Producción de Biocombustibles y Químicos de Origen Renovable

Dra. Ana Alejandra Vargas TahDivisión de Estudios de Posgrado, Facultad de Ingeniería Química,

Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo.

IV REUNIÓN NACIONAL DE LA RED TEMÁTICA DE BIOENERGÍA

XIII REUNIÓN NACIONAL DE LA RED MEXICANA DE BIOENERGÍA

Noviembre 13-15, 2017, Cuernavaca, Morelos, Mexico

Renewable Energy Sources

• Biomasa

– Bio-combustibles líquidos

(Sector transporte).

– Plásticos Biodegradables

– Químicos Renovables.

Biorefinería

Sustentabilidad

Químicos

• Plásticos

• Polímeros

• Solventes

• Fenólicos

• Resinas (furfural)

• Ac. grasos

• Ac. orgánicos

• Pigmentos

• Detergentes

Combustibles

• Etanol

• Butanol

• Propanol

• Metano

• Bio-Diesel

• Bio-Gasolina

•Isopentenol

• Bio-Queroseno

• Bio-Electricidad

Combustibles y Químicos

Renovables

http://refuelingthefuture.yolasite.com/biofuels-and-bioenergy.php

Biofuels

Stöcker M., (2008) Angew. Chem. Int. Ed., 47, 9200 – 9211

¿Cómo se recuperan los azúcares

de la Biomasa?

Sugar Cane

Bagasse

Agave

Bagasse Corn Stover

Grass

Sorghum

Straw

Principales constituyentes:➢ Lignina.

➢ Hemicelulosa.

➢ Celulosa.

Hemicelulosa

(xilanos)

Celulosa

(glucanos)

Materiales

Lignocelulósicos

• Pentosas– Xilosa

– Arabinosa

• Hexosas– Glucosa

– Manosa

– Galactosa

• Azúcares Acetiladas

• Ác. glucuronico

• Ac. ferulico

• Ac p -cumárico

• Glucosa

Ratanakhanokchai et al. 2013, DOI: 10.5772/51820

Figura: http://genomicscience.energy.gov/centers/BRCs2014LR.pdf

• Químicos

• Organosolv• Organosolv pre-treatment removes extensive lignin and nearly

complete hemicelluloses, with resulting increase of accessiblesurface area and pore volume.

• Alkaline• The intermolecular ester bonds cross-linking xylan hemicellulose

and lignin are saponified, thus resulting in delignification ofbiomass.

• Dilute Acid• In dilute acid pretreatment, hemicellulose is hydrolyzed to

monosaccharides and the sugars can be further degraded to formother products. Increase the cellulose accessibility

Pretratamiento Termoquímico

Hidrólisis Termoquímica (HT)

Químicos

AFEX (Ammonia Fiber Expansion)

Organosolv

Alcalino

Líquidos Iónicos

Ácido Diluído

Zhao et al., 2012, Mamman et al., 2008, Hu and Ragauskas, 2012, Zhao et al., 2009.

La HT modifica las propiedades físicas y

químicas de los materiales, hidrolizando

la hemicelulosa y dejando la celulosa

accesible a las enzimas hidrolíticas.

Ácido Diluído

✓ Hidroliza los componentes de la

hemicelulosa e incrementa la

digestibilidad de la celulosa.

× Formación de furanos y ácidos

orgánicos que retardan ó inhiben el

crecimiento celular.

La temperatura, el tiempo y la

concentración de ácido son tres de las

variables que afectan directamente la

hidrólisis de los materiales lignocelulósicos.

Hidrólisis Termoquímica

Formación de furanos

Palmqvist et al., 2000; Li et al., 2009; Mamman et al., 2008; Martínez et al., 2000 y 2001, Zaldivar et al., 1999

Los furanos generados en

el pretratamiento, inhiben

el crecimiento celular y/ó

reducen su capacidad

fermentativa.

En sistemas fermentativos

la concentración máxima

de furanos debe ser

inferior a 2 g/L.

La hemicelulosa remanente del

pretratamiento y la celulosa

expuesta son degradadas por

celulasas y xilanasas para

recuperar los azúcares

presentes en los materiales pre

tratados.

Ratanakhanokchai et al. 2013, DOI: 10.5772/51820

Hidrólisis Enzimática

(Sacarificación)

Hemicelulosa

Celulosa

Se recuperan la xilosa y arabinosa

principalmente, ácido acético y

furanos, dejando expuesta la

celulosa.

Se recuperan las pentosas de la

hemicelulosa no hidrolizada en el

pretratamiento y la glucosa presente

en la celulosa.

HIDROLIZADOS RICOS EN AZÚCARES

FERMENTABLES

Hidrolizados ricos en azúcares fermentables

con bajo contenido de furanos

Lignocellulosic characterization

Pre Treatment

Thermochemical Hydrolysis

Characterization

Saccharification(Enzymatic hydrolysis)

Syrup(Rich in C5)

Solid(Rich in cellulose and lignin)

Characterization

Syrup(Rich in C6)

Solid residues

Rich in lignin

Sequential Thermochemycal and Enzymatic Hydrolysis

Lignocellulosic characterization

Pre Treatment

Thermochemical Hydrolysis

Characterization

Saccharification(Enzymatic hydrolysis)

Syrup(Rich in C5)

Solid(Rich in cellulose and lignin)

Characterization

Solid residues

Rich in lignin

Sequential Thermochemycal and Enzymatic Hydrolysis

Syrup(Rich in C5 and C6)

Procesamiento integral del

material lignocelulósico

Hidrólisis, Sacarificación y Fermentación

Secuencial

Pretratamiento

Sacarificación

Fermentación

EtanolÁcido Láctico

Inóculo

• Hidrolizado

• Rico en azúcares

fermentables.

• Bajo contenido de

furanos.

• Mínima ó nula adición

de compuestos de

medio de cultivo.

• Mínimo número de

operaciones unitarias

posibles.

Caracterización del Material

Lignocelulósico

Rastrojo de Maíz

Composición del rastrojo de maíz

Glucanos

(%)

Xilanos

(%)

Arabinanos

(%)

Lignina

(%)

Cenizas

(%) Referencia

36.8 21.5 17.5 9.3 Lin et al., 2010

35.2 19.8 16.9 2.4 Kadam et al., 2008

37.7 18.8 17.6 Qing et al, 2010

36.9 20 3.07 13.76 Klas 5.67 Jian et al., 2009

36.4 18 3 16.6

Olofsson et al.,

2008

40.8 20.6 21.3 Liu et al., 2009

18.3 6.6 Zhu et al., 2009

36.8 22.2 5.5 23.1 Galbe et al., 2007

% Sin tratar

Glucanos 29.9 (1.2)

Xilanos 19.6 (0.8)

Arabinanos 3.4 (0.2)

Grupo acetilo 4.9 (0.4)

Lignina 21.7 (0.6)

Extractivos 6.8 (0.2)

Cenizas 10.9 (0.7)

Otros 2.8 (2.05)

Rastrojo de Maíz Blanco

(Bajío, cosecha 2012)

El material empleado en todos los

experimentos fue recolectado del campo,

sin proceso de lavado ó limpieza.

Rastrojo de Maíz empleado tiene 15%

menos glucanos que el promedio de los

reportados. La producción máxima teórica de

azúcares para una carga de 15%

WRM/W Reacción de rastrojo de maíz

es:

➢ 33.22 g/L de Xilosa

➢ 49.95 g/L de Glucosa

Hidrólisis TermoquímicaPre-tratamiento.

La concentración de xilosa

disminuye rápidamente al

aumentar la temperatura,

mientras que el Fur se incrementa,

indicando que la xilosa se está

degradando.

Bajo estas condiciones de reacción,

la mayor concentración de xilosa

se presentó a 130 °C . A la misma

temperatura se observó la menor

concentración de Fur e HMF.

15% w/w, 2 % H2SO4

0

10

20

30

40

0

5

10

15

Xy

lose (

g/L

) FU

R (g

/L)

120 130 140 150 160 1700

10

20

30

0

1

2

3

4

5

Glu

co

se (

g/L

) HM

F (g

/L)

CS

F

Temperature (°C)

Efecto de la Temperatura

0 2 4 6 8 10 12 140

10

20

30

40

600.0

0.5

1.0

1.5

Xylo

se

(g

/L)

F (g

/L)

CS

F

Time (min)

Efecto del Tiempo de Hidrólisis

Xilosa

95 % de la xilosa fue recuperada

con 8 min de tiempo de hidrólisis a

130 °C, con una producción de

furfural cercana a los 0.3 g/L

15% w/w, 2% H2SO4, 130 °C

Tiempo

(min)

Xilosa Recuperada

(%)

0 80.2

4-12 95

60 100

El contenido de furfural

se incrementó con el

tiempo de hidrólisis y el

factor de severidad

Combined Severity Factor

CSF = log10(R0) – pH

R0 = tr * exp [(Tr - 100) / 14.75]

0 2 4 6 8 10 12 140

2

4

6

8

10

600.0

0.5

1.0

1.5

Glu

co

se

(g

/L) H

MF

(g/L

)C

SF

Time (min)

Efecto del Tiempo de HidrólisisGlucosa

• La liberación de glucosa incrementa

ligeramente con el tiempo de

hidrólisis.

• El Hidroximetil furfural incrementó

ligeramente con 60 min de hidrólisis

a diferencia del furfural.

15% w/w, 2% H2SO4, 130 °C

Tiempo

(min)

Glucosa recuperada

(%)

0 6.7

4-12 13

60 18.4

8 min de tiempo de mantenimiento es

suficiente para hidrolizar el 95 % de

los xilanos presentes en el rastrojo de

maíz, con una concentración de 0.6

g/L de furanos totales.

0

10

20

30

40

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Xylo

se

(g

/L)

F (g

/L)

0 1 2 3 40

2

4

6

8

10

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Glu

co

se

(g

/L) H

MF

(g/L

)

CS

F

H2SO4 (%, w/w)

Efecto de la Concentración de H2SO4

Con 2% de ácido se hidrolizó el 93

% de los xilanos con 0.44 g/L de

furanos totales.

• La mayor liberación de xilosa fue entre

el 0.5 y 2 % de ácido, en forma lineal.

• F e HMF se incrementaron linealmente

con la concentración de ácido, hasta 1

g/L de furanos totales. La formación de

furanos está directamente relacionada

con el CSF.

15 % w/w, 130 °C, 8 min

Caracterización de los materiales después de la

Hidrólisis Termoquímica

Sin tratar HT

%1%

H2SO4

2%

H2SO4

Glucanos 29.9 (1.2) 45.1 (0.7) 51.5 (0.1)

Xilanos 19.6 (0.8) 13.0 (0.9) 9.3 (0.3)

Arabinanos 3.4 (0.2) 0.8 (0.1) 0.6 (0.2)

Grupo acetilo 4.9 (0.4) 1.7 (0.1) 0

Lignina 21.7 (0.6) 26.9 (1.3) 31.2 (0.6)

Extractivos 6.8 (0.2) ND ND

Cenizas 10.9 (0.7) ND ND

Otros 2.8 (2.05) 12.5 (2.8) 7.4 (1.2)

Después de la HT

• Glucanos

• Xilanos, arabinanos y grupo acetilo

• Lignina aumentó ligeramente

La HT removió la hemicelulosa,

dejando la celulosa expuesta

para la Hidrólisis Enzimática (HE)

Antes Después

Hidrólisis EnzimáticaSacarificación

Hidrólisis Enzimática 15 UPF/gGlucano 50 °C y 150 rpm

0 6 12 18 240

10

20

30

40

2.5 %

3.0%

0 %

0.5 %

1.0 %

2.0 %

Time (h)

Xy

lose (

g/L

)

HE - 12 h

• Menos del 50% de los xilanos fueron recuperados de los materiales tratados con 0 y 0.5 % H2SO4 (12 h) , Indicando una deficiente HT.

• El material tratado con 1 % de ácido liberó el 95.2 % de la xilosa (24 h).

Hidrólisis Enzimática 15 UPF/gGlucano 50 °C y 150 rpm

• El 52.2 % de glucosa puede serrecuperada con el complejo enzimático,cuando el material fue tratado sólo conagua. Indicando que el ácido favorece laremoción de la hemicelulosa.

• Se favoreció la accesibilidad de lasenzimas a la celulosa en los materialestratados con 1-3 % H2SO4 .

0 6 12 18 240

10

20

30

40

2.5 %

3.0 %

0.0 %

0.5 %

1.0 %2.0 %

Time (h)

Glu

co

se (

g/L

)

Material tratado con

(% H2SO4)

Glucosa Liberada (%) –

24 h

0 52.2

0.5 70.4

1 - 3 92.6

• 93.3 % de la xilosa y 92.6 % de la glucosadisponibles fueron recuperadas de losmateriales tratados con 1 y 2 % H2SO4

después de la HE .

• Resultados con 15 UPF/gRM indican que conmayor cantidad de enzima se pueden liberara las 24 h el 95 % de la glucosa.

Material tratado con

(% H2SO4)

Furanos totales

(g/L)

Ác acético

(g/L)

1 0.03 5.14

2 0.26 5.91

Caracterización de los materiales después de la

sacarificación15 FPU/gglucano

1% 2%

Glucanos 39.4 (0.8) 41.2 (1.5)

Xilanos 16.6 (0.7) 10.7 (0.3)

Arabinanos 0.5 (0.1) 0.3 (0.1)

Grupo acetilo 2.3 (0.2) 0

Lignina 31.8 (0.5) 39.5 (2.4)

Extractivos ND ND

Cenizas ND ND

Otros 9.5 (0.2) 8.3 (0.7)

1 % H2SO4 2 % H2SO4

Concentraciones de ácido entre 1 y 3 % favorecieron la accesibilidad de las enzimas a la celulosa.

Producción de etanol

E. coli MS04

Productora de Etanol

1) Utrilla et al., 2009

2) Utrilla et al., 2012

3) Fernández-Sandoval et al., 2012.

PHOSPHOENOLPYRUVATE

PYRUVATE

G3P

FRUCTOSE-6P

XYLOSE

XYLULOSE-5P

XYLULOSE

xylB

ETHANOL

FORMATE

ldhA

E

T

H

A

N

O

L

GLUCOSE

PEP PYRUVATE

GLUCOSE-6P

FRUCTOSE-1,6 BP

DIHYDROXYA-

CETONE-P NAD+

NADH+H

1,3-DIPHOSPHOGLYCERATE

3-PHOSPHOGLYCERATE

pflB

ACETYL-CoA ACETALDEHYDE

adhE

NADH+H NAD+

ACETYL-P ACETATE

ackA

FUMARATE SUCCINATE

frdABCD

PP

PATHWAY

X

X

xylA

ATP

ADP

ATP

ADP

ATP ADP

xylEPTS

XYLOSE

xylFGH

ADP

ATP

NADH+H NAD+

X

NADH+H NAD+

adhEX

NADH+H NAD+pta

ADP ATP

ADP

ATP

X

poxB

X

METHYLGLYOXAL

mgsA

L- LACTATE

gatC S184LXYLOSE

D-LACTATE

ACETALDEHYDE

CO2

pdc

NADH+H

NAD+

adhB

MG1655, ΔpflB, ΔadhE, ΔfrdA, ΔxylFGH,

gatC S184L, ΔmidarpA, Δreg 27.3 kb,

ΔldhA, PpflB::pdcZm, adhBZm

Strain Genotype Re

f

MG1655 Wild type (WT)

CL3 MG1655: ΔpflB, ΔadhE, ΔfrdA 1

JU01 CL3: ΔxylFGH 2

JU15 JU01 Adaptive Evolution:

gatC S184L, ΔmidarpA, Δreg 27.3

kb

2

MS01 JU15 ΔldhA 3

MS04 MS01 PpflB::pdcZm, adhBZm 3

0

20

40

60

80

100

0

10

20

30

Ac

eta

te (g

/L)

Eth

an

ol (g

/L)

To

tal S

ug

ar

(g/L

)

1% H2SO4Glucose (g/L)

Xylose (g/L)

Arabinose (g/L)

0 12 24 36 480

20

40

60

80

100

0

10

20

30

Ac

eta

te (g

/L)

Eth

an

ol (g

/L)

To

tal S

ug

ar

(g/L

)

2% H2SO4

Glucose (g/L)

Xylose (g/L)

Arabinose (g/L)

Time (h)

Producción de Etanol

Hidrolizados de Rastrojo de Maíz

1% H2SO4 2% H2SO4

QTS 12h (gTS/L h) 4.17 (0.29) 3.71 (0.18)

YEtOH 24h (gEtOH/gTS) 75.54 (0.77) 73.97 (0.50)

QEtOH 24h (gEtOH/L h) 0.99 (0.028) 0.96 (0.014)

Etanol Concentration

24h (gEtOH/L) 24.5(0.24) 23.53 (0.26)

QTS – Velocidad volumétrica de consumo de azúcares

Y ETOH – Rendimiento de EtOH por gramo de azúcares totales.

• La concentración de furanos no afectó

el consumo de azúcares.

• Los “lodos” contenían los nutrientes

necesarios para mantener activo el

metabolismo de las células.

• Los sólidos no dañaron las células.

• La concentración de acetato no

inhibió el metabolismo de la cepa.

Vargas-Tah et al., Bioresource Technology, 2015

Producción de Lactato

E. coli AV03

productora de Ácido LácticoMG1655, ΔpflB, ΔadhE, ΔfrdA,

ΔxylFGH, gatC S184L, ΔmidarpA, Δreg

27.3 kb, ΔpoxB, ΔmgsA, ΔackA-pta

Strain Genotype Ref

MG1655 Wild type (WT)

CL3 MG1655: ΔpflB, ΔadhE, ΔfrdA 1

JU01 CL3: ΔxylFGH 2

JU15 JU01 Adaptive Evolution:

gatC S184L, ΔmidarpA, Δreg 27.3 kb

2

AV03 JU15: ΔpoxB, ΔmgsA, ΔackA-pta This Work

1) Utrilla et al., 2009

2) Utrilla et al., 2012

3) Utrilla et al., 2016

La cepa JU15 fue modificada

genéticamente, eliminando las

vías fermentativas de

producción de acetato.

Metabolic Engineering of E. coli for

Lactic Acid Production

Martínez et al., 2017

Hidrólisis Termoquímica, Enzimática y Fermentación

Secuencial

Metodología

15 % w/w (RM), 2 %

H2SO4, 130 °C, 8 min

• pH ~4.8 con KOH

• Citrato de Na (50 mM)

• 15 UPF / gglucano (NS22086)

• Kanamicina (30 mg/mL)• 50 °C, 150 rpm, 24 h

HT HE / Sacarificación

Inoculo

(AV03)• Xilosa 20 g/L

• Acetato Na (4 g/L)

• pH 7.0

• 37 °C

• 480 rpm

• 0.1 vvm

Hidrólisis Termoquímica, Enzimática y Fermentación

Secuencial

Metodología

HE / Sacarificación

Inóculo

(AV03)

Fermentación • pH 7.0 (KOH)

• (NH4)2HPO4 (0.66 g/L)

• NH4H2PO4 (0.22 g/L)

• Citrato de Na (0.1 g/L)

• Betaína (1 mM)

• AV03 (10 DO)

• pH 7.0

• 37 °C

• 100 rpm

0

10

20

30

40

50

0

1

2

3

4

5

Glu

co

se

(g

/L)

Xylo

se

(g

/L)

Ara

bin

os

e (g

/L)

Ac

eta

te (g

/L)

0 12 24 36 48 60 72 84 960

20

40

60

80

0

20

40

60

80

La

cta

te (g

/L)T

ota

l S

ug

ar

(g/L

)

Tiempo (hr)

Producción de Ácido Láctico

AV03

QS

(gTS/L* h)

qS

(gTS / gDWC *h)

QP

(gLc /L* h)

AV033.358

(10h)

0.908

(10h)

2.243

(24h)

• Fermentación eficiente de

azúcares en el hidrolizado

hemicelulósico.

• La concentración de acetato se

mantuvo constante.

Utrilla et al., Bioresource Tech. 2017

Yaca

Composición

(%)

Cascara Fibra Pétalos

Glucanos 8.78 45.28 49.23

Xilanos 2.61 8.35 9.21

Cenizas 5.75 8.00 6.49

Lignina 31.33 26.42 8.38

Ing. Emmanuel Aguilar

UMSNH

Sorgo

Ing. Francisco Javier Rodríguez

UMSNH

¡ Gracias !

Dra. Alejandra Vargas-Tah

aalevar@gmail.com