PRIMER REPORTE DE Trypanosoma vivax EN OVEJAS DE NICARAGUA

a Bonilla José Luis, a Shelevy Jessica, b Blandon Melissa y a Jirón William

a Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI), Escuela de Veterinaria UNAN-LEON

b PIET, Universidad Nacional de Costa Rica

Noviembre 2009

Resumen

La tripanosomiasis o tripanosomosis es una enfermedad severa que afecta a un amplio rango

de animales vertebrados incluyendo al hombre y es causada por parásitos protozoarios

pertenecientes al género tripanosoma. La tripanosomiasis animal es causada por T. evansi, T.

vivax, T. congolense, T. brucei, T. equiperdum y T. equinus, siendo los dos primeros de mayor

importancia clínica. Un total de 30 muestras de sangre con anticoagulante (EDTA) y extendido

periférico fueron remitidas al Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI),

laboratorio de Biopatología. Las muestras fueron analizadas por biometría hemática completa

(BHC) y frotis de extendido periférico teñidas con Giemsa. De las 30 muestras 11 presentaron

el trypanosoma. 20 muestras fueron enviadas al PIET de la Universidad Nacional de Costa Rica

para su confirmación e identificación de la especie mediante reacción en cadena de la

polimerasa. De las 20 muestras 17 fueron positivas, siendo T. vivax la especie encontrada.

Palabras claves: T. vivax, ovejas, Tinción Giemsa, PCR.

Introducción La tripanosomiasis animal es causada por T. evansi, T. vivax, T. congolense, T. brucei, T. equiperdum y T. equinus (Gibson, W. 2003). T. evansi posee un rango muy amplio de hospedadores y es patógeno para un gran número de animales domésticos y de laboratorio. Sin embargo los animales más comúnmente afectados son caballos, camellos, perros, venados y elefantes asiáticos. La infección en cerdos puede ocurrir de forma asintomática o asociado a muy ligeros síntomas clínicos (Brun, R., 1998). Trypanosoma (Duttonella) vivax es otra especie de hemoparásito de gran interés en la clínica veterinaria debido al impacto negativo que ejercen sobre la producción pecuaria (Rivera M.A., 1996). Estos parásitos causan una enfermedad crónica donde los animales afectados exhiben anemia severa, pérdida de peso, alteraciones reproductivas, anorexia y muerte, con parasitemias bajas, difíciles de detectar por métodos parasitológicos convencionales. Estudios sobre tripanosomosis en ovinos (Ovis spp.) de Nicaragua son bastante

escasos. Aspectos epidemiológicos de relevancia, tales como prevalencia, formas de transmisión y especies involucradas son aún poco comprendidos. Igualmente, se desconoce si bovinos y ovinos comparten la misma especie de tripanosoma. Recientes estudios en Kenya han mostrado que pequeños rumiantes (ovinos y caprinos) se infectan de modo natural y son afectados por T. vivax y otras especies de tripanosomas, transmitidos principalmente por Glossina spp. (NG’ayo, M.O., et al., 2005). En Nicaragua, este díptero no está presente, no obstante, se piensa que diversas especies de tripanosomas puedan ser transmitidas por dípteros hematófagos como Tabanus spp., Stomoxys calcitrans y Haematobia irritans, situación que ha sido demostrada en países africanos, donde la transmisión de tipanosomas entre vacunos se mantiene en áreas libres de la mosca tse-tsé (Glossina spp.). La presente publicación representa el primer reporte de T. vivax en ovjeas de Nicaragua.

Material y Método Un total de 30 muestras de sangre con anticoagulante y de extendido periférico de ovejas (hembras y machos) de aproximadamente 5 a 7 años de edad fueron remitidas al Centro Veterinario de Diagnóstico e Investigación (CEVEDI), laboratorio de Biopatología. Ubicación. Las muestras provinieron de una explotación ovina de aproximadamente 400 animales, el cual se encuentran en estrecha relación con otros animales domésticos como son bovinos y equinos. La localidad se encuentra en la comarca San Antonio, longitud de 59° 34’ 95’’, latitud 136° 56’ 37’’ Carretera León- Poneloya, municipio de León. BHC y tinción con Giemsa. Las muestras fueron analizadas por biometría hemática completa y frotis teñidos con Giemsa. En el BHC se tomó en cuenta los valores de hematocrito, proteínas, eritrocitos, leucocitos y hemoglobina. Se realizó un frotis de sangre periférica y se tiñó con Giemsa. Primeramente el extendido es fijado con metanol (100%) y se deja 5 minutos, luego se tiñe con solución Giemsa (3 ml de solución Giemsa y 8 ml de agua destilada) y se deja 15 minutos, finalmente se lava con agua de grifo y se deja secar para posteriormente observarse al microscopio con un lente de 100X con aceite de inmersión. Método de Extracción de ADN. Para la extracción de ADN se utilizó la sangre, utilizando el un kit de extracción de PROMEGA y el procedimiento se realizó según las instrucciones del kit. Cebadores o primers. Se utilizaron cebadores específicos para T. vivax, tomando la secuencia descrita por Masiga et. Al., 1996. TVW A, TVW B forware (5´GTGCTCCATGTGCCACGTTG´3), reverse (5´CATATGGTCTGGGAGCGGGT´3) con un tamaño del producto de 175 bp. Amplificación del ADN. La amplificación del ADN se llevó a cabo en base al protocolo de J.L. González et al., 2005 y Masiga et. Al., 1996.

Resultado De las 30 muestras de sangre con EDTA y extendido periférico remitidas el CEVEDI, laboratorio de Biopatología 11 fueron positivas observándose el tripanosoma. Los niveles de hematocrito en la mayoría de las muestras estaban por debajo de lo normal, tal como se muestra en la gráfica 1. De las 20 muestras que se les realizó el PCR 17 resultaron positivas identificándose T. vivax como agente causal. Figura 1. Los animales presentaban un estado corporal deplorable, caquéxicos, mucosas pálidas y anemia.

Gráfica 1. Valores de hematocrito en ovejas: barras en rojo, muestras positivas a tripanosoma.

Figura 1. Productos de PCR. Gel de agarosa al 2% mostrando el amplicon 175 bp, correspondiente a T. vivax. (M: Marcador 100 bp (Roche Biochemicals).

Discusión En base a los resultados obtenidos por BHC, frotis extendido periférico y PCR se muestra la presencia de Trypanosoma en 11 de las 30 muestras de ovejas según las dos primeras técnicas y 17 de 20 muestras

según PCR. Esto resultados pudieron estar asociado primeramente al tipo de prueba empleada, tomando en cuenta que le BHC y frotis extendido periférico son pruebas con una baja sensibilidad y que para identificar trypanosomas por esta técnica tiene que haber una alta carga parasitaria a diferencia de PCR que es una técnica con mayor sensibilidad y especificidad pudo detectar más positivos, así lo confirman otros estudios realizados donde han utilizado la comparación de métodos parasitológicos convencionales y diferentes métodos PCR, los cuales, este último ha mostrado mejores resultados (J.L.González et. al., 2005). Otro de los resultados importantes es de que la mayoría de los ovinos identificados como positivos por métodos biopatológicos convencionales mostraron niveles de hematocrito bajos comparado con los valores encontrados no infectados. Una situación similar fue reportada en tripanosomosis en pequeños rumiantes (Dinka, H. et al., 2005). Queda demostrado mediante PCR, que Trypanosoma vivax es la especie principal que afecta a ovinos de la zona occidental del país. Bibliografía Brun R, Hecker H, Lun Z-R, 1998. Trypanosoma evansi and T. equiperdum: distribution, biology, treatment and phylogenetic relationship (a review). Vet. Parasitol 79: 95–107. Dinka, H.; Abebe, G., 2005. Small ruminants Trypanosomosis in the southwest of Ethiopia. Small Rum. Res. 57: 239-243. J.L.González, A. Loza, E. Chacon, 2005. Sensitivity of different trypanosome vivax specific primers for the diagnosis of livestock trypanosomosis using different DNA extraction methods. Veterinary Parasitology. 136: 119 – 126. Masiga, D.K., McNamara, J.J., Laveissiere, C., Truc, P., Gibson W.C., 1996. A high prevalence of mixed trypanosome infections in tsetse flies in Sifra, Cote d´Ivoire, detected by DNA amplification. Parasitology. 112: 75 – 80. W. C. Gibson, Z. K. Njiru , K. Ndung’u , G. Matete and J. M. Ndungu, 2003. Detection of Trypanosoma brucei rhodesiense in animals from sleeping sickness foci in East Africa using the serum resistance associated (SRA) gene. Acta Tropical. 90(3):249-254.