Programa “Conservación de los recursos genéticos de interés … RM2006-00013.pdf · 2010. 2....
16
MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN Programa “Conservación de los recursos genéticos de interés agroalimentario” Caracterización de cepas de Penicillium chrysogenum, P. crustosum, Debaryomyces hansenii y Staphylococcus xylosus de interés para la elaboración de productos cárnicos madurados Proyecto RM2006-00013-00-00. INVESTIGADOR PRINCIPAL: Félix Núñez Breña PERSONAL INVESTIGADOR: Elena Bermúdez Polo Mar Rodríguez Jovita Higiene y Seguridad Alimentaria. Facultad de Veterinaria. Universidad de Extremadura
Transcript of Programa “Conservación de los recursos genéticos de interés … RM2006-00013.pdf · 2010. 2....
MINISTERIO DE CIENCIA E INNOVACIÓN
Programa “Conservación de los recursos genéticos de interés agroalimentario”
Caracterización de cepas de Penicillium chrysogenum, P. crustosum, Debaryomyces hansenii y Staphylococcus xylosus
de interés para la elaboración de productos cárnicos madurados
Proyecto RM2006-00013-00-00.
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Félix Núñez BreñaPERSONAL INVESTIGADOR: Elena Bermúdez Polo
Mar Rodríguez JovitaHigiene y Seguridad Alimentaria.Facultad de Veterinaria. Universidad de Extremadura
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
Selección de microorganismos para su utilización como cultivo iniciador mixto en la elaboración de productos cárnicos crudos madurados (INIA CAL02-085).
Caracterización de proteasas de Penicillium chrysogenum aislado de jamón curado y su expresión en Debaryomyces hansenii (CICYT ALI98-0253)
P. chrysogenum
Pg222
D. hansenii
Dh345
S. xylosusSx5EA
• Proteolisis y lipólisis durante la maduración de carne• Compuestos volátiles de interés en productos cárnicos• Olor en carne “a lomo curado”, o “a jamón curado”• Resultados prometedores en lomo y jamón curado
¿Cultivos iniciadores?
P. chrysogenum
Pg222
EPg222
• Activa en embutidos crudos madurados• Secuencia aminoacídica completa:MGFLKVLATSLATLAVVNAGKLLTGSDAGAVVPGSYIVVMNDGVSNDVFKNHRDWAATVHARIASRKGGESGPGKNFDINGMKGYTASFDDRTVKDIASDPAVKYVEPDMVVNATENVVQPNAPSWGLPRISSQKPGATDYVYDSTAGEGIVVYGVDTGIDIRHSDFEGRAEWGTNTVDNDNTDGNGHGTHTASTAVGSKFGVAKKASVVAVKVLSADGSGTNSQVIAGMEWAVKDAKSRGVTGKSVMNMSLGGAFSRAMNDAAANVVKSGVFLSVAAGNEAQDASNSSPASAPNVCTIAASTSSDRSASFSNFGSVVDLYAPGESITAAYPGGGSKTLSGTSMAAPHVAGAAAYLMALEGVASDKACARIVELAISSISSAPFGTTSKLLFNGLNAK
Antecedentes
• EPg222 Serín-proteasa extracelular 30 kDa
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
AntecedentesSelección de Penicillium productores de péptidos antifúngicos para su utilización en productos cárnicos madurados (Ref. AGL2001-0521).Optimización de las condiciones ecológicas que pontencien la actividad y la producción de péptidos antifúngicos en productos cárnicos madurados para controlar mohos toxigénicos (Ref. AGL2004-06546).
P. crustosum
RP42C
• Inhibición de un amplio espectro de mohos toxigénicos
¿Cultivos protectores?
P. chrysogenum
AS51D
PgChP
Secuencia aminoacídica parcial:LSKFGGECSL- -FGGECSLK- -HNTCTYLK--NHVVNCGSAANKK- -yDEHHK- -cqTPVPgAF
P
• Inhibición de Penicillium commune productor de CPA
Secuencia aminoacídica parcial:-NKPDGGPPGSYF- -YFAAGSSLPVAALQSAAAK- -PDATYPLDGDNGA--TIHSDWAK- -WLADMDVDCDGLD- -GNPDGQHQTNFGAL--AAYEVPFFVIPDR- -AGALPGNNVGAVICDGK- -PQVLGEASWLMAR--MFYGIYGDSDGDTPQVLGEASRFFAR- -TYILFTGDDSVLPSSALNK--NYVTNFTTLR- -RSMGDKLM-
• Proteína antifúngica extracelular (6,5 kDa)
• Quitosanasa extracelular con actividad antifúngica (30 kDa)
• Diferenciación de las cepas
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
Objetivos
Caracterizar genéticamente las cepas de Staphylococcus xylosus Sx5EA, Debaryomyces hansenii Dh345, Penicillium chrysogenum Pg222, P. chrysogenum AS51D y P. crustosum RP42C.
1. Confirmar la identificación de las cepas seleccionadas de interés tecnológico mediante técnicas de biología molecular.
2. Diseñar métodos de PCR que permitan la detección específica de las cepas seleccionadas.
3. Determinar la ausencia de potencial toxigénico de las cepas de mohos y el estafilococo seleccionados.
Antecedentes
• Identificación inequívoca
Cultivos iniciadores o protectores
• Potencial toxigénico
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosA. Caracterización de la cepa Staphylococcus xylosus Sx5EA.
A.1. Confirmación de la identificación fenotípica. Región 16S-23S rADN: 99% Staphylococcus xylosus (GenBank).
3000250021762000
1766
1500
123010331000
653
517500453394
298234
154
Sx5EA
pb
A.2. Diseño de un método de diferenciación. RAPD-PCR (GTAACGCC) permitió la diferenciación de la cepa Sx5EA de otros estafilococos procedentes de productos cárnicos.
A.3. Detección de genes enterotoxigénicos. No se detectó ninguno de los genes que codifican las 18 enterotoxinas y like-toxins estafilocócicas conocidas (A-U).
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosB. Caracterización de la cepa Debaryomyces hansenii Dh345.
B.1. Confirmación de la identificación fenotípica. Secuencia 18S: 99% Debaryomyces hansenii (GenBank).
B.2. Diseño de un método de diferenciación de la cepa. El análisis de restricción del ADN mitocondrial (HaeIII), junto RAPD-PCR (GACA)4 permite discriminar entre Dh345 y otras levaduras aisladas a partir de productos cárnicos o procedentes de colecciones de cultivos tipo, incluyendo cepas de su misma especie.
Dh345
Alta correlación del perfil genético con compuestos volátiles generados.
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosC. Caracterización de la cepa Penicillium chrysogenum Pg222.
C.1. Confirmación de la identificación fenotípica. Secuencia de la región ITS: 99% Penicillium chrysogenum.
C.2. Diseño de un método de diferenciación de la cepa. Se probaron cebadores para PCR en tiempo real a partir de la secuencia del gen esp1. Dos parejas de cebadores permiten la amplificación específica del ADN de la cepa Pg222.
P. chrysogenum Pg222P. chrysogenum Pg222
Gen esp1ATGGGTTTCCTCAAGGTCCTCGCTACGTCCCTTGCGACTCTGGCGGTCGTCAATGCCGGTAAGCTCCTTACCGGCAGTGATGCTGGCGCGGTGGTTCCTGGCTCCTACATTGTTGTCATGAATGATGGCGTTAGCAACGACGTGTTCAAAAATCACCGTGACTGGGCTGCAACTGTCCATGCTCGTATCGCGAGCCGCAAGGGTGGCGAGTCTGGACCAGGGAAGAATTTCGACATCAATGGCATGAAAGGATACACCGCTAGCTTCGATGACCGTACCGTCAAAGACATTGCCAGTGACCCGGCGGTATGGCGTTTCATTACCCACGTTGATTCCTCAAGAAAGTGTTGCAATATCTGACCCGCAGTGGAAATATAGGTCAAGTACGTTGAACCAGACATGGTTGTGAACGCGACCGAGAACGTGGTTCAGCCCAATGCTCCTTCATGGGGCCTTCCTCGCATCTCTAGCCAGAAGCCCGGTGCTACCGACTATGTGTATGACTCTACTGCTGGTGAGGGGATCGTGGTGTATGGCGTCGACACCGGGATTGACATTAGGCATTCCGACTTTGAGGGCCGCGCTGAGTGGGGCACCAACACTGTTGATAATGATAACACTGACGGCAATGGCCATGGCACCCACACTGCGTCTACTGCGGTGGGCAGCAAGTTCGGTGTTGCAAAGAAGGCCTCTGTCGTTGCTGTCAAGGTCCTCAGTGCAGATGGTTCTGGAACTAATTCGCAAGTCATCGCTGGCATGGAGTGGGCCGTTAAAGATGCGAAGTCCCGCGGCGTCACTGGGAAGTCTGTTATGAACATGTCTCTGGGTGGTGCGTTTTCTCGGGCTATGAATGACGCCGCTGCCAATGTCGTCAAGTCCGGTGTCTTTCTCTCTGTTGCTGCCGGAAATGAAGCCCAGGATGCGAGTAACAGCTCACCTGCTTCTGCTCCGAATGTATGCACTATCGCCGCTTCTACCAGCTCAGACAGAAGTGCTTCCTTCAGCAACTTCGGTTCCGTTGGTGAGATCCCCCCCCTCCTCCTTAGTGCGAAGCGTGCTTGGTAGTCGAAGAAGCGTACTGATGGCATTACTACAGTCGACCTCTATGCTCCTGGGGAGAGCATCACGGCAGCATACCCTGGTGGTGGCTCAAAGACCCTGTCTGGAACCTCTATGGCTGCTCCACATGTTGCTGGTGCTGCCGCCTACCTGATGGCTCTCGAGGGTGTGGCCTCTGATAAAGCTTGCGCCCGTATTGTCGAGCTTGCTATATCGTCTATCTCCAGCGCTCCGTTCGGCACTACTAGCAAGCTTCTCTTCAACGGTTTAAACGCGAAGTAA
Otros aislados deP. chrysogenum
PCR en tiempo real con cebadores EPg1F y Epg1R (54 pb).
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosC. Caracterización de la cepa Penicillium chrysogenum Pg222.
C.3. Producción de penicilina y micotoxinas. Pg222 produjo roquefortina en extracto de carne, pero no en carne estéril con 5% de NaCl.
• No se detectó penicilina, ácido secalónico, ni otra micotoxina.
• 15 micotoxinas investigadas HPLC-MS.RT: 0,03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22Time (min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Rel
ativ
e A
bund
ance
Roquefortina C
RT: 0,03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
NL:1,30E8TIC MS roque01
RT: 0,03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
NL:1,76E8TIC Macsec
03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5NL:6,78E8TIC MS penicilina1mg_ml20micl
Roquefortina C PenicilinaÁcido secalónico
Pg222 (AEC)Patrones
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosD. Caracterización de la cepa Penicillium crustosum RP42C.
D.1. Confirmación de la identificación fenotípica. Secuencia de la región ITS: 99% Penicillium chrysogenum.
D.2. Diseño de un método de diferenciación de la cepa.
D.2.1. Obtención de la secuencia completa del gen pgafp mediante RACE-PCR.1 atgcagatcaccagcattgccattgtcttcttcgccgcaatgggtgcggttgctaaccccatcgcgagggagtcggacgatcttgatgcccgagacgtaca 101
M Q I T S I A I V F F A A M G A V A N P I A R E S D D L D A R D V Q102 gcttagtaaattcggaggagtaagttcttcttacaagacgtctatatagaaatagcactaacctttctgaaccactttacaggaatgcagcttgaaacaca 202
L S K F G G << Intron 1 >>E C S L K H N203 acacgtgcacatacctaaagggtggaaagaaccatgtagtcaattgcggttcggccgccaacaagaaggtaggttccgattcgattcggggccaattgatt 303
T C T Y L K G G K N H V V N C G S A A N K K << Intron 2 304 tgttcttatcatttaatcttcatctacagtgcaagtctgatcgccaccactgtgaatacgatgagcaccacaagagggttgactgccagaccccagtttga 404
>>C K S D R H H C E Y D E H H K R V D C Q T P V -
LSKFGGECSLKHNTCTY-LKGGKNHVVNCGSAANKKCKSDRHHCEYDEHHKRVDCQTPV
ATYNGKCYKKDNICKYKAQSGKTAICKCYV---KKCPRDGAKCEFDSYKGKCYC
714
26
2833
4049
51
815
28
3643
54
PgAFP
AFP
Similitud con proteínas antifúngicas pequeñas, catiónicas y ricas en cisteína producidas por mohos.
Estructura de la proteína PgAFP.
D. Caracterización de la cepa Penicillium RP42C.crustosumchrysogenum
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosD. Caracterización de la cepa Penicillium chrysogenum RP42C.
D.2.2. Método de PCR en tiempo real para diferenciación de la cepa. Una pareja de cebadores diseñados a partir de la secuencia del gen pgafp permiten la amplificación específica del ADN de la cepa RP42C.
P. chrysogenum RP42C
Otros aislamientosde P. chrysogenum
P. chrysogenum RP42C
Otros aislamientosde P. chrysogenum
Gen pgafpATGCAGATCACCAGCATTGCCATTGTCTTCTTCGCCGCAATGGGTGCGGTTGCTAACCCCATCGCGAGGGAGTCGGACGATCTTGATGCCCGAGACGTACAGCTTAGTAAATTCGGAGGAGTAAGTTCTTCTTACAAGACGTCTATATAGAAATAGCACTAACCTTTCTGAACCACTTTACAGGAATGCAGCTTGAAACACAACACGTGCACATACCTAAAGGGTGGAAAGAACCATGTAGTCAATTGCGGTTCGGCCGCCAACAAGAAGGTAGGTTCCGATTCGATTCGGGGCCAATTGATTTGTTCTTATCATTTAATCTTCATCTACAGTGCAAGTCTGATCGCCACCACTGTGAATACGATGAGCACCACAAGAGGGTTGACTGCCAGACCCCAGTTTGA
PCR en tiempo real con cebadores RP42F2 y RP42R2 (57 pb).
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
Resultados
D.3. Producción de penicilina y micotoxinas. RP42C produjo roquefortina C en los tres medios de cultivo y en carne, y penicilina en extracto de carne.
• No se detectó ácido secalónico, ni ninguna otra micotoxina.
• 15 micotoxinas investigadas HPLC-MS.
RT: 0,03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
NL:1,30E8TIC MS roque01
RT: 0,03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Rel
ativ
e A
bund
ance
NL:1,76E8TIC Macsec
03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
0
5NL:6,78E8TIC MS penicilina1mg_ml20micl
Roquefortina C PenicilinaÁcido secalónico
RP42C (AEC)Patrones
RT: 0,03 - 30,37
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Time (min)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
NL:3,42E11TIC MS 1aRP42cAEC
Roquefortina C
Penicilina
D. Caracterización de la cepa Penicillium chrysogenum RP42C.
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosE. Caracterización de la cepa Penicillium chrysogenum AS51D.
E.1. Confirmación de la identificación fenotípica. Secuencia de la región ITS: 99% Penicillium chrysogenum.
E.2. Diseño de un método de diferenciación de la cepa.
E.2.1. Obtención de la secuencia completa del gen pgchp mediante RACE-PCR.
gcgcaaacagtcgatggctccaaattcaacaagccagacggcggtccaccaggaagctacatgatgacctacagccgcttaatccccttcgctctctttgccttgtttggcacagggA Q T V D G S K F N K P D G G P P G S Y M M T Y S R L I P F A L F A L F G T GctcactcccgtgccagatgcaacctatcctattaatggcgataacggtgctaagaaagttaccttcgctgctggctcgtctattcccgtcgctgctttgcagagcgctgctgcaaagL T P V P D A T Y P I N G D N G A K K V T F A A G S S I P V A A L Q S A A A KgctcgcatccacagcgactgggctaagttcgacaaggtagatactctcactggtcggttaattgcaaggtccgcatgcttattaaatggatcatagggtgcggcatatgtttggattA R I H S D W A K F D K << Intron 1 >> G A A Y V W IgcggatatggacgtcgactgcgacggcattgactacaagtgcaaggtacggtcactattgttgtctgtctgagatgttattgctgacccgatgttcagggaaacccggatggtcagcA D M D V D C D G I D Y K C K << Intron 2 >> G N P D G QaccaaaccaacttcggagctttggctgcgtatgaagtgccgttctttgtgattcccgacaggtttggaaccaagtacgcgaagcagcttcctggaaacaacgttggtgccgttatctH Q T N F G A L A A Y E V P F F V I P D R F G T K Y A K Q L P G N N V G A V I ggtatggtttcctacctttgtaagatatctcagcggcgtcttgttctaaccgaaagctagcaatggaaagatgttctacggaatttacggagactccgatggcgatacccctcaggtC<< Intron 3 >> N G K M F Y G I Y G D S D G D T P Q V I GcatcggcgaggcctcatggttaatggcccggacctgcttccctaatgatgacttgaatggcaatagtggccatggtgatgttgatgtgacctgtaagtttgcagccttggcacatctE A S W L M A R T C F P N D D L N G N S G H G D V D V T << Intron 4 agatccgtattctgtcaactactaatctaaccagatatcctcttcactggcgacgactcggtgctccccagcagcgctctcgctcttgcgaagaacctcaacttcaccgatggaggt
>>Y I L F T G D D S V L P S S A L A L A K N L N F T D G G D G G S P TgatggaggttctccaacaactacgaacaagaattatgtcaccaagttggtaactctgcgctctatgggagacaaactcatgacttgcaaagatgaaaatgattgctccgatcaactgT T N K N Y V T K L V T L R S M G D K L M T C K D E N D C S D Q L V C K S G KgtctgcaaaagtggaaaatgccccagtgctgggtccaaccctactagcgggtcttgtgagtgggagggacactgtgctggtgcgtctgattgaC P S A G S N P T S G S C E W E G H C A G A S D -
Similitud con quitosanasas fúngicas (Familia GH-75).
Estructura de la proteína PgChP.
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
ResultadosE. Caracterización de la cepa Penicillium chrysogenum AS51D.
E.2.1. Obtención de la secuencia completa del gen pgchp mediante RACE-PCR.
Presencia de glicosilaciones.
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
Conclusiones1. La utilización de métodos de ácidos nucleicos han confirmado la identificación fenotípica previa, excepto para P. crustosum, que fue finalmente identificado como P. chrysogenum.
2. Se han diseñado métodos de detección específicos para las cepas seleccionadas que permitirán hacer un seguimiento del nivel de implantación en los productos cárnicos en que se inoculen.
3. P. chrysogenum Pg222 produce roquefortina en medios de cultivo pero no en carne. Por lo tanto podría utilizarse como cultivo iniciador en productos cárnicos.
4. P. chrysogenum RP42C produce penicilina en medio de cultivo y roquefortina en medios de cultivo y en carne, por lo que no debería utilizarse como cultivo iniciador en productos cárnicos. En su lugar podría utilizarse como aditivo la potente proteína antifúngica que produce.
5. S. xylosus Sx5EA no posee ninguno de los genes conocidos que codifican enterotoxinas, por lo que puede considerarse segura.
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
Difusión de los resultadosARTÍCULOS CIENTÍFICOS
• A. Rodríguez-Martín, R. Acosta, S. Liddell, F. Núñez, M.J. Benito y M.A. Asensio. Characterization of the novel antifungal protein PgAFP and the encoding gene of Penicillium chrysogenum. Peptides. En prensa.
• A. Rodríguez-Martín, S. Liddell, R. Acosta, F. Núñez y M.A. Asensio. Characterization of PgChP, a novel chitosanase with antifungal activity from Penicillium chrysogenum. Applied Environmental Microbiology. En preparación.
COMUNICACIONES A CONGRESOS• F. Núñez, M.A. Asensio, B. Sánchez, A. Rodríguez, y E. Bermúdez. Diseño de un método de PCR en tiempo real para diferenciación de la cepa Pg222 de Penicillium chrysogenum. XVI Congreso Nacional de Microbiología de los Alimentos. Córdoba, 14-17 Septiembre, 2008.
DEPÓSITOS DE CEPA EN LA CECT
DEPÓSITO DE SECUENCIAS EN GENBANK
• Penicillium chrysogenum AS51D productor de PgChP (CECT 20753).
• Secuencia completa de 404 bp de la proteína antifúngica PgAFP de la cepa Penicillium chrysogenumRP42C. 14/oct/2009 (GQ911150).
• Depósito de la secuencia completa de 1146 bp de la proteína quitosanasa PgChP de la cepa Penicillium chrysogenum AS51D (en trámite).
Caracterización de P. chrysogenum, P. crustosum, D. hansenii y S. xylosus
Aplicación de los resultados TESIS DOCTORALES
• A. Rodríguez-Martín. Caracterización de proteínas con actividad antifúngica producidas por Penicillium chrysogenum. Universidad de Extremadura, 2009 (5 artículos científicos, 4 comunicaciones a congresos).
CONVENIOS CON EMPRESAS• IBEDROCHES, Implantación de tecnologías innovadoras en el proceso de elaboración del jamón ibérico de los Pedroches. Participantes: COVAP, Embutidos Camilo Ríos S.L., Hermanos Rodríguez Barbancho S.L., IBESA. Financiación CDTI
• M.J. Andrade Gracia. Caracterización de levaduras de interés en jamón ibérico mediante técnicas de ácidos nucleicos. Universidad de Extremadura, 2009 (5 artículos científicos, 3 comunicaciones a congresos).
OTROS• Jornadas técnicas de transferencia tecnológica “Higiene y seguridad microbiológica de los productos cárnicos madurados”. Universidad de Extremadura.
Difusión de los resultados
SERVICIOS• Servicio de Innovación en Productos de Origen Animal. Universidad de Extremadura
• Máster en Ciencia y Tecnología de la Carne. Universidad de Extremadura.
