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PROCEDIMIENTOS BIOQUMICOS Y

FISIOLGICOS EN LAS ALTERACIONES DE LA

SALUD

CUADERNO DE PRCTICAS

CURSO ACADMICO 2006-2007

Alumno/a____________________________________________

Practicas de Procedimientos Bioqumicos y Fisiolgicos en las alteraciones de la salud

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INTRODUCCIN

Un laboratorio clnico es el lugar en el que se efectan trabajos

experimentales y se realizan anlisis y exmenes bioqumicos, serolgicos,

histolgicos citolgicos, bacteriolgicos...

En la actualidad, la mayora de los diagnsticos pueden verse completados,

confirmados o sujetos a revisin gracias a las tcnicas de laboratorio y, por ello,

buena parte de la responsabilidad del mantenimiento de la salud recae sobre

ellos. En definitiva, las tcnicas analticas cumplen bsicamente tres objetivos:

Aportan informacin para que el mdico diagnostique adecuadamente

Permiten seguir la evolucin de una enfermedad durante el tratamiento

Pueden ser utilizadas como medida preventiva para conocer el estado de

salud de los individuos y detectar precozmente alguna alteracin.

Cuatro son las condiciones de un buen profesional de laboratorio:

Ciencia: es imprescindible una compresin adecuada

Paciencia: meticulosidad y capacidad crtica

Conciencia: de la responsabilidad del trabajo realizado

Instrumentacin: conocimiento bsico de los aparatos e instrumentos

utilizados.

OBJETIVO

El objetivo de estas prcticas es familiarizar al alumno con las distintas tcnicas

experimentales empleadas en el laboratorio de anlisis clnicos, trasladando al

mismo los conocimientos adquiridos durante la docencia terica.


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INSTRUCCIONES GENERALES Material necesario Cada alumno deber venir provisto del siguiente material: Bata de laboratorio Cuaderno Rotulador de vidrio (si es posible) Bolgrafo, papel milimetrado, regla y calculadora Laboratorio Sigue cuidadosamente las normas de seguridad. Trata el material con cuidado y rotula adecuadamente todos los tubos y cualquier otro recipiente que utilices. Limpieza Al finalizar la prctica, todo el material de cada grupo, as como el material de uso general deber quedar perfectamente limpio y sin rtulos, el ltimo enjuague debe realizarse con agua destilada. Asistencia Es obligatorio asistir a todas las sesiones prcticas Evaluacin Se evaluar de forma continuada en el laboratorio durante el desarrollo de las sesiones prcticas tanto las aptitudes como las actitudes mostradas por el alumno. Tras la finalizacin del periodo de prcticas se entregar, de forma voluntaria, un cuaderno en el que se incluirn: las respuestas a las cuestiones planteadas, los clculos realizados as como los resultados obtenidos en cada determinacin, un comentario personal con la descripcin de las tcnicas empleadas, el material utilizado, las normas de manipulacin de la muestra, los posibles problemas acaecidos, etc. Si los resultados obtenidos fueran errneos, el alumno deber indicar las posibles causas que han originado el error as como la forma de subsanarlas.


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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Es necesario, antes de comenzar cualquier prueba, saber la finalidad y

procedimiento experimental exacto con el objeto de tener preparado todo el

material y los reactivos necesarios. Aquellos materiales o reactivos que se

utilicen con ms frecuencia se tendrn guardados en lugares fcilmente

accesibles. Es esencial la limpieza, tanto durante el trabajo como al final del

mismo.

En todo laboratorio existen riesgos potenciales que requieren una atencin

especial. Como normas generales para prevenir los accidentes se pueden

considerar las siguientes:

1. Debe utilizarse bata mientras se permanece en el laboratorio

2. No se debe comer o beber dentro del laboratorio, ni utilizar recipientes para

beber o conservar alimentos

3. Antes de utilizar los reactivos, leer los rtulos

4. No dejar destapados los envases

5. Guardar las medidas de asepsia cuando ello sea necesario. En el

laboratorio clnico se debe trabajar con guantes en todo momento.

6. Mantener limpio el lugar de trabajo y lavar el material utilizado al finalizar el

anlisis

7. No fumar

8. No succionar con la boca una pipeta. Utilizar peras de goma.

9. No abandonar una prueba que no est acabada, a no ser que se

especifique claramente que se puede hacer

10. El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo para evitar cortes


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PRCTICA 1 DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SUERO. MTODO GOD-POD Con esta prctica se pretende determinar la concentracin de glucosa en una muestra de suero, utilizando un kit comercial basado en el mtodo GOD-POD. La glucosa es el glcido principal del cuerpo y todos los otros glcidos se convierten en glucosa despus de su digestin y absorcin. Los niveles de glucosa en sangre se mantienen entre unos lmites muy estrechos y constantes gracias, fundamentalmente, a la accin de dos hormonas: insulina y glucagon. En general, dichos valores nunca deben sobrepasar los 200 mg/dl, por grande que sea la ingestin de hidratos de carbono, ni descender por debajo de 50 mg/dl en condiciones fisiolgicas. Interpretacin de los datos de laboratorio -Hiperglucemia: entre las alteraciones que cursan con hiperglucemia podemos citar: - Diabetes mellitus: sndrome caracterizado por un aumento en los niveles fisiolgicos de la glucosa y que cursa de manera caracterstica con polifagia, poliuria y polidipsia. Durante las clases tericas se explicar detalladamente las pruebas de laboratorio que llevan a su diagnstico. - Disminucin de la tolerancia a la glucosa: glucemia basal inferior a 140 mg/dl y, a las dos horas de sobrecarga oral de glucosa, valores intermedios entre los fisiolgicos y los tpicos de la diabetes. -Hipoglucemia: hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en sangre se sitan entre 40 y 45 mg/dl. La hipoglucemia puede presentarse en ayunas, o bien ser reactiva a la ingestin de alimentos o a la toma de medicamentos CUESTIONES 1. Cul es la finalidad del blanco? Cmo se ajusta el espectrofotmetro con el blanco? Ha realizado un blanco de reactivos o de suero? por qu? 2. Calcule la concentracin de glucosa en el suero indicando los clculos realizados. 3. Si la concentracin de glucosa hubiera sido superior a 500 mg/dL. Cmo habra actuado? 4. Para la determinacin ha utilizado un mtodo enzimtico. Se trata de un mtodo cintico? Justifique su respuesta


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PRCTICA 2

DETERMINACIN DE COLESTEROL TOTAL El objetivo de esta prctica es realizar la determinacin del colesterol total presente en una muestra de suero, siguiendo para ello las instrucciones de un kit comercial. El colesterol es un alcohol esteroide insaturado muy soluble en grasas pero poco hidrosoluble. El colesterol presente en el organismo tiene un doble origen: El que procede de la dieta -exgeno- se encuentra en su mayor parte en

forma libre no esterificado-. El colesterol esterificado es hidrolizado por la colesterol esterasa pancretica dando colesterol libre y cidos grasos.

El colesterol endgeno aunque puede ser potencialmente sintetizado por

todas las clulas- se forma fundamentalmente a nivel heptico e intestinal y es eliminado por el hgado con la bilis- o utilizado para la sntesis de cidos biliares.

El colesterol circula en sangre unido a las lipoprotenas: Las LDL transportan el 70% del colesterol Las HDL del 15 al 20% El resto, circula unido a las VLDL y a los quiliomicrones. El aumento de la concentracin plasmtica de colesterol, se asocia a un incremento del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, por lo que su regulacin tiene un alto inters epidemiolgico. Interpretacin de los datos de laboratorio Niveles elevados de colesterol en sangre se van a encontrar en casos de: 1. Dietas ricas en colesterol y grasas saturadas; estas ltimas pueden elevar

hasta en un 15-20% la cifra de colesterol sanguneo. 2. Hipotiroidismo, como consecuencia de la disminucin del metabolismo

lipdico 3. Diabetes mellitus: debido al incremento notable del metabolismo lipdico 4. En enfermedades de retencin renal: en estos casos se eleva tanto el

colesterol sanguneo como los triglicridos y los fosfolpidos. Se cree que es debido a la inhibicin de la lipoprotein lipasa, de manera que se elevan considerablemente las grasas sanguneas.

5. En casos de ictericia obstructiva Niveles bajos de colesterol en sangre suelen ser indicativos de hepatitis grave y cirrosis.


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CUESTIONES

1. Si tuviera que preparar un blanco de suero cmo lo hara? Razone su respuesta.

2. Por qu se incuban los tubos durante 5 min. a 37C o 10 min. a T ambiente? Por qu vara el tiempo en funcin de la temperatura?

3. Si la muestra tuviera un valor de 700 mg/dl podra aplicar el mtodo directamente?

4. Determine el valor de colesterol en la muestra problema, especificando los valores experimentales de D.O. obtenido y el clculo realizado.

5. Si el paciente cuyo suero ha analizado tuviera una concentracin de triglicridos de 200 mg/dl y un nivel de colesterol HDL de 60 mg/dl Cul sera su concentracin de colesterol LDL?


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PRACTICA 3

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS PLASMTICAS

En esta prctica se realizar la cuantificacin de las protenas presentes en una muestra de suero.

Las protenas presentes en el plasma forman parte de un sistema metablicamente "dinmico" con caractersticas y funciones muy diversas.

La suma de las concentraciones de todas y cada una de las protenas presentes en el plasma, se conoce como protenas totales y en condiciones normales oscila entre 66 y 83 g/L.

Fundamento

Existen diferentes mtodos para determinar la concentracin de protenas de una muestra. El mtodo de Bradford se basa en el cambio de color que se produce cuando el Azul Brillante de Coomasie se une a las protenas

MATERIAL

-Reactivo de Bradford -Albmina srica bovina (BSA) (1 mg/ml). -Muestras: Como es un mtodo espectrofotomtrico (Ley de Lambert-Beer), las muestras deben estar convenientemente diluidas para que sus absorbancias se encuentren dentro de los valores de la recta de calibracin. As, la muestra problema inicial (S1 ), se diluir a la mitad 1/2 para obtener otra a la que denominaremos S2. PROCEDIMIENTO

1. Prepare 8 tubos, 6 para la recta patrn (B, 1 2, 3, 4 y 5) y 2 para cada una de las muestras problema que haremos directamente en el tubo de anlisis (S1, S2) segn el protocolo esquematizado en la tabla siguiente:

Tras aadir estos reactivos habr exactamente 0.1 mI en cada tubo de anlisis.


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2. Aada 5 mI de reactivo Bradford a cada uno de los tubos. Agite sin que se forme espuma 3. Incube la mezcla durante 5 minutos. 4. Mida la absorbancia a 595 nm. Primero se mide el tubo blanco (B) que sirve para ajustar el espectrofotmetro (autocero) y a continuacin, el resto de los tubos. Con los 6 primeros valores obtenidos (tubos B, 1 2, 3, 4, 5) podremos construir, en un papel milimetrado, la recta patrn apareando los valores de absorbancia (eje Y) con los de concentracin de glucosa (eje X). Esta recta representa la relacin que existe entre absorbancia y la concentracin de protenas, y por tanto nos permitir calcular la concentracin de protenas de las muestras problemas leyendo en dicha recta los valores de absorbancia obtenidos para cada muestra problema (si entran dentro del intervalo de concentraciones comprendido por la recta patrn). As se calcula la concentracin de protena para cada uno de los tubos de anlisis. La concentracin de protenas en cada uno de los tubos de la recta patrn se calcula a partir de la concentracin de la solucin de albmina (1 mg/ml) mediante la frmula CV = CV donde C = concentracin de albmina estndar (1 mg/ml); V = volumen de albmina estndar aadido a cada tubo; C' = concentracin de albmina en ese tubo; V = volumen total en el tubo (0,1 ml en todos los tubos). El ajuste de la recta a los puntos se puede hacer grficamente o por mnimos cuadrados (opcional). En el primer tubo problema (S1) la muestra no est diludida (dilucin 1 :1 ) por lo que la concentracin de protenas ser la calculada directamente por interpolacin en la recta patrn sin necesidad de multiplicar por ningn factor de dilucin (el factor sera 1 ). En el segundo tubo problema (S2) la muestra est diluida dos veces (1/2; factor de dilucin 2) por lo que la concentracin de protenas en el suero original ser 2 veces mayor, as multiplicamos el resultado de concentracin obtenido por 2. Para calcular la concentracin de protenas en el suero original (sin diluir), como hemos realizado dos medidas a diferentes diluciones, una vez normalizadas (es decir, multiplicadas por 1 o por 2, segn el caso) podremos calcular la media aritmtica entre ellas, y esta ser el resultado del anlisis (s los resultados obtenidos entre ambas diluciones son coherentes ).

Interpretacin de los datos de laboratorio

El aumento en la cifra de protenas plasmticas totales, suele deberse a una disminucin relativa del volumen de lquido plasmtico debido a hipovolemia o a una deshidratacin (en realidad lo que vara no es la cantidad total de protenas sino la proporcin entre stas y el nivel hdrico del organismo).


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La disminucin en la cantidad de protenas totales, puede tener causas tan variadas como:

El aumento del volumen plasmtico, como consecuencia de una retencin de lquidos. La disminucin en la sntesis de albmina debido a alteracin heptica o desnutricin graves . El descenso en la produccin (hipogammaglobulinemia) o aumento de las prdidas (quemaduras intensas, sndrome nefrtico) de la fraccin de las globulinas. CUESTIONES 1. Qu es y para que sirve una recta patrn? Calcule la concentracin de

albmina de los distintos puntos de la recta patrn. 2. Qu interferencias est eliminando el blanco utilizado? Razone la

respuesta. 3. Dibuje la recta de calibracin enfrentando los valores de absorbancia (eje Y)

obtenidos para cada concentracin de albmina (eje X). Calcule la ecuacin de la recta por el mtodo de los mnimos cuadrados (opcional).

4. Calcule la concentracin de protenas de S2. 5. Calcule la concentracin de la muestra S1 utilizando el resultado de la

concentracin de protenas obtenida para S2 y el valor obtenido en el tubo S1.

6. Si suponemos que el suero del enfermo se diluy 200 veces (1/200) para obtener S1 Cul ser la concentracin de protenas del suero del enfermo?


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PRACTICA 4

ELECTROFORESIS DE PROTENAS PLASMTICAS

El objetivo de esta prctica es separar mediante electroforesis las protenas del plasma sanguneo identificando tras tincin las distintas fracciones obtenidas. Fundamento Las protenas poseen carga elctrica en funcin de sus grupos ionizables y del pH y, por tanto, son capaces de migrar al ser sometidas a un campo elctrico (Electroforesis). Normalmente se utiliza un tampn a pH > 8.0. A estos valores de pH, la mayora de las protenas estn cargadas negativamente, por lo que se desplazan hacia el polo positivo (nodo). La velocidad de desplazamiento de cada protena estar determinada por su carga y su tamao (relacin carga/masa). La electroforesis de las protenas plasmticas nos permite separar 5 fracciones con cargas negativas decrecientes, que son: Albmina (la ms negativa); 1-globulinas; 2-globuli-nas; -globulinas; (fibringeno en el caso de utilizar plasma), y -globulinas (las menos negativas). Material - Cubeta de electroforesis - Alimentador para electroforesis - Aplicador semi-micro - Tiras de acetato de celulosa - Tampn veronal sdico 0,04 M: Dietilbarbiturato sdico 8,24 g/l (preparado

comercial, pH >9) - Colorante: Negro amido, 0,5 g; Metanol, 45 ml; Ac. actico 10 ml; Agua

destilada 45 ml - Decolorante: Metanol 47,5 ml; Ac. Actico 5 ml; Agua destilada 47,5 ml - Plasma o suero sanguneo humano Procedimiento experimental - Sumerja previamente las tiras de acetato de celulosa en el tampn durante

15 min. como mnimo, y absorber el exceso de tampn de las tiras entre dos hojas de papel de filtro.

- Monte las tiras sobre el puente de la cubeta de electroforesis, previamente llena de tampn, con la cara absorbente hacia arriba.

- Con el aplicador, tome el plasma sanguneo problema y pngalo sobre la tira a un centmetro del borde del ctodo (polo negativo) de color negro. A los valores de pH determinados por el tampn, las protenas plasmticas muestran carga negativa, por lo que migrarn hacia el nodo (polo positivo)


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de color rojo. Por tanto es muy importante la colocacin correcta de las tiras en la cubeta de electroforesis.

- Conecte la fuente de alimentacin y deje correr la electroforesis durante 35 min. a 200 v. Terminada la migracin desconecte el alimentador y la cubeta.

- Coloree las tiras durante 5 minutos con el colorante negro amido. - Decolore las tiras realizando 3 4 baos en la solucin decolorante hasta

que se visualicen bien las bandas y los lquidos de lavado estn limpios. La solucin decolorante una vez utilizada se filtra con carbn activo para su reutilizacin.

Valores normales en el adulto: Rango % Rango de g/100 ml - Albmina 54-62 % 3,4 - 5,4 - 1-globulinas 2-5 % 0,2 - 0,4 - 2-globulinas 7-10 % 0,5 - 0,9 - -globulinas 8-13 % 0,6 - 1,1 - -globulinas 14-19 % 0,7 - 1,7

Cuestiones 1. Por qu se utiliza un tampn de electroforesis de pH tan alto (pH=9)?

Qu ocurrira si utilizara un tampn de pH inferior ej. pH=6? 2. Qu finalidad se persigue sumergiendo las tiras de acetato de celulosa en

el tampn 15min antes de la electroforesis? 3. Cerca de qu polo se aplican las protenas? Por qu? 4. Para que se utiliza el colorante negro amido? 5. Qu diferencia se observa al hacer el proteinograma en una muestra de

plasma en lugar de suero? Cmo cuantificaras las fracciones proteicas? 6. Cmo realizara un lipidograma?


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PRACTICA 5 ANLISIS DE ORINA MEDIANTE EL EMPLEO DE TIRAS REACTIVAS La finalidad de esta prctica es realizar el anlisis de anormales en una muestra de orina. La tira reactiva diagnstica de inmersin es una tira de plstico a la que se fija una o ms almohadillas de celulosa que est qumicamente impregnada de tampn y varios indicadores qumicos. Cuando se humedece en orina, cada almohadilla se convierte en un medio qumico en miniatura que responde a la presencia de compuestos qumicos especficos presentes en la muestra. Para obtener resultados semicuantitativos, es importante observar los tiempos que se especifican para la realizacin de cada lectura. Las zonas reactivas, una vez impregnadas de orina se comparan con las escalas colorimtricas del envase. Se debe considerar la tira reactiva como un dispositivo de seleccin primaria que junto con el examen visual, permite separar las muestras anormales de las normales. Las anomalas deben dilucidarse usando pruebas de seguimiento y confirmacin. Las tiras reactivas disponibles en el mercado tienen tests para: glucosa, bilirrubina, cuerpos cetnicos, densidad, sangre, pH, protenas, urobilingeno, nitritos y leucocitos. Composicin de las almohadillas Glucosa: 16,3% p/p glucosa oxidasa (1,3UI); 0,6% p/p peroxidasa (3300UI); 7% p/p Yoduro potsico; 60,7% p/p tampn; 15,4% p/p ingredientes no reactivos. Bilirrubina: 0,4% p/p sal de diazonio de 2,4-dicloroanilina; 37,3% p/p tampn; 62,3% p/p ingredientes no reactivos. Cetonas: 7,1% p/p nitroprusiato sdico; 92,9% p/p tampn. Densidad: 2,8% p/p azul bromotimol; 97,2% p/p. Poli(metil vinil ter cido maleico sal sdica). Sangre: 6,8% p/p diisopropilbenceno dihidroperxido; 4% p/p 3,3,5,5tetrametilbencidina; 48% p/p tampn; 41,2% p/p ingredientes no reactivos. pH: 0,2% p/p rojo metilo; 2,8% p/p azul de bromotimol; 97% p/p ingredientes no reactivos. Protenas: 0,3% p/p azul de tetrabromofenol; 97,3% p/p tampn; 2,4% p/p. Ingredientes no reactivos. Urobilingeno: 0,2% p/p p-dietilaminobenzaldehido; 99,8% p/p ingredientes no reactivos. Nitritos: 1,4% p/p p-cido arsanlico; 1,3% p/p 1,2,3,4-tetrahidrobenzoquinolin-3-ol; 10,8% p/p tampn; 86,5% p/p ingredientes no reactivos. Leucocitos: 0,4% p/p ster de pirrol aminoacdico derivatizado; 0,2% p/p sal de diazonio; 40,9% p/p tampn; 58,5% p/p ingredientes no reactivos.


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Recogida y preparacin de muestras No deben utilizarse conservantes de orina porque pueden interferir en los resultados de las cetonas, bilirrubina o urobilingeno. El crecimiento bacteriano tambin puede afectar a los resultados de glucosa, pH y sangre. Manejar siempre las muestras bajo condiciones sanitarias estrictas. Tcnica Las instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente para obtener resultados fiables.

1. Utilizar orina fresca recogida en un recipiente limpio y seco 2. Sacar una sola tira del frasco y utilizarla inmediatamente. Sumergir

brevemente la tira en la muestra y sacarla con rapidez 3. Escurrir el exceso de orina con el borde del frasco. Mantenerla en

posicin horizontal 4. Si estamos leyendo visualmente comparar los colores con la carta de

colores del frasco mantener la tira cerca de la tabla de colores y escoger cuidadosamente-. La mayor precisin se obtendr ajustndola a los tiempos de lectura correctos. Algunos colores toman mayor intensidad con el tiempo y despus decrecen, por lo cual colores que aparezcan transcurridos 2 minutos carecen de significado. Si el color de una zona reactiva no es uniforme debemos fijarnos en la zona ms oscura. Todas las zonas, excepto los leucocitos, se pueden leer entre 1 y 2 minutos como screening de positivo o negativo. Leer los test de leucocitos a los 2 minutos.

5. Si se lee instrumentalmente, seguir las instrucciones de manejo del aparato.

6. Como todos los tests de laboratorio, el diagnstico definitivo o la decisin teraputica no debe basarse en un solo resultado o test.

Instrucciones de almacenaje y cuidado Almacenar las tiras en su propio frasco. No extraer el desecante. No sacar la tira hasta el momento de su uso. No tocar las reas reactivas de la tira. Almacenar a temperaturas inferiores a 30C, pero no en refrigerador. No almacenar bajo luz directa. Informacin sobre las reas reactivas Glucosa. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Este test es especfico de glucosa; no hay otra sustancia que se conozca presente en orina que d resultados positivos. En orinas diluidas o con glucosa en pequea cantidad, concentraciones de cido ascrbico superiores a 2,2 mmol/l pueden dar falsos positivos. Sensibilidad del test: 4-7 mmol/l. Bilirrubina. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Normalmente la bilirrubina no es detectable en orina incluso por los mtodos ms sensibles. Incluso resultados traza de bilirrubina son suficientes para iniciar una investigacin. Colores atpicos (no comparables al bloque positivo o negativo) indican que se deben continuar la investigaciones en esta muestra. Metabolitos de


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drogas que dan color a pH bajo pueden causar falsos positivos. Sensibilidad del test: 7-14 mol/l. Cetonas. Tiempo de lectura visual: 40 seg. El test reacciona con el cido acetoactico en orina. No reacciona con acetona ni con cido betahidroxibutrico. Ciertas orinas de pH bajo y/o densidad alta pueden dar falsos positivos. Las muestras de orina no patolgicas suelen dar negativo con este reactivo. Niveles detectables de acetona puden aparecer en caso de dieta, embarazo o ejercicio extremo frecuente. En cetoacidosis o ayuno prolongado junto con otras alteraciones del metabolismo lipdico o de carbohidratos, las cetonas pueden aparecer en grandes cantidades en la orina antes de que se manifiesten en el suero. Sensibilidad del test: 0,5-1 mmol/l. Densidad. Tiempo de lectura visual: 45 seg. Este test permite la determinacin de densidades entre 1-1,03. No se afecta por constituyentes no inicos como la glucosa o colorantes. Orinas alcalinas altamente tamponadas pueden causar lecturas relativamente bajas en comparacin con otros mtodos. Pueden salir resultados falsamente altos en presencia de concentraciones moderadas de protenas (1-7,5 g). Sangre. Tiempo de lectura visual: 60 seg. La interpretacin del resultado trazas puede variar ampliamente entre distintos pacientes y se requiere valorar cada paciente individualmente. El desarrollo de unos puntos verdes (eritrocitos intactos) o de color verde difuminado (hemoglobina/mioglobina libre) en el rea reactiva de la tira indican la necesidad de una investigacin ms profunda. La sangre se suele encontrar en los periodos menstruales de la mujer. Este test es muy sensible a la hemoglobina libre y algo menos a los eritrocitos intactos y as se complementa con la investigacin microscpica. La sensibilidad de este test puede disminuir algo en las orinas de alta densidad. Este test es igualmente sensible a hemoglobina como a mioglobina. Alta densidad o proteinuria pueden disminuir la sensibilidad del test. Falsos positivos pueden aparecer por ciertos contaminantes oxidantes o por la peroxidasa microbiana asociada a una infeccin. Sensibilidad del test: 150-620 g/l (equivale aproximadamente a 5-20 clulas intactas por microlitro). pH. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El rea de pH mide de una en una unidad en el rango de 5 a 8,5 en lectura visual y de 5 a 9 en lectura instrumental. Si no sigue el procedimiento correcto y permanece un exceso de orina en la tira, se puede producir un fenmeno conocido como runover, en el cual el tampn del reactivo de protena contamina la prueba de pH dando un resultado anormalmente bajo. Protenas. Tiempo de lectura visual: 60 seg. (o inmediatamente, o hasta 2 minutos despus de la inmersin de la tira). El rea reactiva de la tira es ms sensible a las albminas que a las globulinas, hemoglobinas, protenas de Vence-Jones y mucoprotenas. Un resultado negativo no puede descartar por lo tanto la presencia de estas ltimas. Generalmente no se suele detectar protenas por este mtodo en orina a pesar de que normalmente se excreta una pequea cantidad. Cualquier color por encima de trazas es indicador de proteinuria. Para orinas de alta densidad suele aparecer el resultado de trazas en orinas normales. Se precisa una evaluacin clnica para valorar el resultado de trazas. Se pueden encontrar falsos positivos en orinas alcalinas o altamente tamponadas y por contaminacin con compuestos cuaternarios amoniacales y detergentes. Sensibilidad del test: 0,15-0,30 g/l. Urobilingeno. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El rea reactiva puede detectar concentraciones tan bajas como 3 mol/l (aproximadamente 0,2 unidades Ehrlich). El rango normal es de 3-16mol/l. Un resultado de 33mol/l significa el trnsito entre normal y anormal, y el paciente o la orina deben ser examinados con ms cuidado. El rea reactiva puede tener interferencias con sustancias que interfieran con la reaccin de Ehrlich. Reacciones de color atpicas se pueden presentar en caso de presencia de cido p-aminobenzoico o formalinas. Sustancias altamente coloreadas como riboflavinas pueden enmascarar el desarrollo del color. Con este test no se puede determinar la ausencia de urobilingeno.


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Nitritos. Tiempo de lectura visual: 60 seg. Este test depende de la conversin de los nitratos en nitritos a travs de las bacterias presentes en la orina, generalmente Gram negativas. Este test es especfico para nitritos y no reacciona con otras sustancias presentes en la orina. Puntos o bordes rosados no deben confundirse con un resultado positivo. Cualquier desarrollo de color rosa suave uniforme debe interpretarse como un resultado positivo e indicador de al menos 10 microrganismos/ml, pero el desarrollo del color no es proporcional al nmero de microorganismos presentes. Un resultado negativo no puede probar la ausencia de microorganismos. Pueden aparecer falsos negativos debido a la presencia de microorganismos que no contengan la reductasa para el paso de nitratos a nitritos o cuando la orina no ha pasado tiempo suficiente en la vejiga (4 horas o ms) para el proceso de reduccin o cuando no haya habido ingesta de nitratos en la dieta. La sensibilidad est reducida en las orinas de alta densidad. Sensibilidad del test: 13-22 mol/l. Leucocitos. Tiempo de lectura visual: 2 min. Las muestras de orina normales deberan dar en general resultados negativos. Resultados positivos tienen significado clnico. Los resultados de traza deben ser interpretados cuidadosamente aunque, si son repetitivos, se deben considerar positivos. Falsos positivos pueden deberse a descargas vaginales o a drogas. Concentraciones de glucosa elevadas (160mmol/l), alta densidad o la tetraciclina pueden disminuir la sensibilidad. Cualquier sustancia que de color a la orina puede enmascarar la interpretacin del test. Sensibilidad del test: 5-15 clulas/c.a.p. Cuestiones 1. Qu es el anlisis de anormales? 2. Describa el procedimiento utilizado para su realizacin. Ha tenido alguna

precaucin con la posicin de la tira? 3. Por qu deben mantenerse las tiras dentro del frasco evitando al mximo

mantenerlo abierto? 4. Describa el resultado obtenido en su muestra de orina. Se trata de un

anlisis cuantitativo? Justifique su respuesta


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PRCTICA 6 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD CATALTICA DEL ENZIMA FOSFATASA ALCALINA EN SUERO La actividad enzimtica puede determinarse mediante mtodos cinticos o mtodos a punto final. Con esta prctica se pretende determinar de la actividad de la enzima fosfatasa alcalina, utilizando para ello un kit comercial basado en un mtodo cintico. Las fosfatasas son enzimas que catalizan la descomposicin de los steres de fosfato con poca especicidad para un substrato determinado. Existen dos tipos de fosfatasas: la fosfatasa alcalina, que tienen un pH de actividad ptima de 9 y la fosfatasa cida, que tienen un pH de actividad ptima de 5. Pueden separarse, alterando el pH al cual se realiza la prueba, siendo los mtodos de determinacin en esencia similares para ambas. Interpretacin de los datos de laboratorio La determinacin de fosfatasa alcalina se utiliza principalmente para el diagnstico de las ictericias obstructivas post-hepticas. Cuando la obstruccin es completa los valores aumentan de 3 a 8 veces sobre los valores normales en suero. Se ha observado que, cuando la enfermedad est producida por un carcinoma pancretico, los niveles de fosfatasa son ms elevados que en procesos benignos. Igualmente, se encuentran aumentados en casos de hepatitis vrica, ictericia hepatocelular txica, ictericia hepatocanalicular, etc. Se producen elevaciones de esta enzima en procesos hepticos no ictricos, como en la enfermedad hepatobiliar, carcinoma heptico y abcesos hepticos. Otras enfermedades con aumento de los niveles de fosfatasa alcalina son las enfermedades seas, caracterizadas por un aumento de la actividad osteoblstica, como la enfermedad de Paget, raquitismo, fracturas, tumores seos, hiperparatiroidismo... Cifras fisiolgicamente elevadas pueden producirse en mujeres embarazadas y en nios en crecimiento. La determinacin de fosfatasa cida se utiliza para el diagnstico de los pacientes con carcinoma prosttico, observndose niveles elevados. CUESTIONES 1. En la derminacin de la actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina se ha utilizado un mtodo cintico. Comente sus ventajas 2. Ha preparado algn tubo blanco? Por qu? 3. Dibuje una grfica en la que enfrente la D.O. obtenida en cada minuto? Calcule el E/min medio. 4. Determine la actividad enzimtica explicando el significado del factor 3300 empleado en el clculo. 5. Si la actividad obtenida fuera demasiado alta Cmo afectara a la forma de la grfica? Cmo actuara para obtener un resultado fiable?


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PRCTICA 7 TINCIN DIFERENCIAL DE EXTENSIONES HEMATOLGICAS El objetivo de esta prctica es la realizacin de una extensin y tincin sangunea, as como la posterior identificacin al microscopio cada una de las clulas observadas. Los mtodos que se pueden seguir utilizar para hacer un anlisis de la morfologa de las clulas de la sangre son varios. Se puede hacer un examen en fresco sin coloracin, una coloracin vital u observar las clulas fijadas y teidas. El examen de la sangre teida es lo ms habitual. Para ello se hace una extensin de sangre en un porta, se fija y se tie observando por ltimo al microscopio. La extensin de sangre tambin se denomina frotis. Principalmente se utiliza para hacer recuento de los distintos tipos de leucocitos. Puede obtenerse mucha informacin del estudio de una extensin de sangre. Nos puede servir tanto para realizar un diagnstico como para seguir el curso de una enfermedad o indicarnos los efectos nocivos de algn tratamiento. Para que los resultados sean fiables es fundamental que la extensin est bien hecha. Preparacin de la extensin Son varios los mtodos a seguir: a) Mtodo del cubreobjetos Tomar un cubre y depositar en su centro una gota pequea de sangre Colocarlo con la gota de sangre mirando hacia abajo Aproximar desde abajo otro cubre de manera que las esquinas de los

mismos queden alternadas. La sangre entonces se extiende entre los dos cubres de forma rpida y uniforme.

Una vez extendida la sangre se separan los dos cubreobjetos mediante deslizamiento de uno sobre otro. El movimiento ha de ser firme y rpido, no levantndolos ni apretando uno sobre otro.

Colocarlos sobre papel de filtro y dejar secar al aire. La parte donde no est la sangre ser la que est en contacto con el papel.

b) Mtodo del portaobjetos Es el mtodo ms utilizado en la prctica, ya que es mucho ms cmodo de realizar.


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Se utilizan dos portas, en uno de ellos se pone la gota de sangre y con el otro se realiza la extensin. Los pasos a seguir son: Colocar una gota de sangre pequea aproximadamente a 1 cm del borde

del portaobjetos. Este puede estar sujeto con la mano izquierda por el extremo opuesto a donde est la gota, o bien puede estar colocado sobre una mesa. Es preferible lo segundo, ya que as tiene un lugar de apoyo.

Coger con la mano derecha (con los dedos ndice y pulgar) el otro portaobjetos y apoyarlo sobre el que tiene la gota de sangre por delante de ella. El ngulo que forman ambos portaobjetos ha de ser de 30 a 40.

Hacer retroceder el portaobjetos hacia el extremo donde no estaba la gota de manera rpida y uniforme hasta que la sangre quede totalmente extendida.

Observaciones En una extensin de sangre realizada correctamente se observar una parte ms gruesa en donde estaba la gota de sangre, despus una uniforme y al final una zona de menor espesor deshilachada. Cada una de esas partes corresponde a lo que se denomina cabeza, cuerpo y cola de la extensin. La extensin de sangre no ha de llegar a los bordes del portaobjetos ni tener estras o vacuolas. El espesor de la extensin depende del ngulo entre los dos portaobjetos, tamao de la gota, rapidez y presin con que se realiza la extensin. A mayor rapidez se consigue un mayor espesor. A mayor ngulo tambin el espesor es mayor. Si el espesor es muy grueso las clulas aparecen sobrepuestas, con lo que los leucocitos no se identifican con facilidad. Si es demasiado fino las clulas estn muy separadas y hay que recorrer muchos campos para hacer el recuento.


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Una buena preparacin para contar leucocitos es aquella en la que los glbulos rojos aparecen algo amontonados, ya que as los leucocitos se encuentran tambin ms juntos (pero no superpuestos) y su recuento se hace ms rpido. A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuenta que la distribucin de las clulas no es uniforme. Las clulas grandes (monocitos y neutrfilos) se sitan en los bordes, mientras que las clulas pequeas (linfocitos) se sitan en el centro de la extensin. Por esta razn no se cuenta slo en el centro o en los bordes, sino que se siguen unas trayectorias a modo de grecas.

CUESTIONES 1. Cul es la finalidad del fijador? 2. Comente los colorantes utilizados 3. Haga un dibujo de las clulas observadas.


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Basfilo

CClluullaass ssaanngguunneeaass

Plaquetas, Linfocito

Monocito

Neutrfilo

Eosinfilo

Neutrfilos: 3.500-7.000/mm3, 60-70% Eosinfilos: 150-400/ mm3, 2-4% Basfilos: 50-100/ mm3, < 1% Linfocitos: 1.500-2.500/ mm3, 20-25% Monocitos: 200-800/ mm3, 3-8% Eritrocitos: 4,5-5 millones/ mm3 Plaquetas: 200.000-300.000/ mm3

Linfocito


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APENDICE 1. PREPARACIN DE DILUCIONES En el laboratorio, en muchas ocasiones es necesario diluir las muestras o los reactivos para obtener concentraciones adecuadas a las tcnicas. La perfecta preparacin de estas diluciones es imprescindible para la obtencin de unos resultados correctos.

La dilucin realizada se expresa generalmente como una unidad de la solucin inicial por unidades de la solucin final. Por ejemplo, una dilucin al 1/10 requiere que una unidad de la solucin inicial sea o haya sido diluida hasta un volumen final de 10 unidades (un volumen de 1 solucin inicial ms 9 volmenes de disolvente). Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentracin como cantidad de soluto en un volumen fijo de disolucin, como es el caso de la Normalidad, Molaridad o % p/v, se denominan escalas volumtricas de concentracin. Cuando la concentracin se expresa sobre una de estas escalas volumtricas, la cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solucin es igual al producto del volumen por la concentracin:

Cantidad de soluto = volumenconcentracin

Si diluimos una solucin, el volumen de la misma aumentar a la par que disminuye su concentracin, mientras que la cantidad de soluto presente permanecer constante. Por ello, dos soluciones con distintas concentraciones, pero que contienen las mismas cantidades de soluto, estn relacionadas de la siguiente forma:

V1 C1 =V2 C2

Aplicaciones de esta frmula:

a) Si se conocen tres de los trminos de esta ecuacin, se puede calcular el cuarto. Las cantidades a los dos lados de la ecuacin deben expresarse en las mismas unidades. Ejemplo 1 Preparar 50 mI de HNO3 0,1 M a partir de una solucin concentrada de HNO3 1 M. Aplicando la frmula V1 C1 =V2 C2 donde:

C1 = 1 mol/l C2 = 0, 1 mol/l V2 = 50 m I V1 = desconocido


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Sustituyendo:

V 1 1 mol/l = 50 ml 0, 1 mol/l Despejando V1= 5 ml Para preparar 50 m I de HNO3 0, 1 M, mediremos 5 m I de HNO3 1 M y completaremos hasta 50 m I con agua destilada. b) Despejando C2 de la ecuacin [1] obtenemos: C2 = (V1 C1) / V2 = C1 V1 / V2

El cociente de volmenes se denomina cociente de dilucin y se representa 1/d. Por tanto:

C2 = C1 1/d

Es decir, para calcular la concentracin de la nueva solucin diluida, hay que multiplicar la concentracin inicial por el cociente de dilucin.

Ejemplo Calcular la concentracin de una disolucin obtenida a partir de una inicial al 10 por 100 que se ha diluido al 1/10.

C 2 = C1 1/d

C2 = 10 .1/10 = 1 por 100

c) Si se realizan sucesivas diluciones, para conocer la concentracin de la dilucin final, basta multiplicar la concentracin inicial por todos los cocientes de dilucin.

C2 = C1 .1/d [1] .1/d [2]...

Ejemplo: Se ha partido de una solucin al 10 por 100 p/v; sta se ha diluido inicialmente al 1/10, y la solucin obtenida al 1/2. Calcular la concentracin de la solucin final.

C2 = C1 .1/d (1) .1/d (2) ... C2 = 10 .1/10 .1/2 = 0,5 por 100

d) Forma prctica de realizar una dilucin. 1 /d significa 1 unidad de la solucin inicial + (d -1) unidades de disolvente.

Ejemplo: Diluir una solucin al 1/5. Para hacer esta dilucin, por cada unidad que tomemos de la solucin inicial tomaremos 5 -1 = 4 unidades de disolvente. Ej. 1 ml de solucin inicial y 4 ml de disolvente.

Ejemplo:


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Diluir con agua destilada 10 mI de una solucin al 1/10. Para hacer esta dilucin, por cada unidad que tomemos de la solucin inicial tomaremos 10 -1 = 9 unidades de disolvente. Como tenemos 10 unidades de solucin inicial, tendremos que tomar 9 x 10 = 90 unidades de agua destilada. En resumen, para hacer esta dilucin cogeremos los 10 mI de solucin inicial y los completaremos con 90 mI de agua. e) En el laboratorio de Anlisis Clnicos, principalmente en Inmunologa, es frecuente la utilizacin de diluciones seriadas, que se llaman as porque despus de la primera son todas iguales. Ejemplo : Diluir un suero al 1/2 (1:2) por adicin de 1 mililitro de suero a 1 mililitro de solucin salina. Tubo (1). A partir del tubo (1) preparamos cuatro tubos (tubos 2, 3, 4, 5) que contienen cada uno 1 mililitro de solucin salina como diluyente. Realizamos la dilucin seriada por transferencia de 1 mililitro del tubo (1) al tubo (2), mezclamos y transferimos 1 mililitro del tubo (2) al tubo (3), y as sucesivamente hasta el tubo (5). La concentracin del suero decrece segn un factor 2 en cada dilucin: tubo (1) 1/2; tubo (2) 1/4; tubo (3) 1/8; tubo (4) 1/16; tubo (5) 1/32.


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2. CROMATOGRAFA

La cromatografa agrupa un importante grupo de tcnicas que permiten separar componentes de mezclas complejas.

En todas las separaciones cromatogrficas la muestra que se desea separar se disuelve en la "fase mvil" que normalmente est formada por un gas o un lquido. La fase mvil se hace pasar a travs de una "una fase estacionaria", la cual se mantiene fija en una columna o en una superficie slida que acta como soporte.

NOTA: Fase mvil: en la cual estn los solutos que se van a separar Fase estacionaria: lecho a travs del que fluye la fase mvil

Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil. Los componentes con baja afinidad por la fase estacionaria se desplazan con ms rapidez al ser arrastrados por la fase mvil.

Una vez que todos los componentes han atravesado la fase estacionaria, salen separados unos de otros lo que permite utilizar las fracciones en procesos de identificacin o cuantificacin .

FASES DEL PROCESO CROMATOGRFICO

1. Preparacin de la fase estacionaria 2. Introduccin de la muestra vehiculada por una fase mvil 3. Paso a travs de una fase estacionaria donde se producen las interacciones que ms tarde llevarn a su separacin 4. Elucin (segn en que tcnica) 5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma

MECANISMOS IMPLICADOS 1. Adsorcin 2. Reparto 3. Intercambio inico 4. Exclusin molecular 5. Afinidad

Cromatografa de adsorcin: poco usada en clnica

Cromatografia de reparto: basada en las diferencias de solubilidad de las distintos analitos en dos fases inmiscibles Ejemplo: cromatografa en capa fina (ver figura 1):

sobre un cristal u otra superficie se deposita una suspensin uniforme de partculas (ej gel de slice) que ms tarde se seca y activa. En dicha placa se aplica la muestra y se deja secar.


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Se introduce la placa en una cmara en cuyo fondo hay un disolvente que va subiendo por capilaridad y arrastrar a los componentes de la mezcla en funcin de la solubilidad de los mismos en la fase mvil.

Se deja hasta que el frente llegue al final Los resultados se visualizan por ejemplo por tincin con colorantes.

Aparecern unas manchas que se pueden identificar mediante el uso de patrones o cuantificar mediante densitometra o raspado de las manchas, disolucin y determinacin espectrofotomtrica.

Cromatografia de intercambio inico: basada en un mecanismo electrosttico por atraccin entre iones de distinta carga. En el laboratorio clnico se utiliza en analizadores de aminocidos, separacin de Hb, isoenzimas y esteroides (Ver figura 2)

Cromatografia de exclusin molecular: basadas en la diferencia de tamao de las distintas sustancias a separar. En clnica se utiliza para purificaciones ej de hormonas (Ver figura 2)

Cromatografia de afinidad: basada en mecanismos que implican interacciones especficas entre dos molculas como uniones enzima-sustrato, hormona-receptor, antgeno-anticuerpo... (Ver figura 2)

NOTA: HPLC cromatografa lquida de alta presin (resolucin): es un sistema de cromatografa en columna (la fase estacionaria se deposita en una columna) con un sistema inyector de la muestra y un impulsor de la fase mvil que acelera el proceso

Figura 1


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Figura 2

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