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Induccin del metabolismoParte I. Regulacin gentica en el operon lacFacultad de qumica, UNAM

Laboratorio de bioqumica experimental

Grupo:

Profesoras: Sobeida Snchez NietoLilian Gonzlez Segura

Fernando Esteban Hernndez Huerta

La adaptabilidad de las bacterias y otros procariontes depende en grado considerable de su capacidad de encender y apagar la expresin de series especificas de genes en respuesta a demandas del ambiente.ADAPTACIONRegulacin de genes

La expresin de estos genes se lleva a cabo solamente cuando el microorganismos necesita las protenas necesarias ligadas a los nutrimentos del ambiente.

Para producir estas protenas se necesita un alto grado de energa.Galletasa

FIN: Crecer y dejar descendencia

Genes Constitutivos:

Los que codifican para protenas independientemente de las condiciones ambientales.

Ejemplos:

Genes para:

RNA ribosmicosProtenas ribosmicasRNA de transferenciaRNA polimerasa

Regulacin de la expresin gnica:

TranscripcinTratamiento de mRNATraduccinFuncin enzimtica1) El de rpido encendido y apagado de la expresin de genes en respuesta a cambios ambientales.2)Circuitos pre programados de expresin de genesCmo aprovechan los nutrientes?

Las bacterias mejor adaptadas han sido capaces de crecer utilizando diferentes hidratos de carbono (glucosa, sacarosa, lactosa, arabinosa, galactosa)como fuente de energa.

Glucosa Otros carbohidratosLactosaGlucolisisb-lactamasaInduccinExpresin de genesque codifican paradegradar la lactosa.

Genes para la uso de la lactosa como fuente de carbono b-galactosidasa : hidroliza a la lactosa para formar glucosa y galactosa. 4 subunidades idnticas de 1021 aminocidos.

b-galactosido permeasa: transporte de azucares. Bombea b-galactsidos al interior de la clula. 275 aminocidos

b-galactosido transacetilasa: acetila la glucosa transfiere un grupo acetilo desde el acetil-CoA a los b-galactosidos. 275 aminocidos.

La expresin de los genes requiere un alto grado de energa.ATPGTP

Es por ello que las bacterias han desarrollado mecanismo por los cuales la sntesis de estas enzimas que cataboliza la lactosa se enciende en presencia de esta y se apaga en ausencia de la misma.

INDUCCIN: mecanismo por el cual la expresin de los genes se enciende por accin de una sustancia presente en el ambiente. (como la lactosa).

Esas sustancias se llaman INDUCTORES y a los genes que cuya expresin se regula de este modo se llaman GENES INDUCIBLES.

Las enzimas que intervienen en las vas catablicas, en el caso de carbohidratos como la lactosa, galactosa y arabinosa son inducibles de manera caracterstica: a nivel de transcripcin.

Las bacterias posen la capacidad metablica de sintetizar la mayora de las moleculas orgnicas(aminocidos, purinas ,vitaminas etc.) que requieren para crecer.

TriptfanoE. Coli tiene 5 genes que codifican para sntesis de triptfanoy si hay nutrientes en el medio?Si hay nutrientes en el medio se apagan los genes que sintetizan el triptfano, a este proceso se llama REPRESIN.

Un gen cuya expresin se ha apagado de esta forma se dice que se ha REPRIMIDO y cuando se enciende se ha DESREPRIMIDO.

Modelo del opernEn 1965 F. Jacob y J. Monod se les otorgo el premio nobel por proponer el modelo del opern para explicar la regulacin de genes que codifican a las enzimas para el catabolismo de la lactosa en E. coli.

Opern: la unidad contigua completa incluyendo los genes estructurales, el operador y el promotor.OpernNumero de protenas enzimticasFuncinLac3Hidrlisis y transporte de b-galactosidos.His9Sntesis de histidinaLeu4Conversin del a-oxoisovaleriano a leucinaara4Transporte y utilizacin de la arabinosa

Datos importantes sobre el operon lacEl operon lac de E. coli es un opern inducible

El gen regulador del opern de la lactosa, es lacI que codifica para la protena represora, gen i.

La forma activa del represor lac, es un tetrmero que contiene cuatro copias del producto gnico i.

Algunas pocas molculas de los productos gnicos de los genes del opern lac, se sintetizan en el estado no inducida proporcionando un nivel muy bajo de actividad enzimtica

El inductor del opern realmente es la alolactosa

Cunto miden?

1045 pb80 pb 35 pb 3510 pb 780 pb 825 pbOpern

Control positivo del opern lac por CAP Y AMP cclicoCuando hay glucosa y lactosa en el medio, E. coli solo ocupa la glucosa.

Qu le pasa al opern lac?

Represin por catabolito (efecto glucosa)

Centro de entrada de la ARN PolSitio de unin CAP-cAMPcAMPCAPProtena activadora por catabolito

Niveles altos de glucosa, producen niveles bajos de cAMP

NIVELES ALTOS DE GLUCOSAARN PolCuando existe gran cantidad de glucosa, la concentracin de cAMP es muy baja y el complejo CAP-cAMP no se forma. Ello impide que la ARN Pol se una a su centro de entrada. cAMP CAP

NIVELES BAJOS DE GLUCOSANiveles bajos de glucosa, producen niveles altos de cAMP

ARN PolcAMP CAPCuando no hay glucosa disponible, se forma un complejo entre la CAP y el cAMP, que se enlaza a su sitio de unin en el promotor y permite que la ARN Pol se una a su sitio de entrada y hay transcripcin de genes. Practica de laboratorio

Objetivos

- Comprender la importancia de la regulacin gentica como mecanismo paracontrolar los niveles de enzimas en la clula.

Conocer los elementos que integran el opern de la lactosa.

- Entender el funcionamiento del opern de la lactosa en presencia y ausenciade este carbohidrato.

- Conocer el concepto de represin catablica y cmo se lleva a cabo.

Reactivos 1 tubo con medio M9-glicerol estril Solucin de glucosa al 2% estril Solucin de lactosa al 2% estril Solucin de glucosa 2% + lactosa 2% estril Amortiguador Z (Na2HPO4-7H2O 60 mM, NaH2PO4-H2O 40 mM, KCl 10 mM,MgSO4-7H2O 1mM, -mercaptoetanol 50 mM, pH 7.0). Reactivo ONPG (Orto-Nitrofenil Galactosa). El reactivo es incoloro y debe prepararse justo antes de usarse para mejores resultados. SDS al 0.1% Na2CO3 1M CloroformoMaterial biolgicoCultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol.ONPG (o-nitrophenyl galactoside)Sustrato de la -galactosidasaSi existe enzima en el medio, el ONP es utilizado

IncoloroAmarillo

Anlisis de la tcnica:

Explica que es lo que hace cada reactivo. En dnde se encuentran las enzimas que son inducidas por la lactosa, en donde vamos a aadir el reactivo que nos dice que las enzimas se sinterizaron? que resultados se esperan?

Tubo A: Coloracin amarilla dbil ya que no hay lactosa en el medio (BASAL).

Tubo B: Color amarillo mas intenso debido a que la lactosa es la nica fuente de carbono (ENTONCES EL OPERN LAC SE ENCUENTRA INDUCIDO).

Tubo C: Coloracin amarilla intermedia debido a que primero se ocupo la glucosa y posteriormente la lactosa.

Tubo D: Coloracin amarilla intermedia debido a la represin catablica por la glucosa, pero la posterior induccin por la presencia de lactosa, siempre y cuando la glucosa se acabe

Tubo E: Sin Coloracion ya que no hay clulas en el medio. +Lactosa FuentesLehninger Albert L., Principios de bioqumica, Editorial: ediciones omega, S.A., Barcelona, pp. 910-910

Gardner Eldon Jonh, Principios de gentica, editorial Limusa Wiley, Mexico, 4 edicin, pp. 390-400

Devlin, Thomas M., Bioqumica, libro fe texto con aplicaciones clnicas, Editorial Reverte S.A., Mexico, 4 edicin.

Alberts, Bray, Lewis et all, Biologa molecular de la clula, Editorial ediciones Omega S.A. Barcelona, 2 edicin.