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Producción de metabolitos secundarios en biorreactores Alejandro Mentaberry Departamento de Fisiología, Biología Celular y Molecular FCEN-UBA Conceptos y Técnicas de Biotecnología Curso 2010

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Producción de metabolitos secundarios

en biorreactores

Alejandro Mentaberry

Departamento de Fisiología, Biología Celular y Molecular

FCEN-UBA

Conceptos y Técnicas de BiotecnologíaCurso 2010

Sumario

Potencial económico de los metabolitos secundarios

Referencias

Estrategias para incrementar la producciónde metabolitos secundarios.

- Selección de especies vegetales apropiadas- Selección de líneas celulares mejoradas- Optimización de las condiciones de cultivo- Agregado de precursores- Suspensiones, órganos y células inmovilizadas- Uso de elicitores microbianos y de estreses abióticos- Permeabilización y remoción in situ

Diseño de procesos. Ejemplos

Ingeniería metabólica y biotransformación

Potencial económico de los metabolitos secundarios

El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante

Concepto general

• La producción de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.

- Generalmente no está asociada al crecimiento.- Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos

(raíces, tallos, hojas y glándulas).- La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidosy de órganos.

• Los metabolitos secundarios se producen ante situacionesde estrés o enfermedad.

- Factores bióticos- Factores abióticos

Cultivode tejidos y metabolismo secundario

- Insecticidas- Saborizantes- Colorantes

Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de interés comercial

• Potencial

- 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas.

- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.

- 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.

- 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.

- Desarrollo creciente de fitoterapéuticos y nutracéuticos

- Medicinas- Herbicidas- Proteasas

- Fragancias- Antimicrobianos- Enzimas

Ejemplos de terpenoides producidos en plantas Se conocen

unos 25.000 terpenoides presentes en plantas

Taxol (droga anticancerígena)

Forbol (irritante y cocarcinogénico)

Costunólido (repelente de inserctos;

antinutriente de mamíferos)

Azadiractina A (antinutrientede insectos) αααα-Ecdisona

(disruptor de la muda de insectos)

Hecogenina(aglicona de una saponina;

detergente)

Digitoxigenina(aglicona de digitoxina; tratamiento

de congestiones cardíacas)

Taxol(droga anticancerígena)

Forbol(irritante y cocarcinogénico)

Azadiractina A (antinutrientede insectos)

Costunólido(repelente de inserctos;

antinutrientede mamíferos)

Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales

Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cocaína

CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca

Cinchona officinalis

Quinina

Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina

Cocaína

CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca

Cinchona officinalis

Quinina

Ejemplos de fenólicos derivados de fenilpropanoides

Unos 8.000 fenólicos se forman en las plantas por las rutas del ácido shikimico o del malonato/acetato

gingeroles

Rizoma de ginger

Pimiento rojo y negro

piperina

norhidrocapsaicina

capsaicinaGranos de café

Corteza de canela

cinnamaldehido

ácido clorogénico

Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002

Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 m illones US$ Hiosciamina, escopolamina

Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos

Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata

Antineoplásico

Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, vincristina

Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico

Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae

Afrodisíaco

Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2 002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 m illones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millon es US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de

ipecacuana Cephaelis ipecacuanha

Emético

Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico

Antitumoral

Producciónde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode células y órganos vegetales: ¿por qué?

- Independizarse de factores externos, tales como:cambios de temperatura, sequías, plagas,variabilidad de la producción, factores políticosy sociales, etc.

- Evitar la extinción de especies vegetales.

- Disponer de condiciones controladas en el procesode producción y extracción.

- Hacer viable la producción de compuestos complejos con uno o más C quirales en forma máseconómica respecto de la síntesis química

- Posibilitar la obtención de nuevos compuestosno presentes en la planta madre.

- Establecer procesos de biotransformación sólorealizables por enzimas provenientes de plantas.

Procesos industriales

Tipo de compuesto

Farmacéuticos

Pigmentos

Fragancias

Saborizantes

Depigmentadores

Producto

Shikonina

Berberina

Sanguinarina

Gingsenósidos

Taxol

Cartamina

Geraniol

Citronerol

Vanillina

Arbutina

Compañía

Mitsui Petrochemical Ind.

Mitsui Petrochemical Ind.

Vigont Researol Lab.

Nitto Denko Co.

Phyton USA

Kibun Kyoto University

Kanedo Co.

Kanedo Co.

Kanedo Co.

Mitsui Petrochemical Ind.

20 M

0,6 M

4.800

340.000

1.000

n/a

3.250

4.500

-

-

Precio (U$S/kg)

18PigmentosMorinda citrifoliaAntraquinonas

12,4Antibacteriano,

colorante

Lithospermun

erythrorhizon

Shikonina

10,6AntibacterianoThalictrum minusBerberina

8,9PigmentoPerilla frutescensAntocianinas

3,8EsteroideDioscorea deltoideaDiosgenina

0,025AnalgésicoPapaver somniferumMorfina

2,5AntibióticoPapaver somniferumSanguinarina

0AntileucémicoCatharanthus roseusVincristina

0,06AnticancerígenoTaxus brevifoliaPaclitaxel (Taxol)

21-36AntiinflamatorioCloeus blumeiAcido rosmarínico

Rendimiento (%)AplicaciónEspecieProducto

Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998.

Productos comerciales potenciales y rendimientos de algunos cultivos de células vegetales

• Condiciones económicas:

- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)

- Alto rendimiento y productividad del cultivocomparado con la planta entera

- Buen crecimiento en biorreactores

- Crecimiento lento de la planta enteracomo fuente alternativa

• Parámetros principales:

- Productividad: g de producto/L/día

- Concentración máxima de producto: g de producto/L

- Rendimiento: g producto/g sustrato

Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial

Estrategias para incrementarla producción de metabolitos secundarios

Esquema del patrón de crecimientode una suspensión celular vegetal

Rendimiento de biomasa en sustrato

Cuantificacióny cinéticade un proceso Td: tiempo de duplicación de la biomasa

µ: velocidad específica de crecimiento del organismo

Y: rendimiento

X: biomasa

S: sustrato

Asociado al crecimiento No asociado al crecimiento

Patrones de formación de producto

• Selección de especies vegetales apropiadas

• Selección de líneas celulares mejoradas

• Optimización de las condiciones de cultivo

• Agregado de precursores

• Tipo de cultivo: suspensiones, órganoso células inmovilizadas

• Uso de elicitores microbianosy estrés abiótico

• Permeabilización y remoción in situ

Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios

• Screening y selección de líneas sobreproductoras

- Se facilita cuando el metabolito de interés es unpigmento, ya que puede hacerse una selección visual.

- Es importante contar con un método rápido y sencillopara seleccionar líneas más productoras (por ejemplo,ELISA).

• Optimización del medio de cultivo (variables másensayadas)

- Fuente de carbono- Limitación en nitrógeno- Limitación en fosfato- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)- Relación C/N

• Agregado de precursores

- Bajo costo- Baja toxicidad- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica

Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios

Diferencias entre suspensiones de células vegetalesy de células microbianas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Consecuencias paracultivos a gran escala

Sedimentación rápida;sensibilidad a fuerzas de corte;

formación de gradientes;dificultad para tomar muestras

Largos tiempos de proceso;baja productividad

Necesidad de grandescantidades de inóculo;

escalado más largo

Bajas velocidadesde agitación

Baja demanda de oxígeno:fermentadores con bajatransferencia de oxígeno

Permeabilización;remoción in situ

Célulasvegetales

Agregados de 10-200 µm y

de hasta 2 mmde diámetro

Lenta; td ~ 2-5 días

5-20%

Sensible /Tolerante

Baja

Intracelular /a veces extracelular

Célulasmicrobianas

CélulasIndividuales

2-10 µm

Rápida;td ~ 1-2 h

Pequeña

Insensible

Alta

Extracelular

Caracterización

Tamañoy morfología

Velocidadde crecimiento

Densidad de inoculación

Sensibilidad a fuerzas de corte

Aireación

Acumulacióndel producto

• Problemas a considerar:

- Tasa de crecimiento

- Volumen del inóculo

- Tamaño y agregación de las células

- Oxigenación

- Agitación

Cultivos en suspensión

2,30,3080 L (EA)Helianthus annuus

5,90,127 L (EA)Picrasma quassioides

0,720,9615, 30, 130 L (AG)Nicotiana tabacum

0,631,1015, 500 L (AG)Nicotiana tabacum

1,40,4810 L (EA)Morinda citrifolia

2,20,3230 L (EA)Catharanthus roseus

5,20,137 L (EA)Quassia amara

1,70,42600 L (AG)Nicotiana tabacum

Tiempo de duplicación (d)

Tasa de crecimientoespecífica µµµµ(d-1)

BioreactoresLínea celular

AG: bioreactor con agitaciónEA: bioreactor de elevación por aire (airlift)

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Ejemplos de tasas de crecimiento de suspensiones de células vegetales en biorreactores

La densidad el inóculo y del diseño del biorreactor inciden en el desarrollo de las suspensiones celulares

Tamaño y distribución de agregadosde Helianthus annuus en variosbiorreactores y en Erlenmeyer

Efecto de la densidad de inóculo en el crecimiento de cultivos de Picrasma quassiodides.

Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Porcentaje de callos de Vitis viniferaque contienen pigmentos de acuerdo

con el tamaño de los agregados

Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001.

Distribución del tamaños obtenido en biorreactores con medio en presencia de carboximetilcelulosa (cí rculos cerrados)

y en medio control (círculos abiertos)

Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.

Tamaño de agregado y acumulación de metabolitos secundarios

Patrón de flujo de dos diseños de propulsor

Agitador de paletas inclinadas (flujo axial)

Agitador de paletas planas o de Rushton(flujo radial)

Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.

deflector deflector

Adaptado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles,1998.

Diseños de distintos propulsores

Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo

Biorreactores de agitación neumática

El biorreactor más grande del mundo es de tipo air-lift

ICI, Ltd. factory, Billingham, UK

Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de proteína bact eriana ( Methylophilus methylotrophus) por mes.

Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Böhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.

Diseños alternativos para biorreactores con agitación mecánica

Cultivo de órganos: raíces transformadas

Propiedad

Forma de crecimientoPatrón de crecimiento

Tiempo de duplicaciónBiomasa final (peso seco/L)Background genéticoFormación inicial de productoMedio de crecimiento

Localización del producto Tipo de proceso

Suspensiones

Células simples-agregadosDesorganizado; cada célulapuede dividirse y expandirse

15 h-días30-60 g

HeterogéneoUsualmente bajo

Complejo; hormonasy vitaminas

Intracelular- extracelularBatch; continuo, deben

ser inmovilizadas

Raíces transformadas

Red de ramificacionesDivisión celular localizada;

crecimiento linear conramificaciones laterales

36 h-días 30-60 g

EuploideSimilares a la planta madre

Simple, sales y azúcar

Intracelular- extracelularBatch o continuo, no haynecesidad de inmovilizar

Fenotipo de raíz transformada con

Agrobacterium rhizogenes

Género

NicotianaCatharanthus

CinchonaDuboisiaDatura

BetaLippia

ArtemisiaCoreopsis, Bidens

Tagetes

DigitalisCassiaPanax

ChaenactisPodophyllum

LinumLithospermum

Solanum

Metabolito

AlcaloidesAlcaloides piridínicosIndoles

Tropano

OtrosBetalainaSesquiterpenos

PoliacetilenosTiofenos

Glicósidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos

NaftoquinonasEsteroides

Algunos metabolitos secundarios producidospor raíces transformadas

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Biorreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)

Biorreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las raíces

Biorreactores para el cultivo de raíces

Bomba de aire

Rot

ámet

ro

Bom

bape

ristá

ltica

Generador de niebla

Cámarade cultivoControlador Controlador

On Off

Intensidad

Filtro de aire

Condensadorde niebla

Adición de nutrientes

Bomba

Salida de aire

AireAire

Inóculo

Reservorio

Malla de inmovilización

Tomado de:Hairy Roots, Culture and Applications,

1997.

Compuesto

PiretrinasCardenólidosArtemisinina

Aceites esencialesAceites esenciales

Planta

Chrysanthemum spp. Digitalis spp.

Artemisia annuaMentha spp.

Pelargoium spp.

Cultivode tallos

• Ventajas

- Cultivos genética y bioquímicamente estables

- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidospresentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales

- Niveles similares a los de la planta (no siempre se cumple).

• Desventajas

- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas- Vitrificación

Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentación por

goteo; C: Igual que A, pero con alimentación por niebla.

Producción de artemisinina en los distintos bioreactoresTomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003.

Cultivo de tallos de Artemisia annuapara la producción de artemisinina

La inmovilización se define comoel confinamiento de un biocatilizador, enzimático o celular, dentro o sobre una matriz só lida para favorecer la liberación del producto y la reutilización del propio biocatilizador.

Unión a una matriz:

- Covalente - Iónica- Por crosslinking- Por adsorción

• Entrampamiento:

- Geles o polímeros- Membranas: microencapsulacióno reactores de membrana

Inmovilización

• Ventajas

- Posibilita la reutilización del biocatalizador y unarápida separación del medio de cultivo.

- Las células vegetales permanecen viablespor largos períodos de tiempo.

- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo, con el consiguiente aumento en la productividad.

- Es posible establecer cultivos de alta densidad permitiendo el uso de biorreactores más pequeños.

- La inmovilización favorecería la interacción entrelas células, favoreciendo cierto gradode diferenciación con el consiguiente incrementoen la producción.

- Es compatible con otras estrategias de optimización. (elicitación, permeabilización y remoción de producto)

- En muchos casos, la misma inmovilización inducela secreción del producto al medio de cultivo.

Inmovilización

• Desventajas

- Se agrega una etapa más al proceso,con el consiguiente aumento en los costos operativos. Esto incluye el costo de la matriz y de toda la maquinaria necesariapara la inmovilización.

- Al agregar un barrera más al sistema, aumentan los problemas relacionadoscon la transferencia de nutrientesy de oxígeno.

- El agregado de otra etapa en el proceso aumenta los riesgos de contaminación.

Inmovilización

Efectos de la inmovilización en la producción de me tabolitos secundarios

Efectos de la inmovilización en la liberación de me tabolitos secundarios

Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991.

Inmovilización

Compuesto

FerruginolSolasodinaL-DOPACapsaicina

Planta

Salvia miltiorrhizaSolanum surattense

Mucuna pruriensCapsicum frutescens

Células Libres

267-

Trazas

Inmovilizadas

4547-59

90100

% Producto en el medio

Especie

Capsicum frutescensCapsicum frutescensCofffea arabicaCatharanthus roseusTagetes patula

Producto

CapsaicinaCapsaicina

MetilxantinasAjmalicinaTiofenos

Incremento

> 100> 100

133,520

Tipo de inmovilización

PoliuretanoGelGelGel

Agregados naturales

Biorreactores para células inmovilizadas

Lecho empaquetado Lecho fluidizadoAgitación mecánica

Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.

La inmovilización en el contexto de distintas opciones de cultivos de tejidos

Elicitación

• Agentes bióticos

- Extractos de paredes de hongos o bacterias- Acido araquidónico- Quitosano- Metil jasmonato

• Agentes abióticos

- Metales pesados- Radiación UV- Presión osmótica- Ultrasonido

Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997.

Incremento de la producción de metabolitos secundariospor elicitación en diferentes cultivos in vitro

Producto despuésde elicitación

75 µmol / L

4,27 mg / g peso seco

1 mg / frasco

2% peso seco

15 mg / g peso fresco

28 µg / 10 mL

9 mg / g peso seco

160 µg / g peso fresco

0,55 g / 100 gpeso seco

Elicitor

Phytium aphanidermatum(extracto crudo)

Phytophtora megasperma(extracto crudo)

Trichoderma virideae(extracto crudo)

Saccaromyces cereviseae(extracto crudo)

Verticilium dahliae(extracto crudo)

Endógeno(extracto crudo)

Penicilinum spp.(extracto crudo)

Glutation abiótico

Fusarium conglutanis(extracto crudo)

Especie

Catharanthus roseus(suspensiones)

Datura stramonium(suspensiones)

Capsicum annum(suspensiones)

Thalictrum rugosum(suspensiones)

Sanguinaria canadensis(suspensiones)

Lithospermum erythrorizon(suspensiones)

Catharanthus roseus(raíces transformadas)

Lotus corniculatus(raíces transformadas)

Tagetes patula(raíces transformadas)

Producto

Alcaloidesindólicos

Alcaloidesdel tropano

Capsidiol

Berberna

Dopamina

Shikonina

Alcaloidesindólicos

Isoflavonoides

Tiofenos

Concentracióndel elicitor

10 ml / 50 mLde cultivo

55 mg / L de cultivo

20 µg / mL

0,2 mg / g peso fresco

1 ml / 15 mLde cultivo

1 mg / mL

0,01 g / L peso seco

10 mM

0,2 mg / mLde medio

Productoen control

50 µmol / L

0,85 mg / g peso seco

0

0,5% peso seco

3 mg / g peso fresco

0

3 mg / g peso seco

0

0,2 g /100 gpeso seco

Dosaje de elicitor necesario para biorreactor en columna de burbujeo

y para biorreactores de lecho de goteo o de niebla en función de la constante de

equilibrio entre el elicitor y receptor

Gastos de elicitor por biorreactor para biorreactor en columna de burbujeo y para

biorreactor de lecho de goteo o niebla.

Efecto de la configuración del biorreactor sobre el proceso de elicitación

Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997.

• DMSO

• Shock térmico

• Cambios de pH

• Limitación de fosfato y oxígeno

• Elicitación

• Detergentes y aceites de siliconas

• Electropermeabilización

Liberacióndel productoal medio

• Líquido-líquido :

Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventesorgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.

Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o solucionesde polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.

• Sólido-líquido:

La segunda fase es un material sólido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.

• Requerimientos:

- Autoclavables- No tóxicos- Fácil separación del producto de interés

de la segunda fase- No modificación del medio de cultivo- Permanencia de las células en la fase acuosa

Remoción de producto in situ

Diagrama de un tanque de agitación mecánica modific ado para operar con remoción in situ del producto

1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor

DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;

12: marco de la malla

Diagrama de un biorreactor de agitació n por líquido con loop externo

Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.

Adaptaciones para la extracción in situ del producto

Extracción in situ de alcaloides con aceite de silicona a partir de un cultivo de células de Eschscholtzia californica

A: partición de alcaloides con diferentes cantidades de polimetil-silanos. Los alcaloides se acumulan en la fase superior.

B: Extracción in situ de alcaloides en la parte superior de un fermentador de elevación por aire de 2 L.

Secuencia en laoptimización de un proceso para la producciónde metabolitos secundarios

Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro

Establecimiento de cultivos in vitro

Estabilización y selección de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,

liberación al medio

Optimización de medio de cultivo para producciónpor diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación,

liberación y remoción in situ

Optimización en biorreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión,

en dos etapas. Extracción y purificación del producto

Ingeniería metabólica y biotransformación

Estrategiaspara modificarel metabolismo secundariomediante manipulación genética

• Completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos

• Amplificar rutas normales

• Bloquear rutas alternativas

• Bloquear rutas normales

• Modificar la regulación de rutas normales

• Modificar los mecanismos de secrecióny exportación

• Bloquear rutas de degradación

Ingeniería metabólica del metabolismo secundario

Enzima

Triptofano decarboxilasa(TDC)

Hiosciamina-6-hidroxilasa(H6H)

Triptofano decarboxilasa (TDC)y estrictosidina sintasa (STR)

ORCA3 (factorDe transcripción)

(S)-esculerina 9-O-metiltransferasa (SMT)

Desoxixilulosa fosfatoreductoisomerasa (DXR)

C1 y R (factoresde transcripción)

Especie

Peganum harmala(suspensiones y raíces)

Hyosciamus muticus(raíces transformadas)

Catharanthus roseus(suspensiones)

Catharanthus roseus(suspensiones)

Coptis japonica(suspensiones)

Mentha spp.(planta)

Zea mays(callos)

Producto

Serotonina

Escopolamina

Alcaloides indólicos(TIAs)

Alcaloides indólicos(TIAs)

Berberina

Aceites esenciales

Antocianinas

Observaciones

Incremento de 10-20 vecesen producto

Contenido de producto 4 vecessuperior a planta control

Contenido de TIAs de 300 mg/Lcomparado con control 50mg/L.Líneas inestables

Incremento de la concentración de TIAsde 3 veces después de agregarel precursor secologanina

Incremento del flujo hacia la producciónde berberina de 15%

Incremento del 50% ene l contenidode aceites esenciales

Producción de antocianinas y fenolesque no se producían en los callos sin transformar.

Ingeniería metabólica delmetabolismo secundario

• Problemas

- Clonado de genes

- Estabilidad de líneas transgénicas

- Compartimentalización de productos

- Transporte y acumulación de productos

- Limitaciones y arquitecturade la ruta metabólica

- Canales metabólicos (limitación del flujo metabolico por la capacidad de las enzimas participantes)

La biotransformación es la conversión de un sustrat o (natural o sintético) por medio de un biocatalizador (enzima, célula, tejido, órgano, células inmovilizadas) en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimáticos.

Requerimientos:

- Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la células y de sus cofactores.

- La velocidad de formación del producto debe ser mayor que su metabolización.

- El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado.

- El precursor debe poder ingresar en la célula y el producto debe ser preferentemente secretado.

- El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado.

Planta Precursor ProductoCapsicum frutescens(células inmovilizadas)

Acido protocatecuicoy ácido cafeico

Vainillina y capsaicina

Catharanthus roseus(células inmovilizadas)

Vinblastina Vincristina

Daucus carota(células inmovilizadas)

Codeinona Codeína

Mucuna puriens(células inmovilizadas)

Tirosina L-DOPA

Rauwfolia serpentina(células inmovilizadas)

Hidroquinona Arbutina

Mentha spp.(células inmovilizadas)

Mentona Neomentol

Coffea arabica(células inmovilizadas)

Teobromina Cafeína

Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001.

Biotransformación

Ejemplos de diseño de procesos

Operación Productoasociado

Productono-asociado

Batch + +Batch alimentado + +Batch alimentadorepetitivos

+ +

En dos etapas - +Continuo + -Perfusión - +

Relación entre el sistema de cultivo y el patrón de síntesis del metabolito secundario

Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales

Shikonina

• Planta entera- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.

• Suspensiones celulares- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción.- Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen

la producción de shikonina.- Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio.- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.

Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery

Producción de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon

Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.

Proceso para la producción de shikonina a partir de célulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.

Berberina

• Planta entera- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 años.

• Suspensiones celulares

- Las líneas celulares productoras se seleccionaron a través de . protoplastos y screening de por fluorescencia.

- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto está. asociado al crecimiento.

Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery

Producción del alcaloide berberinapor suspensiones celulares de Coptis japonica

Ginsenósidos

• Planta entera- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 años .- Se requieren períodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivosa riesgos de pestes y cambios drásticos de clima.

- La concentración de saponinas es de 0,5 % peso seco.

• Suspensiones celulares- La concentración de saponinas es de 0,65 % peso seco.- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/día.- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.- A gran escala se emplean tanques agitados mecánicamente a bajas velocidades.

• Raíces transformadas- La concentración de saponinas es de 0,95 % peso seco.- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.- A gran escala se emplean tambores rotatorios.

Producción de ginsenósidos por Panax ginseng

Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery

Taxol

• Planta entera

- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años.

- La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.- Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.

. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.

. - El material vegeta empleado presenta variación en la concentración de precursores.

- Las plantas empleadas crecen lentamente.

Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery

Producción de taxol por Taxus spp

Taxol

• Suspensiones celulares de T. brevifolia

- Se emplean metiljasmonato o extractos fúngicos como elicitores.

- La composición óptima de gases es 10% (v/v) oxígeno, 0,5% (v/v) dióxido de carbono y 5 ppm de etileno.

- El incremento de la presión osmótica, sacarosa (60 g/L), estimula la producción.

- Los precursores como la fenilalanina y el ácido benzoico incrementan la productividad.

- El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato.

- El sistema de operación se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda en un medio de producción con elicitación.

- Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcanpoco estrés hidrodinámico (escalado hasta 75.000 L).

Schoepke Plant Image Gallery

Producción de taxol por Taxus spp

• Planta entera- La planta tiene bajas concentracionesde alcaloides.

- La purificación y extracción son costosas.

• Suspensiones celulares- La limitación de fosfato y nitrógeno combinado con la elictación, inducen la producción de del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertención y problemas cardiológicos).

- Las líneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitandoel desarrollo de cultivos a gran escala,

- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.- Las suspensiones no acumulan alcaloides indólicos diméricos: vinblastina y vincristina.- Se necesitaría aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad específica obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/día) para que el proceso sea viable.

Vinblastina

Tomado de: Manhart Plant Image Gallery

Producción de alcaloides indólicos de Catharantus roseus:vincristina y vinblastina

Estructuras de vainillina y de distintasantocianinas

Vainillina (1 )

Pelargonidina-3-glucósido R2=OH (1)Cianidina-3-glucósido R2+R3=OH (2)Delfinidina-3-glucósido R1+R2+R3=OH (3)

Wescott et al., 19940,7B5Raíces aéreas transfectadas

Wescott et al., 19940,002-Fruto

Referencia% Peso SecoMedioMaterial

Wescott et al., 19940,7B5Raíces aéreas transfectadas

Wescott et al., 19940,002-Fruto

Referencia% Peso SecoMedioMaterial

Producción de vainillina en células y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro

a Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/Lb Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM to tal Nc Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina

Do y Cormier, 1991B5bSuspensión celularVitis vinifera

Oxalis reclinata

Aralia cordata

Especie

Crouch et al., 1993MScSuspensión celular

Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensión celular

Referencia% Peso SecoMedioMaterial

Do y Cormier, 1991B5bSuspensión celularVitis vinifera

Oxalis reclinata

Aralia cordata

Especie

Crouch et al., 1993MScSuspensión celular

Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensión celular

Referencia% Peso SecoMedioMaterial

Producción de antocianinas por células cultivadas in vitro

Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998.

Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos típicos...

Conclusiones

• Aspectos bioingenieriles a resolver:

- Diseño de biorreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales

- Instrumentación y control de los bioprocesos- Diseño de biorreactores más económicos- Métodos no letales para liberación

de los metabolitos secundarios- Método adecuado para la remoción in situ

• Aspectos biológicos a resolver:

- Conocimiento de la regulación de las rutas biosintéticas: enzimas y factores de transcripción

- Conocimiento de la regulación del transportey acumulación de los metabolitos secundarios

- Conocimientos de los mecanismosde degradación del producto

1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. andMoo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992.

2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich Hanser Publishers, 1991.

3. Secondary products from plant tissue culture. Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford University Press, 1990.

4. Design, formulation, and optimization of media. In: Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J. (ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995.

5. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.). Harwood Academic Publishers, 1997.

6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. AcademicPress, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.

Referencias