PRODUCCIÓN DE BIOMASA EN CULTIVO CONTINUO

El cultivo continuo simple etapa pertenece al grupo denominado Sistemas Fermentativos Abiertos. En este sistema hay una entrada y salida de materiales:

suministro continuo de nutrientes, y salida continua de biomasa, sustrato residual y producto.

Operativamente el flujo de entrada es igual al flujo de salida por lo que el volumen de operación del biorreactor permanece constante durante todo el cultivo.

Fue en la década de los sesentas cuando se iniciaron los primeros estudios experimentales y teóricos acerca del cultivo continuo. En estos estudios se propuso la Teoría del Quimiostato, la cual a grandes rasgos, establece que al trabajar un volumen constante en cultivo continuo, y después de un determinado tiempo (el necesario para realizar dos o tres recambios del volumen de trabajo).

En un quimiostato (biorreactor de laboratorio operando en continuo) una vez que se ha alcanzado el estado de equilibrio, se crean ambientes constantes que permiten mantener indefinidamente un determinado estado fisiológico del microorganismo.

Así, uno de los principales usos del quimiostato es el de la caracterización cinética de la producción de metabolitos empleando un determinado microorganismo, en un determinado medio de cultivo y en determinadas condiciones de cultivo.

Con todo lo anterior, en un cultivo continuo puede controlarse y mantenerse aquella velocidad específica de crecimiento donde el microorganismo produzca la mayor cantidad de aquel metabolito que se desea obtener.

OBJETIVO

El alumno determinará los parámetros cinéticos de Candida utilis creciendo en condiciones óptimas en un cultivo continuo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Equipo 1. Autoclave (15 litros de capacidad). 2. Baño metabólico de Temperatura controlada. 3. Fermentador con panel de control (2 ó 6 litros). 4. Electrodo de pH esterilizable. 5. Electrodo de oxígeno disuelto. 6. 3 Bombas peristálticas (0 a 2 L/h). 7. 2 Placas de calentamiento y agitación. 8. Espectrofotómetro (intervalo: 200 a 700 nm). 9. Centrífuga clínica (0 a 5000 rpm). 10. Balanza analítica (0 a 200 g de capac.). 11. Estufa con vacío. 12. Equipo de filtración con vacío.

Microorganismo utilizado: Candida utilis.

La cepa empleada se conserva en tubos en medio inclinado de PDA (papa-dextrosaagar) a una temperatura de 4°C.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

MÉTODOS ANALÍTICOS

Determinación de la concentración celular Procedimiento: A las membranas puestas

previamente a peso constante y colocadas sobre el dispositivo de filtración se les adiciona 5mL de suspensión celular y se filtra al vacío. Se separa el filtrado, y el paquete celular se lava con 5mL de agua destilada y se filtra nuevamente (este segundo filtrado no debe mezclarse con el primero). El paquete celular lavado se coloca en una estufa a 60°C durante 24 horas. La concentración celular se estima por diferencia de pesos. (todas las pesadas deben hacerse en balanza analítica).

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR DNS

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Preparación del inóculo: Se preparan 180 mL de medio de cultivo para

desarrollo del inóculo, los cuales se reparten en dos matraces (de 500ml) con 90 mL de medio cada uno. Se esterilizan a 15 lb/in2 durante 15 min. Se enfría. Se inoculan con 5mL del mismo medio sobre la cepa en tubo inclinado, en condiciones asépticas. Se dejan incubando en una agitadora (110 golpes/minuto) a una temperatura de 35°C durante 18 horas.

CULTIVO POR LOTE

A) Se preparan 1620 mL de medio de cultivo para el cultivo por lote y se ajusta el pH a 4.0. El medio se carga en el fermentador, previamente preparado, y se esteriliza en el autoclave a 15 lb/in2, 15 min. También se esterilizan, conjuntamente, los recipientes que contienen el antiespumante y el álcali.

B) El fermentador con el medio de cultivo se coloca en el sistema de agitación, venteo, agua de enfriamiento, etc. y después se inocula con los dos matraces del inóculo, en condiciones asépticas: El cultivo por lote operará bajo las siguientes condiciones: velocidad de agitación : 500 rpm aireación : 1 vvm temperatura : 35 ºC pH (con NH4OH 2N) : 3.8 antiespumante (PPG-10%): “de acuerdo a la formación

de espuma”

C) Se tomarán muestras cada hora para la determinación de la concentración celular por peso seco y turbidimetría, y azúcares residuales por el método del DNS. Las determinaciones se harán por duplicado. El cultivo por lote durará aprox. 10 horas durante las cuales el pH será controlado con NH4OH 2N.

INFORME

1. Presentar los resultados en el cuadro 2. 2. Presentar las curvas tipo de

concentración celular y de glucosa. 3. Elaborar los siguientes gráficos:

a) Concentración celular (x) vs. Tiempo (identificar las fases del crecimiento).

b) Concentración residual de glucosa (s) vs. Tiempo

c) Logaritmo natural de la concentración celular vs. Tiempo (solo para la fase exponencial)