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PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EN CÉLULAS EUCARIOTAS

Laboratorio de Fisiología y Genética de Bacterias Lácticas

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN CÉLULAS EUCARIOTAS

• Problemas que suelen aparecer cuando proteínas eucarióticas son expresadas en células procariotas• inestables• sin actividad biológica• contaminantes procarióticos

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EUCARIOTAS

• Para eliminar estos problemas se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas

• Necesidad de que tengan idénticas propiedades a la proteína natural: bioquímicas, biofísicas y funcionales

• Especialmente importantes para proteínas terapéuticas

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EUCARIOTAS

• Cual es la diferencia?• Modificaciones post-traduccionales de la mayoría de las proteínas eucariotas no

pueden ser llevadas a cabo en células procariotas

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES

• Formación de uniones disulfuro correctas• Clivaje proteolítico del precursor inactivo

• Insulina• Tripsinógeno

• Glicosilación, agregado de residuos de azúcar• Modificación de aminoácidos:

• Fosforilación• Acetilación• Acilación• γ-carboxilación• Agregado de grupos sulfato• Agregado de ácidos grasos

• Miristoilación• Palmitoilación

VENTAJAS DE PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES A GRAN ESCALA EN

LEVADURAS

• utilización de cepas modificadas en su pared celular que permiten una fácil y eficiente liberación del producto intracelular

• se puede acoplar a procedimientos de purificación en un solo paso• las levaduras son sistemas idóneos para mimetizar funcionalmente a

las células humanas

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN LEVADURAS:VENTAJAS

• Organismo unicellular• Crecimiento rápido• Bien caracterizadas genética y fisiológicamente• Promotores fuertes disponibles• Eucariotas, ocurren modificaciones post- traduccionales• Capaces de secretar algunas proteínas• No patógeno

SACCHAROMYCES CEREVISIAE S288C

• Primer genoma eucariota secuenciado (600 laboratorios) en 1997• Schizosaccharomyces pombe, 2002

• Posee 16 cromosomas• 12.01 millones de pb, 6275 genes• ¾ de los ORFs identificados• DNA nuclear haploide solo 3,5 veces el de E. coli

VENTAJAS DEL USO DE LEVADURAS

• Conservación de procesos celulares respecto a otros eucariotas (Transcripción, traducción splicing, modif PT, etc.)

• Organismo GRAS• Cultivo simple, económico y rápido (90 min td)• Contiene organelas como otros eucariotas• Modifica mRNA similar a otros eucariotas

MEDIOS PARA LEVADURAS

• Pueden ser crecidas en medios líquidos o sólidos• Crecen en medio mínimo con glucosa, nitrógeno, fosforo y

trazas de metales• Fuentes alternativas de carbono: rafinosa, maltosa, fructosa,

galactosa

• Galactosa se utiliza para inducir la transcripción de secuencias fusionadas al promotor Gal

SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN EUCARIOTAS

• Los vectores de clonado pueden ser:• Plásmidos diseñados para mantenerse en el huésped eucariota• Virus específicos• Cromosomas artificiales (YAC)

• Deben tener:• Un promotor eucariota• Señales transcripcionales y traduccionales• Secuencia que permita la poliAdenilación del mRNA• Marcador de selección eucariotaPara facilitar el clonado:• Origen de replicación procariota• Marcador de selección procariota

La era de la genetica molecular en levaduras comenzó en 1978, cuando S. cerevisiae fue transformada con DNA heterólogo.

Hay muchos protocolos de transformación pero son como mínimo tres órdenes de magnitud menos eficientes que los de E. coli.

El clonado y preparación de plásmidos de levaduras es muy ineficiente

pUC182686 bp

APr

ALPHAP(BLA)

P(LAC)ORI

Ava I (435)

BamH I (430)

EcoR I (451)

Hind III (400)

Pst I (416)

Sma I (437)Xma I (435)

Apa LI (178)

Apa LI (1121)

Apa LI (2367)

CLONADO EN LEVADURAS

Entonces para el clonado en levadura se utiliza E. coli como sistema de produccion:

Los plásmidos se construyen in vitro

Los plásmidos son transformados en E. coli y se confirma la construcción

Se producen los plasmidos en bacteria....

....y luego se transforman en levadura

Se trabaja con vectores shuttle levadura - E. coli

Por otro lado, las levaduras tienen un sistema muy eficiente de recombinacion que se utiliza para el clonado

MARCADORES DE SELECCIÓN EN LEVADURA

TRPl codifica la N-(5 'fosforri bosil) antranilatoisomerasa (síntesis de triptofano y metabolismo

de la glutamina)

URA3 codifica Orotidine - 5 '- fosfato descarboxilasa(proteína de 267 aminoácidos que participa en

la biosíntesis de uracilo)

LEU2 codifica la beta isopropil malato deshidrogenasa (cataliza la tercera etapa en

la biosíntesis de leucina)

LVS2 codifica para una alfa-aminoadipato reductasa (paso esencial en la biosíntesis de

lisina)

HIS3 codifica la imidazol glicerolfosfato deshidratasa (involucrada en la síntesis de histidina)

• Complementación de auxotrofías

VECTORES SHUTTLE LEVADURA-E. COLI

• Plásmidos integrativos (YIp) consisten de:

• La estrructura de plasmidos de E. coli vectores como pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

• Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2

• Pero carecen de origen de replicación para levaduras

• Por lo tanto, se propagan solo por integración en el genoma

YIp55541bp

URA3

PMB1

Ava I (2541)

BamH I (379)

Cla I (28)EcoR I (2)

Hind III (33)

Nco I (1867)

Sma I (2543)Xma I (2541)

Pst I (1644)

Pst I (4795)

Apa LI (3473)

Apa LI (3971)

Apa LI (5217)

Amp-resistanceTet-resistance

YIp5: pBR322 + URA3 gene

Los plásmidos replicativos episomales (YEp) consisten de: La estrructura de plasmidos de E. coli vectores como

pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT

Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2

Y poseen el origen de replicación del plásmido 2micron de levaduras

Entonces, se propagan relativamente estables a un alto número de copias, gralmente 20-50 por célula

YEp24: pBR322 + URA3 gene + 2micron origin

YEp247769bp

URA3

PMB1

2micron ORI

BamH I (3785)

ClaI (2268)

NcoI (2705)

SmaI (3381)

XmaI (3379)

EcoR I (2)

EcoR I (2242)

ApaLI (7445)

AvaI (1391)

AvaI (3379)

AvaI (4835)

Hind III (106)

Hind III (2273)

Hind III (3439)

PstI (2001)

PstI (2482)

PstI (7023)Amp-resistance

Tet-resistance

VECTOR SHUTTLE E. COLI - LEVADURA

Los plásmidos replicativos centroméricos (YCp) consisten de: La estrructura de plásmidos de E. coli vectores como pBR322, pUC19,

pBLUESCRIPT

Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2

Y poseen un origen de replicación cromosomal para levaduras (ARS, for autonomously replicating sequence)

Poseen un centrómero CEN de un cromosoma de levadura

Se propagan de forma estable a un bajo número de copias, por lo general uno por célula.

Amp-resistance

Tet-resistance

YCp507950bp URA3

POLY

CEN4

ARS1

POLY

PMB1

BamH I (379)

ClaI (28)EcoR I (2)

Hind III (33)

NcoI (1867)

SmaI (2543)

XmaI (2541)AvaI (2541)

AvaI (4703)

PstI (1644)

PstI (7204)

ApaLI (7626)

YCp50: pBR322 + URA3 gene, + CEN4 + ARS1

VECTOR SHUTTLE E. COLI - LEVADURA

PROMOTORES DE LEVADURAS

La mayoría de vectores de expresión actuales tienen promotoresinducibles, como los de shock térmico, o el GAL 1 y el GAL10 que seinducen 1000 veces en presencia de galactosa.

MÉTODOS ARTIFICIALES PARA INTRODUCIR ADN EXÓGENO EN LEVADURAS:

• Electroporación• Obtención de protoplastos en medio hipertónico y

mezclándolos con el ADN en presencia de una sustancia fusogénica como el polietilenglicol (PEG)

• Tratamiento de células completas con sales de litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con choque térmico para estimular la transformación

SISTEMAS DE EXPRESIÓN ENLEVADURAS-DESVENTAJAS

• Inestabilidad de plásmidos en gran escala• Vectores episomales (integración en el cromosoma)

• Superglicosilación de glicoproteínas• 100 o más residuos manosa versus 8-13• puede alterar la actividad de la proteína

• Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular)• se usan señales peptídicas

SOLUCIONES A LOS PROBLEMAS EN SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN LEVADURAS

• Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación igual a humanos• Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)

• Deleción de genes de glicosilación de levaduras

• Agregado de genes de glicosilación de humanos

• Usar otro tipo de levaduras• Pichia pastoris• Hansenula polymorpha• No solo Saccharomyces cerevisiae

• Usar otros eucariotas• Células de insectos• Cultivos de células de mamíferos

SOLUCIONES A LOS PROBLEMAS EN SISTEMAS DE EXPRESIÓN EN LEVADURAS

PICHIA PASTORIS EXPRESSION SYSTEM: VENTAJAS

• Puede utilizar metanol como fuente de carbono en ausencia de glucosa

• Utiliza el promotor AOX1 (alcohol oxidasa)• Las proteínas producidas suelen ser plegadas correctamente y

secretadas en el medio.• Bastante fáciles de crecer en un frasco con agitación y manipuladas

genéticamente• Son GRAS• Capaz de expresar un alto nivel de proteínas heterólogas• La existencia de una señal de secreción para una fácil purificación

del sobrenadante.

VENTAJAS DE PICHIA PASTORIS SOBRE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

• El gen de alcohol oxidasa (AOX1) es inducible por metanol• El metanol es la fuente de carbono e inductor• AOX1 : gen altamente regulado que se reprime en ausencia de metanol• Evita los efectos tóxicos de la expresión de proteínas heterólogas hasta que la expresión es inducida por el metanol.• Pichia puede crecer hasta densidades mayores que S. cerevisiae (150 g / litro)• Mayor rendimiento reportado en Pichia (12 g/L para el fragmento de la toxina tetánica C)

• Puede utilizar también promotor GAP (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), un promotor constitutivo con crecimiento en glucosa, glicerol o metanol.

• Otros promotores: AOX2, FLD (formaldehído deshidrogenasa), ICL 1 (Isocitrato liasa)

• Posibilidad de utilizar métodos estándar de S. cerevisiae para su manipulación genética.

OTRAS VENTAJAS

• Metabolismo preferentemente respiratorio, lo que permite grandes densidades celulares

• Mejores modificaciones postraduccionales que S. cerevisiae: procesamiento proteolítico, glicosilación y formación de puentes disulfuro

• Grandes rendimientos de proteína (mayor que baculovirus y mamífero)• Altos niveles de secreción de proteína heteróloga casi sin secreción de

proteínas nativas• Fácilmente escalable en industria y mas barato y rápido que los sistemas

de eucariotas superiores.

MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES:S. CEREVISIAE VS. PICHIA

• Pichia no hiperglicosila• Polisacáridos tipo manosa• S. cerevisiae agrega 50-150 residuos de manosa y Pichia agrega 8- 14

residuos de manosa (+ cortos que S. cerevisiae)• Pichia hace poca O-glicosilación• S. cerevisiae termina en alfa-1,3 glucanos (alta actividad antigénica)• Pichia no termina en alfa-1,3,y por ello, poseen mayor similitud con

proteínas humanas

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNASRECOMBINANTES EN PICHIA PASTORIS

• Quimosina recombinante: clonado del gen de la quimosinabovina en Pichia. Se usa en la coagulación de la caseína, en la obtención de quesos.

• Hormona de crecimiento humana (E. coli y levaduras)• Vacuna contra la Hepatitis

LIMITACIONES DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN EN PICHIA PASTORIS

• El metanol que se necesita para la inducción implica riesgo por su toxicidad y puede no ser adecuado para producir proteínas alimentarias. Se necesitan promotores fuertes no inducibles por metanol• Promotor del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP). Alto nivel

constitutivo de expresión en glucosa o glicerol. Desventaja: constitutivo.• Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codifica para la glutatión deshidrogenasa

dependiente de formaldehído. Se puede inducir por metanol o metilamina (una fuente inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles inducidos de expresión con este promotor son parecidos a los del gen AOX1 en metanol.

• Se necesitan promotores de expresión moderada:• El gen PEX8, que codifica una proteína de biogénesis del peroxisoma. Bajo

nivel de expresión con glucosa, y se induce moderadamente (unas 10 veces) cuando las células se pasan a metanol.

• El gen YPT1: confiere expresión baja pero constitutiva en glucosa, metanol o manitol.

• Carencia de mas genes marcadores para seleccionar los recombinantes.• Hasta hace poco, solo se disponía de HIS4, ARG4 y Sh ble (resistencia a

zeocina). Ahora hay otros marcadores: ADE1, URA3.

VENTAJAS PRINCIPALES DEL USO DE LEVADURAS

• Conservación de procesos celulares respecto a otros eucariotas (Transcripción, traducción splicing, modif PT, etc.)

• Organismo GRAS• Cultivo simple, económico y rápido (90 min td)• Contiene organelas como otros eucariotas• Capaz de secretar proteínas