transposones
Centrómeros
Telómeros Microsatélites
Minisatélites
TIPOS DE SECUENCIAS UTILIZADAS EN MAMIFEROS
Uniparentales
Polimorfismos del cromosoma X.
Biparentales: loci autosómicosCodificantes.
No-codificantes.
Mitocondriales
Cromosoma Y
HERENCIA DEL MATERIAL GENÉTICO EN MAMIFEROS
MADRE PADRE
CRÍA
CIRCUITO DE LA MUESTRA
VERIFICADO DEL PRODUCTO DE PCR
ANÁLISIS A TRAVÉS DEDISTINTOS METODOS
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
AMPLIFICACIÓN POR PCR
EXTRACCIÓN DE ADN
OBTENCIÓN DEL ADN
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
EXTRACCIÓN DE ADN DE LA MUESTRA
LA EXTRACCIÓN ES EL PUNTO DE INICIO DE LA TECNOLOGÍA DEL ADN
Selección del material de donde podemos
aislar el ADN de interés
Selección del método adecuado para la
extracción del ADN
BACTERIAS CULTIVOS CELULARES
TEJIDOS
HISOPADO BUCAL
SANGRE ENTERA
PELO
MATERIAL DE ORIGEN DE LA MUESTRA
ORINA
MANCHA HEMATICA
AMPLIFICACION
DEL ADN
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA
¿Que
necesito?
¿Cómo
funciona?
LA AMPLIFICACION PERMITE OBTENER UN GRAN NUMERO DE COPIAS
A PARTIR DE UNA CANTIDAD MINIMA DE ADN MOLDE
FRAGMENTO DE INTERES
CEBADORES O PRIMERS
Los primers son los que dan especificidad a la PCR
¿COMO DETERMINO EL GENOTIPO DE LA MUESTRA?
AMPLIFICACIÓN POR PCR
ANÁLISIS A TRAVÉS DE DISTINTOS
METODOS
DETERMINACION DEL GENOTIPO
VARIANTES DE PCR
PCR – RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
El amplificado obtenido del PCR, es incubado en un medio con una
enzima de restricción (ER).
PCR - RFLP
TAATATTA
ENZIMA HIPOTETICA
ALELO A
ALELO a
TAATATTA
PCR alelo especifica y anidada
PCR ALELO ESPECIFICASe realiza con cebadores que permiten solo la amplificación de un alelo en especial.
PCR ANIDADA
CEBADORES DIRECTOS
CEBADORES INVERSOS
Fragmentos obtenidos por amplificación (PCR) al azar del ADN genómico
No se conoce la ubicación genómica de las bandas
Utilidad en organismos de genoma desconocido: sondeo de variabilidad y
clonado de fragmentos variables para obtener polimorfismos de locus
conocido
RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA)
Microsatelites O STR (SHORT TAMDEN REPEAT)
PCR MICROSATELITES - MINISATELITES
SON DE ELECCION LOS
DINUCLEOTIDICOS
PORQUE PRESENTAN
MENOS PROBLEMAS
CON EL SLIPPAGE QUE
CORE DE REPETICION
MAYORES
MICROSATELITES O STR (SHORT TAMDEN REPEAT)
DIFERENCIAS ENTRE AMPLIFICACION DE UN LOCUS SIMPLE OMULTIPLEX EN GEL DE POLIACRILAMIDA
MULTIPLEX LOCUS SIMPLE
¿CÓMO DETERMINARIAN EL GENOTIPO DE CADA INDIVIDUO?
SECUENCIADOR AUTOMÁTICO DE ADN
LOS FRAGMENTOS SE RESUELVEN POR ELECTROFORESIS CAPILAR.
A
170.6
B
173.1
C
175.3
D
177.3
E
179.3
180
181.1
182
183.3
184
185.2
I
187.2
J
189.2
190
191.5
192
193.6
A
198.0
B
200.0
C
202.0
204
204.0
E
206.1
208
208.0
G
210.2
212
212.1
214
214.1
216
216.0
218
218.1
220
220.2
222
222.1
224
224.0
226
226.0
P
228.0
Q
230.1
R
232.1
S
234.0
A01 100408_M474_BTA5Run01 3731 (M)
0
10000
20000
188.6
193.8
213.0
215.0
ETH10
Label: 192
Label: ?
Label: ?
A
221.3
B
223.2
225
225.2
227
227.3
229
229.2
231
231.0
G
233.0
H
235.1
A01 100224_M417_BTA5Run01 3727
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
228.9
IGF1
Label: 229
A
170.6
B
173.1
C
175.3
D
177.3
E
179.3
180
181.1
182
183.3
184
185.2
I
187.2
J
189.2
190
191.5
192
193.6
B02 061116_BovRun01 He M 927
0
1000
2000
3000
181.1
185.3
BM1824
Label: 180
Label: 184
G02 090319_M226_BTY_BTA5Run01 1458(A) 2243(B U)
0
100
200
300
400
500
600
700
Varios marcadores se pueden amplificary correr al mismo tiempo.
Requieren de personal capacitado pues cada marcador tiene un patrón particular.
PCR - SECUENCIACION
Conjunto de métodos y técnicas que permiten determinar el orden de los
nucleótidos (A, C, G y T) en una región del ADN.
PCR – SNP
Single Nucleotide Polymorphism / Polimorfismo de nucleótido simple
MICROARRAY
HIBRIDACION
VENTAJAS GRAN NÚMERO DE SITIOS ANALIZADOS
PEQUEÑO VOLUMEN DE MUESTRA REQUERIDO
REPRODUCIBLE Y ROBUSTO
DESVENTAJAS GRAN CONOCIMIENTO DEL SISTEMA A ANALIZAR
COSTO RELATIVAMENTE ELEVADO
¿QUE UTILIDAD TIENEN LOS
MARCADORES GENETICOS?
IDENTIFICACION INDIVIDUAL
IDENTIFICACION DE PATOGENOS
CARACTERIZACION DE ESPECIES
CONSERVACION DE BIODIVERSIDAD GENETICA
GENETICA DE POBLACIONES
DETECCION DE ENFERMEDADES GENETICAS
SEXADO EMBRIONARIO
ANALISIS DE FILOGENIA
GENETICA FORENSE (PATERNIDAD, IDENTIDAD)
ADULTERACION DE ALIMENTOS
ETC.
IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE UN INDIVIDUO/MUESTRA
87
86.2
89
88.2
91
90.2
93
92.2
95
94.1
97
96.2
99
98.2
236
234.9
238
236.8
240
238.9
242
241.1
244
242.8
246
244.8
248
246.8
250
248.8
252
251.1
254
253.0
256
255.0
G01 060224_CTD_DogRun01 CTD7
0
100
200
300
400
500
227
232.0
229
233.8
231
235.6
233
237.6
235
239.4
237
241.2
239
243.2
241
245.2
243
247.2
245
249.0
B02 060309_CT_DOG CT2
0
100
200
300
400
500
600
235245
192
191.4
194
193.1
196
195.1
198
197.1
200
199.2
202
201.2
204
203.3
206
205.2
208
207.1
210
209.3
212
211.6
D01 060309_CT_DOG CT15
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
199
201
220
223.5
222
225.4
224
227.5
226
229.5
228
231.6
230
233.7
232
235.9
234
237.9
236
239.9
238
241.8
240
243.6
E02 060228_TC_EqDogRun01 CTD18
0
1000
2000
3000
229 239
MARCADOR 1
MARCADOR 2
MARCADOR 3
MARCADOR 4
ANALISIS DE PARENTEZCO: PATERNIDAD
PADRE ALEGADOMADRE BIOLÓGICA
CRÍA
?
140 / 144
136
136.9
140
140.9
144
144.7
148
148.7
152
152.7
156
156.8
160
161.0
164
165.0
168
169.3
172
173.4
176
177.2
B02 050207_CT_Bov_DogRun01 CTB12
1401501601700
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
FH2054
140141144
145
ALELO PATERNO
ALELO MATERNO
136
136.9
140
140.9
144
144.7
148
148.7
152
152.7
156
156.8
160
161.0
164
165.0
168
169.3
172
173.4
176
177.2
E01 050207_CT_Bov_DogRun01 CTB7
1401501601700
5000
10000
FH2054
136137
144145
136 / 144 140 / 148
136
136.9
140
140.9
144
144.7
148
148.7
152
152.7
156
156.8
160
161.0
164
165.0
168
169.3
172
173.4
176
177.2
H01 050207_CT_Bov_DogRun01 CTB10
1401501601700
1000
2000
3000
FH2054
140141
148149
1 - NO EXCLUSIÓN DE PATERNIDAD
PADRE ALEGADO
MADRE
CRÍA
PADRE ALEGADO
MADRE
CRÍA
2 - EXCLUSIÓN DE PATERNIDAD
ANALISIS DE DIVERSIDAD: CONSERVACION
OVINO CRIOLLOARGENTINO
ADN
IDENTIFICACIÓN DEL ORIGEN DE LOS COMPONENTES
ADULTERACION DE ALIMENTOS
DETERMINACION DE LA ESPECIE DE ORIGEN
(+)
(-)
PCR – RFLP
CITOCROMO BCITOCROMO OXIDASA I
DETECCION DE ENFERMEDADES
