Productos Lacteos Fermentados

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Productos lácteos fermentados (queso, requesón, mantequilla, kefir, yogur) *fines de conservación (tienen diferente contenido de agua, ácido y contienen bacteriocinas) *presentan una textura, un olor y un “flavor” mucho más atractivos Añadiendo bacterias lácticas iniciadoras a la leche pateurizada: Cultivos iniciadores o estárter, su función es la de fermentar la lactosa, transformándola en ácido láctico, lo cual baja el pH, modifica las proteínas de la leche……... Además poseen sistemas proteolíticos y lipolíticos y producen compuestos como el diacetilo y el acetaldehido que le dan aroma y aspecto diferente . Acido Láctico Lactosa COOH H-C-OH CH3 ¿Como se obtienen? Leche pasteurizada, reduce la posibilidad de crecimiento de ciertos m.o. patógenos y …

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Productos lácteos fermentados(queso, requesón, mantequilla, kefir, yogur)

*fines de conservación (tienen diferente contenido de agua, ácidoy contienen bacteriocinas)

*presentan una textura, un olor y un “flavor” mucho más atractivos

Añadiendo bacterias lácticas iniciadoras a la leche pateurizada:Cultivos iniciadores o estárter, su función es la de fermentar la lactosa, transformándola en ácido láctico, lo cual baja el pH, modifica las proteínas de la leche……... Además poseen sistemas proteolíticos y lipolíticos y producen compuestos como el diacetilo y el acetaldehido que le dan aroma y aspecto diferente.

Acido LácticoLactosa

COOH

H-C-OHCH3

¿Como se obtienen?

Leche pasteurizada, reduce la posibilidad de crecimiento de ciertos m.o. patógenos y …

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CULTIVOS “ESTARTER”

Bacterias ácido-lácticas homofermentativas

Mesófilas (25-30ºC)

Lactococcus lactis subesp. lactisLactococcus lactis subesp. cremoris

Termófilas (37º-42ºC)

Streptococcus thermophilusLactobacillus delbrueckii subesp. bulgaricusLactobacillus helveticus

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MICROFLORA SECUNDARIA

Leuconostoc y ciertas cepas deLc. lactis sub lactis citrato+

Propionibacterium freundenreichii

Metabolizan el ácido cítricoproduciendo compuestos aromáticosy CO2 (Edam, Gouda, Azul..)

Metaboliza el ácido láctico a ácidopropiónico, ácido acético y CO2. CO2 forma los agujeros de los quesosde tipo suizo (Gruyere, Emmental).

Devaryomyces y Trichosporom (levaduras) Brevibacterium linen y especies de Mixococcus (bacterias)

Quesos madurados en superficiecomo el Limburger

Penicillium camembertiiPenicillium roqueforti

Maduración de los quesos Camembert y quesos azulesrespectivamente

Penicillium roqueforti

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Microorganismos que participan en la elaboración de quesos y leches fermentadas•Productos Microorganismos Flora secundaria

productores de la acidez

QuesosColby, Cheddar, Cottage Lactococcus lactis subesp. cremoris Ningunoy tipo cremosos Lc. lactis subesp. lactisGouda, Edam y Havarti Lactococcus lactis subesp. cremoris Leuconostoc sp. Citrato

Lc. lactis subesp. lactis Lc. lactis subesp. LactisBrick y Limburger Lactococcus lactis subesp. cremoris Geotrichum candidum,

Lc. lactis subesp. lactis Brevibactrium linens, Micrococcus sp.Camembert Lactococcus lactis subesp. cremoris Penicillium camemberti y en ocasiones

Lc. lactis subesp. Lactis Brevibacterium linenQuesos azules, Lactococcus lactis subesp. cremoris Citrato* Lactococcus lactis subesp. lactisRoquefort Lc. lactis subesp. Lactis Penicillium roqueforti

Mozarella, Provolone Streptococcus thermóphilus, Lactobacillus Ninguno. Al romano se le añaden lipasasRomano, Parmesano delbruekii subesp. bulgaricus, Lb helveticus animales para obtener un sabor rancio o

picanteQuesos suizos, Gruyere Streptococcus thermóphilus, Lactobacillus Propionibacterium freundenreichii subesp.Emmenthal helveticus, Lb delbruekii subesp. bulgaricus shermanii

Leches fermentadasYogur Streptococcus thermóphilus, Lactobacillus Ninguno

delbruekii subesp. bulgaricusSuero de mantequería Lactococcus lactis subesp. cremoris Leuconostoc sp. Citrato, Lactococcus lactis

Lc. lactis subesp. lactis subesp. LactisNata ácida Lactococcus lactis subesp. cremoris Ninguna

Lc. lactis subesp. lactis

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Productos Lácteos: Yogur

Cultivos iniciadores:

YOGURStreptococcus termophilus (ácido). Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus(sabor).

ADITIVOS: Lactobacillus acidophilus

Bifidobacterium bifidum

LECHE

Page 6: Productos Lacteos Fermentados

Etapas básicas en la elaboración de quesoMateria prima, leche (analizada microbiológica y químicamente)

+/- Pasteurización

+ Cultivo iniciador, bacterias lácticas (0,5-2% v/v)

(Leche a 30-35ºC)

Acidificación(+/- aditivos (ej. color)

Coagulación por la renina o cuajo

Cuajada Corte (molienda)/ agitaciónTratamiento térmico/Salado

Separación del suero del cuajo

Prensado Maduración

Lactosuero

+/- adición de inóculo microbiano (microflorasecundaria) u otros aditivos

(10-75 minutos)

Deshidratación

Productos Lácteos: Queso

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Renina o Quimosina

Pre-pro-quimosinaAspartil-proteasa

16 aa

Pro-quimosina27 aa41.000 daltons

Quimosina (activa)pH

35.000 daltons

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¿Cómo actúa la quimosina?

Proteínas de la leche

Caseinasα1 caseinaα2 caseinaβ caseinaκ caseina

Suero LactoglobulinaSeroalbuminainmunoglobulinas

quimosina

Submicelade caseína

Micelade caseína

Page 9: Productos Lacteos Fermentados

Cuajo

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Etapas básicas en la elaboración de quesoMateria prima, leche (analizada microbiológica y químicamente)

+/- Pasteurización

+ Cultivo iniciador, bacterias lácticas (0,5-2% v/v)

(Leche a 30-35ºC)

Acidificación(+/- aditivos (ej. color)

Coagulación por la renina o cuajo

CuajadaCorte (molienda)/ agitaciónTratamiento térmico/Salado

Separación del suero del cuajo

Prensado Maduración

Lactosuero

+/- adición de inóculo microbiano (microflorasecundaria) u otros aditivos

(10-75 minutos)

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CH3-CO-COOH CH3-CHOH-COOH

NADH+H NAD

Lactato deshidrogenasa

Piruvico Láctico

Bacterias ácido-lácticas (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus,Leuconostoc, Pediococcus)

Son bacterias Gram (-), no esporuladas, inmóviles, anaerobias aerotolerantesy la diferencia radica en la morfología: cocos y bacilos.

Son bacterias catalasa negativaLa mayoría son mesófilas, pero también hay algunas pocas psicrófilasy termófilas

Su metabolismo es fermentadorSon muy exigentes por lo que es difícil de cultivarlas, aún cuando se empleanmedios muy ricos. Su hábitat son los vegetales en descomposición.

Según los productos resultantes de la fermentación de la glucosa se clasifican en Homofermentativas y Heterofermentativas

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(4) Acido piruvico

(4) Acido láctico

Glucosa-6-fosfato

Fructosa-fosfato

(2)Triosa-fosfato

Fructosa-1-6-difosfato

(4) NAD (4) NADH

(4) NADH (4) NADLactatodeshidrogenasa

Fructosa-1-6-difosfato-aldolasa(2) Triosa-fosfato

Tagatosa-6-fosfato

Tagatosa-1-6-difosfato

Ruta de la tagatosa

Tagatosa-1-6-difosfato-aldolasa

Galactosa-6-fosfato

Metabolismo de la lactosa en las bacterias lácticas homofermentativas

Glucosa

Lactosa-fosfato

Fosfo β-galactosidasa

Galactosa-6-fosfato

Lactosa

Galactosa

Galactosa-1-fosfato

Glucosa-1-fosfato

β-galactosidasa

Ruta de Leloir

excretada

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Metabolismo de la lactosa en las bacterias lácticas heterofermentativas

Ruta de lafosfocetolasa

Glucosa

Glucosa-6-fosfato

Lactosa

Galactosa

β-galactosidasa

Ruta de Leloir

1Acido pirúvico

1Acido láctico

NAD+

NADH

NAD+

Acetil-fosfato

Acetaldehido

Etanol

NADH

NAD+

NADH

NAD+

2NAD+6-fosfo-gluconato

Xilulosa-5-fosfato

1Triosa-fosfato

CO2 2NADH

fosfocetolasaPi

ADP

ATP Acido acético

AEROBIOSIS

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Metabolismo del ácido pirúvico y del Ácido cítrico en las bacterias ácido-lacticas

Cítrato

membrana citrato permeasa

(2) Citrato

acetato

(2) oxalacetato

(2) Acido pirúvico

Acetaldehido

Etanol

NADH

NAD+

NADH

NAD+

Acetil-fosfato(2) Acido láctico

NAD+

NADH

CH3

HC OH

COOH

ADP

ATP Acido acético

Acetil-fosfato

α-acetolactato

CH3

COCOCH3

diacetilo

Acetoina2,3-butanodiol

CO2

CO2

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2) son necesarios para crecer en la leche.Las bacterias lácticas son auxótrofas para muchos aaLos aa libres presentes en la leche no son suficientes para favorecer el crecimiento hasta una D.O elevadaLas caseínas se convierten en la primera fuente de N2 proteico al agotarse el N2 no proteico

1) “ “ para que se desarrolle el sabor, olor y color de los quesos madurados.

Los aa son precursores de muchos compuestos volátilesCiertos aa y péptidos producen de por si un “marcado aroma”.

1) Enzimas localizadas en el exterior de la membrana citoplasmática2) Sistemas de transporte.3) Enzimas intracelulares

3)

Sistemas proteolíticos de los lactococcos

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Oligopéptidos

Di/tripéptidos

aminoácidos

Oligopéptidos>100

Caseinas

aminoácidosEPAPTPDP

aminoácidosAPTPDP

1) Enzimas localizadas en el exterior de la membrana citoplasmática: PrtP(serín-proteasa que libera más de 100 péptidos a partir de la β–caseína soluble)2) Sistemas de transporte.3) Enzimas intracelulares: exopeptidasas y endopeptidasas que convierten los péptidos en aa.

Paredcelular

membranaPrtP

oligopéptidos

di/tripéptidos

aminoácidos

N2 noproteico

Opp

Dtp

Aat

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Genética de las bacterias ácido-lácticas

Muchas de las propiedades metabólicas esenciales en el crecimiento de las bacterias ácido-lácticas en la leche son inestables y esta inestabilidad …….

se relaciona con el número inusualmente elevado de plásmidos que hay en los cultivos lácticos

Existen plásmidos que codifican ……-los genes responsables de las enzimas de las rutas PEP-PTS

la tagatosa-6-fosfato,la fosfo-β-galactosidasael transporte de citrato.

Además…….. la producción de proteinasa,el transporte de oligopéptidos,los mecanismos de resistencia a bacteriofagos,la producción de bacteriocinas y la resistencia bacteriocinas,la producción de exopolisacáridos.

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1) La estabilización de genes codificados por plásmidos por integración cromosómica.

2) El desarrollo de cultivos resistentes a bacteriofagos.

3) La mejora de la textura y el sabor y la aceleración de la maduración de los quesos.

4) La producción de bacteriocinas y otros compuestos antimicrobianos naturales.Por ejemplo de nisina.

5) La producción de polímeros que mejoran el cuerpo y la textura de los productos lácteos fermentados.

6) La consecución de cultivos lácteos que toleren la liofilización

Las aplicaciones más importantes de la biología molecularde los cultivos iniciadores a la industria láctea

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Productos Lácteos: QUESOS

MaduraciónMicroflora: Penicillium roquefortisecundaria

P. camemberti

Propionibacterium

Salado

Calor

Prensado

SueroDESHIDRATACIONACIDIFICACIÓN

COAGULACION

CUAJORENINA.

Lactococcus lactis.Streptococcus thermophilus

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Bacterias lácticas(Familia Lactobacteriaceae)

Cocos

Bacilos

Streptococcus(homo)Pediococcus(homo)Leuconostoc(hetero)

StreptococusLactococcusEnterococcus (no son bacterias lacticas)

Thermobacterium(homo)

Betabacterium(hetero)Streptobacterium(homo)

Lactobacillus

Page 23: Productos Lacteos Fermentados

Glucosa

Glucosa-6-P

Fructosa-6-P

Fructosa-1,6-di-P

ATPADP

ATPADP

2ATP 2ADP

EtapaIReaccionespreparatorias

(2) Pirúvico (2) láctico

NADH NAD+

EtapaIIReducción

Productos de fermentación

ADPATP

(2) gliceraldehido-3-P Dihidroxiacetona-P

(2) 1,3-di-P-glicérico

(2) 3-P-glicérico

(2) 2-P-glicérico

(2) Fosfoenol pirúvico

NAD+

NADH

ADPATP

EtapaIIOxidación

2ADP 2ATP

2ADP 2ATP

Pi

H2O

FERMENTACIÓN LACTICA

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•Producción de renina en E. coli

Se obtuvo mRNA a partir de la mucosa de ternera lechal, se purificó y se utilizó en experimentos de traducción in vitro

Se preparó cDNA a partir de este mRNA y el cDNA se insertó en un vector de clonación

Se expresó como proteína de fusión con la beta–galactosidasa

Se insertó la secuencia de la proquimosina detrás de un promotor procariótico

La expresión resultó 5% del total de proteínaspero se formaron cuerpos de inclusión.

Cuerpos de inclusión

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Levaduras como huéspedes de clonación: ventajas

Más apropiados para genes eucariotas Ciertas modificaciones postraduccionales

(glucosilaciones, eliminación Met-1, procesamiento proteolítico de precursores) Fácil manejo microbiológico y genético S. cerevisiae y otras levaduras tienen su genoma secuenciado Levaduras son huéspedes GRAS (seguros)

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La quimosina se clonó entrelas secuencias promotoras y terminadoras de gen LAC4(lactasa de Kluyveromyces) Se insertó en pUC19, el plasmido se linearizó y se integró en el cromosoma-la quimosina se secretó alsobrenadante de cultivo (80%)-el rendimiento fue de 100U de enzima/ml, lo que corresponde al 10% de las proteínas celulares.

Producción de quimosina/renina en Kluyveromyces lactis

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Actualmente mas del 90% del queso que se hace en Inglaterra se obtiene con quimosina obtenida a partir de un GMO (Organismo modificdogeneticamente). Sin embargo el queso no esta hecho con un GMO, sino con el producto de un GMO (la enzima).

Chymosin