Producción de Proteasas

5/10/2018 Producción de Proteasas - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/produccion-de-proteasas 1/8

Producción de Proteasas y Bacteriocinas por la Cepa Mexicana Bacillus subtilis No. 21Contra Hongos y Bacterias Patógenas en Alimentos

María del Rosario Razo Belmán, José Eleazar Barboza Corona, Rubén Salcedo Hernández,Manuel Vázquez Arista, Ma. Guadalupe L. Basurto Cadena.

Departamento de Alimentos, Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato. Km9 Carretera Irapuato-Silao, Exhacienda El Copal S/N Irapuato, Gto.

[email protected].

RESUMEN

En estudios previos se comprobó la actividad antagónica, “in Vitro” y en invernadero, que

presenta una cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21, aislada de cultivos de fresa de la

región de Irapuato contra los hongos fitopatógenos Fusarium verticillioides y Rhizoctonia

solani . Por tal motivo, se decidió evaluar algunos de los posibles mecanismos de acción de

esta bacteria. En este trabajo se detectó la producción de proteasas y bacteriocinas, las

cuales pudieran estar involucradas en el mecanismo antagónico de la bacteria B . subtilis No.

21.

ABSTRACT

Previous studies, “in vitro” and greenhouse, it was proved that the antagonistic activity of a

Mexican Bacillus subtilis strain 21, isolated from strawberry fields in Irapuato, against its

pathogenic fungi Fusarium verticillioides and Rhizoctonia Solani, Hence, it was decided

evaluate some possible action mechanisms of this bacteria. In this work proteases and

bacteriocinas production were detected, which could be involved in the antagonistic

mechanism of Bacillus subtilis strain 21.

INTRODUCCION

Uno de los aspectos que más afectan la producción de los cultivos a nivel mundial lo es sin

dudas la presencia cada vez más creciente de enfermedades causadas por hongos,

bacterias y virus, esto trae como consecuencia la merma mundial de los cultivos. Este

aumento en las pérdidas de cultivos y el número de enfermedades presentes en éstos, hace

notable la disminución de la efectividad de los productos químicos, lo que con frecuencia da

lugar a problemas económicos para los agricultores.

Actualmente se está desarrollando la base científica de la lucha biológica y como principal

componente de esta se encuentra el control biológico el cual abarca desde la represión o

control de insectos hasta las enfermedades causadas por hongos bacterias y virus. Para su



control se han utilizado microorganismos los cuales ejercen una actividad antagónica contra

dichas enfermedades, entre estos se encuentran hongos como Beauveria, Metarhizium y

Paecilomyces y bacterias como Bacillus thuringiensis y Bacillus subtilis. (Antela, 2004).

Uno de los principales problemas que limita la productividad de los cultivos es el usoconstante de fungicidas, los cuales son nocivos para la salud y el medio ambiente

(EPA,1999).

Estudios realizados en los últimos años sugieren que el método para combatir plagas y

enfermedades en productos hortícola es el control biológico, el cual puede ser incorporado a

un plan de manejo integral con el uso adecuado de rizobacterias antagonistas contra hongos

fitopatógenos (Fernández, 1999), tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis No. 21, aislada

de cultivos de fresa de la región de Irapuato, la cual demostró, a nivel de invernadero, ser

antagónica contra hongos de Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani (Torres - Basurto,2000).

El objetivo de este trabajo fue estudiar dos de los posibles mecanismos por los cuales la

bacteria B. subtilis No.21 ejerce su antagonismo contra los microorganismos probados. Se

observo la presencia de altos niveles de proteasas y una posible actividad (baja) de

bacteriocina.

MATERIALES Y METODOS

Cultivo deBacillus subtilis

No 21. La cepa, conservada en el cepario del Instituto deCiencias Agrícolas se creció como colonias aisladas en Agar Nutitivo estandar (BD Bioxon).

Una colonia se picó en 3 mL de caldo nutrido (BD Bioxon) y se dejó crecer toda la noche, de

este preinóculo se transfirieron 0.5 mL en 100 mL de Caldo nutritivo y se cultivó en los

tiempos indicados (ver resultados). Las células se centrifugaron y el sobrenadante se utilizó

como “medio condicionado”.

Determinación de proteasas. Se añadieron 100 μL de medio condicionado en pozos

horadados en un medio caseolítico, se dejaron 24 h en refrigeración para la difusión de las

proteasas en el medio y se incubaron a 28 ºC por otras 24 h. Posteriormente se midió el áreade hidrólisis en las diferentes muestras usando el halo transparente delimitado por un círculo

blanquecino formado alrededor de los pozos. Una unidad de proteasa (U) fue definida como

el equivalente a 1mm2

de área de hidrólisis.

Cuantificación de proteasas por el método de Kunitz. Se preparó una mezcla de 0.5 mL

de enzima + 1 mL de sustrato de caseína en regulador con glicina, se incubó a 37 °C durante



30 min. Una vez terminada la incubación se agregaron 3.5 mL de ácido tricloroacético 4%

para detener la reacción, se agitó durante unos segundos para mezclar y se tomó una

muestra de 1 mL la cual se depositó en un microtubo y posteriormente se centrifugo durante

10 min a 10,000 rpm. Una vez terminada la centrifugación se recuperó el sobrenadante paramedir la absorbencia a 280 nm una unidad fue definida como

A280nm*Dilución*160.566/volumen/30 min. (Rojas I., 1994).

Método de difusión de pozos para la determinación de bacteriocinas. Para la evaluación

de bacteriocinas se inocularon previamente las cepas de diferentes bacterias patógenas y

Bacillus cereus en 15 mL de Caldo de Soya Tripticaseína (CST), se incubaran a 37 °C y 28

°C respectivamente con una agitación de 200 rpm durante 24 h. Después de la incubación se

ajusto la concentración de células a una absorbencia a 2.0 nm y posteriormente se

mezclaron 105 µL de B. cereus + 15 ml de agar para pozos. Se realizó la misma mezcla paracada una de las 12 especies patógenas que se utilizaron, la mezcla se vació en cajas de

Petri y se dejó solidificar, una vez solidificado el medio se hicieron pozos de 8 mm y se

dejaron secar a 37 °C durante 2 h. Después se agregaron 100 µL de la bacteriocina (medio

condicionado) y se incubaron a 4 °C durante 24 horas para la absorción de la bacteriocina,

luego se incubó a B. cereus a 28°C y las cepas patógenas a 37°C durante 24 h. Si la prueba

es positiva se observaran halos de inhibición y se medirá el diámetro del halo para

determinar así la actividad de bacteriocinas.

Método de fluorescencia para determinación de bacteriocinas. Se preparó un preinoculóde B. cereus , el cual constó de 10 mL de Caldo de Soya Tripticaseína (CST)+ 2 asadas de la

colonia y se incubara a 28 °C durante 24 h. Después se efectuó una siembra de 5 µL de

preinoculó +45 mL de CST y se incubara a 28 °C a 200 rpm durante 2 h, posteriormente se

tomarán 35 mL de la muestra y se centrifugaron a 0 °C durante 5 – 10 min a 4000 rpm. El

sobrenadante se tiró y se resuspendió la pastilla en buffer de fosfatos hasta ajustar las

células a una absorbencia de 0.887 nm. Se preparó un blanco agregando 50 µL buffer de

fosfatos + 20 µL células normales + 930 µL (Berberina + buffer de fosfatos) y un control

agregando 45 µL buffer de fosfatos + 5 µL muestra +20 µL células normales + 930 µL(Berberina + buffer de fosfatos). La preparación de las muestras se realizaron agregando 50

µL muestra + 20 µL células normales + 930 µL (Berberina + buffer de fosfatos), se agitaron

unos segundos en el vortex y se realizó la medición en el fluorómetro Hoefer DynA Quant

200 a una longitud de onda de 360 nm de excitación y 460 de emisión (Fuente –Salcido,

2007).



RESULTADOS

Determinación de proteasas. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de

proteasas. En la Tabla 1, se muestran los resultados del diámetro que presentaron los halos

de hidrólisis al colocar la cepa de Bacillu s subtilis No. 21, en dos diferentes medios. LasFiguras 2 y 3 muestran el ensayo de proteasas a 24, 48 y 72 h en medio de caldo nutritivo.

Las Figuras 4 y 5 muestran el ensayo de proteasas a las 24, 48 y 72 h en medio de quitina

coloidal. En estas figuras se puede observar que las muestras colocadas en caldo nutritivo

tuvieron mayor actividad de proteasas que las muestras colocadas en quitina coloidal.

Tiempo

Medio de Cultivo

Caldo

Nutritivo

Quitina

Coloidal

24 1.3823 0.3534

48 2.8589 0.7461

72 2.7568 1.1545

Tabla 1. Determinación de proteasas (U) producidas por B. subtilis No. 21 al cultivarlos en diferentes medios de cultivo

Fig. 1. Ensayo de proteasas Fig. 2. Ensayo de proteasas

a las 24, y 48 h en caldo nutritivo a las 72 h en caldo nutritivo

24 48 72



Fig. 3. Ensayo de proteasas a Fig. 4. Ensayo de proteasas a

las 24, y 48 h producidas por células las 72 h producidas por células

crecidas en quitina coloidal crecidas en quitina coloidal

Cuantificación de proteasas por el método de Kunitz. Los resultados obtenidos de la

cuantificación de proteasas para B. subtilis No. 21 se muestra en la Figura 5, donde se

realizaron muestreos cada 2 h durante 74 h.

0 10 20 30 40 50 60 70 80

100

200

300

400

500

U P / m L / m i n .

tiempo (h)

Fig. 5. Curva de Producción de proteasas

24 48 72



Determinación de Actividad de Bacteriocinas por el método de difusión en pozos. Los

resultados obtenidos de está prueba en la cual se midió la efectividad de las bacteriocinas

producidas por la cepa de B. subtilis No. 21 contra las 12 especies de bacterias patógenas

utilizadas las cuales afectan a productos alimenticios se muestran en la tabla 2.

Nombre

Bacteria

Medio de Cultivo

Caldo Nutritivo Quitina Coloidal

Streptococcus pyogenes 25.13 19.44

Bacillus cereus 183 275.68 35.34

Enterobacter cloacae ATCC13047 25.13 25.13

Staphylococcus aureus ATCC 25923 275.68 21.99

Staphylococcus xylosus ATCC700404 0 0

Pseudomona aeruginosa ATCC27853 0 0

Escherichia coli 0 0

Listeria inocua 0 0

Proteus vulgaris ATCC13315 0 0

Salmonella sp. 0 0

Shigella flexneri 0 0

Streptococcus pneumoniae 0 0

Tabla 2. Determinación de actividad de Bacteriocinas producidas

por B. subtilis No. 21 al enfrentarlo contra diferentes bacterias patógenas

Método de fluorescencia para determinación de bacteriocinas. Las mediciones

obtenidos en está prueba se graficaron y se ajustaron a una curva sigmoidal la cual se

muestra en la Figura 6. Se observó un máximo de actividad de bacteriocinas después de las

60 horas de cultivo, de acuerdo con el ajuste el máximo se alcanza después de las 50 horas.



0 10 20 30 40 50 60 70 80

20

40

60

80

100

120

140

160

180

f l u o r e s c e n c i a ( U R )

tiempo (h)

Fig. 6. Curva de actividad de bacteriocinas

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos sugieren que la cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21

analizada en este trabajo puede ejercer una actividad antagónica contra diversas cepas de

hongos fitopatógenos como son Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani mediante la

liberación de proteasas donde su mayor producción se presentó entre las 18 y 24 h, de

acuerdo a la Figura 5. Además de producir proteasas, B. subtilis No. 21 produce también

bacteriocinas, las cuales según los resultados obtenidos pueden inhibir el crecimiento de

algunas bacterias patógenas para el ser humano y las cuales pueden ser encontradas en los

alimentos. Dichas bacteriocinas alcanza su mayor actividad a después 60 h de cultivo, la

cual es de 160 UR. En posteriores trabajos se realizar estudios adicionales para la

determinación cuantitativa de proteasas mediante zimogramas, además de realizar pruebas

para determinar que otros compuestos pueden ser producidos por dicha cepa bacteriana. El

ensayo de fluorescencia está diseñado específicamente para la detección rápida de

bacteriocinas (Fuente Salcido, et. al., 2007), en nuestro caso pudimos detectar actividad con

dicho ensayo, sin embargo nos falta una prueba adicional para demostrar que la actividad

medida efectivamente es una bacteriocina: la prueba de que la actividad mostrada es debida

a una molécula de naturaleza protéica, actualmente estamos trabajando en ese tema.



BIBLIOGRAFIAAntela- Arrastía., O., 2004. Control biológico como estrategia en el manejo integrado de

plagas.

EPA., 1999 Environmental Protection Agency and pesticides.

Fernández, G.J., 1999. Agroecología Americana. En Enciclopedia Práctica de la Agricultura y

Ganadería: 11-18. Grupo Editorial Océano. Barcelona, España.

Fuente Salcido N., Salcedo Hernandez R., Alanís Guzmán M., K. Bideshi D., Barboza

Corona J., 2007. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin actiity.,

Journal of Microbiological Methods.

Torres G.L.I., Basurto C.M.G. 2000. Control Biológico De Hongos Fitopatógenos De La Raíz

y Corona De Fresa Con Cepas Antagónicas De Bacillus subtilis . Tesis de Licenciatura.

ICA. U. de Guanajuato. Irapuato, Gto. México.

Rojas I. 1994. Producción de proteasas por Bacillus thuringensis crecido en medios a base

de materiales protein-quitinosos. Posible uso de estas enzimas en la obtención de hidrolizados de carne y harinas de pescado. Tesis de Maestría. Instituto Tecnológico

de Veracruz. Veracruz, Veracruz, México.

Producción de Proteasas

Documents

Transcript of Producción de Proteasas