Presentacion catedra ainia

INFLUENCIA DEL PROCESADO Y LA DIGESTIÓN IN

VITRO EN LAS PROPIEDADES BIOACTIVAS DE LOS

EXTRACTOS DE HOJA DE OLIVO (VAR. SERRANA)

TRABAJO FINAL DE CARRERA

TITULACIÓN:

INGENIERO AGRÓNOMO

ALUMNO:

JAIME CÁNOVAS DE LA NUEZ

DIRECTORES:

Dr. JOSÉ VICENTE GARCÍA PÉREZ

Dr. JOSÉ ENRIQUE CARRERES MALONDA

DIRECTORA EXPERIMENTAL:

Dña. MARGARITA H. AHMAD QASEM MATEO

Valencia, Diciembre 2011

1

ÍNDICE 1. Introducción 2. Objetivos 3. Materiales y métodos 4. Resultados y discusión 5. Conclusiones

2

INTRODUCCIÓN

3

INTRODUCCIÓN

•España es el mayor productor de aceitunas y de aceite del mundo. •Las hojas de olivo son un subproducto con escaso valor añadido procedente de la elaboración del aceite de oliva y de la poda. •Su uso normalmente está destinado a la alimentación animal y a la quema.

El cultivo del olivo

4

• Las hojas de olivo presentan compuestos polifenólicos con propiedades bioactivas.

• Es necesario procesar las hojas de olivo para obtener extractos ricos en compuestos polifenólicos.

•El procesado puede influir tanto en los costes del proceso como en la composición de los extractos.

Compuestos fenólicos

Oleuropeína

Luteolina

Verbascósido

INTRODUCCIÓN

Hidroxitirosol

5

• La deshidratación previa del material vegetal puede favorecer la liberación de compuestos polifenólicos.

•El secado por aire caliente es una técnica sencilla y rápida.

• La liofilización es una técnica óptima para preservar la calidad pero es muy costosa.

Métodos de deshidratación INTRODUCCIÓN

6

• La extracción convencional es una técnica sencilla pero muy lenta.

• La aplicación de ultrasonidos puede facilitar el intercambio de materia entre sólido y solvente y reducir el tiempo de extracción.

• Es necesario evaluar cómo influye la aplicación de los ultrasonidos en la cinética de extracción y en la composición de los extractos.

Métodos de extracción INTRODUCCIÓN

7

• Para determinar la bioaccesibilidad y biodisponibilidad es necesario realizar una simulación gastrointestinal.

• Durante esta etapa se promueve la degradación y/o formación de nuevos compuestos polifenólicos.

Digestión in vitro INTRODUCCIÓN

8

OBJETIVOS

9

El objetivo general de este trabajo fue contribuir a la mejora de la obtención de extractos naturales a partir de hojas de olivo. Determinar la influencia del procesado en la extracción de compuestos fenólicos. - Deshidratación. - Aplicación de ultrasonidos en el proceso de extracción. Determinar los cambios en la composición de los extractos durante la digestión in vitro. - Cinética de los cambios. - Degradación y/o formación de los compuestos fenólicos.

OBJETIVOS

10

MATERIALES Y MÉTODOS

11

Materia prima

-Hojas de olivo (Olea europea L. var. Serrana).

- Recogidas en el T.M. de Segorbe.


12

AOAC, procedimiento 934.01

Determinación de la humedad


Deshidratación

Secado por aire caliente Liofilización

13

70°C-55 min 120°C-12 min 24 h


Extracción convencional

Molienda 8°C 10 min 5000 rpm

Extracción Centrifugado

Filtrado Almacenamiento

14

30°C Solvente etanol-agua ,80% 24 h 120 rpm


Equipo de

refrigeración

Depósito-

pulmón

Bomba

Vaso de

vidrio con

camisa

Sonda

ultrasónica

Controlador

Ordenador

15

Extracción asistida por ultrasonidos


16

Determinación de la potencia aplicada EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS

Tiempo (s)

Te

mp

eratu

ra

(°C

)

m Masa de solvente

Cp Calor específico del

solvente

Incremento de

temperatura

respecto al tiempo

dT/dt

( ) dTP W m Cp t

y = 0,0668x + 19,3270 R² = 0,9993

0

5

10

15

20

25

30

35

0 20 40 60 80 100 120 140 160


SELECCIÓN DE VARIABLES ÓPTIMAS

Amplitud Ø de sonda ultrasónica

Temperatura Tiempo

40 mm 22 mm 14 mm

5 min

10 min

15 min 20 min

25 min

30 min

35 min

40 min

25

30

35

40

45

50

40%

60% 80%

100%

17

EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS


Modelización

tB

tYY

Modelo de Naik

Cinéticas de extracción de compuestos fenólicos

18

Y

B

t

Contenido fenólico en

el equilibrio

Tiempo de extracción

Tiempo necesario

para alcanzar la

mitad del contenido

fenólico en el

equilibrio

EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDOS

Digestión in vitro

Digestión gástrica

Digestión intestinal

-Adición de pepsina

- pH 2

-Temperatura: 37°C

-Adición de pancreatina y sales biliares

- pH 7

-Temperatura: 37°C


19

Toma de

muestras

1ª h

2ª h

3ª h

4ª h

Propiedades bioactivas MATERIALES Y MÉTODOS

MÉTODO FOLIN-CIOCALTEU

CONTENIDO TOTAL EN COMPUESTOS FENÓLICOS

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE MÉTODO FRAP

MÉTODO TEAC

IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS MAYORITARIOS CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC-DAD) ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS-MS)

20

Deshidratación

Hojas de olivo

120°C 70°C Liofilización

Extracción

convencional

Extracción

asistida por

ultrasonidos

POLIFENOLES TOTALES FRAP TEAC HPLC

Digestión in vitro

-Digestión gástrica (1ª y 2ª h)

-Digestión intestinal (3ª y 4ª h)

POLIFENOLES TOTALES FRAP TEAC HPLC


21

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

22


Influencia del método de deshidratación

Método de deshidratación Compuestos fenólicos (mg GAE/g m.s.)

Aire caliente 120°C-12 min 66±3a

Aire caliente 70°C-55 min 42±3b

Liofilización-24 h 33±3c

Contenido total en fenoles

Tabla 4.1. Contenido de fenoles totales de los extractos procedentes de hojas de olivo deshidratadas.

23

• Con el secado por aire caliente se obtuvieron extractos con mayor contenido fenólico que con las muestras liofilizadas.

• Conforme aumentó la temperatura de secado los extractos presentaron mayor contenido total en fenoles.


Capacidad antioxidante

Método de deshidratación Capacidad antioxidante (mg TROLOX/g m.s.)

Aire caliente 120°C-12 min 92±7a

Aire caliente 70°C-55 min 87±6a,b

Liofilización-24 h 75±4b

Método de deshidratación Capacidad antioxidante (mg TROLOX/g m.s.)

Aire caliente 120°C-12 min 6,26±0,22a

Aire caliente 70°C-55 min 5,12±0,37a,b

Liofilización-24 h 4,65±0,49b

Tabla 4.2. Capacidad antioxidante (FRAP) de los extractos procedentes de hojas de olivo deshidratadas.

MÉTODO TEAC

Tabla 4.3. Capacidad antioxidante (TEAC) de los extractos procedentes de hojas de olivo deshidratadas.

MÉTODO FRAP

24

INFLUENCIA DEL MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN


Identificación de compuestos bioactivos

Tiempo de retención (min)

Ab

sorb

anci

a (U

A) Los compuestos mayoritarios son

Oleuropeína, verbascósido y luteolina-glucósido


Figura 4.1. Cromatograma a 280 nm de extracto de hoja liofilizada.

Tabla 4.4. Tiempos de retención de los compuestos fenólicos presentes en el extracto de hoja de olivo.

25


Cuantificación de compuestos bioactivos

Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD

Tratamiento

Co

nce

ntr

ació

n (

mg

/g m

.s.)

120°C 70°C LF

20

30

40

50

60

70

80

Oleuropeína

Verbascósido Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD

Tratamiento

Co

nce

ntr

ació

n (

mg

/g m

.s.)

120°C 70°C LF

0

4

8

12

16

20

• Las muestras secadas a 120°C presentaron los mayores contenidos de oleuropeína y verbascósido.


Figura 4.2. Media e Intervalos LSD (p < 0,05) para la concentración de oleuropeína (A) y de verbascósido (B).

A

B

26


Luteolina-glucósido

• La luteolina-glucósido prácticamente no se vio afectada por el método de deshidratación.

• La sensibilidad de los diferentes compuestos fenólicos al estrés ocasionado por la deshidratación es diferente.


27

CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS


Tratamiento

Con

cen

tració

n (

mg c

om

pu

esto

/ g

m.s

.)

120°C 70°C LF

7

8

9

10

11


Aplicación de ultrasonidos de potencia en el proceso de extracción

Amplitud

Figura 4.3. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo para diferentes amplitudes eléctricas.

Figura 4.4. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes amplitudes eléctricas.

Selección de variables óptimas Amplitud eléctrica (%) Potencia aplicada (W)

40 13

60 19

80 24

100 28

28



Diámetro de sonda ultrasónica

Figura 4.7. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo para diferentes diámetros de sonda ultrasónica.

Figura 4.8. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes diámetros de sonda ultrasónica.

APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA

Diámetro de sonda ultrasónica (mm) Potencia aplicada (W)

14 28

22 51

40 33

29


Temperatura de extracción

Figura 4.10. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo para diferentes temperaturas.

Figura 4.11. Evolución de la capacidad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes temperaturas.



Temperatura

CT

F (

mg

GA

E/g

m.s

.)

25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C

32

34

36

38

40

42


Temperatura

CA

(m

g T

RO

LO

X/g

m.s

.)

25°C 30°C 35°C 40°C 45°C 50°C

60

63

66

69

72

75

78

30



Tiempo de extracción

Figura 4.13. Evolución del contenido de compuestos fenólicos totales de los extractos de hoja de olivo para diferentes tiempos de extracción.

Figura 4.14. Evolución de la actividad antioxidante de los extractos de hoja de olivo para diferentes tiempos de extracción.



Tiempo

CT

F (

mg

GA

E/g

m.s

.)

5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min

31

34

37

40

43

46


Tiempo

CA

(m

g T

RO

LO

X/g

m.s

.)

5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30 min 35 min 40 min

58

63

68

73

78

83

88

31



Amplitud

Diámetro de sonda ultrasónica

Temperatura

Modelización APLICACIÓN DE ULTRASONIDOS DE POTENCIA

32



Influencia en la cinética de extracción

0

10

20

30

40

50

0 3 6 9 12 15

CF

T (

mg

GA

E/

g m

.s.)

Tiempo (min)

Extracción estática


US

Figura 4.16. Influencia del método de extracción en la evolución del contenido total de compuestos fenólicos de los extractos de hoja de olivo.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 3 6 9 12 15

CA

(mg

TRO

LOX

/g m

.s.)

Tiempo (min)



US

Figura 4.17. Influencia del método de extracción en la evolución de la actividad antioxidante de extractos de hoja de olivo.


US



US



33



Extracción

CT

F (

mg

GA

E/g

m.s

.)

Convencional US

30

32

34

36

38

40

INFLUENCIA EN LA CINÉTICA DE EXTRACCIÓN


Extracción

CA

(m

g T

RO

LO

X/g

m.s

.)

Convencional US

66

68

70

72

74

76

Figura 4.18. Media e Intervalos LSD (p < 0,05) para el contenido total de compuestos fenólicos (A) y capacidad antioxidante (B).

A

B

- Los extractos finales mostraron un contenido fenólico similar.

- La aplicación de ultrasonidos permitió obtener extractos con una capacidad antioxidante ligeramente superior.


34


Influencia en la Composición de los extractos Extracción convencional

Extracción asistida por ultrasonidos

- La aplicación de ultrasonidos permitió obtener extractos con un perfil fenólico idéntico a los obtenidos con extracción convencional.

Ab

sorb

anci

a (U

A)

Ab

sorb

anci

a (U

A)



A

B

Figura 4.19. Cromatograma a 280 nm de extracto procedente de hoja secada a 120°C y obtenido de forma convencional (A) y con aplicación de ultrasonidos (B).

O

L

V

V

L

O

35


Influencia de la digestión in vitro en las propiedades de los extractos

Contenido total en fenoles

Figura 4.20. Evolución del contenido total de compuestos fenólicos durante la digestión in vitro.

• La digestión in vitro redujo la cantidad de compuestos fenólicos en el extracto, especialmente durante la primera hora de la digestión.

• La mayor reducción correspondió a los extractos procedentes de muestras secadas a 120°C mientras que la menor a las muestras liofilizadas.

36


Figura 4.21. Evolución de la capacidad antioxidante (FRAP) durante la digestión in vitro.

• La capacidad antioxidante medida con FRAP de los extractos no varió prácticamente durante la digestión gástrica.

• Sin embargo, a lo largo de la digestión intestinal (3ª h) se produjo un incremento de la capacidad antioxidante.

Capacidad antioxidante (FRAP)

INFLUENCIA DE LA DIGESTIÓN IN VITRO

37

Capacidad antioxidante (TEAC)

Figura 4.22. Evolución de la capacidad antioxidante (TEAC) durante la digestión in vitro.

• La mayor reducción de la capacidad antioxidante (TEAC) se produjo durante la primera hora de la digestión.


Identificación de los principales compuestos fenólicos

Extracto inicial

Ab

sorb

anci

a (U

A)

Ab

sorb

anci

a (U

A)

Tiempo de retención (min) Tiempo de retención (min)

Figura 4.23. Cromatograma a 280 nm de extractos iniciales (A) y digeridos (B) procedente de hoja secada a 70°C.

A

Extracto digerido B


V L O

L

O

38


Cuantificación de los principales compuestos fenólicos

Oleuropeína

Figura 4.24. Evolución de la concentración de oleuropeína durante la digestión in vitro.


• La oleuropeína descendió a lo largo de toda la simulación, especialmente durante la primera y tercera hora de la digestión.

• Todos los extractos presentaron una reducción de oleuropeína superior al 86%.

39


Verbascósido


Figura 4.25. Evolución de la concentración de verbascósido durante la digestión in vitro.

• El verbascósido descendió de forma moderada durante la primera hora de la digestión y prácticamente desapareció durante la tercera hora de la digestión.

CUANTIFICACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS

40

•Los extractos “120°C” mostraron la mayor degradación de oleuropeína y verbascósido, mientras que los extractos “LF” mostraron la menor al final de la simulación.


Luteolina-glucósido


Figura 4.26. Evolución del contenido de luteolina-glucósido durante la digestión in vitro.

•La luteolina glucósido de los extractos sufrió una menor degradación que la oleuropeína y el verbascósido

•Este compuesto se redujo de forma considerable durante la primera hora de la digestión (40%).

41

0

2

4

6

8

10

12

0 60 120 180 240

mg

/ g

m.s

.

Tiempo digestión (min)

LF

120 °C-US

70 °C

120 °C

CONCLUSIONES

42

CONCLUSIONES

• El método de deshidratación de la hoja de olivo influyó en la composición de los extractos. La liofilización fue la técnica que conllevó una mayor degradación de los compuestos fenólicos, mientras que el secado por aire caliente a 120°C fue el método que de deshidratación que mejor preservó estos compuestos.

•La oleuropeína y el verbascósido presente en los extractos varió en función del método de deshidratación aplicado, mientras que el contenido de luteolina-glucósido fue muy similar para todos ellos. Esto indica que la sensibilidad de los distintos fenoles de la hoja de olivo al estrés producido por la deshidratación es diferente. • Una eficiente aplicación de ultrasonidos durante el proceso de extracción permitió acortar de manera drástica el tiempo de tratamiento. Así, con únicamente 15 minutos de tratamiento de aplicación ultrasónica, se obtuvieron un contenido total fenólico y capacidad antioxidante similar que con 24 horas de extracción convencional. Estos resultados muestran el potencial de esta tecnología para mejorar la productividad de este proceso a nivel industrial.

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• El método de deshidratación de la hoja de olivo influyó en la composición de los extractos. La liofilización fue la técnica que conllevó una mayor degradación de los compuestos fenólicos, mientras que el secado por aire caliente a 120°C fue el método que de deshidratación que mejor preservó estos compuestos.

•La oleuropeína y el verbascósido presente en los extractos varió en función del método de deshidratación aplicado, mientras que el contenido de luteolina-glucósido fue muy similar para todos ellos. Esto indica que la sensibilidad de los distintos fenoles de la hoja de olivo al estrés producido por la deshidratación es diferente. • Una eficiente aplicación de ultrasonidos durante el proceso de extracción permitió acortar de manera drástica el tiempo de tratamiento. Así, con únicamente 15 minutos de tratamiento de aplicación ultrasónica, se obtuvieron un contenido total fenólico y capacidad antioxidante similar que con 24 horas de extracción convencional. Estos resultados muestran el potencial de esta tecnología para mejorar la productividad de este proceso a nivel industrial.

CONCLUSIONES

• La aplicación de ultrasonidos no varió el perfil polifenólico de los extractos, ya que no se identificaron prácticamente diferencias respecto a los extractos obtenidos de forma convencional. Así, la energía ultrasónica no implicó la formación de nuevos compuestos.

• El contenido total fenólico y la capacidad antioxidante de los extractos se redujeron durante la digestión in vitro. Los cambios más importantes ocurrieron durante la primera y tercera hora de dicha simulación.

• La digestión in vitro redujo de forma considerable la oleuropeína presente en los extractos, mientras que el verbascósido prácticamente desapareció. La luteolina-glucósido fue el compuesto más estable durante la digestión. Estos resultados sugieren la posibilidad de proteger los extractos de hoja de olivo con técnicas de micro o nanoencapsulación para evitar la degradación de los polifenoles más sensibles a la digestión gastrointestinal.

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• La aplicación de ultrasonidos no varió el perfil polifenólico de los extractos, ya que no se identificaron prácticamente diferencias respecto a los extractos obtenidos de forma convencional. Así, la energía ultrasónica no implicó la formación de nuevos compuestos.

• El contenido total fenólico y la capacidad antioxidante de los extractos se redujeron durante la digestión in vitro. Los cambios más importantes ocurrieron durante la primera y tercera hora de dicha simulación.

• La digestión in vitro redujo de forma considerable la oleuropeína presente en los extractos, mientras que el verbascósido prácticamente desapareció. La luteolina-glucósido fue el compuesto más estable durante la digestión. Estos resultados sugieren la posibilidad de proteger los extractos de hoja de olivo con técnicas de micro o nanoencapsulación para evitar la degradación de los polifenoles más sensibles a la digestión gastrointestinal.

INFLUENCIA DEL PROCESADO Y LA DIGESTIÓN IN

VITRO EN LAS PROPIEDADES BIOACTIVAS DE LOS

EXTRACTOS DE HOJA DE OLIVO (VAR. SERRANA)

TRABAJO FINAL DE CARRERA

TITULACIÓN:

INGENIERO AGRÓNOMO

ALUMNO:

JAIME CÁNOVAS DE LA NUEZ

DIRECTORES:

Dr. JOSÉ VICENTE GARCÍA PÉREZ

Dr. JOSÉ ENRIQUE CARRERES MALONDA

DIRECTORA EXPERIMENTAL:

Dña. MARGARITA H. AHMAD QASEM MATEO

Valencia, Diciembre 2011

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