PRIMERA INVESTIGACIÓN ARGENTINA DE ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES:

Avance en la Identificación Grupal y Desarrollo Metodológico para la Individuación Patológica

BecariaLic. Silvina Edith Bender

DirectoraDra. Raquel Dodelson de Kremer

CEMECOCentro de Estudio de las Metabolopatías Congénitas

ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP)ERRORES INNATOS DEL METABOLISMO

Sindrome deZellweger

(SZ)

Adrenoleucodistrofia

Neonatal (ALDN)

Enfermedad de Refsum Infantil

(ERI)

Defectos de la Biogénesis Peroxisomal

Condrodisplasia Rizomélica

Puntata

(CDRP I)

Deficiencias Enzimáticas Aisladas

Pseudo Zellweger

(ALD-X)

AdrenoleucodistrofiaLigada al

Cromosoma X

Enfermedad de Refsum Clasica (ERC)

Pseudo Adrenoleucodistrofia

Hiperoxaluria

(HO)

Deficiencia de Proteína Bifuncional

Deficiencia de AcilCoA-Oxidasa

(DPBF)

(P-SZ)

Acidemia Pipecólica

Neonatal (ALDN)

ENFERMEDADES GENÉTICAS PEROXISOMALES (EGP)

CONSECUENCIA METABÓLICA

-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, ácido pristánico, ácido trihidroxico-lestanoico y cadenas laterales del colesterol

Síntesis de ácidos biliares, plasmalógenos e isoprenoides

α- oxidación del ácido fitánico

Catabolismo de poliaminas, ácido L-pipecólico y H2O2

Metabolismo de glioxilato prostaglandinas, etanol y gluconeogenesis

FUNCIONES PEROXISOMALES

ácidos grasos de cadena muy larga

ácido trihidroxi-colestanoico

ácido pristánico

colesterol

plasmalógenos

ácido fitánico

ácido pipecólico

oxalato

MARCADORES

BIOQUÍMICOS

Integrar los objetivos hacia la “Investigación Trasnlacional”; colaboración entre investigadores clínicos, laboratorios y pacientes para propugnar que los descubrimientos sean translacionales a la práctica asistencial y promover enérgicamente la Investigación Clínica en Genética Médica como herramienta básica para el progreso en el cuidado de la Salud.

OBJETIVOS GENERALES DEL PROYECTO

Continuar con el desarrollo del temario seleccionado en el campo de la Genética Médica-Bioquímica, área de Enfermedades Genéticas Peroxisomales (EGP), graves patologías neurodegenerativas previamente no abordadas en nuestro país.

Contribuir a la difusión y utilización de un centro referencial en el país destinado a la contención del paciente, su familia y la sociedad, tendiente a disminuir el enorme impacto humano y económico que provoca la falta de diagnóstico en estas patologías.

OBJETIVOS ESPECIFICOS DEL PROYECTO

I. Desarrollar la metodología bioquímica diagnóstica, destinada a la definición nosológica exacta de cada una de las entidades del amplio grupo de las EGP (Algoritmo Bioquímico).

II. Estudiar biomarcadores secundarios a las EGP, perfil de ácidos orgánicos urinarios y análisis molecular de polimorfismos, involucrados en la extraordinaria variación fenotípica interfamiliar e intrafamiliar. (focalización: ALD-X)

III. Estandarizar los métodos para la medición de los metabolitos diagnósticos en muestras de sangre impregnadas en papel de filtro. (sensibilidad, reproducibilidad y estabilidad).

ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTOALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO

EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA

AGCML PLASMÁTICOS

AUMENTADONORMAL

Excluye Defecto de -Oxidación y

DBP

Estudios Histométricos Peroxisomales, Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular

ANORMALNORMAL

Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa

Peroxisomal

PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS

DISMINUÍDO

ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO

Probable Defecto de -Oxidación/ Otras Conrodisplasias

DBP/CDRP

NORMALNORMALAUMENTADO

CDRP Tipo II y Tipo III

Probable Deficiencia de Acil

CoA-Oxidasa

RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO

NORMAL AUMENTADO

Probable DBP

NORMALNORMALAUMENTADO

INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA)

DBP DPBF Tipo BDeficiencia de

Acil CoA-Oxidasa

AUMENTADO

NORMAL

ALD-X

CDRP Tipo I

ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS

ALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTOALGORITMO BIOQUÍMICO PROPUESTO

EXACTA DEFINICIÓN NOSOLÓGICA

AGCML PLASMÁTICOS

AUMENTADONORMAL

Excluye Defecto de -Oxidación y

DBP

Estudios Histométricos Peroxisomales, Determinaciones Enzimáticas y Análisis Molecular

ANORMALNORMAL

Probable Deficiencia de DPBF o Tiolasa

Peroxisomal

PLASMALÓGENOS ERITROCITAROS

DISMINUÍDO

ÁCIDO FITÁNICO PLASMÁTICO

Probable Defecto de -Oxidación/ Otras Conrodisplasias

DBP/CDRP

NORMALNORMALAUMENTADO

CDRP Tipo II y Tipo III

Probable Deficiencia de Acil

CoA-Oxidasa

RELACIÓN PRISTÁNICO/FITÁNICO

NORMAL AUMENTADO

Probable DBP

NORMALNORMALAUMENTADO

INTERMEDIARIOS DE AC. BILIARES (DHCA Y THCA)

DBP DPBF Tipo BDeficiencia de

Acil CoA-Oxidasa

AUMENTADO

NORMAL

ALD-X

CDRP Tipo I

ACIDOS ORGÁNICOS URINARIOS

METODOLOGÍA BIOQUIMICA

Ac. Orgánicos Urinarios (AOU)

Orina 5 ml

Cromatografía Gaseosa Capilar-Ionización a la llama

(CG-FID)

Ac. Grasos de Cadena muy Larga (AGCML)

Ac. Grasos Ramificados (AGR)

Plasma 250 µl

Metabolitos Primarios Biomarcadores Secundarios

METODOLOGÍA DEL ANÁLISIS MOLECULAR

Polimorfimos del Metabolismo de la Metionina Parámetros no convencionales a las EGP

Sustitución 677C>T de la MTHFR

Inserción 844ins68 de la CBS

Digestión de producto de PCR con enzima de restricción HindI. Electroforesis en gel de poliacrilamida 6% (Frosst 1995)

Separación de productos de PCR por electroforesis en gel de agarosa 3%. El alelo “wild type” produce un fragmento de 596 pb y la insersión uno de 664 pb. (Urreizti 2003)

5,10-Metilenetetrahidrofolato Reductasa (MTHFR)

Cistationina Beta-Sintasa (CBS)

Mayor vulnerabilidad desmielinización

Efecto protector desmielinización

INTEGRACIÓN DEL ALGORITMO BIOQUÍMICO A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA

Evaluación Clínica Clasificación Fenotípica de ALD-X

FenotiposMoser HW 1997, 2001

Patrones de Lesión anatómica Loes 2003

Clasificación de RMN en 5 grupos

Severidad de Afectación Loes 1994

Escala de severidad de RMNespecífica

para ALD-X de 0 - 34 puntos

Cerebral Infantil

Cerebral Juvenil

Adrenomieloneuropatía

Cerebral Adulto

Addison Aislado

Asintomático

Portadoras Sintomáticas

Parieto-OccipitalFrontalCortico-EspinalCerebelarParieto-Occipital y Frontal

Definición o aproximación diagnóstica por determinación de AGCML

BN (9 a/M)BML (4 a/F)

BN (14 a/F)BE (11 a/M)

0,941,540,80

ND0,09

12,9115,4813,34

0,68 ND 10,43BI (4 a/M) 1,44 0,06 23,92BM (2 a/M) 1,61 0,05 21,79VG (madre) 1,25 0,02 26,90

0,78NDND0,740,920,51

ND

Valores deReferencia

ALD-X HemicigotaNormal

ALD-X Heterocigota

C24:0 (µg/ml)

0,84 ± 0,08

C24/C22

1,49 ± 0,45 1,09 ± 0,34

C26/C22

0,01 ± 0,01 0,07 ± 0,04 0,03 ± 0,02

13,34 ± 3,78 25,12 ± 4,83 25,43 ± 6,04

C26:0 (µg/ml)

0,22 ± 0,08 1,18 ± 0,53

0,70 ± 0,40

Pacientes

Heterocigota

ADL-X

Hemicigota -CI

Hemicigota- AsintomáticoNo Afectado

Heterocigota

ND

Hemicigota- Asintomático

No Afectado

CI

BMT

Asnt AA AA

Asnt

IB MBEB

Metabolitos Primarios: ALD-X

AGCML y AGCR en plasma

Pacientes sospechados de EGP

Heterocigotas ALD-X

n=3 n=3

AGCML normal

n=70

Hemicigotos ALD-X

Heterocigotas ALD-X

n=13 n=19

Sanos

n=11

Familiares directos de ALD-X

Hemicigotos ALD-X

n=46

EB IB MB

RMN Cerebral Normal RMN Cerebral Normal

EB

RMN Score: 0

RMN patrón : Normal

CI

TMO

Asnt AA AA

Asnt

677CT

677CT 677CT

Extensive involvement of periventricular white matter with temporal extension. Involvement of the splenium and body

Corpus callosum, internal capsule, peduncles and protuberance

parieto-occipital

RMN patrón: 1

RMN Score: 4

IB MBEB

11y 11y 10y 7y

INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA

Familia EB

Marked slimness of the spinal cord. Diffuse atrophy

RMN Cerebral : Normal

OR

OR

41

RMN patrón: 3

MRI Score: 3

10 19

CI

9

10

CIAMN

? Asnt

? ?

?

CI

CI CI Asnt

?

? ? ? ? ? ?

677 CC

OR

Sint SintSint

677 CT 677 CC

INTEGRACIÓN DE METABOLITOS PRIMARIOS Y BIOMARCADORES SECUNDARIOS, A LA COMPATIBILIDAD CLÍNICA

OR

Familia ORTracto corticospinal

Biomarcadores Moleculares Variación Fenotípica inter/intrafamiliar

CBS InsIns

CBS WIns

CBS WW

0

10

85 2 4 2 1

2

63

- - - - - -

- - - - -

Controlesn=95

X-ALD Hemicigotosn=9

CI AA AMN Asnt Sint Asnt

MTHFR 677TT

MTHFR 677CT

MTHFR 677CC

11

45

39

1 2 1

- - - -

1 2 1

-

1

- -

1 3

52

Polimorfismos Estudiados

X-ALD Heterocigotasn=11

Biomarcadores secundarios en EGP, específicamente en ALD-X

Caracterización del perfil de Ácidos Orgánicos Urinarios

≥ 300 metabolitos en corrida cromatográfica

1) lactato, 2) oxalato, 3) piruvato, 4) adipato, 5) p-OH-fenilacetato, 6) 2-cetoglutarato, 7) sebàcico, 8) p-OH-fenillactato, 9)estándar interno, 10) 3-OH sebàcico, 11) 3-6 epoxitetradecanedioico

PERFIL AOU NORMAL

10 20 30 40 50

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1.0e4

1.1e4

1.2e4

1.3e4

Time (min.)

1

2

3

4

6

7

8

5

9

10

11

10 20 30 40 50

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1.0e4

1.1e4

1.2e4

1.3e4

Time (min.)

1

2

3

4

6

7

8

5

9

10

11

17 19

6

8

14

13 16

3 5 -15 18 23 24 1 4 7 9 10 20 2- 11-

10 20 30 40 50

5000

5200

5400

5600

5800

6000

6200

Tiempo (min)

1) lactato, 2) oxalato, 3) cresol, 4) piruvato, 5) 3-OH-butirato, 6) gliceraldehído I, 7) 3-OH-isovalerato, 8) gliceraldehído II + urea, 9) fosfato + etilmalonato, 10) succinato, 11) adipato, 12) piroglutamato, 13) m-OH-fenilacetato, 14) p-OH-fenilacetato, 15) 2-cetoglutarato, 16) aconitato, 17) hipurato, 18)citrato, 19) estándar interno, 20) palmitato, 21) oleato, 22) estearato, 23 24) p-OH-hipurato

PERFIL AOU Adrenoleucodistrofia Neonatal

Hipotonía, dismorfias faciales, retraso psicomotor, convulsiones, cliteromegalia y disfunción hepática

Efectuar el diagnóstico o aproximación diagnóstica de EGP en nuestro medio.

Brindar una posta asistencial no disponible con anterioridad y evitar una larga deambulación diagnóstica de la afección en cuestión.

Definir en alta proporción el estado de portadora de ALD-X, entidad de aparente alta prevalencia en nuestra población.

Precisar el asesoramiento genético en las familias involucradas, acorde a los conocimientos científicos actuales.

Brindar el adecuado manejo del paciente, según su específica EGP.

Estimación preliminar de avance del proyecto

El estado de avance de la aplicación del Protocolo Clínico-Bioquímico posibilitó:

CEMECO

Metabolismo H2O2CatalasaAcatalasemia

Acido PipecólicoDegradación de Acido Pipecólico? No identificadaHiperpipecolico

Acidemia(variab)

Metabolismo Glutaril-CoA Glutaril-CoA OxidasaGlutarico Aciduria

III

Acido Oxállico, Glioxílico

Detoxificación Glioxilato

Alaninaglioxilato Aminotransferasa

Hiperoxaluria I

AGCR-Oxidación de Acidos GrasosFitanoil-CoA hidroxilasaER

Alkil-DHAP SintasaPlasmalógenosBiosíntesis de

EtherfosfolípidosDHAPAT

CDRP

RacemasaNeuropatía tardía

Tiolasa IP-SZ

D-Proteína BifuncionalP-SZ/ALDN

Acil-CoA OxidasaP-ALDN

AGCML- Oxidación de Acidos Grasos

PALD X-ALD

FenotipoBioquímico

Función Metabólica Alterada

Enzima/Proteína AfectadaFenotipo Clínico

Deficiencias de una Unica Proteína Peroxisomal (DUP)

A. Defectos de la Biogénesis Peroxisomal (DBP)

Sindrome de Zellweger (SZ)

B. Deficiencias Enzimáticas Aisladas

Condrodisplasia Rizomelica Punctata (RCDP) tipo I

Enfermedad de Refsum Infantil (ERI)

Adrenoleucodistrofia Neonatal (ALDN)

β-Oxidación de Ácidos GrasosAdrenoleucodistrofia Ligada al Cromosoma X (ALD-X)

Deficiencia de Acyl-CoA Oxidasa (ACOX1)

Deficiencia Proteina D-Bifunctional (PDB)Deficiencia Proteina Transportadora de Sterol-X (SCPx)

Deficienciencia 2-Methylacyl-CoA Racemasa (AMACR)Biosintesis Eterfosfolipidos

Deficiencia Dihidroxiacetona fosfato aciltransferasa (DHAPAT) (CDRP Tipo II)Deficiencia Alquil-DHAP sintasa (CDRP Tipo III)

α-Oxidacion de acidos grasosEnfermedad de Refsum (Deficiencia de Fitanoil-CoA hidroxilasa)

Metabolismo del Peróxido de HidrógenoAcatalasaemia (Deficiencia de Catalasa)

Detoxificación del GlioxilatoHyperoxaluria Tipo I (Deficiencia de Alanina Glioxilato Aminotransferasa)

C. Sindrome de Gen Contiguo

Sindrome de Deleción Contigua ABCD1 DXS1357E (CADDS)

PEX 7

Genes Involucrados

GNPAT AGPS

ABCD1

ACOX1

HSD17B4

AMACR

SCP2

PHYH/PAHX

AGXT

CAT

PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 16, PEX 1, PEX 2, PEX 13, PEX 19, PEX 5, PEX 12PEX 26, PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 3, PEX 13, PEX 5, PEX 12PEX 26,PEX 10, PEX 6, PEX 1, PEX 5, PEX 12

Genes Involucrados