Quorum sensing

Ing. Hana Sýkorová, Ph.D. 2014

Vibrio fischeri

• G- mořská bakterie

• schopnost bioluminiscence

otázka: Kdy svítí?

odpověď: Jen za určité hustoty.

otázka: Jak to pozná?

odpověď: „Chemický jazyk“

Vibrio fischeri

Eupryma scolopes

• oliheň (sepiola kropenatá), max 35mm

• symbióza s V. fischeri

• modulace luminiscence (predátoři)

Quorum Sensing

kvórum z lat. quorum = „z nichž“

kvantitativní podmínka pro platnost (voleb, referenda…)

Quorum sensing

• „vycítit kvórum“

• typ rozhodovacího procesu využívaného decentralizovanými skupinami k jednotné reakci

• sociální druhy hmyzu – včely, mravenci…

• bakterie – koordinace genové exprese v závislosti na místní hustotě populace

Quorum Sensing - bakterie

mechanismus kterým pomocí signálních molekul bakterie reguluje expresi některých genů v závislosti na hustotě populace

60. léta – Alexander Tomasz (maďarský mikrobiolog) – přirozená kompetence (příjem DNA z prostředí) u Streptococcus pneumoniae

Mechanismus QS

LuxI

Luciferase Genes

LuxR

LuxR

Vibrio fischeri

Co je to za molekuly?

N-(3-oxohexanoyl)-homoserin lakton (3-oxo-C6-HSL)

Co je to za molekuly?

Co je to za molekuly?

• AHL = N-acyl homoserin-lakton

• „Intra-species“ Communication

• molekuly specifické pro jednotlivé druhy

Autoinduktory typu 1 = AI-1

Bacteria constantly produce molecules called acylated homoserine lactones (AHLs) and release them into the environment. (The LuxR proteins comes into play later.)

If other bacteria are not in the vicinity, the AHLs will soon degrade and bacterial “silence” will prevail.

But if enough AHL-producing bacteria are nearby, the concentration of AHLs outside the bacteria will rise, signaling the increase in cell density around them.

(1) When a quorum (or critical number) of bacterial cells is reached, AHLs are able to bind to receptor proteins called LuxR. (2) That changes LuxR’s shape so that it can bind to DNA in the bacteria, like a key in a lock.

The LuxR “key” turns on a string of genes (1) that produce the components (2) to make an enzyme called luciferase (3), which generates light (bioluminescence). By similar biochemical processes, bacteria can produce several other collective behaviors.

http://www.whoi.edu/page.do?pid=7501&tid=4142&cid=31613&i=1

Systém LuxI-LuxR

Target Genes

systém G negat bakterií

• LuxI – AHL synthase - konstitutivní syntéza bazálního množství AHL

• volná sekrece AHL do prostředí

• při vzrůstu koncentrace AHL v prostředí – aktivace regulátoru LuxR

• vazba LuxR na specifické palindromní sekvence „lux box“

• zvýšení transkripce specifických genů (např. pro bioluminiscenci)

V. fischeri Bioluminescence

P. aeruginosa Virulence Factors, Biofilms

A. tumefaciens Mating, Transfer of Mobile DNA

E. carotovora Virulence Factors, Antibiotic Synthesis

Systém LuxI-LuxR

Target Genes

systém G negat bakterií

Autoindukce

Systémy analogické „LuxI-LuxR“

A jak je to u G+ ?

Signály G+ bakterií:

• modifikované oligopeptidy

• autoinducer peptides AIPs („feromon-like“ peptidy)

• syntéza peptidu ve formě prekurzoru

• modifikace

• sekrece přes ATP-Binding Casette (ABC) transportní komplex

• detekční systém – dvě složky

• fosforylace

• exprese specifických genů

Oligopeptidy jako induktory (AIP)

G- x G+

• LuxI – autoinducer synthase

• AHL – acyl homoserine lactone

• LuxR – receptor

• LuxR/AHL → transcription

• LuxS – autoinducer synthase

• AIP – auto-inducing peptide

• transporter for secretion

• HK receptor – histidin kinase

• RR – response regulator

• activated RR → transcription

Jak je to ve směsných kulturách?

Cross talk

Vibrio harveyi

• 2 systémy komunikace: AI-1 • molekula = AHL • produkce LuxLM • senzor LuxN

AI-2 • molekula = furanon • produkce LuxS • senzor LuxP, LuxQ

Fosforylační kaskáda: LuxN (LuxQ) → LuxU → LuxO

LuxO – kontrola transkripce represoru X

exprese luciferázového operonu luxCDABE

Vibrio harveyi

LuxS systém – „bakteriální esperanto“

Actinobacillus actinomycetemcomitans Actinobacillus pleuropneumoniae Actinobacillus suis Bacillus anthracis Bacillus halodurans Bacillus subtilis Borrelia burgdorferi Campylobacter jejuni Clostridium acetobutylicum Clostridium difficile Clostridium perfringens Deinococcus radiodurans Escherichia coli MG1655 Escherichia coli O157:H7 Enterococcus faecalis Haemophilus influenzae Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae Lactococcus lactis Leuconostoc oenos Listeria monocytogenes Mannheimia haemolytica

Neisseria gonorrhoeae Neisseria meningitidis Pasteurella multocida Pasteurella trehalosi Porphyromonas gingivalis Proteus mirabilis Salmonella paratyphi Salmonella typhi Salmonella typhimurium Shewanella putrefaciens Shigella flexneri Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus gordonii Streptococcus mutans Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Vibrio cholerae Vibrio harveyi Vibrio parahaemolyticus Vibrio anguillarum Vibrio vulnificus Yersinia pestis

Actinobacillus actinomycetemcomitans Periodontal virulence, Mixed-species biofilms

Bacillus anthracis Growth

Bacillus cereus Biofilms

Bacillus subtilis Development

Borrelia burgdorferi Virulence

Campylobacter jejuni Motility, Toxins

Clostridium difficile Virulence, Toxins

Clostridium perfringens Virulence, Toxins

Escherichia coli K12 AI-2 transport, Biofilms, Cell division, DNA processing, Iron uptake

Escherichia coli EHEC O157:H7 Virulence, Type III Secretion , Motility

Escherichia coli EPEC Motility, Type III Secretion

Haemophilus influenzae Virulence, Cell invasion

Helicobacter pylori Motility, Biofilms

Klebsiella pneumoniae Biofilms

Lactobacillus reuteri Biofilms in mice

Listeria monocytogenes Biofilms

Mannheimia haemolytica Virulence, Encapsulation, Adhesion

Neisseria meningitidis Virulence, Bacteremia

Photorhabdus luminescens Antibiotic production

Porphyromonas gingivalis Virulence, Proteases Hemin acquisition, Stress response

Salmonella typhi Biofilms

Salmonella typhimurium AI-2 transport, Biofilms

Serratia marcescens Virulence in C. elegans, Hemolysin, Antibiotic production

Shigella flexneri VirB (virulence factor)

Staphylococcus epidermis Virulence, Biofilms

Streptococcus gordonii Mixed-species biofilms

Streptococcus mutans Virulence, Biofilms, Competence, Stress response

Streptococcus pneumoniae Virulence, Persistence, Competence

Streptococcus pyogenes Virulence factors, Protease, Hemolysin

Vibrio anguillarum Protease

Vibrio cholerae Virulence, Toxins, Biofilms

Vibrio fischeri Bioluminescence, Colonization

Vibrio harveyi Bioluminescence, Biofilms, Siderophore, Virulence, Type III Secretion, Protease

LuxS systém – vlastnosti pod kontrolou AI-2

Bakteriální esperanto – LuxS systém

společný prekurzor = produkt LuxS :

• 4,5-dihydroxy-2,3-pentandion (DPD)

spontánní cyklizace → autoiduktor AI-2

• furanony

• někdy vázaný bór

Syntéza AI-2

Syntéza AI-1 a AI-2: společný prekurzor SAM

SAM – S-adenosylmethionin

SAH – S-adenosylhomocystein

SRH – S-ribosylhomocystein

AHL – acyl-homoserin lakton (AI-1)

DPD – dihydroxy-pentandion (prekurzor AI-2)

Vibrio harveyi

Salmonella typhimurium, E. coli

AI-2

Jak spolu komunikují?

G+: AIP G-: AI-1 = AHL

Cross Talk: AI-2

Jak spolu komunikují?

G+: AIP G-: AI-1 = AHL

Cross Talk: AI-2

AI-3: Komunikace na vyšší úrovni

AI-3/epinefrin/norepinefrin

• katecholaminy (adrenalin/noradrenalin) - krátké peptidy (neuropeptidy)

• AI-3 – podobná aromatická sloučenina

• „interkingdom communication“

• komunikace hostitel x mikroflóra

• produkce:

• bakterie

• houby

• rostliny

• vyšší živočichové

• člověk: ovlivnění mozkových funkcí

• hypotéza: složení střevní mikroflóry do jisté míry ovlivňuje chování

(myši x Lbc. rhamnosus)

• poprvé popsáno u EHEC kmenů E. coli (např. E. coli O157:H7)

• kolonizují střevní epitel, produkce toxinu (shigatoxin/verotoxin)

• HUS – hemolyticko-uremický syndrom

• tvorba tzv. „attaching and effacing“ (AE) lézí – kódovány chromozomálními ostrovy patogenity LEE

• AI-3 a epinefrin/norepinefrin – shodný receptor (membrána)

• AI-3: produkce běžnou střevní mikroflórou

• epinefrin/norepinefrin: produkce hostitelem (kontrakce hladkého svalstva)

• obdobné systémy: Shigella, Salmonella, ….

AI-3/epinefrin/norepinefrin

epinefrin norepinefrin

AI-3 systém u EHEC E. coli

Sekrece typu III = „injekce“ (G- patogeny)

Konkrétní příklady podrobněji

Vibrio harveyi – 3 paralelní systémy

AHL: HAI-1 (3OHC4-homoserin lakton); syntéza LuxM LuxN (senzor) histidin-kináza

AI-2: furanosyl-borát-diester; syntéza LuxS vazba na LuxP a následně na LuxQ (histidin kináza)

CAI-1: 3-aminotridekan-4-one; syntéza CsqA CsqS (senzor) histidin-kináza

Role „Small RNA“ v regulaci QS

sRNA – small RNA Qrr – Quorum Regulatory RNA

nízká hladina AI = nízká hustota buněk P-LuxO → aktivace transkripce 5 regulačních sRNA (Qrr1-5); společně s chaperonem Hfq, destabilizace mRNA pro regulátor LuxR (luxR-mRNA). LuxR nutný pro aktivaci transkripce operonu luxCDABE → nesvítí vysoká hladina AI = vysoká hustota buněk defosforylovaný LuxO → translace luxR-mRNA → produkce LuxR → transkripce operonu luxCDABE → svítí

Vibrio cholerae

• G- fakultativně anaerobní tyčinka

• původce cholery (inkubační doba 12-72h)

• vazba na některé druhy řas a zooplanktonu

• množí se v tenkém střevě (TCP – toxin coregulated pilus)

• produkce enterotoxinu – choleratoxin (CT)

Vibrio cholerae

• analogie s V. harveyi • 2 systémy:

• AI-2/LuxPQ • CAI-1/CqsS

• absence systému AI-1/LuxN • analog LuxR = HapR

QS:

exprese virulentních faktorů + biofilm x

exprese proteázy

exprese virulentních faktorů a tvorba biofilmu –

za nízkých koncetrací

Vibrio cholerae

vps - Vibrio polysaccharide synthesis CT - expression of cholera toxin TCP - toxin coregulated pilus (colonization factor) HapA – hemaglutin protease

Infekční cyklus V. cholerae: biofilm = ochrana (nízkému pH v žaludku) ↓ střevo – rozvolnění biofilmu ↓ kolonizace (exprese CT, TCP) ↓ nárůst počtu buněk ↓ aktivace proteázy (HapA) ↓ uvolnění buněk z epitelu ↓ ven z hostitele ↓ biofilm = přežití ve vnějším prostředí

Vibrio harveyi x V. cholerae

Pseudomonas aeruginosa

• G- aerobní pohyblivá nefermentující tyčinka

• často slizovitý obal

• v odpadních vodách, na rostlinách a v půdě

• často v nemocničním prostředí (katetry, dýchací přístroje)

• kolonizace sliznic dýchacího a močového ústrojí

• infekty popálenin, oka, sepse novorozenců

• vážný problém – pacienti s cystickou fibrózou

• QS kontrola:

faktory virulence (elastáza, exotoxin A, pyocyanin)

tvorba biofilmu

Pseudomonas aeruginosa

dva systémy řízené AHL (Las, Rhl)

• N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (3OC12-HSL) x LasI/R

elastáza, proteáza, exotoxin A

• N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) x RhlI/R

rhamnolipidy, pyocyanin, elastáza, fosfatáza

Las

Rhl

Pseudomonas aeruginosa

• LasI – produkce AHL1

• LasR-AHL1 komplex iniciace exprese

virulentních faktorů (lasB elastáza, lasA proteáza, toxA enterotoxinA, aprA alk. fosfatáza)

indukce transkripce rhlR

• RhlI – produkce AHL2

• RhlR-AHL komplex exprese virulentních

faktorů (lasB, aprA) exprese dalších specifických

genů (rhamnolipidy, pyocyanin, cytotoxický lektin)

Zjednodušené schéma QS u Ps. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

dva systémy řízené AHL (Las, Rhl)

• N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone (3OC12-HSL) x LasI/R

elastáza, proteáza, exotoxin A, alkalická fosfatáza

• N-butanoyl-L-homoserine lactone (C4-HSL) x RhlI/R

rhamnolipidy, pyocyanin, elastáza, proteáza

třetí systém = PQS (Pseudomonas quinolone signal system)

• 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone (PQS) x PqsR

• regulace mezi systémy Las a Rhl

Pqs

Pseudomonas aeruginosa

nejde o pralalelní nezávislé systémy, ale o systémy navzájem komplikovaně propojené

• systém Las nadřazen

• systém PQS „propojovací“

• LasR → regulace syntézy PQS → exprese rhlR a rhlI

Agrobacterium tumefaciens • gramnegativní bakterie

• infikuje dvouděložné rostliny (nádory v rostlinných pletivech)

• princip: průnik části DNA bakterie (Ti-plasmid = tumor inducing, T-DNA) do rostlinné buňky, začlenění do genomu rostliny

• inkorporovaná bakteriální DNA:

• geny pro produkci rostlinných hormonů, které vedou k vytvoření nádoru

• geny pro rostlinnou produkci opinů - energetický zdroj pro bakterii

• přenos Ti plasmidů kontrolován QS systémem (Tra systém) – analogie LuxI/R

Agrobacterium tumefaciens

QS kontrola:

• konjugační přenos Ti-plasmidů

• TraI/TraR – lokalizace na Ti-plasmidu

• konjugace vyžaduje 2 typy signálů 1. AHL (TraI bakterie) 2. opin (od hostitele)

• funkce opinů • zdroj energie • signální molekula

2 typy regulačních opinů v procesu konjugace: • „octapine-type“ – octapin: indukce TraR přes aktivátor OccR • „nopaline-type“ – agrocinopin: indukce TraR přes inaktivaci represoru AccR

bazální hladina exprese traI → nízká hladina AHL → + opiny → exprese traR → TraR-AHL → vyšší exprese traI → vyšší hladina AHL…

TraR-AHL → exprese operonů tra (mobilizace Ti-plasmidu) + trb (tvorba pórů pro přechod plasmidu) + traM ( TraM - řada regulačních funkcí)

Erwinia carotovora

• čeleď Enterobacteriaceae

• rostlinný patogen (měkká hniloba brambor)

• poprvé izolována z karotky

• produkce pektolytických a celulolytických enzymů (narušení rostl. pletiv)

QS – dva systémy LuxI/R

• produkce extracelulárních enzymů (ExpI/ExpR) – napadení pletiv až při dosažení dostatečné hustoty populace

• produkce karbapenemových antibiotik (CarI/CarR) – simultánně s exoenzymy = potlačení kompetitivní mikroflóry

• oba systémy - identický AHL

Erwinia carotovora x Serratia sp.

podobné systémy, ale různá regulace

Zástupci G+

Streptococcus pneumoniae

• „pneumococcus“

• grampozitivní, aerobní, α-hemolytický, viridující kok (ve dvojicích)

• běžně kolonizuje sliznici horních cest dýchacích (v neopouzdřené formě) - kolonizováno je až 70 % dětí

• podmíněný patogen – v opouzdřené formě může vyvolávat závažné infekce – meningitidy, pneumonie, sepse

• faktory virulence - pneumolysin O, neuraminidáza, purpurogenní toxin, polysacharidové pouzdro (zabraňuje fagocytóze)

Streptococcus pneumoniae

QS: • navození stavu přirozené kompetence (systém Com)

Přirozená kompetence

• geneticky programovaný fyziologický stav dovolující příjem makromolekul DNA

• DNA vstoupí do recipientní buňky za určitých růstových podmínek → kompetentní buňka

• Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae

1-Bacterial cell DNA 2-Bacterial cell plasmids 3-Sex pili 4-Plasmid of foreign DNA from a dead cell 5-Bacterial cell restriction enzyme 6-Unwound foreign plasmid 7-DNA ligase I 8-integated DNA

Streptococcus pneumoniae

QS: • navození stavu přirozené kompetence (systém Com)

• podíl na regulaci virulence a tvorby biofilmu

• signální molekula: CSP (Competence Stimulating Peptide) – 17ak

• CSP – vyštěpením z prekurzoru ComC (41ak)

Streptococcus pneumoniae

The precursor of the signaling molecules, ComC, is processed and secreted by the activity of the membrane-associated ComAB machinery. The competence stimulating peptide (CSP) interacts with membrane-associated histidine kinase ComD. This interaction results in the phosphorylation of the regulator ComE (ComE∼P). The activated regulator ComE∼P positively (+) stimulates the transcription rate of the Com-dependent promoters (Pcom). This leads to the increased production of the alternative sigma factor ComX, which in turn by interaction with the RNA polymerase core enzyme results in differential transcription of many secondary Com-dependent genes.

Streptococcus pneumoniae

QS: • navození stavu přirozené kompetence (systém Com)

• podíl na regulaci virulence a tvorby biofilmu

• signální molekula: CSP (Competence Stimulating Peptide) – 17ak

• CSP – vyštěpením z prekurzoru ComC (41ak)

• rychlá odpověď – rychlé navození stavu kompetence a jeho ukončení

• důvod? – buňky ve stavu kompetence jsou citlivé k autolýze

Competence in Streptococcus pneumoniae (red line) rises sharply at a specific growth stage (blue line), followed by a rapid decline. Optical Density (OD550) was used to measure cell number and resistance to erythromycin (Ery-R) was used to assess competence (příjem DNA s rezistencí k Ery)

Staphylococcus aureus

• gram-pozitivní kok

• člověk = přirozený hostitel (20-50%) - kůže, vlasy, sliznice

• záněty kůže a měkkých tkání

• výskyt v potravinách – masné produkty, lahůdkové saláty, mléčné výrobky, pudinky

• riziko – produkce termostabilních enterotoxinů (var 20min)

• enterotoxikóza – zvracení, průjem, křeče (během 1-6 hodin)

Elektronový mikroskop Světelný mikroskop (po obarvení dle Grama) Typické kolonie na selektivním médiu

Staphylococcus aureus

systém arg = accessory gene regulator

• dva operony, dva promotory (P2 a P3)

P2: produkce a detekce signálu AIP

P3: RNAIII = regulační úloha + δ-hemolysin → inhibice biofilmu

AIP

Staphylococcus aureus

1. exprese adhesinů – kolonizace

2. nárůst populace, nedostatek živin

3. exprese exoenzymů a toxinů

4. uvolnění buněk

5. nové působiště s dostatkem živin

Bacillus subtilis

• G+ aerobní tyčinka

• tepelně odolné spóry (120°C/30min)

• QS: dva systémy pod kontrolou AIP

• ComX – regulace přirozené kompetence

• CSF – spolurace (Competence and Sporulating Factor)

• kompetence: příjem DNA na pomezí exponenciální a stacionární fáze

• sporulace: při limitaci živin

ComX

Bacillus subtilis – kompetence (Com)

• cca 10% buněk B.subtilis na počátku stac. fáze ve stavu kompetence

Bacillus subtilis

• „přepínání“ mezi procesy kompetence a sporulace

CSF

• role v obou mechanismech

• intracelulární signál

• při nízké hustotě stimulace aktivity ComP/A

• při vysoké hustotě „přepnutí“ do procesu sporulace

DSF – diffusible signal factor

• poprvé u Xanthomonas campestris

• další G-: Burkolderia, Pseudomonas, Stenotrophomonas…

• zákl. struktura: mastné kyseliny

Jiné signální molekuly QS

indol

• podrobně popsáno u E. coli indol

Xanthomonas campestris - DSF

• G- aerobní tyčinka

• rostlinný patogen – bakteriální skvrnitost

• produkce extracelulárních enzymů (proteázy, pektinázy, celulázy)

• kontrola QS: produkce enzymů, biofilm, rezistence k toxinům

• signální molekula: DSF = diffusible signal factor

Xanthomonas campestris - DSF

• RpfF – signal synthesis

• RpfC – detection

• RpfG – signal transduction

RpfG

• fosfodiesteráza

• štěpí intracelulární cyklický nukleotid diguanosin-monofosfát (c-di-GMP) ; tzv. „second messenger“ – malé efektorové molekuly mající nezastupitelnou roli v řadě signálních drah a regulačních procesů

propojení mechanismů quorum sensing a c-di-GMP

Xanthomonas campestris - DSF

At low cell densities, when the concentration of DSF is low, RpfC interacts with RpfF and decreases its activity. In this state RpfG (green) is unphosphorylated and inactive. This leads to an increase in c-di-GMP levels. C-di-GMP binds to the transcription factor Clp (gray) to abrogate its ability to bind DNA.

At high cell density, RpfC binds to DSF, leading to phosphorylation of RpfG, which activates its PDE activity and decreases the c-di-GMP pool. RpfF no longer binds to RpfC and produces more DSF. The decrease in c-di-GMP activates Clp, which then induces target gene expression either directly or through modulation of other transcription factors.

Indol jako signální molekula QS

• produkce indolu - E. coli, některé kmeny Shigella, Enterococcus faecalis, V. cholerae, Aeromonas… (G- i G+)

• indol – různé funkce (extracelulární signál, tvorba biofilmu, kontrola virulence, stabilita plasmidů…

• signál QS – popsáno r. 2007

• řada podobností s AI-2

• TnaA – tryptofanáza (rozklad tryptofanu na indol + pyruvát + NH3)

Indol jako signální molekula QS

• TnaA – tryptofanáza (rozklad tryptofanu na indol + pyruvát + NH3)

Architektura systémů QS

• paralelní: V. harvey / V.cholerae

• propojené: Ps. aeruginosa (komplikovaně propojené Las, Rhl, Pqs)

• kompetitivní: B. subtilis (přepínání mezi kompetencí a sporulací)

• blesková reakce „On-Off“ : S. pneumonie (CSP - kompetence)

• odpověď na podnět hostitele: A. tumefaciens (opiny)

Využití znalostí o QS

Quorum Quenching (QQ) = „zhášení“

inhibice QS na různých úrovních

Využití

• medicína – nový typ „antibiotik“

• potravinářství – konzervanty, prevence kontaminace

zaměřeno především na kontrolu virulence a tvorby biofilmu

Inhibice QS

3 strategies can be applied

Targeting AHL signal

dissemination

Targeting the signal

receptor

Targeting signal

generation

Signal precursor

Signal

Signal receptor

Signal precursor Signal precursor

Signal Signal

Signal receptor Signal receptor

X

X X

Inhibitory QS

malé molekuly • kompetitivní inhibice – vazba na signální receptor • nejčastěji AHL-dependentní inhibitory • přírodní furanony

• řasa Delisea pulchra • L-canavanine – luštěniny (až 5% sušiny) • grapefruit • cinnamaldehyd (skořicovník)

• modifikace přírodních látek – zvýšení účinnosti

makromolekuly – „QQ enzymes“ • řada bakterií (konkurenční boj) • nejčastěji degradace signální molekuly (AHL, AI-2, DSF, PQS)

• AHL laktonázy – hydrolýza laktonu • AHL acylázy – hydrolýza amidové vazby (lakton + m.kyselina) • AHL oxidázy a reduktázy – modifikace AHL

• např. Bacillus sp. – metalo-β-laktamáza AiiA

Inhibitory QS – QQ enzymy

Laktonázy x Erwinia carotovora

Lactonase AiiA expression in plants inhibits virulence effects of Erwinia carotovora. E. carotovora was inoculated onto leaves of tobacco (a and b) or potato tuber slices (c), transformed with an aiiA expression vector (top row) or untransformed (bottom row). The extent of tissue maceration was measured at 20 h (a), 40 h (b), and 48 h (c).

Inhibice v systému LuxS

Possible AI-2-based druggable targets. (1) LuxS; (2) AI-2 transporter (such as LsrB); (3) efflux pump for AI-2; (4) extracellular receptor for AI-2 (such as LuxP); (5) intracellular receptor for AI-2; (6) AI-2-regulated transcription factor or repressor (such as LsrR); (7) small regulatory RNA (sRNA) mediated quorum sensing (QS) circuit.

Pseudomonas aeruginosa - QQ

Pseudomonas aeruginosa - QQ

Potenciální cíle QQ:

1. LasR / RhlR

2. AHL (3O-C12-HSL; C4-HSL)

3. lasI/lasR a rhlI/rhlR exprese

QS:

• systémy las, rhl (+ regulační pqs)

• faktory virulence

• problém - multirezistentní kmeny

• QQ – možná strategie terapie

Pseudomonas aeruginosa - QQ

Cíl QQ: LasR / RhlR

• analogy AHL

• kompetice o LasR (RhlR)

• inhibice aktivace LasR → nedochází k expresi elastázy

• sloučeniny: s anilinovým kruhem, syntetické halogenované furanony

Pseudomonas aeruginosa - QQ

Cíl QQ: AHL

• AHL-specifické protilátky

• enzymové štěpení – laktonázy (problém s distribucí do místa infekce)

• blokace na úrovni LasI

(inhibice produkce syntézy AHL - dráha SAM)

Pseudomonas aeruginosa - QQ

Cíl QQ: lasI/lasR a rhlI/rhlR exprese

• inhibice regulačních faktorů potřebných pro expresi

• „antisense“ oligonukleotidy – vazba na lasR/lasI → inhibice translace

Něco navíc

Transgenní E.coli - produkce LasR – rozpoznání komunikace Ps. aeruginosa

zaznamenání signálu LasR - exprese dvou genů • pyocin • lyzační protein – uvolnění pyocinu

Účinnost – až 99% buněk Ps. aeruginosa v suspenzi; až 90% buněk v biofilmu (Saeidi, Wong, Lo, Nguyen, Ling, Leong, Poh & Chang. 2011. )

Transgenní E. coli

„The beauty of this solution is that it uses P.aeurginosa’s own weapons against it“

„Odposlech“

Chromobacterium violaceum

• G- fakultativně anaerobní krátká tyčinka

• pigment violacein (atb účinek)

• produkuje pigment v přítomnosti AHL s krátkým řetězcem

• mutantní kmeny – blokace syntézy AHL (biosenzory)

Test látek s anti-QS účinkem test produkce AHL

Biosenzory AHL

• neprodukují signál

• mají receptor (LuxR)

• reportérový gen (GFP, luciferáza…)

• biosenzory pro různá spektra AHL (AHL s krátkým nebo dlouhým řetězcem…)

TCL přeliv:

• extrakt rozdělem TCL • přeliv agarem s reportérovým kmenem • vznik „spotů“ • některé tvarově specifické

3-O-AHL kapky 3-OH-AHL kulaté

Shrnutí

systémy komunikace

signální molekuly

fenotypy řízené QS

inhibice QS

Systémy komunikace

intra-species AI-1, AIP

inter-species AI-2

inter-kingdom AI-3

Systémy komunikace

Signální molekuly QS

acyl-homoserin laktony (AHL) AI-1 G negativní analogie V. fischeri

furanony AI-2 Vibrio sp. – furanosyl-borát diester cross-talk (G+ i G-)

oligopeptidy AIP modifikace G pozitivní

AI-3

epinefrin/norepinefrin buňka-hostitel, EHEC

CAI-1 tridekanony (ketony s řetězcem C13) Vibrio harveyi, V. cholerae

PQS = 2-heptyl-3-hydroxy-4-chinolon Pseudomonas aeruginosa

DSF – nenasycené mastné kyseliny Difusible Signal Factor Xanthomonas campestris

indol mezidruhová komunikace , E. coli

Základní: Další:

Fenotypy regulované QS

Konkrétní příklady

• Vibrio fischeri - modelový systém LuxI/LuxR

• Vibrio harveyi / Vibrio cholerae – paralelní systémy, role small-RNA

• Pseudomonas aeruginosa – navzájem propojené systémy Las, Rhl, PQS

• E. coli – zákl. systém AI2 - Lsr, EHEC kmeny komunikace s hostitelem přes AI-3, indol

• Agrobacterium – přenos plasmidů, opiny

• Erwinia – extracelulární proteiny + antibiotika

• Xanthomonas – propojení se systémem c-di-GMP, DSF

• Streptococcus pneumoniae - kompetence

• S. aureus – systém Arg

• Bacillus subtilis – přepínání mezi stavem sporulace a kompetence

Děkuji za pozornost!

sykorovh@vscht.cz