PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE Bacillus thuringiensis

ICA – PERÚ 2010

PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS

PRÁCTICA N 2 DE BIOTECNOLOGÍA

DOCENTE: DRA. ROSA ALTAMIRANO DÍAZ PRESENTADO POR: BRAVO ROMERO, ANGELA FABIOLA. LOPEZ MONTOYA, VICTOR W. HUAMÁN CAICHYHUA, NADIA. RAMOS BURGOS, ALFREDO. VALVERDE LUNA, KATHERINE.

X CICLO

PRÁCTICA DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS

PRACTICA Nº 2: PRODUCCIÓN Y EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE BIOINSECTICIDAS

I. INTRODUCCIÓN

Las plagas tanto urbanas como rurales son una amenaza constante para la salud y la calidad de vida humana (Dulmage, et al., l990), son también la causa de grandes pérdidas económicas en los cultivos (Kaelin, et al., l994). Hasta ahora la única forma eficaz de controlar estos insectos plaga se basa en la aplicación de pesticidas químicos, aunque ello trae en consecuencia problemas ecológicos; por tanto el uso irracional de los agroquímicos ha sido causa de contaminación ambiental en todo el planeta. Una posible alternativa para solucionar este problema es el control biológico, definido como el uso de un organismo natural o modificado genéticamente y/o sus productos para reducir los efectos de insectos plaga. Se ha reportado la existencia de más de 1500 especies de microorganismos entomopatógenos con potencial para el control microbiano de insectos, en relación a su diversidad se señalan: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde las últimas son las de mayor importancia. De las bacterias la más sobresaliente pertenece al género Bacillus (3). Bacillus thuringiensis, es una bacteria GRAM positiva esporulada, nativa del suelo, caracterizada por producir inclusiones paraesporales de constitución proteica (ICP), también denominadas δ-endotoxinas, con actividad tóxica frente algunas especies de insectos de los órdenes Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera, Homoptera, Orthoptera, y Mallophaga, y contra otros organismos, como ácaros, nematodos y platelminos (1). Desde su descubrimiento en el siglo pasado, B. thuringiensis se ha convertido en el entomopatógeno más utilizado a nivel mundial, con ventas que representan de 90% del mercado de bioplaguicidas, y además es aprovechado para obtener plantas resistentes a insectos (2). En este informe se evaluó en forma rápida y efectiva la actividad insecticida de las proteínas cry, producidas en un Biorreactor, de la cepa nativa Bacillus thuringiensis var. Kurstaki para ratificar su valor como alternativa para el control biológico sobre plagas agrícolas.

Modo de acción de las biotoxinas de Bacillus thuringiensis


II. MATERIALES

Material biológico: Cepa de Bacillus thuringiensis var. kurstaki 20 larvas de Spodoptera sp. (Lepidóptero) Hojas y granos de Maíz Equipo: Balanza analítica Microscopio Centrifuga Biorreactor de tanque agitado y aireado. Cristalería: Matraz Erlenmeyer de 500 y 2000 mL Pipetas de 5 y 10 mL Vaso de precipitados de 250 y 1000 mL 10 tubos de centrífuga Utensilios: Asa y porta-asa microbiológica Espátula Mechero o lámpara de alcohol Pinzas de disección

Porta y cubre objetos Varios: Algodón Gasa Papel aluminio 25 vasos de unisel Ligas Cinta de pH. Insumos y Reactivos: Agar nutritivo Azul de Comassie Colorantes para tinción de Gram Glucosa Extracto de levadura Harina de soya Pure de tomate KH2P04 CaC03 MgS04-7H20 MnS04- H20 FeS04-7 H20 CaC12-4 H20

III. PROCEDIMIENTOS GENERALES

Obtención de Biomasa de Bacillus thuringiensis var kurstaki. Obtención de Cristales Proteicos toxicos. Evaluación toxicológica de los cristales proteicos de B. thuringiensis sobre larvas de insectos

plaga (bioensayos).

3.1. OBTENCIÓN DE BIOMASA DE Bacillus thuringiensis.

PROCEDIMIENTO:

REACTIVACIÓN DE LA CEPA Repicar por estría una cepa nativa de B. thuringiensis en tubos con agar nutritivo. Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.


PREPARACIÓN DEL INOCULO.

Proliferación celular: Se sembró en toda la superficie de 1 placa con agar nutritivo e incubó a 37ºC por 24 horas. Cosecha celular: a. Añadimos 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio estériles.

Luego movimos las placas suavemente hasta obtener una suspensión celular. b. Tomamos la suspensión celular y lo colocamos en un frasco schott de 150 ml estéril y

se enrazó hasta 50 ml con caldo nutritivo. Antes, comprobamos la formación de esporas y cristales de la Cepa, haciendo una coloración con Azul de Comassie.

Obtención del inóculo: a. Se incubó el frasco schott con la suspensión celular en agitación a 150 rpm a

temperatura ambiente por 18 a 24 horas (alternativa estufa a 37 ºC). b. Realizamos el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar nutritivo

de diluciones seriadas del cultivo hasta 10-5.

PREPARACIÓN DEL BIORREACTOR.

Armar y esterilizar el biorreactor tanque agitado y aireado.

PRODUCCIÓN DEL BIOINSECTICIDA

a. Se colocó 1 ml. del inóculo y el medio base + harina de soya al 0.6% hasta un volumen de trabajo de 1800ml. en el biorreactor. (Concentración inicial de fermentación aproximadamente 4.3 104 UFC/ml).

Componentes de Medio de Fermentación (Componente g/l)

Glucosa 5.0 Harina de soya 6.0 Pure de tomate 40 ml KH2P04 2.5 CaC03 1 MgS04-7H20 0.0001 MnS04- H20 0.04

FeS04-7 H20 0.028 CaC12-4 H20 0.030 Ajustar el pH, con NaOH 1 N. a 7.0. Los medios se esterilizan a 121°C durante 15 minutos.

Concentración del inóculo: 7.8 x 107 UFC/ml.


Calculo de la Concentración Inicial de Fermentación Ci = 7.8 x 107 UFC/ml. CIF = ? V1= 1 ml. V2 = 1801 ml.

Ci x V1 = CIF x V2

(7.8 x 107 UFC/ml.)x(1 ml.) = (CIF)x(1801 ml.) CIF = 4.3 104 UFC/ml

b. Insuflamos aire estéril a 1.72 VVM. Cálculo del VVM

PRUEBAS

Tiempo (seg.) Volúmen (ml.)

1.7 1.9 1.7 1.8 1.9

40 38 42 44 40

Promedio = 1.8 seg. Promedio = 40.8 ml.

0.030 min (1.8 seg) ----- 40.8 ml. 1 min ---------------------- X X = 1360 ml.

1 VVM ----- 1300 ml. X ------------ 1800 ml. X = 1.72 VVM

c. Poner en funcionamiento por espacio de 24 - 48 horas a temperatura ambiente.

Biorreactor en funcionamiento

d. Dejar en reposo por 48 h para que las células esporulen y formen los cristales

proteicos.

Concentración final de Femrnetación: 1.52 x 1012 UFC/ml.


3.2. OBTENCIÓN DE CRISTALES PROTEICOS TOXICOS.

Con los cristales proteicos se llevará a cabo un bioensayo en el que se pondrán en contacto con larvas de Spodoptera sp. que son plagas de plantas.

PROCEDIMIENTO:

1. Verificación del crecimiento celular y formación de precipitados.

Se observó la turbidez del medio de cultivo a las 48 horas lo que indicó el crecimiento bacteriano y después de 48 horas la formación esporas y de cristales proteicos por la aparición de precipitados en el reactor y aclaración del medio.

Fermento luego de 48 horas - Formación de Precipitados

2. Decantación y centrifugación del fermento.

Se decantó cuidadosamente el medio de fermentación y se separó los complejos espora - cristal en tubos (uno por cada mesa de trabajo) mediante centrifugación a 5000 rpm por 5 min. No se midió el volumen del sedimento, pero si se midieron los volúmenes de los tubos antes de centrifugar.

Centrífugación a 5000 RPM Distribución del sedimento en tubos por grupo.


3. Verificación de los cristales proteicos. (Procedimiento no ejecutado) 4. Lavado de los complejos espora-cristal. (Procedimiento no ejecutado) 5. Se conservó el complejo de espora-cristales en congelación

3.3. EVALUACIÓN TOXICOLÓGICA DE LOS CRISTALES PROTEICOS DE B. thuringiensis SOBRE

LARVAS DE Spodoptera sp. (BIOENSAYOS)

PROCEDIMIENTO:

1. Recolección de larvas. Se priorizó en conseguir posturas de lepidópteros desde el cultivo hospedero, para la obtención de estadíos uniformes y mejor interpretación de resultados.

2. Identificación de larvas Se identificaron larvas de Spodoptera sp. (Lepidóptero de importancia agroindustrial) que según sus características morfológicas pertenezcan a estadios I y II.

Distribución del sedimento en tubos por grupo.

Características Macroscópicas de Spodoptera sp.

Conservar a T° de congelación


3. Preparación de la dosis de biotoxina.

Se homogenizaron los complejos espora – cristal de cada grupo y se prepararon para la posterior sumergida del alimento de las larvas.

4. Resuspender la toxina conservada en 500ml de SSF estéril (1 mg/ml) (Procedimiento no ejecutado)

5. Bioensayo:

Se lavó cuidadosamente con agua destilada estéril la superficie de las hojas que servirán de alimento de las larvas a ensayar.

Empleamos 2 vasos de vidrio de 1 litro cubierta con un tul en la parte superior: uno de ellos se utilizará como ensayo (E) y el otro como control negativo (N).

Tubos Centrifugados con el Complejo Espora - Cristal

Homogenización

Lavado del alimento


Para el vaso E: colocamos 2 a 3 granos de maíz en la superficie con la suspensión de bioinsecticida en estudio.

Para el vaso N: colocar 2 a 3 granos de maíz en la superficie con SSF estéril.

A cada vaso se colocó 10 larvas de lepidóptero de I o II estadio.

Control (+) y Control (-)

Alimento de larvas con Biotoxina

Alimento de larvas con SSF


Observamos cuidadosamente la ingestión de las hojas por parte de las larvas y anotamos el tiempo de efecto de la toxina hasta un lapso de 72 horas y anotar los resultados.

III. RESULTADOS

A. Cultivo de la Bacteria

Cultivo de la cepa de Bacillus thuringiensis utilizada.

B. Observación de Esporas y Cristales (1000X)

Tinción de Esporas y Cristales con Azul de Comassie


C. Bioensayos

TABLA N°1 Suceptibilidad de diferentes especies larvas de Lepidopteros frente a toxinas de Bacillus

thuringiensis durante 72 horas.

HORAS

Tipo de Larva Evaluación 0.5 1 2 4 6 12 24 48 72 T

Heliothis

Positivo

G1 - - - - - - - 1 1

2

Negativo G1 - - - - - - 1 - - 1

Spodoptera

Positivo

G2 - - - - - 1 2 2 2 7

G3 - - - - 3 2 5 5 - 15

G4 - - - - - - 1 4 5 10

G6 - - - - - - 3 4 2 9

Negativo

G2 - - - - - 2 2 4 4 12

G3 - - - - 1 - - - - 1

G4 - - - - - - - 1 9 10

G6 - - - - - - - - - 0

Onmiodes

Positivo

G7 - - - 1 - 2 3 3 1 10

G5 - - - 2 - 3 - - 5 10

Negativo

G7 - - - - - - 2 5 3 10

G5 - - - - - 2 2 - 6 10

* Resultados esperados

TABLA N°2 Suceptibilidad de Spodoptera sp. (Grupo 2) frente a toxinas Bacillus thuringiensis durante

72 horas.

HORAS

Evaluación 0.5 1 2 4 6 12 24 48 72 Total

Ensayo - - - - - 1 2 2 2 7

Negativo - - - - - 2 2 4 4 12

Larvas muertas después de 72 horas con características de la infección de

Bacillus thuringiensis


GRÁFICO N°1 Número de larvas muertas vs tiempo en días.

LARVAS

DÍAS


IV. DISCUSIÓN Algunas especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus, Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una notable estrategia adaptativa cuando se ven sometidas a privación de nutrientes en su medio ambiente: si los niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto constituye una señal a la célula de que se avecina un largo período de privación de nutrientes. Entonces, la célula se implica en una serie de complejos cambios genéticos, metabólicos y estructurales (proceso de esporulación o esporogénesis), que conducen a la diferenciación, en el interior de la célula vegetativa original, de una célula durmiente (la endospora). La célula-madre, la célula vegetativa original que generó la endospora finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz de permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, incluso siglos. En el laboratorio tras reactivar el cultivo de Bacillus thuringiensis nosotros logramos inducir la esporulación de B. thuringiensis al cambiarla de un medio rico en nutrientes (Agar nutritivo) a un biorreactor de tanque agitado con pocos nutrientes, además de que para asegurar que la mayoría de los bacilos lograran la esporulación y lisado celular (liberándose también los cristales), se mantuvieron en este medio durante 5 días. En el ensayo de la biotoxicidad de los cristales proteicos de Bacillus thuringiensis inicialmente utilizamos un total de 26 larvas, las cuales distribuimos en números iguales para lo que corresponde al bioensayo y a la muestra control. La acción citotoxica en las larvas destinadas al bioensayo produjo un total de 7 larvas muertas encontrando resultados similares con el grupo 6 en el cual, a través de un mismo bioensayo, termino con un total de 9 larvas muertas. En relación del grupo 3 afirmamos que obtuvimos solo un 50 % del total de muertes que logro este grupo, el cual llego a 15 larvas muertas por la actividad de la biotoxina. Con respecto a las muertes obtenidas en los grupos 4, 5 y 7, por acción del bioinsecticida, observamos que no obtuvimos mucha desventaja con dichos grupos. Por último el desarrollo obstaculizado de las larvas, con respecto a su condición de control, manifestó que las muertes de las larvas control se debieron a factores de nutrición y/o mala manipulación (muerte por aplastamiento). Y es así que nuestro grupo en conjunto con el grupo 4, 5 y 7 representaron más del 50 % de los grupos que obtuvieron muertes altas en el trabajo control.


V. CONCLUSIONES La toxina es eficiente y demostró su capacidad citotoxica. Las dosis de toxina obtenidas a partir de 1.52 x 1012 fue eficiente contra las larvas plaga. La toxina es específica, demostrando mayor efectividad en Spodoptera sp. que en otras

larvas de plaga. Las condiciones de temperatura, humedad, presión no intervienen en la acción citotoxica

de la toxina. La observación, en intervalos, de las larvas permitió la verificación de la acción de la toxina

manifestándose en parálisis o en muertes de larvas. Las larvas presentaron una característica general: el abdomen se torno más oscuro que el

resto de su cuerpo, ya que la larva tiene acción citotoxica en el tracto digestivo originando deshidratación aquí.

Las larvas control tuvieron una importancia relevante ya que se mantuvieron vivas hasta la

falta de alimento pero demostrando la efectividad de la toxina.

VI. REFERENCIAS 1. Feitelson, J; J. Payane y L. Kim. 1992. Bacillus thuringiensis: Insectos y más allá. Biotecnology

10(3), 271-275. 2. Schnepf, E; N. Crickmore; J. Van Rie; D. Lereclus; J. Baum; J. Feitelson; D.R. Zeigler y D.H.

1998. Bacillus thuringiensis y su cristales proteicos pesticidas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 775-806.

3. Vega I; Cultivo de Bacillus thuringiensis y su uso como bioinsecticida. Instituto Politecnico

Nacional. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. México. 2008. Pag. 2-3.

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