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Colección de trabajo de variedades de cítricos libres
de CTV,EXOCORTIS, HLB
Diana Rodríguez Msc, Lizeth Palacios, Mauricio Martínez Msc., Nubia Murcia Riaño Ph.D
La Habana, 17 de Octubre de 2017
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PRODUCCION DE CITRICOS EN COLOMBIA
Naranjas: 33.213 haPn: 25.104 ha2012: 519.941 TonRto: 21 Ton/ha
Limas ácidas: 15.214 haPn: 10.140 ha2012: 128.318 TonRto: 12,7 Ton/ha
Mandarinas: 10.498 haPn: 8.262 ha2012: 106.277 TonRto: 12,9 Ton/ha
Fuente: ENA – DANE, 2012
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NACIONAL 2010 2011 2012 2013 2014* 2015* 2016* e
Área (ha) 65,004 66,311 70,255 73,641 79.419 83,576 86,596
Producción (t) 1´165,610 798,383 1´163,745 1,256,718 1´482,000 1´747,161 2´061,650
Rendimiento(t/ha)
17,2 12,04 17,2 17,2 18 19 23,04
En los últimos 6 años, el área de cítricos 18.572 hectáreas, con un promedio por año de 3,720 ha, que equivale a un crecimiento anual del 4,8%. Las limas es la de mayor crecimiento. Al 2015 el área productiva de cítricos fue de 63.621 hectáreas.
PRODUCCION DE CITRICOS EN COLOMBIA
* Cálculos realizados con la información de Naranjas, Mandarinas y Limas ácidas de la CNC, 2014, ENA, 2014 2015, SIOC, 2016
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PROBLEMAS FITOSANITARIOS DE LOS
CÍTRICOS EN COLOMBIA
Exocortis
Tristeza de los Cítricos
Leprosis
Psorosis
(Resolución 2390, ICA 2015)
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VIRUS DE LA TRISTEZA
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Lima acida mejicana
Síntomas asociados a infecciones de CTV
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VIROIDE DE LA EXOCORTIS CEVd
Naranja Valencia con síntomas en portainjerto
Fuente: Duran-Vila, 2009
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Síntomas asociados a CEVd
•Viroide de la exocortis de los cítricos(CEVd)•Viroide del enanismo del lúpulo (HSVd)•Viroide del enanismo de los cítricos(CDVd)
Murcia et al., 2009.
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Colección de germoplasma de Cítricos en Colombia
Cultivares Total Géneros Total
Naranjas 55 Citrus 238
Mandarinas y similares 47 Clausena 1
Limas acidas 10 Fortunella 2
Limones verdaderos 6 Poncirus 5
Pomelos 21 Trifasia 1
Criollos y otros 142 Hibridos 34
(Criollos…) (142)
Total 281 Total 281
Introducidos: 162 (59.6%)
Mejorados: 12 (4.4% ) V.
Agricultor: 27 (6.6% )
Nuevos Criollos: 80 (29.4%)
Fuente: Corpoica, 2009. Bancos de Germoplasma
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Colección de trabajo de variedades de
cítricos
Número Especie Número Especie
1 Tangelo Orlando 10 Naranja Olinda Valencia
2 Tangelo Mineola 11 Naranja Valle Washington
3 Mandarina Oneco 12 Naranja Sweety
4 Mandarina ICA Bolo 13 Naranja Frost Washington
5 Mandarina Clemenules 14 Mandarina Arrayana
6 Naranja Salustiana 15 Lima ácida Tahití
7 Naranja Campbell Valencia 16 Lima acida Pajarito
8 Naranja Frost Valencia 17 Start Ruby
9 Naranja Garcia Valencia
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Colección de trabajo de variedades de
cítricos
Se conserva en casa de malla 17 variedades de cítricos
comerciales y 4 replicas por cada una, en un ambiente protegido
por una malla antipulgón.
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• Evaluar la sanidad de la colección de trabajo de 17
variedades de cítricos obtenidas por microinjerto de
ápices caulinares frente al virus de la tristeza
(CTV), Viroide de la exocortis (CEVd), y
Huanglongbing(HLB)
OBJETIVO GENERAL
Objetivos específicos:
• Evaluación frente al virus de la tristeza de los cítricos (CTV)
método serologico DAS – ELISA.
• Evaluación frente al viroide de la exocortis de los cítricos
(CEVd) método biológico y molecular.
• Evaluación frente a HLB, candidatus Liberibacter qPCR
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Metodología
Analisis
Virus de la tristeza de los
cítricos
CTV
Das-ELISA
HuanglongbingHLB
Candidatusliberibacterasiaticus
PCR en Tiempo Real
Exocortis de los cítricos
Viroide de la exocortis de los
cítricos
RT-PCR
Hibridación de ácidos nucleicos
.
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Evaluación frente a virus de la tristeza de los cítricos
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Tejidos: Corteza- Hojas- Nervaduras- pecíolos.
Voller et al,1976, Clark y Adams,1977, Clark et al,1986.
Colecta y procesamiento de muestra vegetales
Metodología
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Metodología
Procesamiento de muestra vegetales
c
• Protocolo Bioreba AG.• Anticuerpo IgG CTV :1:1000• Conjugado 1:1000• Lecturas a 60-120 min
• Control positivo: Lima acidamexicana.
• Control negativo: Tejido deplanta de semilla.
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Metodología
ELISA (DAS-ELISA)
Se procesaron 68 plantas de 17 especies de cítricos
microinjertadas. Por cada variedad se evaluaron cuatro plantas.
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Código EspecieCTV
(DAS-ELISA)
1 T. Orlando Negativo
2 T. Mineola Negativo
3 M. Oneco Negativo
4 M. Ica-Bolo Negativo
5 M. Clemenules Negativo
6 N. Salustiana Negativo
7 N. V. Campbell Negativo
8 N. Frost V. Negativo
9 N. Garcia Val Negativo
10 N. V. Olinda Negativo
11 N. V. Washington Negativo
12 N. Sweety O Negativo
13 M. Arrayana Negativo
14 N. F. Washington Negativo
15 Lima Tahiti Negativo
16 Lima Pajarito Negativo
17 Star Ruby Negativo
Resultados
DAS-ELISA
Se realizaron 2 evaluaciones/año, frente al virus de la tristeza de los cítricos (CTV)
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Evaluación frente al viroide de la Exocortis de los cítricos
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Producción de patrones para multiplicación de
Cidro Etrog.
Siembra de semillas de los portainjertos
trifoliados CitrumelloCPB 4475 y Citrange
Troyer.
Portainjertos aproxdiámetro de 0.8 mm se
injerto con yemas de Cidro Etrog clon Arizona 861-S1.
Las plantas se conservaron a
temperatura promedio de 27°C y Humedad relativa promedio de
60.1%.
Cidro etrog alcanzó un desarrollo entre 10 y 15 cm, se inocularon
por injerto.
Metodología
Multiplicación de plantas indicadoras e inoculación para
evaluación de CEVd.
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Multiplicación de plantas indicadoras (Cidro Etrog)
Semillero
Transplant
e
Injertación
Inoculación
•Selección de semillas de portainjertos• Siembra en germinadores (Turba, vermiculitay cascarilla de arroz en proporción 1:1)
•Preparación del sustrato•Trasplante a bolsas de polietileno de 5 kiloscalibre No 4
• injertacion en “T” invertida con yemaslimpias de Cidro etrog- Clon Arizona, 861 S1.
• Inoculación por tejido de parche paraevaluación de las copas comerciales
Manejo de malezas se realiza cada 15 días y riego tres veces por semana
Metodología
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Metodología
Producción de portainjertos
• Citrumello CPB4475
• Citrange Troyer
Planta indicadora
• Cidro Etrog Clon Arizona 861-S1
para multiplicación de yemas
sanas.
Plantas de Cidro etrog con brotes entre 10 a
15 cm para inoculación con el viroide de la
exocortis de los cítricos (CEVd).
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Inoculación en Cidro Etrog clon Arizona 861-S1
28-32ºC, 3 – 4 meses.
Metodología
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Cidro
28-32 oC
Epinastia
Necrosis de pecíolos y nervadura central
(Duran-Vila et al., 1988
Metodología
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Metodología
Evaluación de síntomas
Síntomas de Epinastia,
necrosis de pecíolos y
nervadura central.
Control Sano
de Cidro Etrog
Control positivo CEVd
(1238-IVIA)Control negativo
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Resultados
N. Valle W. (11-2-2) T. Mineola (2-1-2) Especies de la colección de
cítricos sin síntomas
Control positivo Control negativo
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Código EspecieCEVd
(Biológico)
1 T. Orlando Negativo
2 T. Mineola (1Positiva/3 Negativas)
3 M. Oneco Negativo
4 M. Ica-Bolo Negativo
5 M. Clemenules Negativo
6 N. Salustiana Negativo
7 N. V. Campbell Negativo
8 N. Frost V. Negativo
9 N. Garcia Val Negativo
10 N. V. Olinda Negativo
11 N. V. Washington (1Positiva/3 Negativas)
12 N. Sweety O Negativo
13 M. Arrayana Negativo
14 N. F. Washington Negativo
15 Lima Tahiti Negativo
16 Lima Pajarito Negativo
17 Star Ruby Negativo
Control Positivo 1238 (IVIA) Positivo
Control Negativo Cidro Etrog Negativo
De cada variedad de cítrico. Se evaluaron cuatro repeticiones y las inoculaciones
en Cidro Etrog se realizaron por duplicado, para un total de 136 plantas evaluadas
Resultados
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Evaluación molecular de Cevd de la colección de trabajo de cítricos
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Dot-Blot
Hibridación Molecular
RT-PCR
sPAGE
Análisis de ácidos nucleicos
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Metodología
Exocortis
Colecta y procesamiento de muestra
Se procesaron 120 plantas correspondientes a la colección de
trabajo de 16 especies de cítricos microinjertadas.
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Metodología
Fase l
Fase ll
Fase lll
(Rodríguez, 2015)
Extracción de ácidos nucleicos
Semancik et al.,1975
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• Cebadores F1/R1 y F2/R1
Metodología
RT-PCR
Bernad y Duran-Vila (2006)
Los productos amplificados por PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1.5%,
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Resultados
RT- PCR
Dot blot
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Metodología
HLB
Colecta y procesamiento de muestra
Extracción de DNA: Purificación de DNA total de tejido del kit deextracción Dneasy Plant Kit de Qiagen.
PCR en Tiempo Real: Iniciadores 298-295 especifico para Ca. L.asiaticus, iniciadores 315-317 específicos para gen cox, Sonda paraCa. L. asiaticus 409-FAM, Sonda para control interno de insectos316-CY3.
Control positivo: Plásmido con región 16S de Candidatus L.asiaticus.
Control negativo: ADN de adulto de Diaphorina citri no infectado yADN de cítricos no infectados.
Análisis realizado por el Laboratorio de diagnóstico fitosanitario ICA.
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Código EspecieAnalisis a Candidatus
liberibacter asiaticus (qPCR)
1 T. Orlando Negativo
2 T. Mineola Negativo
3 M. Oneco Negativo
4 M. Ica-Bolo Negativo
5 M. Clemenules Negativo
6 N. Salustiana Negativo
7 N. V. Campbell Negativo
8 N. Frost V. Negativo
9 N. Garcia Val Negativo
10 N. V. Olinda Negativo
11 N. V. Washington Negativo
12 N. Sweety O Negativo
13 M. Arrayana Negativo
14 N. F. Washington Negativo
15 Lima Tahiti Negativo
16 Lima Pajarito Negativo
17 Star Ruby Negativo
Resultados
Se realizó 1 monitoreo para Candidatus liberibacter asiaticus por el método PCR
Cuantitativa (ICA)
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Código EspecieCTV
DAS-ELISA
HLB
(qPCR)
CEVd
Biológico RT-PCR Dot blot
1 T. Orlando - - - - -
2 T. Mineola - - 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-)
3 M. Oneco - - - - -
4 M. Ica-Bolo - - - - -
5 M. Clemenules - - - - -
6 N. Salustiana - - - - -
7 N. V. Campbell - - - - -
8 N. V. Frost - - - - -
9 N. Garcia Val - - - - -
10 N. V. Olinda - - - - -
11 N. V. Washington - - 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-) 1 (+), 3 (-)
12 N. Sweety - - - - -
13 M. Arrayana - - - - -
14 N. F. Washington - - - - -
15 Lima Tahiti - - - - -
16 Lima Pajarito - - - - -
17 Star Ruby - - - - -
Control + + + + + +
Control - - - - - -
RESUMEN
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CONCLUSIONES
La colección de 17 variedades de cítricos: Tangelo Orlando, T.
Mineola, Mandarina Oneco, M. Ica Bolo, M. Clemenules. M.
Arrayana,N. salustiana,N.Campbell,N.frost Valencia,N.Garcia
Valencia,N.Olinda,N.valle Washington,N. Frost
Washington,N.Sweety,Lima Acida tahiti y Lima Pajarito y Star
Ruby, se encontraron libres de CTV.
El análisis por los métodos biológico y molecular de CEVd
determinó que la colección de 17 variedades de cítricos, T.
Orlando,M.Oneco,M.Ica bolo
M,Clemenules,M.arrayana,N.Salustiana,N.Campbell,V.Frost
V. Garcia, libres de CEVd. Dos de las variedades; T.Mineola
y N. Valle W resultaron positivas a CEVd.
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CONCLUSIONES
El diagnóstico de C. Liberibacter asiaticus realizado por
el Laboratorio de diagnóstico del ICA en las 17
variedades correspondientes a 68 muestras de cítricos
dieron reacción negativa, utilizando la técnica qPCR.
Las técnicas diagnóstico biológico y molecular pueden
utilizarse para fortalecer el Programa de Certificación de
cítricos para Colombia.
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EQUIPO DE TRABAJO
Corpoica
• Mauricio Martínez- Diana Rodríguez-Nubia Murcia
• Profesionales de Apoyo: Andrea Barreto, Lizeth
Palacios, Hover Beltrán López.
• Asistente de Investigación: Gustavo Acosta, Luz
Marina Acosta.
ICA- Laboratorio Nacional de Diagnostico
• Adriana Castañeda
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CENTRO DE INVESTIGACION CORPOICA-PALMIRA Valle del Cauca-Colombia
TEL 2758161-66pagina web www.corpoica.org.co
GRACIAS POR SU ATENCIÓN