UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ.

FACULTAD DE INGENIERÍA.

INGENIERO AGROINDUSTRIAL.

por

Francisco de Jesús Hernández Negrete.

Dr. Luis Manuel Rosales Colunga.

Asesor.

Noviembre del 2016 San Luis Potosí, S.L.P.1

*Introducción.

*Antecedentes.

*Objetivos.

*Justificación.

*Metodología.

*Resultados

*Cronograma de actividades.

*Referencias bibliográficas.

2

3

Muchos de los procesosindustriales se basan en eluso de combustibles fósilescomo el petróleo, gas, ycarbón.

• Dependencia energética.• No son renovables.• CO2.• Efecto invernadero.• Calentamiento global.

FUENTE: anpier.org/

FUENTE: veoverde.com

Introducción

4

Productos valiosos a partir de biomasa.

Almidón

(componente de la biomasa).

Alternativas.

FUENTE:

curiosidadesdelamicrobiologia.mx

FUENTE: miliarium.com

5

Introducción

Almidón.

• Amilosa (α-glucano

lineal).

• Amilopectina (α-glucano

ramificado).

FUENTE: blogalimentos.com

6

Introducción

Microbios capaces de hidrolizar el

almidón.

FUENTE: wikipedia.org/wiki/Bacillus_megaterium

7

Introducción

Ventajas adaptativas.Métodos de manipulación

sencillos.

Amplio conocimiento acerca de sus sistemas.

Se pueden modificar para generar una gran variedad de productos y

utilizar diversos sustratos.

E. coli

8

Introducción

E. coli.

Microorganismo modelo.

No puede metabolizar

almidón.

FUENTE: samiorza.blogspot.mx/

9

Introducción

10

Introducción

No es dependiente de

maltosa.

E. coli. produce

una α amilasa

citosólica (AmyA).

Cepas de E. coli. para utilizar

almidón y otras maltodextrinas

y producir compuestos valiosos.

FUENTE: elgrafico.mx

11

Introducción

12

AmyAMalZ

Introducción

13

Actividad de la amilasa secretada. tinción de M9 con Lugol

más almidón, placas donde WT , Amy0, y Bacillus megaterium

se cultivaron (Rosales-Colunga, 2014).

Ingeniería de Escherichia coli K12 MG1655 para

utilizar almidón.

FUENTE: microbialcellfactories.com/content/13/1/74

Antecedentes.

14

Wt = cepa silvestre

Amy0 = cepa que

secreta AmyA al

medio

B.M = bacillus

megaterium

15

¿Esta cepa desarrollada tiene la capacidad de hidrolizar

y crecer utilizando diferentes tipos de almidón?

Diferentes tipos de almidón (dif. Porcentaje de amilosa y amilopectina)

Introducción

Evaluar la degradación de distintos tipos de almidón y

el crecimiento asociado por distintas cepas de E. coli.

FUENTE: http://www.cdc.gov/ecoli/

16

O. específicos.

*Obtener las cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes

*Evaluar el crecimiento de estas cepas utilizando maltosa y

almidón.

*Evaluar la degradación del sustrato por cada una de las cepas.

*Interpretar el crecimiento de las diferentes cepas mutantes de E.

coli.

FUENTE: elproyectomatriz.wordpress.com

17

18

El aprovechamiento de la biomasa es fundamental para establecer

procesos sustentables dirigidos a la generación de productos valiosos.

Siendo el almidón un componente considerable de la biomasa y un

residuo abundante en la industria alimentaria, se busca entender el

catabolismo de almidón y sus componentes por uno de los

microorganismos más empleados tanto en investigación como en la

industria.

FUENTE: abc.es

Justificación.

19

H(a): El crecimiento de cada cepa utilizada es influenciado por los distintos tipos de almidón, sin afectar el metabolismo

de maltosa.

20

21

*Se desarrollaron por medio de herramientas

de biología molecular.

Metodología.

22

*

Tabla 1.1 muestra Cepas MG1655 (silvestre) y las mutantes amyA , malS y malZ de la colección KEIO.

23

Cepas. Nombre. Descripción.

Silvestre (Wt) E. coli MG1655 Cepa silvestre de E. coli.

Mutante 1 E. coli ΔamyA Cepa que carece del gen amyA.

Mutante 2 E. coli ΔmalS Cepa que carece del gen malS.

Mutante 3 E. coli ΔmalZ Cepa que carece del gen malZ.

Mutante adaptada E. coli Amy6 Mutante adaptativa a crecer en

almidón, que sobreexpresa y secreta

AmyA.

Metodología.

*

*Obtención del medio

de cultivo.

*Resiembra.

JULIO 20 AGOSTO 15 SEPTIEMBRE 14

24

Metodología.

FUENTE: ehowenespanol.com

Las cepas se cultivaran a 37°C en

medio mínimo M9 utilizando

maltosa y almidón como fuente de

carbono.

El crecimiento se determino

midiendo la D.O. a 600 nm

Metodología.

25

26

*

• Preparación de inóculos.

• Medio de evaluación de

crecimiento.

Metodología.

27

*

• M9/maltosa y M9/almidón

• Cultivos 37°C, 150 rpm

• Toma de las muestras.

• Mediciones del crecimiento en

un espectrofotómetro a 600nm.

Metodología.

FUENTE: pinterest.com

Metodología.

El contenido de almidón se determinará por su

capacidad de formar un complejo con el yodo.

28

29

• Tinción con lugol 1:10

• Incubación a 37°C• Preparación M9/almidón

Metodología.

30

Resultados.

31

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 2 4 6 8 10 12

ABSO

RBA

NC

IA (

D.O

)

TIEMPO (h)

Wt

M1

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 2 4 6 8 10 12

ABSO

RBA

NC

IA (

D.O

)

TIEMPO (h)

Wt

M2

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 2 4 6 8 10 12

ABSO

RBA

NC

IA (

D.O

)

TIEMPO (h)

Wt

M3

Wt = cepa

silvestre

M1 = ∆AmyA

M2 = ∆MalS

M3 = ∆MalZ

32

Crecimiento sobre M9/maltosa de las cepas silvestre y mutante adaptiva.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Abso

rbancia

(D

.O)

Tiempo (h)

Wt Wt6

Resultados.

33

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 20 40 60 80 100Abso

rbancia

(D

.O)

Tiempo (h)

Wt Wt6

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 20 40 60 80 100Abso

rbancia

(D

.O)

Tiempo (h)

Wt ∆AmyA

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0 20 40 60 80 100Abso

rbancia

(D

.O)

Tiempo (h)

Wt ∆MalS

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 20 40 60 80 100Abso

rbancia

(D

.O)

Tiempo (h)

Wt ∆MalZ

Cinéticas de crecimiento sobre M9/maltosa de las cepas silvestre y mutantes

Resultados.

34

Determinación de la degradación del sustrato y actividad amilolítica

por cada una de las cepas con distinto tipo de almidón.

Almidón 1

Almidón 2

Resultados.

35

MG1655

Wt6

Amy0

Amy6

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96

ABSO

RBA

NC

IA (

D.O

)

TIEMPO (H)

CINÉTICA DE CRECIMIENTO EN ALMIDÓN 1

MG1655 Wt6 Amy0 Amy6

Resultados.

36

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ABSO

RBAN

CIA

(D

.O)

TIEMPO (H)

ALMIDÓN 2

MG1655 Wt6 Amy0 Amy6

MG1655

Wt6

Amy0

Amy6

Resultados.

37

38

*Todas las cepas evaluadas presentan una fase lag de 12 horas

para el crecimiento en maltosa

*El tipo de almidón influye sobre el crecimiento y la actividad

amilolítica de las cepas evaluadas.

*La cepa adaptativa para crecer en almidón no presenta una

desregulación del operón de maltosa

Conclusiones

Meses/acciones Feb-Mar

2015

Abr-Mayo

2015

Jun-Jul

2015

Agos-Sept

2015

Oct-Nov

2015

Dic-Ene

2015-2016

Agos-sept

2016

Oct-Nov

2016

Búsqueda de tema y recopilación de

información.

Correcciones, retroalimentación y

presentación del protocolo.

Búsqueda de bibliografía.

Conservación de las cepas obtenidas.

Obtener las cepas MG1655 (silvestre) y las

mutantes e Identificar las condiciones de

cultivo de estas cepas.

Evaluar el crecimiento de las cepas

utilizando maltosa y almidón. Evaluar la

degradación del sustrato por cada una de

las cepas anteriores

Interpretar el crecimiento de las

diferentes cepas mutantes de E. coli.

Captura de resultados y presentación del

proyecto.

39

* Aux, G. W. (2009). U.S. Patent Application 12/395,180.

* Cenci, G., Caldini, G., & Strappini, C. (1998). Effect of different starches on

Escherichia coli (S1) β‐glucuronidase expression. Journal of basic

microbiology, 38(2), 95-100.

* Cunningham, S. D., Shann, J. R., Crowley, D. E., & Anderson, T. A. (1997).

Phytoremediation of contaminated water and soil. ISO 690

* EcoCyc E. coli Database (2015), http://ecocyc.org/

* Enzyme: α-amylase (2015), http://ecocyc.org/

* FitzPatrick, M., Champagne, P., Cunningham, M. F., & Whitney, R. A. (2010). A

biorefinery processing perspective: treatment of lignocellulosic materials for the

production of value-added products. Bioresource technology, 101(23), 8915-8922

* Rosales-Colunga and Martínez-Antonio Microbial Cell Factories 2014, 13:74

http://www.microbialcellfactories.com/content/13/1/74 .

* Rosales-Colunga, L. M., Razo-Flores, E., Ordoñez, L. G., Alatriste-Mondragón, F.,

& De León-Rodríguez, A. (2010). Hydrogen production by Escherichia coli ΔhycA

ΔlacI using cheese whey as substrate. international journal of hydrogen energy,

35(2), 491-499

40