Programa de Posgrado en Ciencias en Física de Materiales · funcionalizada capaz de unirse con los...

Centro de Investigación Científica y de Educación

Superior de Ensenada, Baja California

Programa de Posgrado en Ciencias

en Física de Materiales

Nanomateriales luminiscentes como bioetiquetadores de

células de cáncer

Tesis

para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de

Doctor en Ciencias

Presenta:

Dalia Holanda Chávez García

Ensenada, Baja California, México. 2016

i

Tesis defendida por

Dalia Holanda Chávez García

y aprobada por el Comité

Dra. Olivia Amalia Graeve

Dr. Alejandro Huerta Saquero

Dr. Mario Humberto Farías Sánchez

Dr. Leonel Susano Cota Araiza Coordinador del Posgrado en Física de

Materiales

Dra. Rufina Hernández Martínez

Directora de Estudios de Posgrado

Dalia Holanda Chávez García © 2016

Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso del autor y director de tesis

Dr. Gustavo Alonso Hirata Flores Dra. Karla Oyuky Juárez Moreno . Codirector Codirectora

eliminar línea para firma, solo firman los codirectores

ii

Resumen de la tesis que presenta DALIA HOLANDA CHÁVEZ GARCÍA, como requisito

parcial para la obtención del grado de Doctor en Ciencias en Física de materiales

Nanomateriales luminiscentes como bioetiquetadores de células de cáncer

Resumen aprobado por:

Dr. Gustavo Alonso Hirata Flores Dra. Karla Oyuky Juárez Moreno Codirector de Tesis Codirectora de Tesis

Este trabajo de investigación se enfoca en la síntesis y caracterización de

nanopartículas (NPs) de conversión ascendente, que tienen la capacidad de absorber

energía infrarroja de 980 nm de longitud de onda y emitir en el espectro visible en rojo

y/o verde. Las nanopartículas luminiscentes fueron recubiertas con una capa delgada

de sílica de 3 a 5 nm de espesor y funcionalizadas con grupos aminos y ácido fólico. El

propósito es utilizarlas como bioetiquetadores de células de cáncer de mama y cáncer

cervicouterino. Las NPs luminiscentes se sintetizaron por los métodos de sol-gel y

síntesis por combustión, siendo el método de sol-gel fue el óptimo en cuanto a forma y

tamaño de las nanopartículas. Se investigaron varias concentraciones de los iones de

Er3+ e Yb3+ en las redes cristalinas de Y2O3 y Gd2O3 y después de la caracterización se

seleccionaron las NPs con mejor luminiscencia. Los resultados indican que las

nanopartículas de Gd2O3: Er3+/Yb3+ (1%,10%), Y2O3: Er3+/Yb3+ (1%,1%) y (1%,10%)

sintetizadas por el método de sol-gel presentan las mejores propiedades luminiscentes,

tamaño y forma para aplicaciones como bioetiquetadores de células cancerígenas. Las

NPs fueron recubiertas con una capa de sílica y funcionalizadas con aminosilanos y

posteriormente caracterizadas con el microscopio electrónico de transmisión (TEM),

espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) y espectrofotómetro de

luminiscencia. Los resultados indican que la recubierta de sílica es uniforme alrededor

de las nanopartículas luminiscentes y que el ácido fólico se enlaza químicamente a la

superficie de las NPs a través de los grupos amino. Esto resultó en una nanopartícula

funcionalizada capaz de unirse con los receptores de ácido fólico sobre-expresados en

las células de cáncer cervicouterino y de mama. Se realizaron ensayos de citotoxicidad

y se determina que las NPs al desnudo presentaban baja toxicidad en las células, pero

al ser funcionalizadas con ácido fólico, la citotoxicidad fue casi nula. Se comprobó

mediante microscopía confocal, que las nanopartículas se internalizaban en el

citoplasma de las líneas celulares de cáncer de cervix y mama, comprobando así la

hipótesis planteada de que pueden funcionar como bioetiquetadores de células

cancerígenas.

Palabras Clave: Sol-gel, síntesis por combustión, conversión ascendente,

bioetiquetadores, aminosilanos, funcionalización, ácido fólico.

Solo inicial mayúscula D H C y G

iii

Abstract of the thesis presented by DALIA HOLANDA CHÁVEZ GARCÍA as a partial

requirement to obtain the Doctor of Science degree in Physics of materials

Luminescent nanomaterials to be used as biolabels for cancer cells

Abstract approved by:

Dr. Gustavo Alonso Hirata Flores Dra. Karla Oyuky Juárez Moreno Codirector de Tesis Codirectora de Tesis

This research is focused on the synthesis and characterization of upconversion

nanoparticles (NPs), which possess the ability to absorb near infrared energy (λ= 980

nm) and upconvert it to emit in green (λ=550 nm) or red (λ=660 nm) wavelengths. The

luminescent NPs were coated with a thin silica layer of 3 to 5 nm thickness and

functionalized with amino groups and folic acid (FA). The goal is to develop a system to

be used as cell biolabels for breast and cervical cancer detection. The luminescent NPs

were synthesized by the sol-gel and combustion synthesis methods. The sol-gel method

produced nanoparticles with best shape and size. Various doping concentrations were

tested with the host lattices of Y2O3 and Gd2O3, using ions Er3+ and Yb3+. After

characterization, the UCNPs that exhibited improved properties of size, shape and

luminescence were chosen, these being Gd2O3: Er3+, Yb3+ (1%, 10% mol), Y2O3: Er3+,

Yb3+ (1%, 1% mol) and (1%, 10% mol) synthesized by the sol-gel method. The NPs

were coated with a thin silica shell and functionalized with aminosilanes and

characterized by transmission electron microscope (TEM), infrared spectroscopy (FTIR)

and photoluminescence spectra. The results confirmed that a uniform silica coating is

deposited around the nanophosphor surface and folic acid (FA) was linked to amino

groups. The functionalized NPs were able to bind to folate receptors which are

overexpressed in cervical and breast cancers cells. In the cytotoxicity tests conducted, it

was found that bare nanoparticles showed smooth toxicity in cancer cells, but after

functionalization with folic acid, their cytotoxicity was almost nullify. It was demonstrated

by confocal microscopy, that the nanoparticles were internalized into the cancer cells

cytoplasm, confirming the hypothesis that they can function as biolabels of breast and

cervical cancer cells.

Keywords: Sol-gel, combustion synthesis, up-conversion, biolabels, aminosilanes,

functionalization, folic acid.

iv

Dedicatoria:

A mi esposo Héctor Escoffery, a mis hijos

Priscila y André Escoffery y sobre todo a mis

Padres que me dieron la vida.

v

Agradecimientos A mi esposo Héctor Escoffery y mis hijos Priscila y Héctor André Escoffery Chávez por su gran amor, apoyo, paciencia y comprensión a lo largo de mis estudios. A mis padres Juanita García (QEPD) y Florencio Chávez que me dieron la vida y que me han apoyado siempre. A mis tíos Jaime Romero y Martha García por todo su apoyo a lo largo de mi vida. Al Dr. Gustavo Alonso Hirata Flores y la Dra. Karla Oyuky Juárez Moreno por su dirección, apoyo, paciencia, amistad y confianza durante toda mi tesis. Al comité de tesis conformado por Dr. Mario Farías, Dr. Alejandro Huerta y la Dra. Olivia Graeve por su tiempo dedicado, observaciones y su apoyo en los avances, la revisión y desarrollo de este proyecto. A la Dra. Laura Viana, Dr. Leonel Cota, Cynthia González y Laura Rosales por todo su apoyo en el posgrado. Al personal académico y técnico del CICESE y CNyN-UNAM. M.C. Eloisa Aparicio por su apoyo técnico en difracción de rayos X. M.C. Francisco Ruiz por su apoyo en las mediciones del microscopio de transmisión electrónica. Al Dr. Felipe Castillon por su apoyo para los análisis de FTIR.

vi

Lic. Juan Antonio Peralta y Aritz Barrondo responsable del laboratorio de cómputo por toda su ayuda. Al personal administrativo del CICESE y CNyN-UNAM que siempre tuvieron la atención y servicio con una sonrisa. A todos los que fueron mis profesores por todas sus enseñanzas Al CoNaCyT por su apoyo económico. A mi familia que siempre estuvo presente.

A mis amigos que siempre estuvieron ahí apoyándome.

vii

Tabla de contenido

Página

Resumen en español……………………………………...……...……….. ii

Resumen en inglés…………………………………………………...…… iii

Dedicatorias………………………………………………………..………… iv

Agradecimientos…………………………………………………..………... v

Lista de figuras…………………………………………………….…..….… xi

Lista de tablas……………………………………………………….………. xviii

Capítulo 1. Introducción. 1

1.1. Antecedentes………………………………………………………… 4

1.1.1. Bioimagen en la nanotecnología…………………………… 4

1.1.2. Puntos cuánticos………………………………………………. 5

1.1.3. Nanopartículas de conversión ascendente…………………. 6

1.2 Hipótesis………………………………………………………………. 12

1.3 Objetivo general………………………………………………………. 12

1.4 Objetivos específicos………………………………………………… 12

Capítulo 2. Marco teórico 13

2.1 Materiales luminiscentes de conversión ascendente……………. 13

2.2 Tipos de conversión ascendente…………………………………… 14

2.3 Redes cristalinas…………………………………………………….. 18

2.4 Co-dopajes con iones lantánidos en conversión ascendente….. 19

2.5 Nanopartículas de conversión ascendente como

bioetiquetadores………………………………………………………

20

2.6 Método síntesis……………………………………………………….

2.6.1 Método síntesis por Sol-gel……………………………………..

22

22

2.6.2 Método de Síntesis por combustión…………………………… 22

2.7 Caracterización. ………………………………………………………. 23

2.7.1 Difracción de rayos-X (XRD)………………………………….. 23

viii

2.7.2 Microscopio electrónico de transmisión (TEM)………………. 25

2.7.3 Espectroscopia de energía dispersiva (EDS)………………... 25

2.7.4 Espectrofluorómetro…………………………………………….. 26

2.7.5 Espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier

(FTIR) …………………………………………………………....

26

2.8 Funcionalización y recubierta de sílica por el método

APTES/TEOS……………………………………………………….

28

2.9 Funcionalización con ácido fólico…………………………………… 31

2.10 Ensayos de citotoxicidad………………………………………….. 34

2.11 Microscopio confocal……………………………………………….. 35

Capítulo 3. Materiales y métodos 37

3.1 Síntesis de las nanopartículas……………………………………… 37

3.1.1 Síntesis de la red anfitriona Y2O3 con Erbio e Iterbio………….. 37

3.1.1.1 Método de Síntesis por Combustión………………………. 37

3.1.1.2 Método de Sol-gel…………………………………………… 38

3.1.2 Síntesis de la red anfitriona Gd2O3 con Erbio e Iterbio………... 39

3.1.2.1 Método de Síntesis por Combustión………………………. 39

3.1.2.2 Método de Sol-gel…………………………………………… 40

3.2 Sonicación de las nanopartículas…………………………………... 41

3.3 Funcionalización de las nanopartículas…………………………… 41

3.3.1 Funcionalización con aminosilanos por el método

APTES/TEOS………………………………………………….

41

3.3.2 Funcionalización de las nanopartículas con ácido fólico…. 42

3.4 Pruebas de citotoxicidad…………………………………………… 43

3.4.1 Cultivos celulares………………………………………………

3.4.2 Ensayo de viabilidad celular por reducción del MTT……….

43

44

3.4.3 Ensayo azul tripano…………………………………………… 45

3.4.4 Análisis estadístico……………………………………………. 46

3.5 Imágenes por microscopía confocal…………………………….. 46

ix

Capítulo 4. Resultados y discusión. 48

4.1 Análisis de Y2O3: Er3+, Yb3+………………………………………… 48

4.1.1 Análisis de la morfología y estructura……………………….. 48

4.1.2 Análisis de fotoluminiscencia…………………………………. 52

4.2 Análisis de Gd2O3: Er 3+, Yb3+……………………………………… 55

4.2.1 Análisis de la morfología y estructura………………………… 55

4.2.2 Análisis de fotoluminiscencia…………………………………. 59

4.3 Análisis de la funcionalización de las nanopartículas por el

método APTES/TEOS…………………………………………………..

64

4.3.1 Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)… 64

4.3.2 Análisis de espectroscopía de energía dispersiva (EDS)… 66

4.3.3 Análisis de fotoluminiscencia………………………………… 71

4.3.4 Análisis de espectroscopía de infrarrojo por transformada

de Fourier (FTIR) ………………………………………………………

72

4.4 Análisis de la funcionalización con ácido fólico…………………… 75

4.4.1 Análisis de Microscopía electrónica de transmisión (TEM)… 76

4.4.2 Análisis de Espectroscopía de infrarrojo por transformada

de Fourier (FTIR)……………………………………………………….

76

4.4.3 Análisis de fotoluminiscencia………………………………….. 78

4.5 Análisis biológico……………………………………………………. 80

4.5.1 Análisis de citotoxicidad con el ensayo MTT………………… 80

4.5.1.1 Análisis de citotoxicidad de NPs al desnudo y

funcionalizadas con APTES/TEOS……………………………….

80

4.5.1.2 Análisis de citotoxicidad de NPs funcionalizadas con

ácido fólico. …………………………………………………………

84

4.5.2 Análisis de citotoxicidad con azul tripano……………………. 87

4.5.3 Análisis por microscopía confocal……………………………. 89

Capítulo 5. Conclusiones……………………………………………………

Lista de referencias bibliográficas…………………………………………

96

98

x

Apéndices………………………………………………………………………

Apéndice A. Fichas de difracción de rayos X de las bases de datos de

JCPDS utilizadas en esta tesis……………………………………………….

Apéndice B. Artículos publicados derivados del trabajo de investigación

de la tesis………………………………………………………………………..

104

104

105

xi

Lista de figuras

Figura Página

1 Proceso de absorción de energía de la red, el activador absorbe la energía, es excitado y emite fotones (Adaptada de Blasse y Grabmaier, 1994) …………………………………………………………..

2

2 Figura que muestra la investigación Ai y colaboradores con nanopartículas de oro funcionalizadas con ácido fólico, las cuales fueron unidas a céulas de cáncer de mama (Adaptada de Ai, et al, 2012) ………………………………………………………………………...

7

3 (a) Representación esquemática del proceso de conversión ascendente (ESA). Las flechas hacia arriba representan la excitación directa de un electrón a un nivel más alto de energía, las flechas hacia abajo representan la relajación en forma de radiación………………………………………………………………..

(b) Representación esquemática del proceso de transferencia de energía ascendente (ETU). Las flechas punteadas representan la relajación no radiactiva, las flechas punteadas curveadas representan transferencia de energía y la flecha punteada hacia arriba es excitación indirecta de un electrón. (los fotones de entrada y salida fueron omitidos por claridad) (Zhang, 2010)…….

9

9

4 (a) Ilustración de un nanomaterial dopado con un lantánido con una gran proporción de iones en su superficie……………………………….

(b) Los iones son confinados en el interior de un recubrimiento o coraza (Shell) que cubre la superficie de la nanopartícula (Lin, et. al, 2012) ………………………………………………………………………….

10

10

5 Diagramas parciales de los niveles de energía 4fn de los iones lantánidos (Liu, et al, 2013) ……………………………………………….

14

6 Principales procesos de conversión ascendente de nanopartículas dopadas con lantánidos. (a) ESA, (b) ETU, (c) CSU, (d) CR, (e) PA. Las líneas rojas representan excitación con fotones, las violetas transferencia de energía y las verdes emisión de energía (Zhang, 2015) ………………………………………………………………………….

15

7 Estado excitado de absorción (ESA) para el ion Er3+. (Yang, 2013)…. 16

xii

8 Proceso transferencia de energía de conversión ascendente (ETU) para los iones Yb3+ y Er3+ (Chen, et al, 2007)…………………………..

17

9 Representación de una familia de planos que cumplen con la Ley de Bragg. (Ashcroft, 1976) ……………………………………………………

24

10 Hidrólisis en el proceso de silanización (Arkles, 1977)………………… 29

11 Condensación en el proceso de silanización (Arkles, 1977)………….. 30

12 Secado en el proceso de silanización (Arkles, 1977)…………………. 30

13 Proceso completo de la funcionalización APTES/TEOS con las NPs..

31

14 Estrutura del ácido fólico. Los grupos carboxilos α y γ están indicados. (Sudimack, et al, 2000)……………………………………….. 32

15 Proceso de internalización en una célula por vía FA-FR (Sudimack, et al, 2000) ………………………………………………………………….. 33

16 Proceso que muestra el tejido vascular defectuoso de una célula

tumoral en comparación con un tejido sano, lo que permite una

penetración de las NPs dentro de la célula. (Adaptado de Zwicke, et

al, 2012) ……………………………………………………………………… 48

17 Patrones de difracción de Y2O3:Er3+/Yb3+, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de CS: a) JCPDS no. 89-5592 [Y2O3]; b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,1%) a 1100°C; c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,5%) a 1100°C y d) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%) 1200°C………………………………………………………………………..

49

18 Patrones de difracción de Y2O3:Er3+/Yb3+, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de SG: a) JCPDS no. 89-5592 [Y2O3]; b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,1%) a 1100°C; c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,5%) a 1000°C y d) Y2O3:Er3+/Yb3+(1%,10%) a 1200°C………………………………………………………………………..

50

19 Imágenes de TEM de Y2O3 al desnudo sintetizadas por SC con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,1%), b) Er3+/Yb3+ (1%,5%) y c) Er3+/Yb3+ (1%,10%)……………………………………………………………………..

46

20 Imágenes de TEM de Y2O3 al desnudo sintetizadas por SG con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,1%), b) Er3+/Yb3+ (1%,5%) y c) Er3+/Yb3+ (1%,10%)………………….…………………………………………………

..

51

xiii

21 Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Y2O3:Er3+/Yb3+sintetizadas por el método de SC con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,1%), b) Er3+/Yb3+ (1%,5%) y c) Er3+/Yb3+ (1%,10%)…..

53

22 Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Y2O3:Er3+/Yb3+sintetizadas por el método de SG con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,1%), b) Er3+/Yb3+ (1%,5%) y c) Er3+/Yb3+ (1%,10%)…..

54

23 Patrones de difracción de Gd2O3:Er3+/Yb3+, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de CS: a) JCPDS no. 88-2165 [Gd2O3]; b) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%) a 900°C; c) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (2%,3%) a 800°C, d) Gd2O3:Er3+ (1%) a 900°C y e) Gd2O3:Yb3+ (2%) a 900°C…………………………………………………

55

24 Patrones de difracción de Gd2O3:Er3+/Yb3+, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de SG: a) JCPDS no. 88-2165 [Gd2O3]; b) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%) a 800°C; c) Er3+/Yb3+ (2%,3%) a 800°C, d) Gd2O3:Er3+ (1%) a 900°C y e) Gd2O3:Yb3+ (2%) a 900°C…………………………………………………

56

25 Imágenes de TEM de Gd2O3 al desnudo sintetizadas por SC con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Er3+/Yb3+ (2%,3%), c):Er3+ (1%) y d) Yb3+ (2%) …………………………………………………………………

57

26 Imágenes de TEM de Gd2O3 al desnudo sintetizadas por SG con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Er3+/Yb3+ (2%,3%), c):Er3+ (1%) y d) Yb3+ (2%) …………………………………………………………………

58

27 Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Gd2O3:Er3+/Yb3+sintetizadas por el método de SC con el dopaje Er3+/Yb3(1%,10%)…………………………………………………………..

59

28 Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Gd2O3:Er3+/Yb3+sintetizadas por el método de SC con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (2%,3%) y b) Er3+ (1%)…………………………………………

60

29 Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Gd2O3:Er3+/Yb3+sintetizadas por el método de SG con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,10%) y b) Yb3+ (2%), solo hubo emisión a 900oC……...

61

30 Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Gd2O3:Er3+/Yb3+sintetizadas por el método de SG con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (2%,3%) y b) Er3+ (1%)…………………………………………

62

31 Imágenes de TEM de Y2O3 con sílica sintetizadas por SC y SG con los dopajes a) Er3+/Yb3+ (1%,1%) SG, b) SC, c) Er3+/Yb3+ (1%,5%) SG, d) SC, e) Er3+/Yb3+ (1%,10%) SG y f) SC………………………….

65

xiv

32 Imágenes de TEM de Gd2O3 con sílica sintetizadas por SG y SC con el dopaje Er3+/Yb3+ (1%,10%) a) SG y b) SC…………………………… 66

33 Análisis por EDS de Y2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,1%) en el cual se muestra a) la nanopartícula con el escaneo lineal, b) elementos presentes en la muestra y c) gráfica con la distribución de los elementos del análisis lineal……………………………………………… 64

34 Análisis por EDS de Gd2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) en el cual se muestra a) la nanopartícula con el escaneo lineal, b) elementos presentes en la muestra y c) gráfica con la distribución de los elementos del análisis lineal……………………………………………… 68

35 Análisis por EDS de Y2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) en el cual se muestra a) la nanopartícula con el escaneo lineal y b) gráfica con la distribución de los elementos del análisis lineal…………………………………………………………………………. 70

36 Análisis por fotoluminiscencia de Y2O3 con Er3+/Yb3+ a) (1%,1%), b) (1%,10%) y c) Gd2O3:Er3+/Yb3 (1%,10%)……………………………….

71

37 Análisis por FTIR de Y2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,1%) a) al desnudo y b) UCNPs funcionalizadas por APTES/TEOS…………………………….

72

38 Análisis por FTIR de Y2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) a) al desnudo y b) UCNPs funcionalizadas por APTES/TEOS…………………………….

73

39 Análisis por FTIR de Gd2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) a) al desnudo y b) UCNPs funcionalizadas por APTES/TEOS………………………….

74

40 Imágenes de TEM de las UCNPs funcionalizadas con ácido fólico, sintetizadas por SG a) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,1%), b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%) y c) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%)………………………………

76

41 Análisis por FTIR de Y2O3 con Er3+/Yb3+ al a) (1%,1%) y b) (1%,10%) funcionalizadas por ácido fólico……………………………..

77

42 Análisis por FTIR de Gd2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) funcionalizadas por ácido fólico………………………………………………………………

78

43 Análisis por fotoluminiscencia de Y2O3 con Er3+/Yb3+ al desnudo y con FA de los dopajes a) (1%,1%) y b) (1%,10)……………………….. 79

44 Análisis por fotoluminiscencia de Gd2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) al desnudo y con FA…………………………………………………………..

79

xv

45 Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con aminosilanos (barras grises) incubadas en células HeLa. a) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%). Los resultados representan la media y desviación estándar de 3 ensayos independientes.*p<0.05; ** p<0.01 and ***p<0.001…………………….

82

46 Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con aminosilanos (barras rayadas) incubadas en células de cáncer colorectal DLD-1. a) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%). Los resultados representan la media y desviación estándar de 3 ensayos independientes.*p<0.05; ** p<0.01 and ***p<0.001……….

86

47 Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con ácido fólico (barras negras) incubadas en células HeLa. a) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%)……………

86

48 Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con ácido fólico (barras negras) incubadas en células de cáncer de mama MCF-7. a) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%)…………………………………………………………………………..

86

49 Ensayo de azul tripano con incubación por 24 hr de las UCNPs con ácido fólico incubadas en células de cáncer de mama. En azul se muestra el porcentaje de células vivas respecto del porcentaje de células muertas (barras rojas) a) Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%)……………

88

50 Microscopia confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) en células HeLa. a) Tinción nuclear con DAPI emitiendo a 461 nm, la letra N indica la posición del núcleo de las células, b) excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + EGFP, la flecha indica la localización de las nanopartículas en el citoplasma de la célula y c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en la región citoplasmática…………………. 89

51 Microscopía confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,

1%) en células de cáncer de mama MDA-MB-231. a) Tinción

nuclear con DAPI emitiendo a 461 nm, la letra N indica la posición

del núcleo de las células, b) excitación de las UCNPs con láser NIR

980 nm + EGFP, la flecha indica la localización de las nanopartículas

en la región citoplasmática de la célula y c) traslape de

DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las

UCNPs en el citoplasma…………………………………………………. 90

xvi

52 Microscopia confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,

10%) incubadas con células de cáncer HeLa. a) El colorante DAPI

muestra la localización del núcleo, el cual emite a 461 nm, la letra N

indica la posición del núcleo de las células, b) excitación de las

UCNPs con láser NIR 980 nm + RFP, la flecha indica la localización

de las nanopartículas en el interior de las células c) traslape de


UCNPs en el citoplasma………………………………………………….. 91

53 Microscopía confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%) incubadas con células de cáncer de mama MDA-MB-231. a) Se observa la tinción nuclear con DAPI, el cual emite a 461 nm, la letra N indica la posición del núcleo de las células, b)Se observa la excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + RFP, la flecha indica la localización intracelular de las nanopartículas y c) traslape de DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma , se agregó como referencia el fondo en campo claro de las células para apreciar mejor las UCNPs………….. 91

54 Micrografía confocal de las células de cáncer cevicouterino, HeLa, incubadas con UCNP-NH2-FA de Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%). a) La tinción nuclear con DAPI emitiendo a 461 nm, se indica con la letra N b) La excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + RFP, está indicada por una flecha y c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma celular………………………………………………………………………… 92

55 Micrografía confocal de células de cáncer de mama MDA-MB-231

incubadas con UCNP-NH2-FA de Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%). a)

Tinción nuclear con DAPI, “N” indica la posición del núcleo de las

células, b) la flecha indica la localización intracelular de las UCNPs

excitadas con láser NIR 980 nm + RFP, y c) traslape de


UCNPs en el citoplasma, se agregó como referencia el fondo de las

células para apreciar mejor las UCNPs…………………………………. 92

56 Figura 56. Micrografía confocal de células de cáncer de mama MCF-

7 incubadas con UCNP-NH2-FA de Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%). a)




DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las


células para apreciar mejor las UCNPs………………………………… 93

xvii


7 incubadas con UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%). a)



excitadas con láser NIR 980 nm + EGFP, y c) traslape de





7 incubadas con UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%). a)




DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las



xviii

Lista de tablas

Tabla Página

1 Muestras realizadas con la red anfitriona Y2O3………………… 38

2 Muestras realizadas con la red anfitriona Gd2O3………………. 40

3 UCNPs seleccionadas para continuar con la investigación después de un análisis de sus propiedades…………………….. 67

1

Capítulo 1. Introducción

La luminiscencia es la propiedad que presentan algunos materiales de emitir luz

cuando son sometidos a determinada fuente de energía. Presentan esta

capacidad ciertos minerales y sulfuros metálicos. Los sistemas luminiscentes

pueden ser sólidos, líquidos o gaseosos y muchos se encuentran en la naturaleza;

generalmente para aplicaciones tecnológicas son creados por el hombre.

Un material luminiscente convierte ciertos tipos de energía en radiación

electromagnética. Esta radiación se encuentra usualmente en el intervalo visible,

pero puede estar también en otros intervalos espectrales, como el ultravioleta y el

infrarrojo. Para que el fenómeno de la luminiscencia pueda ocurrir, el material

luminiscente deberá estar formado por una red anfitriona, que generalmente está

compuesta por un nitrato, un sulfato o un óxido y por lo menos un ion o activador

de algún elemento que pertenece a las tierras raras. Cuando este activador

absorbe la radiación, ocasiona un estado excitado del electrón. Este es impulsado

de su estado inicial, también llamado estado base, al siguiente nivel de energía.

Al regresar el electrón a su estado base emite luz. Tambien hay una liberación de

fonones, en menor cantidad que se presenta como vibraciones de la red cristlina.

Ver figura 1 (Blasse y Grabmaier, 1994; Shionoya, 1999).

La emisión de luz ocurre en un tiempo característico τ, después de la absorción de

la radiación incidente. A partir de este parámetro se subdivide la luminiscencia en

dos tipos: fluorescencia, en la cual se restringe a la luminiscencia causada por

rayos ultravioleta y se caracteriza por tener un tiempo característico τ < 10-8 s y la

fosforescencia, que es la luminiscencia que perdura una vez cortada la excitación.

Se considera fosforescencia si τ > 10-8 s.

http://es.wikipedia.org/wiki/Fluorescencia

http://es.wikipedia.org/wiki/Fosforescencia

2

Figura 1. Proceso de absorción de energía de la red, el activador absorbe la energía, es excitado y emite fotones (Adaptada de Blasse y Grabmaier, 1994).

Según el tipo de energía que puede producir la luminiscencia, esta se clasifica en:

fotoluminiscencia que se produce al excitar el material con un haz de fotones,

generalmente ultravioleta; la cátodoluminiscencia con un haz de electrones

energéticos; la electroluminiscencia con un campo eléctrico; la triboluminiscencia

con energía mecánica; radioluminiscencia con rayos-X y la quimioluminiscencia

con una reacción química (Blasse y Grabmaier, 1994).

La nanociencia y la nanotecnología están relacionadas con la síntesis,

caracterización, exploración y explotación de materiales nanoestructurados, los

cuales tienen dimensiones entre un nanómetro (1 nm=10-9 m) y hasta 100 nm. La

síntesis de nanomateriales incluye control del tamaño, forma y estructura. Las

nanoestructuras individuales pueden ser cúmulos, puntos cuánticos, nanocristales,

nanotubos, entre otros. Una colección de nanoestructuras incluye arreglos,

ensambles o superceldas de nanoestructuras individuales (Yury, 2006). Entre los

materiales luminiscentes que han sido sintetizados en el laboratorio, encontramos

que también pueden ser de tamaño nanométrico.

Cuando los nanomateriales son biocompatibles, se llaman biomateriales. Un

biomaterial es un compuesto farmacológicamente inerte diseñado para ser

Fotones Energía incidente

Activador Red anfitriona

Fonones

http://es.wikipedia.org/wiki/Farmacolog%C3%ADa

http://es.wikipedia.org/wiki/Inerte

3

implantado o incorporado dentro de un organismo vivo. De esta forma, los

biomateriales se pueden implantar con el objetivo de sustituir o regenerar tejidos y

sus funciones, para marcar células o para transportar medicamento a lugares

específicos (Lin, et al, 2011).

El desarrollo de bionanomateriales surge a raíz de buscar nuevas herramientas

de análisis a nivel celular y molecular, las cuales permiten el desarrollo de nuevas

tecnologías para el diagnóstico y tratamiento de diferentes enfermedades. Los

biomateriales se están usando en miles de aplicaciones médicas, pero todavía se

necesita trabajar en mejores diseños para mejorar los sistemas actuales (Yury,

2006).

Las aplicaciones de la nanotecnología en el cáncer constituyen un área

interdisciplinaria que comprende la física, la química, la biología, la ingeniería y la

medicina, para producir diversas aplicaciones como imagen molecular, diagnóstico

molecular y la terapia enfocada a nivel celular. Los bionanomateriales tienen

propiedades útiles y necesarias para lograr estas aplicaciones, que otros

materiales usados anteriormente no tenían. Dichas propiedades mejoradas

incluyen las ópticas, magnéticas o estructurales (Nie, et al, 2007).

Los bioetiquetadores son nanopartículas que pueden ser dirigidas a una célula

mediante ligandos específicos para unirse a ella, algunas de las características

que se desean en ellos es que deben ser inertes y de preferencia no deben afectar

o reconocer a otros tipos celulares que pudieran estar en su vecindad (Cho, et al,

2008). Su alta afinidad y especificidad permite que sean dirigidos hacia células

tumorales. En el intervalo de tamaños de 5 a 100 nm, estas nanopartículas

presentan superficies grandes que se pueden utilizar en múltiples diagnósticos,

como los ópticos, radio-isotópicos o magnéticos (Nie, et al, 2007).

Dos características importantes que deben ser consideradas al momento de

diseñar y utilizar nanopartículas como bioetiquetadores son la capacidad de poder

4

funcionalizarlas con diferentes moléculas orgánicas y que sean biológicamente

inertes. En la mayoría de los casos, debido a la composición química de las

nanopartículas, al exponerse a un sistema biológico (in vitro o in vivo) pueden ser

tóxicas, inmunogénicas y estimular la respuesta inmunológica (Lin, et al, 2011);

por lo tanto, una de las tendencias actuales es recubrirlas para hacerlas

biológicamente inertes. Este proceso se realiza mediante la utilización de

polímeros sintéticos como el polietilenglicol (PEG); el ácido poli-L-glutámico

(PGA); el copolímero N-(2-hidroxipropil)-metalacrilamida (HPMA) o polímeros

naturales como la albúmina, quitosano y heparina. Una vez que las nanoparticulas

han sido recubiertas con algún polímero inerte, estas pueden ser funcionalizadas

con diferentes moléculas que actuarán como ligandos específicos para la

direccionalización hacia las células blanco (Destito, et al, 2007).

Todavía existen muchos retos en cuanto a la detección y tratamiento del cáncer.

El propósito de este estudio es crear un nanomaterial luminiscente que funcione

como bioetiquetador para células de cáncer de mama y cervicouterino. Los

bioetiquetadores actuales, en muchas ocasiones no presentan el color y la luz

deseada para le detección e imagen de tumores. El objetivo de esta investigación

es sintetizar nanopartículas con mejores propiedades luminiscentes, es decir, con

más duración, mejor intensidad, con forma óptima (esferoidal), dimensiones

nanométricas y con la capacidad de poder dirigirlas específicamente a las células

tumorales.

1.1 Antecedentes

1.1.1. Bioimagen en la nanotecnología

La bionanotecnología ha ido cambiando el enfoque de los tratamientos para evitar

los efectos secundarios que se tienen hoy en día con las quimioterapias y

radioterapias. En este sentido, la nueva tendencia es el direccionamiento

específico de los tratamientos hacia las células de cáncer, evitando su acción

5

sobre las células no transformadas. En este sentido, los primeros intentos en

tratamientos dirigidos a células cancerígenas de la bionanotecnología fueron con

puntos cuánticos, sin embargo se ha reportado que han resultado tóxicos para el

organismo cuando se administran en forma sistémica (Nie, et al., 2007). En el año

2008 se empieza a descubrir que los elementos lantánidos o tierras raras ofrecen

una posibilidad de usarse como bioetiquetadores, debido a su carácter

luminiscente. Es así, que los nanomateriales luminiscentes surgen como una

nueva alternativa para la detección de cáncer al ser funcionalizados para ser

biocompatibles, con recubrimientos como el PEG y la sílica, y que pueden ser

utilizados como bioetiquetadores y portadores de medicamentos

(nanoportadores).

Nie y colaboradores (2007), mencionan que la bioimagen es una herramienta de

diagnóstico importante en la investigación y la visualización de los fenómenos

biológicos en las células y en la medicina. Los métodos tradicionales de detección

de imagen in vivo o con agentes de contraste tales como la Tomografía de

Emisión de Positrones (TEP), están siendo reemplazados por nuevos métodos

para la imagen de células de cáncer, tales como las nanopartículas compuestas

con Gadolinio en resonancia magnética, los anticuerpos usados como

bioetiquetadores, los puntos cuánticos (QD), entre otros.

1.1.2 Puntos cuánticos

Los QD proporcionan características únicas debidas a su tamaño nanométrico y

sus propiedades físicas, que pueden ser ajustadas continuamente cambiando el

tamaño de la nanopartícula, ya que los QD emiten diferente longitud de onda al

variar su tamaño. Pero la ventaja de las nanopartículas luminiscentes sobre los

QD es que tienen más área superficial, lo que da cabida a un mayor número de

grupos funcionales que se le pueden adherir en su superficie, los cuales le

confieren a las nanopartículas la capacidad de ser utilizadas en múltiples

6

diagnósticos, como el radioisotópico, magnético y terapéutico. Esta característica

también brinda la oportunidad de diseñar nanopartículas multifuncionales

“inteligentes” para la formación de imágenes con multimodalidad, así como para la

formación de imágenes integradas (Nie et al, 2007).

Se han realizado imágenes in vivo con puntos cuánticos (QD) recubiertos con

polietilenglicol (PEG) en el torrente sanguíneo de ratones para investigar el tiempo

de circulación de la nanopartículas. En contraste con los tintes orgánicos que son

eliminados rápidamente del torrente circulatorio, los puntos cuánticos permanecen

en la circulación por aproximadamente tres horas. Estos QD fueron excitados con

fotones y se encontró que su magnitud en luminiscencia es más intensa que los

fluoróforos orgánicos. Otras investigaciones muestran que algunos QD para la

detección de cáncer vascular en animales vivos, no son muy eficientes como los

son in vitro, por lo que les agregaron un recubrimiento de copolímero ABC

(acrilonitrilo butadieno) que resolvió los problemas de acumulación y pérdida de

fluorescencia. También se realizaron estudios que muestran una buena

correlación entre los rayos-X y la imagen de fluorescencia de alta calidad con QD

para la detección de tumores pequeños. Pero se ha descubierto que los QD

pueden ser tóxicos en el organismo, por lo que su uso ha sido descartado por

algunos investigadores (Nie et al, 2007).

1.1.3 Nanopartículas luminiscentes de conversión ascendente

Se ha demostrado que las nanopartículas en el intervalo de tamaño de 10 a 100

nm se acumulan preferentemente en los lugares tumorales por medio de un efecto

de aumento de la permeabilidad y retención (EPR). Se cree que el efecto EPR,

surge a partir de dos factores: los tumores en crecimiento, producen el factor de

crecimiento vascular endotelial (VEGF) que promueve la angiogénesis, que es la

formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes y la segunda,

7

es que muchos tumores carecen de un tejido linfático eficaz para el sistema de

drenaje, lo que conduce a la acumulación de nanopartículas (Nie et al, 2007).

Un punto muy importante es el direccionamiento de la nanopartícula, con el

objetivo de que la NP pueda unirse específicamente a una célula tumoral o a un

tumor. Este acercamiento se logra mediante interacciones específicas del tipo

ligando-receptor, tales como el carbohidrato de lectina, los folatos o los

anticuerpos. El carbohidrato de lectina es muy usado para la entrega de

medicamentos. Los folatos, por otra parte, se encuentran sobreexpresados en la

superficie de las células cancerígenas de diferentes tipos, como el de ovario,

riñón, mama, cerebro y pulmón (Sudimack, et al, 2000). Estudios con resonancia

de plasmones en la superficie revelan que las nanopartículas recubiertas con PEG

o sílica y conjugadas con folatos tienen una alta afinidad para unirse a las células

con receptores de folato o ácido fólico, de manera más eficiente que las que no los

tienen. Los folatos o ligandos de ácido fólico están organizados en grupos y se

unen preferentemente a ligandos con varias valencias (Nie et al., 2007). Por

ejemplo Ai y colaboradores (2012) lograron unir NPs de oro funcionalizadas con

ácido fólico a células de cáncer de mama, como se aprecia en la figura 2.

Figura 2. Figura que muestra la investigación Ai y colaboradores con nanopartículas de oro funcionalizadas con ácido fólico, las cuales fueron unidas a células de cáncer de mama (Adaptada de Ai, et al, 2012).

8

Zhang y colaboradores se centraron en estudiar nanofósforos de tierras raras con

conversión ascendente (UCNP) los cuales son una clase particular de emisores,

cuya fotoluminiscencia es la diferencia fundamental entre los colorantes

convencionales (fluoróforos orgánicos) y los puntos cuánticos semiconductores.

Las técnicas de funcionalización para estos nanomateriales representan la

modificación de microestructuras y la mejora de las propiedades, con respecto a

las nanopartículas originales. También se hace hincapié en su aplicación en los

campos de investigación de bioetiquetadores y transferencia de energía, ya que su

alto rendimiento beneficia el espectro de excitación y sus propiedades de emisión

(Zhang, 2010).

El mecanismo de conversión ascendente fue propuesto por N. Bloembergen y se

denominó más tarde como estado excitado de absorción (ESA) o superexcitación,

que se muestra esquemáticamente en la figura 3, en donde se muestra el proceso

de absorción de dos fotones entre los tres niveles de energía. Un fotón con

energía de hν1 es absorbido por un ion intercalado en una matriz cristalina, lo que

promueve la transición electrónica del estado base E1 a un nivel intermedio

metaestable E2. El electrón excitado de E2 puede volver a E1 o también puede

absorber un fotón de energía hν2 y elevarse a un nivel aún más alto E3. Cuando

este electrón superexcitado cae de nuevo a E1, la energía puede ser relajada en

forma de radiación, teniendo una emisión de un fotón de hν3, donde ν3 es más

grande que ambos ν1 y ν2. En particular, cuando ν1 es aproximadamente igual a ν2,

sucede la conversión ascendente de una sola longitud de onda de excitación. A

pesar de que el mecanismo es simple, la emisión de conversión ascendente ESA

no era fácil de observar. Esto se debe, principalmente, a que el segundo fotón

debe ser capturado por un electrón en el nivel intermedio (E2) y la ocupación es

generalmente baja (Zhang, 2010).

Hay tres factores que determinan la ocupación en el estado metaestable excitado:

la potencia de la fuente de excitación, el tiempo de vida del estado metaestable, y

la sección transversal eficaz de la absorción de iones. El láser de alta potencia

9

puede usarse como fuente de excitación. Los iones de tierras raras son

ampliamente seleccionados como el activador luminiscente, ya que tienen altos

niveles de energía metaestables y tienen características de largos tiempos de vida

del estado excitado (por lo general 10-6-10-3s, en comparación con 10-9-10-6

segundos para iones convencionales). El proceso de absorción de la sección

transversal, además de la inherencia de cada ion en particular, también se puede

aumentar de forma efectiva si se involucran procesos de transferencia de energía

ascendente (ETU). Esto constituye otro aspecto básico muy importante además

del mecanismo ESA. Otros estudios recientes están incorporando el uso de ion

magnético de Gd3+, en la celda cristalina y puede sustituir completa o parcialmente

el ion Y3+ en la matriz principal (Zhang, 2010).

Figura 3 (a) Representación esquemática del proceso de conversión ascendente (ESA). Las flechas hacia arriba representan la excitación directa de un electrón a un nivel más alto de energía, las flechas hacia abajo representan la relajación en forma de radiación.

(b) Representación esquemática del proceso de transferencia de energía ascendente (ETU). Las flechas punteadas representan la relajación no radiactiva, las flechas punteadas curveadas representan transferencia de energía y la flecha punteada hacia arriba es excitación indirecta de un electrón. (los fotones de entrada y salida fueron omitidos por claridad) (Zhang, et al, 2010).

Las NPs que pueden ser excitadas con infrarrojo cercano (NIR) (= 650~900 nm),

prometen ser una tecnología útil para la administración de fármacos, ya que

10

puede penetrar la piel y el tejido, lo que permite la activación profunda dentro del

organismo. (Timko, et al, 2011). También las NPs basadas en elementos

lantánidos (Ln) con conversión ascendente ESA pueden ser utilizadas en

aplicaciones biomédicas con una funcionalización adecuada en su superficie.

Algunos de los métodos utilizados para la síntesis de nanopartículas dopadas con

Ln pueden ser: método de co-precipitación, método de descomposición térmica,

método de sol- gel, síntesis por combustión y método hidrotérmico. También

existen diferentes técnicas de funcionalización de las nanopartículas, es decir,

cómo poner el recubrimiento para hacerlos biocompatibles. En la figura 3 se

muestra un esquema de la funcionalización de las nanopartículas (Lin, et al, 2012).

Figura 4. (a) Ilustración de un nanomaterial dopado con un lantánido con una gran

proporción de iones en su superficie.

(b) Los iones son confinados en el interior de un recubrimiento o coraza (Shell) que cubre la superficie de la nanopartícula. (Lin, et. al, 2012)

Las NPs dopadas con lantánidos tienen excelentes propiedades ópticas y

magnéticas lo que las hace muy buenas candidatas para su uso como

biomarcadores luminiscentes o como agentes de contraste en imágenes de

resonancia magnética (MRI), de acuerdo con Hemmer y colaboradores (Hemmer,

et al, 2013). La conversión ascendente de fósforos es la obtención de longitudes

de onda más altas al excitar una partícula con longitudes de onda más bajas,

Iones lantánidos

Celda matriz

Ion interior

Celda matriz

Coraza

(a) (b)

11

como el Erbio (Er3+) dopado con Y2O3 que absorbe rayos infrarrojos (IR) y emite

radiación en el espectro visible. El infrarrojo cercano (NIR), en el cual absorben y

emiten materiales inorgánicos y compuestos orgánicos, está atrayendo la atención

y se han aplicado con éxito en bioetiquetadores fluorescentes y también como

herramientas de orientación de la imagen en la cirugía. El uso de la luz NIR (~

650-900 nm) como una fuente de excitación disminuye la fototoxicidad y

dispersión, además de que permite mayor penetración en el tejido debido a la

transparencia del NIR. Las NPs y nanotubos de Gd2O3: Er3+ y Yb3+ han sido

sintetizados por los métodos de precipitación y de síntesis hidrotermal.

Independientemente del tamaño y morfología, el compuesto Gd2O3: Er3+ y Yb3+,

en forma de polvos, muestra conversión ascendente (550 nm, 670 nm), con

emisión en NIR (1.5 µm) a 980 nm de excitación. Con respecto a su potencial

aplicación en bioimagen, la citotoxicidad es un aspecto importante y está

fuertemente influenciada por las propiedades fisicoquímicas de las

nanoestructuras investigadas (Hemmer, et al, 2013).

Gracias a numerosas investigaciones realizadas en el campo de la

bionanotecnología, los tratamientos contra el cáncer han ido cambiando y

mejorando, siendo actualmente el enfoque más a nivel celular., El uso de

elementos lantánidos, tierras raras, como agentes dopantes o activadores en

óxidos está teniendo un auge en la investigación, debido a sus propiedades antes

mencionadas, ya que pueden ser utilizados como bioetiquetadores y para

administración de fármacos. El propósito de esta investigación es seguir

estudiando estos materiales para su aplicación como bioetiquetadores de células

de cáncer, funcionalizarlos para hacerlos biocompatibles y lograr tener la

luminiscencia adecuada para su uso en imagenología.

12

1.2 Hipótesis

Las nanopartículas luminiscentes de óxidos dopados con lantánidos,

funcionalizadas con sílica y ácido fólico funcionan como bioetiquetadores de

células de cáncer.

1.2 Objetivo general

Sintetizar y caracterizar nanopartículas luminiscentes de óxidos dopados

con lantánidos que tengan conversión ascendente, funcionalizarlas con sílica

(SiO2) y ligandos de ácido fólico para evaluarlas como bioetiquetadores de células

de cáncer.

1.4 Objetivos específicos

1. Producción de nanopartículas de conversión ascendente de forma

esférica mediante diversas técnicas.

2. Caracterizar las nanopartículas mediante análisis de difracción de

rayos-X, de espectro infrarrojo (FTIR), espectrofluorómetro, entre

otros.

3. Funcionalizar las nanopartículas con sílica y ácido fólico

4. Verificar la funcionalización y tamaño de las nanopartículas mediante

espectroscopía FTIR y con el microscopio electrónico de transmisión

(TEM).

5. Realizar pruebas in vitro de citotoxicidad de las nanopartículas

funcionalizadas.

6. Evaluar la unión especifica de la nanopartícula a la célula de cáncer

y determinar su localización celular mediante microscopia confocal.

13

2. Marco teórico

2.1 Materiales luminiscentes de conversión ascendente

Los materiales luminiscentes de conversión ascendente tienen la habilidad de

absorber energía del espectro infrarrojo cercano (IRC) con = 980 nm y emitir en

el espectro visible (= 400-700 nm), la ventaja es que la longitud de onda de

emisión es más corta que la longitud de onda de excitación (Blasse, et al, 1994).

Y aunque actualmente, tienen una gran variedad de aplicaciones, el enfoque de

esta tesis es en aplicaciones biomédicas, específicamente en bioetiquetadores.

Los bioetiquetadores son materiales, en este caso NPs, que están funcionalizados

para unirse a una célula de cáncer, esto es se logra proporcionando el ligando

adecuado a la NP para que pueda unirse específicamente a un tipo celular e

internalizarse en el citoplasma por medio de la unión con un receptor en su

superficie. La NP debe tener un recubrimiento que proteja su durabilidad química y

evite el efecto citotóxico en las células y tejidos que no se quieren afectar.

Las NPs de conversión ascendente (UCNPs) tienen una red anfitriona cristalina

que normalmente es un óxido, sulfuro o fluoruro, el cual está dopado con iones de

tierras raras (RE) o lantánidos. Los elementos de las tierras raras están

localizados en la tabla periódica después del Lantano, desde el Cerio (número

atómico 58) con configuración electrónica 5s25p65d14f16s2 hasta el Yterbio con

numero atómico 70 y configuración electrónica 5s25p64f146s2. Estos átomos se

pueden insertar en la red anfitriona como cationes divalentes o trivalentes. En los

iones trivalentes, algunos electrones de los niveles 5d, 6s y algunos 4f son

removidos, y el ion (RE)3+ tiene transiciones entre los subniveles de energía de la

configuración 4fn (Solé, et al, 2005).

Las NPs luminiscentes basadas en lantánidos, tienen una estabilidad foto-física

pues los iones lantánidos están atrapados en una red cristalina rígida, que evita

14

las pérdidas de energía por agentes ambientales. La luminiscencia puede ser de

conversión descendente o ascendente, en la figura 5 se muestran los niveles

parciales de energía de los niveles 4fn de los iones lantánidos, los niveles de

luminiscencia principales están dibujados en rojo y el estado basal esta mostrado

en azul (Liu, et al, 2013). La conversión ascendente fue estudiada desde los años

sesentas, de forma independiente por Auzel, Ovsyankin, and Feofilov. La

conversión ascendente, tiene aplicaciones actuales en biomedicina, sensores de

temperatura, láseres de estado sólido, resonancia magnética, etc. (Yang, 2013).

Figura 5. Diagramas parciales de los niveles de energía 4fn de los iones lantánidos (Liu, et al,

2013).

II.2 Tipos de conversión ascendente

El proceso de conversión ascendente puede clasificarse en: estado excitado de

absorción (ESA por sus siglas en ingles), transferencia de energía de conversión

ascendente (ETU), conversión ascendente cooperativa (CSU), relajación cruzada

2.2 Tipos de conversión

15

(CR) o avalancha de fotones (PA). Estos procesos se observan en la figura 6

(Zhang, 2015).

En el estado excitado de absorción (ESA), la excitación sucede debido a una

sucesiva absorción de fotones desde el estado base, como se muestra en la figura

6 (a) y aplica para las NPs creadas en este estudio con la red Gd2O3 dopadas con

Er3+ al 1% molar o Yb3+ al 2% molar. En el caso del ion Er3+, al ser excitado con

fotones a una =980 nm, el electrón sube al nivel 4I9/2, como hay una sucesiva

excitación, sube de éste nivel al nivel superior 4S3/2, al regresar a su estado base

4I15/2 emite en verde (=563 nm), como se aprecia en la figura 7. Este proceso no

puede ser aplicado en todos los iones, solo en los que tengan este tipo de

estructura electrónica como Er3+, Ho3+, Tm3+, and Nd3+ (Yang, 2013).

Figura 6. Principales procesos de conversión ascendente de nanopartículas dopadas con lantánidos. (a) ESA, (b) ETU, (c) CSU, (d) CR, (e) PA. Las líneas rojas representan excitación con fotones, las violetas transferencia de energía y las verdes emisión de energía (Zhang, 2015).

16

Figura 7. Estado excitado de absorción (ESA) para el ion Er3+

(Yang, 2013).

El proceso de transferencia de energía de conversión ascendente (ETU), es

parecido a ESA en que hay una absorción secuencial de dos fotones que hacen

que los electrones suban a niveles de energía metaestables. A diferencia del ESA,

el ETU opera con dos iones, el ion sensibilizador que es excitado del estado base

al nivel de energía E1, en el caso del Yb3+ es el nivel 2F5/2, y el segundo ion, el

activador, que recibe un fotón del primero. El activador, que en el caso de este

estudio es el Er3+, es promovido del nivel 4I15/2 al nivel 4I11/2 (Figura 8), después

recibe otro fotón del sensibilizador para ser elevado al nivel de energía E2. La

concentración de los dopantes es la que determina la distancia media entre los

dos iones vecinos y es determinante en el nivel de energía máximo alcanzado por

el activador, por lo que el color de la emisión puede variar. A diferencia del ESA

que el proceso de conversión ascendente es independiente de la concentración

del dopante debida a la característica única del ion (Yang, 2013).

17

Figura 8. Proceso transferencia de energía de conversión ascendente (ETU) para los iones Yb

3+ y Er

3+ (Chen, et al, 2007).

Para las concentraciones utilizadas en este estudio, si el porcentaje de Yb3+ es 1%

molar y el de Er3+ es 1% molar, el activador sube del nivel 4I11/2 al 4S3/2, al decaer

emite en verde, como se muestra en la figura 8 indicado con la flecha verde. Para

las concentraciones de Yb3+ 5% y Er3+ 1%, pasa del nivel 4I11/2 al 4F9/2, pero

también tiene transiciones del nivel 4I11/2 al 4S3/2, por lo que la emisión es en color

naranja. Para los dopantes Yb3+ 10% y Er3+ 1%, pasa del nivel 4I11/2 al 4F9/2,

emitiendo en rojo. Para el dopaje Yb3+ 3% y Er3+ 2%, la emisión es en rojo con la

transición electrónica 4F9/2 4I11/2, ver figura 8 indicado con la flecha roja.

Para la conversión ascendente cooperativa (CSU), se involucra la interacción de

tres iones, generalmente los sensibilizadores son los iones 1 y 3. Cuando éstos

reciben excitación, el electrón sube al nivel de energía E1 y éstos interactúan con

el ion 2 (activador) de forma simultánea, excitándolo al nivel de energía E1 del

activador. Al regresar el activador al estado base, emite en el intervalo visible, ver

figura 6 (c). Este proceso tiene menor eficiencia que los procesos ESA y ETU

porque involucra dos pares de niveles cuasi-virtuales durante la transición. El

mecanismo de relajación cruzada (CR), mostrado en la figura 6 (e), se considera

18

un proceso detrimental en lo que se refiere a la conversión ascendente,

generalmente sucede con la interacción de dos iones, en los cuales el ion 1 le

transfiere parte de su energía de excitación al ion 2. El proceso es E2 (ion 1) + G

(ion 2) → E1 (ion 1) + E1 (ion 2) (Chen, et al, 2014). El ion 1 y el ion 2 pueden ser

iguales o diferentes. El ion 2 también puede estar en su estado excitado en

algunas ocasiones. Si los iones son iguales, la intensidad de la emisión puede ser

disminuida debida a la “extinción por concentración” (Yang, 2013).

Por último, la avalancha de fotones (PA), es un fenómeno que fue descubierto por

Joubert y colaboradores (1999) en el Pr3+. La conversión ascendente inducida

consiste en un mecanismo de bombeo inusual de fotones que requiere una

intensidad por encima de cierto umbral definido. Si el bombeo está por debajo de

su límite, se produce muy poca luminiscencia por conversión ascendente, pero la

fotoluminiscencia aumenta si el bombeo está por encima del límite. Los procesos

actuales involucran una combinación del estado ESA para la excitación y una

eficiente relajación cruzada. El proceso sucede cuando el ion 2 sube al nivel E1, el

cual es un nivel no resonante, seguido de un proceso ESA con un nivel resonante,

el cual llega al nivel E2 y al relajarse emite en el espectro visible. Después sucede

un proceso de relajación cruzada entre el ion 1 y ion 2 como sigue: E2 (ion 2) + G

(ion 1) →E1 (ion 2) + E1 (ion 1). Lo que da como resultado que los dos iones

ocupen el nivel intermedio E1, los dos iones suben al nivel E2 para iniciar al

relajación cruzada e incrementar exponencialmente la cantidad de electrones que

van al nivel E2, lo que produce una intensa emisión como un proceso de

avalancha (Yang, 2013).

2.3 Redes cristalinas

Las propiedades de la red cristalina que recibe a los iones lantánidos tienen una

influencia muy importante en el proceso de conversión ascendente, porque el

19

tamaño de la red determina la distancia entre los iones dopantes, su posición

espacial relativa, números de coordinación y el tipo de aniones que rodean el

dopante. Hay dos factores importantes que se requieren para la selección de la

red anfitriona: baja energía de los fonones de la red y que los iones dopantes

tengan un tamaño similar con respecto a la red cristalina (Yang, 2013).

Ha habido numerosos estudios para la selección de una red cristalina ideal, uno

de los más comunes son los haluros de inorgánicos pesados, cloruros, bromuros y

yoduros que tienen fonones con energías menores a los 300 cm-1, pero son

higroscópicos y su uso es limitado. Los que exhiben una alta durabilidad y

estabilidad química son los óxidos, pero la desventaja de algunos es que tienen

fonones con energías de 500 cm-1 o más, debido a las vibraciones de la red

cristalina. En el caso del Y2O3 la energía de los fonones varía entre 300-380 cm-1.

Los iones trivalentes son los más ideales para trabajar con compuestos

inorgánicos, en varios estudios se ha visto que los mejores materiales para

trabajar con ellos son Na+-, Ca2+-, and Y3+- (Wang, et al, 2009).

2.4 Co-dopajes con iones lantánidos en conversión

ascendente

Las nanopartículas de conversión ascendente (UCNPs), tienen un rango limitado

en la concentración de los dopantes debido a la relajación cruzada, ya que a altas

concentraciones en los dopantes se puede ocasionar una pérdida de la energía.

La concentración de los activadores debe ser baja y precisa, para evitar pérdidas

energéticas, pero la desventaja es que si el porcentaje molar es muy bajo se

puede tener una baja absorción de fotones, lo que provoca una baja emisión. La

ventaja de usar sensibilizadores, es que aumentan la eficiencia de la transferencia

de energía al activador (Hasse y Schafer 2011).

20

El codopaje mejora la sección transversal de absorción del sensibilizador en la

región del infrarrojo cercano (NIR), los sensibilizadores más usados son Yb3+, Er3+

y Tm3+. El ion Yb3+ es muy utilizado porque tiene un nivel de energía muy simple

con un solo estado excitado en el nivel 4f que es el 2F5/2 (Figura 8). La separación

del nivel de energía desde el estado base 2F7/2 al estado excitado 2F5/2 concuerda

perfectamente con las transiciones del Er3+ entre los niveles 4I11/2 y 4I15/2, además

de los niveles 4F7/2 y 4I11/2, lo que permite una mejor eficiencia entre la

transferencia de energía de los dos iones, a éstos niveles se le llaman resonantes

(Wang y Liu, 2009).

2.5 Nanopartículas de conversión ascendente como

bioetiquetadores

Hay estudios acerca de conversión ascendente en materiales de gran tamaño,

pero las nuevas tendencias son en hacer nanocristales, sobre todo en

aplicaciones biomédicas como bioetiquetadores para detectar células de cáncer.

Comparados con los fluoróforos orgánicos, los cuales tienen una luminiscencia por

tiempo limitado, las UCNPs pueden tener luminiscencia durante el tiempo que

estén dentro del organismo. También la excitación con luz NIR reduce la

fototoxicidad en comparación con los materiales excitados con luz ultravioleta (UV)

o rayos-X. Los tamaños pueden ser menores a los 100 nm, debido a que se tiene

una alta relación superficie-volumen lo que da una alta eficiencia en la

fotoluminiscencia. También se tienen bandas de emisión muy bien definidas y una

alta emisión anti-Stokes, estas cualidades los hacen ideales para aplicaciones

teranósticas, es decir, la tendencia actual a asociar las pruebas diagnósticas y el

tratamiento farmacológico en una estrategia diagnóstico-terapéutica integral.

Los requerimientos técnicos para que las UCNPs puedan ser usadas con

aplicaciones biomédicas están muy bien definidos:

21

(i) alta eficiencia y emisiones en multicolor,

(ii) tamaño menor a 100 nm y que sea uniforme en tamaño, forma y

composición estequiométrica, esto es porque se requieren propiedades

idénticas en el momento de la unión de las UCNPs con las células, la

estequiometría uniforme garantiza un mejor control en las

concentraciones de los iones dopantes que confieren las propiedades

ópticas deseadas,

(iii) que exista una interface adecuada entre la UCNPs y los ligandos que tiene

la célula blanco. Como las UCNPs no tienen la estructura química

necesaria para poder unirse a las células, se tienen que crear

mecanismos en la superficie de la misma para poder lograrlo, que

pueden variar desde la adición de ácido fólico, anticuerpos, péptidos y

proteínas,

(iv) se requiere que sean biocompatibles (Yang, 2013).

Muchos investigadores han preparado UCNPs con la red anfitriona de Y2O3 y

Gd2O3. Por ejemplo, Li y colaboradores (2008) utilizaron Y2O3 y Gd2O3 co-dopadas

con Er3+/ Yb3+ (3%, 20% mol) por el método de precipitación and síntesis por

combustión. Algunos otros fueron Chen (2007), quien co-dopó la red Y2O3 con

Er3+/ Yb3+ en concentraciones 1% y 10% molar, respectivamente, también Kong

(2010) quien comparó las redes Y2O3, La2O3 y Gd2O3 co-dopadas con varias

concentraciones of Er3+/ Yb3+, en los cuales se obtuvieron diferentes intensidades

en la luminiscencia dependiendo el método de síntesis y los dopajes utilizados.

En este estudio se compararán las redes Y2O3 y Gd2O3 co-dopadas con Er3+y Yb3+

con los métodos de síntesis por combustión y sol-gel, para determinar cuáles

tienen las mejores propiedades para crear bioetiquetadores eficientes que puedan

unirse a células de cáncer de mama y cervix.

22

2.6 Métodos de síntesis

2.6.1 Método de síntesis por Sol-Gel

Las NPs de este estudio, fueron sintetizadas por el método de sol-gel, para

compararlas con el método de síntesis por combustión y así poder definir una

forma y tamaño adecuado para que puedan ser funcionalizadas. El método de sol-

gel es muy recurrido en la síntesis de nanopartículas debido a que es un método

químico en el que se puede obtener un sólido altamente puro y homogéneo. El

proceso consta de cinco etapas:

1. Desarrollo de una suspensión estable de partículas con tamaño inferior a 1

mm. Se forma una dilución coloidal de los precursores, que se le llama etapa sol.

2. Gelificación de la suspensión estable mediante técnicas de coagulación-

floculación de los coloides.

3. Secado y formación de xerogel.

4. Calcinación del xerogel para la obtención del material cerámico.

5. Tratamiento térmico del xerogel.

En comparación con los métodos convencionales, el método de síntesis por sol-

gel, presenta ventajas por el empleo de temperaturas bajas de síntesis que

permiten obtener materiales cristalinos y con separación de fase. Una desventaja

es que los precursores utilizados son de alto costo, pero se obtiene un control de

las microestructuras, composiciones y propiedades finales (Taxak, et al, 2009).

2.6.2 Método de síntesis por combustión

Este método consiste en una reacción exotérmica que produce óxidos metálicos.

En la reacción se combinan nitratos metálicos como agentes oxidantes, los cuales

se funden a temperaturas menores a los 450ºC. Se utiliza combustible como

catalizador de la reacción, generalmente el combustible está basado en la

23

hidracina, urea o glicerina. Es un método muy utilizado por ser de bajo costo y

rápido, con el cual se pueden sinterizar polvos cerámicos, metálicos, vidrios y

cementos. Para la producción de polvos luminiscentes se necesitan altas

temperaturas para la calcinación.

2.7 Caracterización

Después de sintetizar las UCNPs, es necesario estudiar su morfología y estructura

para identificar y justificar sus propiedades fisicoquímicas. Si es un material

previamente conocido, entonces su caracterización da un punto de referencia para

determinar si el método de síntesis es reproducible. También se debe verificar la

morfología y en caso de haber sido funcionalizadas es necesario determinar que el

proceso de modificación fue exitoso, por ejemplo, el recubrimiento de sílica, los

enlaces de grupos amino y de ácido fólico.

2.7.1 Difracción de rayos-X (XRD)

Para poder comprobar que las NPs sintetizadas son cristalinas, se puede utilizar la

técnica de difracción de rayos-X. Esta técnica obedece la Ley de Bragg y está

basada en la construcción de la esfera de Ewald. La condición de Bragg es: nʎ =

2d sen Ɵ. Donde n es el orden de la difracción, ʎ es la longitud de onda del rayo

incidente, d y Ɵ son las distancias y el ángulo respectivo que se forman cuando

sucede la difracción. Ver figura 9 (Ashcroft, et al, 1976).

24

Figura 9. Representación de una familia de planos que cumplen con la Ley de Bragg (Ashcroft, 1976).

El ángulo de Bragg Ɵ es solo la mitad del ángulo que el rayo incidente es

deflectado. Por esta razón, el reporte de rayos-X está en términos del ángulo 2Ɵ y

la intensidad del pico obtenido. Los planos cristalográficos o planos atómicos son

un arreglo periódico tridimensional de capas atómicas separadas entre ellas con

distancias en el orden de Armstrongs (Å) (10-10 cm). La separación entre las capas

se le llama distancia interplanar. Debido a que la longitud de onda de los rayos-X

es muy pequeña, varía entre 0.5-2.5 Å, éstos pueden ayudarnos a analizar los

planos cristalográficos presentes en nuestra muestra, ya que la luz visible tienen

longitudes de onda del orden de 6000 Å. (Ashcroft, et al., 1976).

La intensidad (I) de los picos obtenidos en el difractómetro de rayos-X es la tasa

de flujo por unidad de área perpendicular a la dirección en la que viajan las ondas

de las radiaciones electromagnéticas. El valor promedio de la intensidad es

proporcional al cuadrado de la amplitud de la onda (I≈ A2). La intensidad de los

rayos-X está en base relativa a unidades arbitrarias. La cristalinidad de las UCNPs

fué analizada con el difractómetro modelo X’Pert-MPD. Todos los patrones se

obtuvieron bajo las mismas condiciones, un rango de dispersión 2 = 10-60

grados con pasos de 0.1° usando radiación CuKα (= 0.15406 nm). Los resultados

25

obtenidos se compararon con la base de datos PCPDFWIN. Los datos para Y2O3

se compararon con la base JCPDS No. 89-5592 y para Gd2O3 se utilizó la base de

datos JCPDS No. 88-2165.

2.7.2 Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Con un microscopio electrónico de transmisión TEM (de las siglas en inglés

Transmission Electron Microscope) se puede obtener información de la naturaleza

de la muestra, es decir, su morfología, estructura cristalina. El TEM es un

instrumento que utiliza un haz de electrones con el que se irradia una muestra

delgada con densidad de corriente uniforme. El haz de electrones es acelerado

por un voltaje entre 100 y 200 kV. Se utiliza la transmisión/dispersión de los

electrones en la muestra para formar una imagen de esta con alta resolución. Para

que se pueda llevar a cabo la transmisión de electrones a través de la muestra es

necesario que ésta esté muy delgada, normalmente se recomienda no utilizar

muestras que superen los 100 nm de espesor, entre menor sea el espesor de la

muestra la calidad de la imagen será mucho mayor (Brandon, et al, 2008).

Para la captura de las imágenes de TEM se usa cualquiera de los dos siguientes

sistemas: películas fotográficas o cámaras CCD. El uso del TEM en esta tesis es

necesario para observar el tamaño y la forma de las NPs, ya que deben ser lo más

esféricas posibles. También es necesario revisar la muestra después de haber

hecho la funcionalización con sílica, para asegurar que toda las UCNPs tuvieran el

recubrimiento deseado.

2.7.3 Espectroscopia de energía dispersiva (EDS)

La técnica de EDS fué utilizada para verificar la presencia de sílica en la superficie

de las UCNPs después de la funcionalización. Es una técnica de muestreo

26

versátil, rápida y no destructiva, que reconoce un gran número de elementos

químicos y presenta los resultados en tiempo real, permitiendo decidir la

necesidad de muestreo adicional ante resultados analíticos no concluyentes.

2.7.4 Espectrofluorómetro

El espectrofluorómetro se utiliza para medir los espectros de excitación y emisión

de las UCNPs, ya que en el caso de los bioetiquetadores, el brillo y la intensidad

del color emitido es una propiedad importante a buscar, entre más alta sea su

luminiscencia, mejor se cumple con el propósito del bioetiquetador.

Los componentes principales del espectrómetro son: una fuente de radiación, un

sistema selector de longitudes de onda (filtro o monocromador), una celda

conteniendo la muestra y un detector. Pueden registrarse dos tipos de espectros:

el primero es el espectro de excitación, que es la intensidad de fluorescencia

observada en función de la longitud de onda de excitación a una determinada

longitud de onda de emisión. El segundo espectro que se registra es el de

emisión, que es la intensidad de la emisión fluorescente en función de la longitud

de onda de emisión, a una longitud de onda de excitación fija. Esto es, si se fija la

λex y se mide la radiación emitida a las diferentes λem se obtiene el espectro de

emisión. En cambio, si se mantiene constante la λem y se van variando las λex se

obtiene el espectro de excitación. (Blasse y Grabmaier, 1994)

Para aplicaciones analíticas se usa el espectro de emisión, aunque, generalmente,

cuando se trabaja con un espectrofluorómetro, se obtiene primero un espectro de

excitación, con objeto de confirmar la identidad de la sustancia y seleccionar la

longitud de onda óptima de excitación.

27

2.7.5 Espectroscopía de infrarrojo por transformada de

Fourier (FTIR)

La porción infrarroja del espectro electromagnético se divide en tres regiones; el

infrarrojo cercano, medio y lejano, así nombrados por su relación con el espectro

visible. El infrarrojo lejano (aproximadamente 400-10 cm-1) se encuentra

adyacente a la región de microondas, posee una baja energía y puede ser usado

en espectroscopia rotacional. El infrarrojo medio (aproximadamente 4000-400 cm-

1) puede ser usado para estudiar las vibraciones fundamentales y la estructura

rotacional vibracional, mientras que el infrarrojo cercano (14000-4000 cm-1) puede

excitar sobretonos o vibraciones armónicas.

La espectroscopia infrarroja se basa en el hecho de que las moléculas tienen

frecuencias a las cuales rotan y vibran, es decir, los movimientos de rotación y

vibración moleculares tienen niveles de energía discretos (modos normales

vibracionales). Las frecuencias resonantes o frecuencias vibracionales son

determinados por la forma de las superficies de energía potencial molecular, las

masas de los átomos y, eventualmente por el acoplamiento vibrónico asociado.

Para que un modo vibracional en una molécula sea activa al IR, debe estar

asociada con cambios en el dipolo permanente. En particular, en las

aproximaciones de Born-Oppenheimer y armónicas, esto es cuando el

Hamiltoniano molecular correspondiente al estado electrónico puede ser

aproximado por un oscilador armónico en la vecindad de la geometría molecular

de equilibrio, las frecuencias resonantes son determinadas por los modos

normales correspondientes a la superficie de energía potencial del estado

electrónico de la molécula. Sin embargo, las frecuencias resonantes pueden estar

en una primera aproximación relacionadas con la fuerza del enlace, y la masa de

los átomos a cada lado del mismo. Así, la frecuencia de las vibraciones puede ser

asociada con un tipo particular de enlace.

https://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAmero_de_onda

https://es.wikipedia.org/wiki/Microondas_(radiaci%C3%B3n)

https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Espectroscopia_rotacional&action=edit&redlink=1

https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Excitaci%C3%B3n_Rovibr%C3%B3nica&action=edit&redlink=1

https://es.wikipedia.org/wiki/Sobretono

https://es.wikipedia.org/wiki/Arm%C3%B3nicas

https://es.wikipedia.org/wiki/Rotor_r%C3%ADgido

https://es.wikipedia.org/wiki/Oscilador_arm%C3%B3nico_cu%C3%A1ntico

https://es.wikipedia.org/wiki/Nivel_energ%C3%A9tico

https://es.wikipedia.org/wiki/Modos_normales


https://es.wikipedia.org/wiki/Resonancia_(mec%C3%A1nica)

https://es.wikipedia.org/wiki/Acoplamiento_vibr%C3%B3nico

https://es.wikipedia.org/wiki/Aproximaci%C3%B3n_de_Born-Oppenheimer

https://es.wikipedia.org/wiki/Hamiltoniano_molecular

https://es.wikipedia.org/wiki/Estado_estacionario_(mec%C3%A1nica_cu%C3%A1ntica)

https://es.wikipedia.org/wiki/Oscilador_arm%C3%B3nico_cu%C3%A1ntico

https://es.wikipedia.org/wiki/Geometr%C3%ADa_molecular



https://es.wikipedia.org/wiki/Masa_at%C3%B3mica

https://es.wikipedia.org/wiki/Masa_at%C3%B3mica

28

Las moléculas diatómicas simples tienen solamente un enlace, el cual se puede

estirar. Las moléculas más complejas pueden tener muchos enlaces, y las

vibraciones pueden ser conjugadas, llevando a absorciones en el infrarrojo a

frecuencias características que pueden relacionarse a grupos químicos. Los

átomos en un grupo CH2, encontrado comúnmente en compuestos orgánicos

pueden vibrar de seis formas distintas, estiramientos simétricos y asimétricos,

flexiones simétricas y asimétricas en el plano (scissoring o tijereteo y rocking o

balanceo, respectivamente), y flexiones simétricas y asimétricas fuera del plano

(wagging o aleteo y twisting o torsión, respectivamente).

La espectroscopía se basa en la interpretación del espectro en términos de la

estructura atómica y molecular. Los intervalos de excitación son por arriba de los

700 nm de longitud de onda. Es de utilidad para la detección de la presencia o

ausencia de grupos funcionales, para poder confirmar la presencia de los

elementos deseados en la NP, tanto su composición química como la

funcionalización en el exterior con sílica (Pasto y Johnson, 1981).

Esta técnica proporciona un espectro de reflexión de las bandas de los grupos

funcionales de las sustancias inorgánicas y orgánicas, por lo cual es posible

realizar una identificación de los materiales

2.8 Funcionalización y recubierta de sílica por el método

APTES/TEOS

La silanización es un proceso químico para la adición de grupos silanos, el cual es

muy importante para la modificación de la superficie de las UCNPs. Los silanos

modificados como el aminopropiltrimetoxisilano (APTES) pueden hacer a las

UCNPs solubles en agua y capaces de conjugarse con otras moléculas. Las

UCNPs silanizadas son más estables en soluciones que las recubiertas

poliméricas y también la recubierta reduce los efectos citotóxicos de las UCNPs en

https://es.wikipedia.org/wiki/Compuesto_org%C3%A1nico

https://es.wikipedia.org/wiki/Vibraci%C3%B3n_molecular

29

las células (Yang, et al, 2003). El propósito funcionalizar a las UCNPs es para

obtener grupos amino libres (-NH2) en la superficie de las NPs, que puedan estar

disponibles para adicionarles ácido fólico (FA), que harán que la UCNP se una

específicamente a los receptores de ácido fólico (FR) presentes

mayoriotariamente en la superficie de las células de cáncer. Es muy importante

que el ligando de la UCNP tenga alta afinidad al receptor celular, para que puede

unirse a la superficie celular o internalizarse en el citoplasma (dependiendo del

tipo de receptor utilizado) y permitir la identificación de las células. En el caso de

las células de cáncer de mama (MDA-MB-231 y MCF7) y de cáncer cervicouterino

(HeLa), los receptores de ácido fólico están sobre-expresados en la superficie de

la célula, lo que facilita la unión con el ligando de FA de la UCNP funcionalizada

(Lin, et al, 2011).

El mecanismo de silanización es un proceso químico para convertir los

componentes SiOH de una forma estacionaria a la forma éster, permite la

adhesión de cadenas orgánicas con grupos funcionales, en este estudio son los

grupos amino (-NH2). El método, consiste primero en la hidrólisis de los 3 grupos

lábiles, es decir, los enlaces químicos más inestables que están listos para una

reacción, en el caso de las UCNPs estudaidas en este trabajo, son los grupos

SiOH3, como se observa en la figura 10 (Arkles, 1977).

Figura 10. Hidrólisis en el proceso de silanización (Arkles, 1977).

30

El siguiente paso es el proceso de condensación para formar oligómeros, los

cuales se unen con grupos hidroxilo (-OH). Ver figura 11 (Arkles, 1977)

Figura 11. Condensación en el proceso de silanización (Arkles, 1977)

Finalmente durante el proceso de secado o curado se tiene la formación de un

enlace covalente en la superficie de la UCNP, durante este proceso hay pérdida

de agua, como se observa en la figura 12.

Figura 12. Secado en el proceso de silanización (Arkles, 1977)

La figura 13 muestra una representación esquemática del proceso de

funcionalización de las UCNPs con la técnica APTES/TEOS.

31

Figura 13. Proceso completo de la funcionalización APTES/TEOS con las NPs.

2.9 Funcionalización con ácido fólico

Para aplicaciones biológicas, es muy importante que las NPs recubiertas tengan

solubilidad en medios acuosos. La ventaja de la sílica es que le da durabilidad

química a la NP y protege a las células de la citotoxicidad. Al tener las NPs

funcionalizadas con grupos amino, se facilita la unión con los grupos de ácido

fólico (C19H19N7O6). Como se mencionó anteriormente, las células de cáncer de

cervix (HeLa) y de cáncer de mama (MDA-MB-231 y MCF7), tienen sobre-

expresados los receptores de ácido fólico (FR), lo que facilita la unión de las NPs

funcionalizadas con los receptores de la superficie de la célula (Hu, et al, 2009).

El FA también es conocido como folato y tiene una alta afinidad para unirse a un

receptor de folato. El FR esta sobre-expresado sólo en ciertas células tumorales

como las de ovario, pulmón, de mama, riñón, endometrio y riñones. Sin embargo,

32

no todos los tipos de cáncer sobre-expresan FA, como en el caso de algunos

sarcomas, linfomas, y cáncer de páncreas, testículos, vejiga, próstata y riñón. El

FA acoplado con un FR puede internalizar a las moléculas o NPs que lo

contengan. El FR puede ser de tipo α ó , el tipo α es el que esta sobre-expresado

en las células de cáncer (Ai J., et al, 2012). Además, el FA conserva sus

propiedades de alta afinidad cuando es conjugado por medio del grupo γ-carboxilo

al FR, como se aprecia su estructura en la figura 14 (Sudimack, et al, 2000).

Figura 14. Estructura del ácido fólico. Los grupos carboxilos α y γ están indicados (Sudimack, et al, 2000).

El FA juega un papel importante en la división celular, proliferación y síntesis de

algunas macromoléculas. Numerosos estudios sugieren que se requieren grandes

cantidades de FA para que haya proliferación de un tumor, pero los resultados no

han sido concluyentes. Los FR han sido encontrados en grupos aglomerados en

regiones de la membrana llamadas caveolas. Pero en general, están ausentes en

los tejidos normales, con excepción del plexo coroideo, la placenta, los riñones y

algunas zonas del pulmón y tiroides. El proceso de internalización de un FA vía FR

es mediante endocitosis como se muestra en la figura 15 (Sudimack, et al, 2000).

Debido a que el FR se internaliza a las células, es que se decidió utilizar como

ligando al FA para funcionalizar las UCNPs de este trabajo, de tal forma que

pudieran ser internalizadas a la región citoplasmática de la célula y poder detectar

su presencia en el interior de las células de cáncer mediante la luminiscencia de

las UCNPs.

33

Figura 15. Proceso de internalización en una célula por vía FA-FR (Sudimack, et al, 2000).

Otros estudios sugieren que las células cancerosas, al crecer rápidamente,

requieren de un proceso de vascularización más acelerado, lo que conduce a una

arquitectura vascular defectuosa que es más permeable a macromoléculas que los

tejidos normales. Las UCNPs pueden tener la capacidad de penetrar de forma

intersticial en los tejidos vasculares tumorales con tiempos de retención más altos

que los normales, a este efecto se le llama permeabilidad y retención mejorada

(EPR) y se muestra en la figura 15 (Zwicke, et al, 2012).

Invaginación

34

Figura 16. Proceso que muestra el tejido vascular defectuoso de una célula tumoral en comparación con un tejido sano, lo que permite una penetración de las NPs dentro de la célula. (Adaptado de Zwicke, et al, 2012).

2.10 Ensayos de citotoxicidad

La citotoxicidad celular se define como una alteración de las funciones celulares

básicas que conlleva a un daño detectable de la célula. Diferentes autores han

desarrollado pruebas in vitro para predecir los efectos tóxicos de drogas y

compuestos químicos, utilizando como modelos experimentales cultivos primarios

y órganos aislados como líneas celulares establecidas (Arrébola, et al, 2009).

Para evaluar si las UCNPs funcionalizadas tienen algún efecto tóxico en los

cultivos de células de cáncer, es posible utilizar un ensayo colorimétrico de

viabilidad celular, que se basa en la reducción del bromuro de 3(4,5 dimetil-2-

tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico, (MTT o tetrazolio). El ensayo de citotoxicidad por

MTT, mide la actividad metabólica de las células, al ser capaz de procesar el MTT

en la mitocondria mediante la acción de enzimas mitocondriales. El MTT es

captado por las células y reducido por la enzima succínico deshidrogenasa

mitocondrial a su forma insoluble formazan. El producto de la reacción, el

NANOPARTÍCULA

TEJIDO NORMAL TEJIDO CANCEROSO

ENDOTELIO

35

formazan forma cristales que quedan retenidos en las células y pueden ser

liberados mediante su solubilización. De esta forma se cuantifica la cantidad de

MTT reducido mediante un método colorimétrico, ya que se produce como

consecuencia de la reacción un cambio de coloración del amarillo al azul o violeta.

La capacidad de las células para reducir al MTT constituye un indicador de la

integridad de las mitocondrias y su actividad funcional es interpretada como una

medida de la viabilidad celular. La determinación de la capacidad de las células de

reducir al MTT a formazan después de su exposición a un compuesto permite

obtener información acerca de la toxicidad del compuesto que se evalúa

(Eisenbrand, et al, 2002).

2.11 Microscopio confocal

La Microscopía confocal es una técnica que permite observar a una resolución

mayor que la que se puede lograr con la microscopía óptica convencional.

Emplea un sistema láser que aplica el haz de luz en forma de barrido, en una

pequeña parte del espécimen. El láser aplicado a una longitud de onda

determinada en la muestra, hace que moléculas excitadas de la misma, emitan

fluorescencia a una longitud de onda mayor a la aplicada. La fluorescencia en una

muestra puede ser debida a moléculas que se encuentran de forma natural

(autofluorescencia, como en el caso de la clorofila) o puede ser producida por

moléculas aplicadas artificialmente a la muestra, en este estudio serán las UCNPs

funcionalizadas y que se introdujeron en el citoplasma de la célula.

El uso de varias combinaciones de láser capaces de detectar y producir

fluorescencia a diferentes longitudes de onda, permite un escaneo de la muestra

en un amplio rango del espectro de luz, permitiendo la observación de estructuras

teñidas con tal detalle cómo no se puede lograr con técnicas convencionales.

Debido a que penetra fácilmente la muestra, el microscopio confocal logra

36

imágenes en diferentes planos focales que ligados a un programa de computo,

puede reproducir una imagen tridimensional del material observado. Las

siguientes características han hecho de la microscopia confocal una de las

herramientas de trabajo predilectas por científicos de las ciencias biológicas y de

materiales de todo el mundo:

1. Alta sensibilidad en la observación.

2. Especificidad en la emisión de la fluorescencia.

3. Mayor Resolución.

4. Tridimensionalidad de las imágenes.

37

3. Materiales y métodos

3.1 Síntesis de nanopartículas

3.1.1 Síntesis de la red anfitriona Y2O3 con Erbio e Iterbio

3.1.1.1 Método de síntesis por combustión

La combustión se realizó en un horno abierto (mufla) de acuerdo al protocolo

descrito previamente por Hirata y colaboradores (Hirata, et al, 2008). Los polvos

luminiscentes (Y1-x-yYbxEry)2O3 se prepararon utilizando como precursores nitrato

de Ytrio [Y(NO3)3 Alfa Aesar 99.9965%], nitrato de Iterbio [Yb(NO3)3 Alfa Aesar

99.9%], nitrato de Erbio [Er(NO3)3 Alfa Aesar 99.9%] y carbohidrazida [CH6N4O

Alfa Aesar 94%] como agente reductor. Los precursores se pesaron de acuerdo a

la reacción:

2(1-x-y)Y(NO3)3 + 2xYb(NO3)3 + 2yEr(NO3)3 + CH6N4O --> (Y 1-x-y YbxEry)2O3

+ 3H2O + 5N2 + CO2 + (11/2)O2

(1)

donde la variable x varía entre 0.01, 0.05 y 0.10, que son los porcentajes de Iterbio

y la variable y toma valores de .01, que es el porcentaje de Erbio. Los valores de x

y y para cada una de las muestras se presentan en la tabla 1.

38

Tabla 1. Muestras realizadas con la red anfitriona Y2O3

Num Red anfitriona

% Er y

% Yb x

Tratamiento Térmico (oC)

Tiempo de horneado

(hs.)

1 Y2O3 1 1 900, 1000, 1100, 1200

2

2 Y2O3 1 5 900, 1000, 1100, 1200

2

3 Y2O3 1 10 900, 1000, 1100, 1200

2

Los precursores fueron debidamente pesados y disueltos en 20 ml de agua

desionizada en un vaso de cuarzo con la ayuda de un agitador magnético.

Después de agregar la carbohidrazida, se obtuvo una solución homogénea de

color blanquecino y de consistencia gelatinosa. El vaso con la mezcla se introdujo

dentro de la mufla. La temperatura se elevó entre 450 y 550ºC, la mezcla de los

nitratos y el combustible provocaron una combustión espontánea debido al calor

de la mufla, la reacción química se realizó de forma muy rápida. Posteriormente

las muestras fueron sometidas a diferentes temperaturas como tratamiento

térmico final que variaron de 900°C a1200°C por dos horas.

3.1.1.2 Método de sol-gel

Los polvos luminiscentes (Y1-x-yYbxEry)2O3 se prepararon utilizando como

precursores nitrato de Ytrio [Y(NO3)3 Alfa Aesar 99.9965%], nitrato de Iterbio

[Yb(NO3)3 Alfa Aesar 99.9%], nitrato de Erbio [Er(NO3)3 Alfa Aesar 99.9%] y ácido

tartárico [C4H6O6 Aldrich, USA] como agente reductor. Los precursores se

pesaron de acuerdo a la reacción:

2(1-x-y) Y (NO3)3 + 2xYb (NO3)3 + 2yEr (NO3)3 + C4H6O6 --> (Y 1-x-y YbxEry)

2O3 + 6NO2 + (3/2) O2

(2)

39

donde la variable x varía entre 0.01, 0.05 y 0.10, que son los porcentajes de Iterbio

y la variable y toma valores de .01, que es el porcentaje de Erbio. Los valores de x

y y para cada una de las muestras se presentan en la tabla 1.

Los precursores fueron mezclados con ácido nítrico al 14% molar y 40 ml de agua

destilada. El ácido tartárico se mezcló con agua destilada también con una

concentración molar de 1:2 de los iones metálicos presentes en óxido der Ytrio,

una vez que ambas mezclas fueron agitadas y homogenizadas, se mezclaron en

un solo vaso y se dejaron agitando 24 horas. Después se aumentó la temperatura

a 80oC por 2 horas más, al finalizar se aumentó la temperatura 120oC por media

hora para el formado del xerogel (Taxak, et al, 2009). Posteriormente las

muestras fueron sometidas a diferentes temperaturas como tratamiento térmico

final como se muestra en la Tabla 1.

3.1.2 Síntesis de la red anfitriona Gd2O3 con Erbio e Iterbio

3.1.2.1 Método de síntesis por combustión

Los polvos luminiscentes (Gd1-x-yYbxEry)2O3 se prepararon utilizando como

precursores nitrato de Gadolinio [Y(NO3)3 Alfa Aesar 99.9965%], nitrato de Iterbio

[Yb(NO3)3 Alfa Aesar 999%], nitrato de Erbio [Er(NO3)3 Alfa Aesar 99.9%] y

carbohidrazida [CH6N4O Alfa Aesar 94%] como agente reductor. Los precursores

se pesaron de acuerdo a la reacción:

2(1-x-y)Gd(NO3)3 + 2xYb(NO3)3 + 2yEr(NO3)3 + CH6N4O --> (Gd 1-x-yYbxEry)2O3

+ 3H2O + 5N2 + CO2 + (11/2)O2

(3)

40

donde la variable x varía entre 0, 0.02 y 0.10, que son los porcentajes de Iterbio y

la variable y toma valores de .01,0 y 0.03 que es el porcentaje de Erbio. Los

valores de x y y para cada una de las muestras se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Muestras realizadas con la red anfitriona Gd2O3

Num Red anfitriona

% Er y

% Yb x

Tratamiento Térmico (oC)

Tiempo de horneado

(hs.)

1 Gd2O3 1 0 800,900 2

2 Gd2O3 0 2 900 2

3 Gd2O3 1 10 700,800,900 2

4 Gd2O3 3 2 800,900 2

Los precursores fueron debidamente pesados y disueltos en 20 ml de agua

desionizada en un vaso de cuarzo con la ayuda de un agitador magnético.

Después de agregar la carbohidrazida, se obtuvo una solución homogénea de

color blanquecino y de consistencia gelatinosa. El vaso con la mezcla se introdujo

dentro de la mufla. La temperatura se elevó a 450-550ºC y se realizó la reacción

química de forma muy rápida. Posteriormente las muestras fueron sometidas a

diferentes temperaturas como tratamiento térmico final.

3.1.2.1 Método de Sol-gel

Los polvos luminiscentes (Gd1-x-yYbxEry)2O3 se prepararon utilizando como

precursores nitrato de Gadolinio [Y(NO3)3 Alfa Aesar 99.9965%], nitrato de Iterbio

[Yb(NO3)3 Alfa Aesar 99.9%], nitrato de Erbio [Er(NO3)3 Alfa Aesar 99.9%] y ácido

tartárico [C4H6O6, Aldrich] como agente reductor. Los precursores se pesaron de

acuerdo a la reacción:

2(1-x-y)Gd(NO3)3 + 2xYb(NO3)3 + 2yEr(NO3)3 + C4H6O6 --> (Gd 1-x-yYbxEry)2O3

+ 6NO2+3/2O2 (4)

41

donde la variable x varía entre 0, 0.02 y 0.10, que son los porcentajes de Iterbio y

la variable y toma valores de .01,0 y 0.03 que es el porcentaje de Erbio. Los

valores de x y y para cada una de las muestras se presentan en la tabla 2.

Los precursores fueron mezclados con ácido nítrico al 14% y 40 ml de agua

destilada. El ácido tartárico se mezcló con agua destilada también, una vez que

ambas mezclas fueron agitadas y homogenizadas, se mezclan en un solo vaso y

se dejan agitando 24 horas. Después se aumenta la temperatura a 80oC por 2

horas más, al finalizar se aumenta la temperatura 120oC por media hora para el

formado del xerogel. (Taxak, et al, 2009). Posteriormente las muestras fueron

sometidas a diferentes temperaturas como tratamiento térmico final.

3.2 Sonicación de las nanopartículas

Todas las UCNPs previamente sintetizadas, fueron sonicadas con un

ultrasonicador de alta intensidad (al 70%) de la marca Sonics & Materials, Inc., por

aproximadamente 30 minutos con 20-30 ml de isopropanol/etanol para los

procesos de recubrimiento con sílica y funcionalización con APTES/TEOS. Las

UCNPs funcionalizadas con FA fueron sonicadas con agua destilada para ser

utilizadas en experimentos de viabilidad celular La ultrasonicación de las UCNPs

se realizó para minimizar su aglomeración durante la caracterización con TEM,

funcionalización de aminosilanos o las pruebas in vitro con células.

3.3 Funcionalización de las nanopartículas

3.3.1 Funcionalización con aminosilanos por el método

APTES/TEOS

El recubrimiento de sílica de las UCNPs se realizó por el método de Stöber

(Stöber y Fink, 1968), como se describe a continuación.

42

Se obtuvo una mezcla de 100 ml de agua destilada con una concentración 10

mmol de NPs, la mezcla se mantuvo en agitación constante por 20 minutos. De

forma separada, se mezclaron por 20 min. 30 ml de etanol con 0.6 ml de TEOS

(Tetra-etilortosilicato, Sigma Aldrich 98%). Una tercera solución que contenía 1

mol de hidróxido de amonio (NH4OH, Sigma Aldrich), 0.2 ml del surfactante

IGEPAL (Sigma Aldrich) y agua destilada, se mantuvo en agitación constante, esta

solución servirá para evitar aglomeración de las UCNPs. Las tres soluciones

fueron mezcladas y se dejaron en agitación constante por 24 hr. Las UCNPs

recubiertas quedaron adheridas al fondo del vaso, las cuales fueron recuperadas y

centrifugadas con acetona en tres ocasiones, a 4000 rpm por 3 minutos en cada

ocasión. Las UCNPs se filtraron y se sometieron a tratamiento térmico a 900°C por

2 hr (Singh, et al, 2009).

La funcionalización con aminosilanos se realizó mezclando una concentración de

1 mol de las UCNPs recubiertas con etanol, 0.02 ml de 3-Aminopropil-

trimethoxisilano (APTES, 98% Sigma Aldrich), 0.14 ml of TEOS y 0.2 ml de

hidróxido de amonio por aproximadamente 4 hr a 24°C (Sounderya y Zhang,

2009).Las UCNPs funcionalizadas con aminosilanos fueron secadas y

centrifugadas tres veces a 4000 rpm por 3 minutos.

3.3.2 Funcionalización de las nanopartículas con ácido fólico

La síntesis se realizó empleando un intermediario modificado de ácido fólico (FA)

(C19H19N7O6) que fue modificados utilizando N-hidroxisuccinimida (NHS) en

presencia de N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC). La reacción se llevó a cabo en

un sistema Schlenk donde se agregaron 0.500 g de FA y 500 l de trietilamina

(TEA, previamente destilada) en 10 mL de dimetilsulfoxido (DMSO, secado en

tamices moleculares activados por 1 noche) en atmosfera de N2. La mezcla se

agitó por un periodo de 2 horas a 37°C y se agregaron rápidamente 0.260 g de

43

NHS y 0.470 g de DCC. Posteriormente el sistema se mantuvo en agitación por

una noche a 37°C en oscuridad. La mezcla es filtrada para retirar los productos

colaterales. Finalmente la mezcla obtenida (color café intenso) se afora en un

matraz aforado de 10 mL con DMSO (producto obtenido denominado como FA-

NHS).

La inmovilización de FA en las nanopartículas previamente funcionalizadas con

silanos (NP-NH2) se realizó dispersándolas en 25 mL de una solución buffer de

carbonato/bicarbonato (0.01M pH 9.0). Las UCNPs se ultrasonicaron por 5

minutos y posteriormente se les agregó 3 mL de la solución de FA-NHS y se

agitaron en oscuridad por el periodo de 2h. Las NPs obtenidas (UCNPs-NH2-FA)

se centrifugaron (6000 rpm por 15 minutos) y se lavaron con DMSO (3 x 45 mL) y

etanol (5 x 45mL). El material obtenido se secó por una noche a vacío a

temperatura de 30°C.

3.4 Pruebas de citotoxicidad

3.4.1 Cultivos celulares

Las líneas celulares que se utilizaron fueron obtenidas del American Type Culture

Collection (ATCC). Se cultivaron las siguientes líneas celulares: carcinoma de

cérvix humano (HeLa), cáncer de mama humano (MDA-MB-231 y MCF7), también

se realizaron estudios de citotoxicidad en células de cáncer de colorectal

adenocarcinoma DLD-221 (CCL-221).

Las células se cultivan en medios de cultivo específicos de acuerdo al tipo celular,

en este caso se utilizó medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de

suero fetal bovino (FBS, BenchMark, Gemini Bio Products), 1% de Penicillina

streptomycin (Sigma-Aldrich), 1% del aminoácido L-glutamina y 1.5 g/l de

44

bicarbonato de sodio y para el caso de las células MCF7 se utilizó medio DMEM

suplementado con 0.010 g/L de insulina bovina recombinante.

Las cajas de Petri que contienen los cultivos celulares se mantienen en incubación

a 37ºC y en presencia de una mezcla de gases de 5% de CO2 y 95% O2 en un

incubadora para cultivo celular (Juárez, et al, 2013). Estas células son las que se

utilizarán para realizar las pruebas de citotoxicidad cuando se unan a las NPs

funcionalizadas.

3.4.2 Ensayo de viabilidad celular por reducción del MTT

El efecto de las UCNPs en la viabilidad de las tres líneas celulares se analizó

mediante un ensayo colorimétrico basado en la reducción del reactivo MTT

(bromuro de 3(4,5 dimetil-2-tiazoil)-2,5-difeniltetrazólico) utilizando el kit de

toxicología in vitro TOX1 (Sigma-Aldrich). El reactivo MTT o tetrazolio, es captado

por las células y reducido por la enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial a

formazan. El producto de la reacción, el formazan, queda retenido en las células y

puede ser liberado de las mismas mediante su solubilización con isopropanol.. De

esta forma se cuantifica la cantidad de MTT reducido mediante un método

colorimétrico, que mide el cambio de coloración del amarillo al azul/morado, el cual

es producido como consecuencia de la reacción de reducción.

La capacidad de las células para reducir al MTT constituye un indicador de la

integridad de las mitocondrias y su actividad funcional es interpretada como una

medida de la viabilidad celular. La determinación de la capacidad de las células de

reducir al MTT a formazan después de su exposición a un compuesto permite

obtener información acerca de la toxicidad del compuesto que se evalúa (Arrebola,

et al, 2009) (Chávez, et al, 2016).

45

El ensayo de citotoxicidad se realizó en una placa de 96 pozos. Cada pozo

contiene 10,000 células de cáncer. Las UCNPs fueron a ultrasonicadas y se

realizaron diluciones que variaron entre 0.001 μg//ml y 1 μg//ml en medio de

cultivo RPMI-1640. Las células se incubaron con las diferentes cantidades de

UCNPs durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2. La incubación de las células en

medio RPMI-1640 sin UCNPs se tomó como control positivo, simulando el

comportamiento de la célula en condiciones ideales. Se utilizó DMSO para inducir

la muerte celular, el cual fungió como control negativo de viabilidad celular.

Después del tiempo de incubación, las células se lavaron con una solución salina

de buffer de fosfatos (PBS 1x) a pH 7.4 (PBS 1x), se agregó el reactivo MTT a la

placa siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich). La citotoxicidad

se evaluó midiendo la absorbancia con un lector de placas de ELISA (Thermo

Scientific, EE.UU.) a 570 y 690 nm. Todos los datos obtenidos a partir de UCNPs

incubadas se normalizaron a los datos de tres pozos de control positivo sin

UCNPs: Gd2O3: Er3+/Yb3+ y sin Y2O3: Er3+/Yb3+ en cada experimento de forma

independiente (Hemmer, et al, 2013).

3.4.3 Ensayo azul tripano

El azul de tripano es un colorante utilizado para el recuento de células íntegras por

exclusión de dicho colorante. Este método está basado en que las células vivas

(viables) no captan el azul tripano mientras que las células muertas (no viables) si

lo hacen. Se cuentan como muertas las células teñidas de azul y como vivas las

refringentes.

Para realizar el ensayo se utiliza colorante azul tripano al 0.4%, el cual fue

preparado agregando 0.4 gr en 100 ml de solución. Las células son lavadas varias

veces con PBS, éstas se despegan de la placa con tripsina (Tripsina 1x/EDTA).

46

Una vez despegadas se colocan en tubos cónicos de 15 mL. Las células se

centrifugan y se re-suspenden con 1 ml de PBS.

En un vial se colocan 90 µl de solución con células y 10 µl de azul tripano, se

agitan y se colocan 10µl de la solución anterior en la cámara de Neubauer, que

permitirá contar el número de células vivas y muertas en un microscopio óptico. El

conteo se realizó tomando en cuenta que las células muertas están teñidas de

azul, mientras que las vivas se observan translucidas porque no están teñidas de

azul.

3.4.4 Análisis estadístico

Los experimentos de viabilidad celular con las UCNPs incubadas fueron

realizados por triplicado. Los resultados fueron descritos como la media ± la

desviación estándar de tres experimentos realizados de forma independiente. Los

datos fueron evaluados a través de un análisis de ANOVA (análisis de varianza) y

se realizó la prueba de hipótesis por medio del estudio de comparación múltiple de

Tukey, calculando el valor del estadístico p, en donde p< 0.05 es considerado

estadísticamente significativo. El software utilizado para el análisis estadístico y

sus gráficos fue Graph Pad Prism 6.0.

3.5 Imágenes por microscopía confocal

En la microscopía de fluorescencia, es muy utilizado el colorante fluorescente

DAPI (4', 6-diamino-2-fenilindol) que se liga fuertemente con las bases

nitrogenadas adenina-tiamina (A-T) en el ADN. Como el DAPI puede pasar

íntegramente a través de una membrana, es utilizado para teñir e identificar la

localización del núcleo en células vivas o fijadas.

47

En este estudio, el DAPI se utilizó para teñir el núcleo de las células de cáncer

cervicouterino HeLa y de cáncer de mama MB-MDA-231 y MCF7. Se utilizaron

cajas Petri con Poli-d-lisina (Mat-Tek P35GC1.5-10C), en las cuales se colocaron

300,000 células en medio RPMI-1640 (para las células MDA-MB-231 y HeLa) y

DMEM (para las células MCF7), las cuales se incubaron por 24 h, con 1 µg/mL de

UCNPs a 37°C y 5% CO2. Las UCNPs utilizadas fueron: Gd2O3: Er3+/Yb3+ (1%,

10% mol), Y2O3: Er3+/Yb3+ (1%,1% mol) y (1%, 10% mol).

Posteriormente, las células se lavaron con PBS 1x y se fijaron con 4% de una

solución de formaldehido/PBS 1x a 4°C por 15 min. Al terminar la fijación, las

células fueron permeabilizadas con una solución al 0.5% de Tritón X/PBS 1x 4°C

por 15 min. Se procedió a teñir el núcleo de las células con DAPI, agregando 0.5

ng/µL en la oscuridad por 10 min, procedido de cinco lavados con PBS 1x.

La tinción del núcleo se observó en el microscopio confocal Olympus FluoView

FV1000 (Japón) usando un láser de Argón para excitar a 405 nm de longitud de

onda y una emisión ~ 461 nm para el DAPI. Para observar las UCNPs dentro de

las células se utilizó un láser NIR a 980 nm de excitación y un filtro EGFP

(Enhanced Green Fluorescent Protein) con excitación a 488 nm y emisión a 515-

530 nm. También se utilizó un filtro RFP (Red Fluorescent Protein) con excitación

a 488 o 532 nm y emisión en 588-593 nm.

Las células se observaron a 63 x (DIC), en un objetivo de inmersión

planapocromático 1.4 N.A. Las imagines observadas no produjeron señales de

fondo de ninguna fuente externa. Las imágenes fueron capturadas utilizando el

software MetaMorph para Olympus (Sánchez-Sánchez, et al, 2015).

48

4. Resultados y discusión

4.1 Análisis de Y2O3: Er3+/ Yb3+

4.1.1 Análisis de la morfología y estructura

Como se mencionó en el capítulo previo, la composición obtenida de la UCNPs

sintetizadas por el método de síntesis por combustión (SC) y por el método de sol-

gel (SG) fue: (Y1-x-yYbxEry)2O3. Los patrones de difracción de rayos X, mostrados

en la figura 17, para las UCNPs preparadas con el método SC, indican que son

consistentes con la base de datos JCPDS No. 89-5592 (Y2O3), demostrando que

tienen estructura cúbica. Los picos dominantes relacionados a la fase cúbica de

Y2O3 corresponden a los planos (211), (222), (400), (440) y (622) localizados a

20.51, 29.17, 33.81, 48.56 y 57.66 respectivamente. Las temperaturas

mostradas en las figuras corresponden a los tratamientos térmicos a las que

fueron sometidas previamente.

Figura 17. Patrones de difracción de Y2O3:Er3+

/Yb3+

, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de CS: a) JCPDS no. 89-5592 [Y2O3]; b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,1%) a 1100°C; c) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,5%) a 1100°C y d

Y2O3:Er3+

/Yb3+

a (1%,10%)1200°C.

Inte

nsid

ad

(u.a

)

*

* *

*

* *

*

d)

c)

b)

a)

* * * *

*

Ángulo 2 (grados)

* * * *

*

49

Los patrones de difracción de rayos X, mostrados en la figura 18, corresponden a

las UCNPs preparadas con el método SG, indican que son consistentes con la

base de datos JCPDS No. 89-5592 (Y2O3).

Figura 18. Patrones de difracción de Y2O3:Er

3+/Yb

3+, comparados con la base de datos y las

UCNPs realizadas con el método de SG: a) JCPDS no. 89-5592 [Y2O3]; b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,1%) a 1100°C; c) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,5%) a 1000°C y d

Y2O3:Er3+

/Yb3+

a (1%,10%)1200°C.

La figura 19 muestra las imágenes de TEM de las UCNPs de Y2O3 al desnudo

sintetizadas por el método SC. Ambos métodos muestran forma esferoidal. Las

UCNPs obtenidas por SC están más aglomeradas que las realizadas por SG, el

tamaño promedio es de 70 ± 10 nm. Importante de mencionar es que la forma de

las UCNPs no cambió debido a los diferentes dopajes utilizados.

*

Inte

nsid

ad

(u.a

) Ángulo 2 (grados)

d)

c)

b)

a) * *

* * * * *

* * * * *

* * * *

50

a) b)

c)

Figura 19. Imágenes de TEM de Y2O3 al desnudo sintetizadas por SC con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+ (1%,1%), b) Er

3+/Yb

3+ (1%,5%) y c) Er

3+/Yb

3+ (1%,10%)

La figura 20 muestra las imágenes de TEM de las UCNPs de Y2O3 al desnudo

sintetizadas por el método de SG, las cuales tienden a mostrar menos

aglomeración y mejor forma que las UCNPs sintetizadas por SC.

51

a) b)

c)

Figura 20. Imágenes de TEM de Y2O3 al desnudo sintetizadas por SG con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+ (1%,1%), b) Er

3+/Yb

3+ (1%,5%) y c) Er

3+/Yb

3+ (1%,10%)

Las UCNPs sintetizadas fueron (Gd1-x-yYbxEry)2O3 y (Y 1-x-yYbxEry)2O3 (Ver tabla 1

para los dopajes), el análisis de Rayos X muestra que la estructura cristalina es

cúbica de acuerdo a la comparación con las bases de datos JCPDS nos. 89-5592

(Y2O3) y 88-2165 (Gd2O3). De acuerdo a las imágenes del TEM, el tamaño

promedio para las UCNPs de Y2O3 es 70 ±10 nm y para Gd2O3 es 50 ±10 nm.

Las NPs sintetizadas por el método de SG, presentan una forma más esférica que

las obtenidas por el método de SC. En ambos métodos se presentan

aglomerados, por lo que las NPs tuvieron que sonicarse antes de los procesos de

52

funcionalización para garantizar que el recubrimiento fuera homogéneo sobre la

superficie de la UCNP.

4.1.2 Análisis de fotoluminiscencia

Los espectros de conversión ascendente de las UCNPs al desnudo de

Y2O3:Er3+/Yb3+ se muestran en las figuras 21 y 22 para los diferentes dopajes y

tratamientos térmicos para el método de SC y SG respectivamente (tabla 1). Con

una excitación de 980 nm se pueden apreciar las transiciones 2H11/2→ 4I15/2 (550

nm), 4S3/2→4I15/2 (564 nm) y 4F9/2→

4I15/2 (660nm) en la marcadas en la figura 21, la

emisión en el dopaje de Er3+/Yb3+ (1%, 1% mol) es en verde en 564 nm. Para el

dopaje Er3+/Yb3+ (1%, 5% mol) tiene las mismas transiciones presentes pero la

emisión es en 660-663 nm (4F9/2→4I15/2), ver en figura 22. Para el dopaje Er3+/Yb3+

(1%, 10% mol) la emisión más alta es en rojo a 663 nm. Las transiciones en verde

también están presentes pero en una baja intensidad.

53

a)

b)

c)

Figura 21. Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Y2O3:Er3+/

Yb3+

sintetizadas por el método de SC con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+ (1%,1%), b) Er

3+/Yb

3+ (1%,5%) y c)

Er3+

/Yb3+

(1%,10%)

54

a)

b)

c) Figura 22. Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Y2O3:Er

3+/Yb

3+sintetizadas

por el método de SG con los dopajes a) Er3+

/Yb3+

(1%,1%), b) Er3+

/Yb3+

(1%,5%) y c) Er

3+/Yb

3+ (1%,10%)

55

4.2 Análisis de Gd2O3: Er3+/ Yb3+

4.2.1 Análisis de la morfología y estructura

La composición obtenida de la UCNPs sintetizadas por el método de síntesis por

combustión (SC) y por el método de sol-gel (SG) fue: (Gd1-x-yYbxEry)2O3.

En la figura 23 se muestran los patrones de difracción de rayos X para las UCNPs

preparadas por el método SC, los resultados indican que son consistentes con la

base de datos JCPDS No. 88-2165 (Gd2O3), demostrando que tienen estructura

cúbica. Los picos dominantes relacionados a la fase cúbica de Gd2O3

corresponden a los planos (211), (222), (400), (440) y (622) localizados a 20.14,

28.64, 29.17, 33.18, y 56.52 respectivamente. Las temperaturas mostradas en

las figuras corresponden a los tratamientos térmicos a las que fueron sometidas

previamente.

Figura 23. Patrones de difracción de Gd2O3:Er3+

/Yb3+

, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de CS: a) JCPDS no. 88-2165 [Gd2O3]; b) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%) a 900°C; c) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (2%,3%) a 800°C, d)

Gd2O3:Er3+

(1%) a 900°C y e) Gd2O3:Yb3+

(2%) a 900°C

Ángulo 2 (grados)

e)

d)

c)

b)

a)

*

* *

(211)

*

Inte

nsid

ad

(u.a

)

*

*

* * *

56

Los patrones de difracción de rayos X, mostrados en la figura 24, corresponden a

las UCNPs preparadas con el método SG, estos resultados indican que son

consistentes con la base de datos JCPDS No.8-2165 (Gd2O3).

Figura 24. Patrones de difracción de Gd2O3:Er3+

/Yb3+

, comparados con la base de datos y las UCNPs realizadas con el método de SG: a) JCPDS no. 88-2165 [Gd2O3]; b) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%) a 800°C; c) Er

3+/Yb

3+ (2%,3%) a 800°C, d) Gd2O3:Er

3+ (1%) a

900°C y e) Gd2O3:Yb3+

(2%) a 900°C

En la figura 25 se muestran las imágenes de TEM de las UCNPs de Gd2O3 al

desnudo sintetizadas por el método SC. En ambos métodos se obtienen NPs de

forma esférica. Las UCNPs realizadas con SC están más aglomeradas que las

sintetizadas por SG, el tamaño promedio de las NPs es de 50 nm ± 10 nm. Los

cambios en los dopajes, no afectaron la forma de las UCNPs.

La figura 26 muestra las imágenes de TEM de las UCNPs de Gd2O3 al desnudo

sintetizadas por el método de SG. Estas UCNPs, tienden a mostrar menos

aglomeración y mejor forma que las realizadas por SC.

(211)

Ángulo 2 (grados) In

ten

sid

ad

(u.a

)

e)

d)

c)

b)

a)

*igura 15. Imágenes de TEM de Y






2

O


2

O


2

O


2

O


2

O


2

O

3


2

O

3


2

O

3


2

O

3


2

O

3


2

O

3

al


2

O

3

al


2

O

3

al


2

O

3

al


2

O

3

al

*

57

a) b)

c) d)

Figura 25. Imágenes de TEM de Gd2O3 al desnudo sintetizadas por SC con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Er

3+/Yb

3+ (2%,3%), c):Er

3+ (1%) y d) Yb

3+ (2%)

58

a) b)

c) d)

Figura 26. Imágenes de TEM de Gd2O3 al desnudo sintetizadas por SG con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Er

3+/Yb

3+ (2%,3%), c):Er

3+ (1%) y d) Yb

3+ (2%)

59


Los espectros de conversión ascendente de las UCNPs al desnudo de

Gd2O3:Er3+/Yb3+ se muestran en las figuras 27 y 28 para los diferentes dopajes y

tratamientos térmicos para el método de SC (tabla 1). Mientras que en las figuras

29 y 30 se muestran los espectros de conversión ascendente para las UCNPs

sintetizadas por SG. La excitación fue con un láser de 980 nm y las transiciones

presentes son: para el dopaje Er3+/Yb3+ (1%,10%) y Er3+/Yb3+ (2%,3%) corresponde

4F9/2→4I15/2 (660nm) también están presentes en (2%,3%) las transiciones 2H11/2→

4I15/2 (550 nm) y 4S3/2→4I15/2 (564 nm) con menor intensidad en SG y en SC casi no

se aprecian, además la muestra horneada a 800°C no presentó emisión. La

muestra de Yb (2%) no presento emisión en la síntesis de SC pero si hay emisión

en la síntesis de SG.

Para el dopaje de Er (1%) la emisión es en 563 nm y corresponde a la transición

4S3/2→4I15/2. También la transición 2H11/2→ 4I15/2 (550 nm) está presente y en más

baja intensidad 4F9/2→4I15/2 (660nm). Solo hubo emisión para las UCNPs

horneadas a 900°C.

Figura 27. Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de Gd2O3:Er

3+/Yb

3+sintetizadas por el método de SC con el dopaje Er

3+/Yb

3+

(1%,10%)

60

a)

b)


3+/Yb

3+sintetizadas por el método de SC con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+

(2%,3%) y b) Er3+

(1%).

En la figura 29 se muestran los espectros de emisión de las UCNPs sintetizadas

por el método de SG con los dopajes Er3+/Yb3+ (1%,10%) donde no se presentó

emisión a 700°C e Yb (2%) en el cual sólo hubo emisión a 900°C.

61

Asimismo, en la figura 30 se muestran los dopajes Er3+/Yb3+ (2%,3%) y Er3+ (1%).

A diferencia del método SC, en este método se obtuvo una buena intensidad en

las dos temperaturas de horneado a 800 y 900°C.

a)

b)


3+/Yb

3+sintetizadas por el método de SG con los dopajes a) Er

3+/Yb

3+

(1%,10%) y b) Yb3+

(2%), sólo se obtuvo emisión a 900oC.

62

a)

b)

Figura 30. Espectro de luminiscencia de las UCNPs al desnudo de

Gd2O3:Er3+/

Yb3+

sintetizadas por el método de SG con los dopajes a) Er3+

/Yb3+

(2%,3%) y b) Er

3+ (1%).

En general, las temperaturas de tratamiento térmico más alta muestran una

intensidad mayor en la luminiscencia de las UCNPs. Para las UCNPs de Y2O3, las

temperaturas utilizadas fueron 1100-1200C y para las de Gd2O3 fueron 900C.

63

Este fenómeno se puede explicar debido a que a esta temperatura existe una

mejor formación de la estructura cristalina y una mejor inserción de los iones

Er3+/Yb3+ dentro de la estructura. El Y2O3 tiene más estabilidad química que el

Gd2O3, por eso fue que en el caso del primero se pudieron tener temperaturas

más altas. El Gd2O3 a 600C está en la transformación de una multifase, con

estructura monoclínica y cúbica, mientras que a 700C está en proceso de

formación de la estructura cristalina (Singh, et al, 2009), por eso existieron dopajes

que presentaron muy baja o nula luminiscencia a 700C. Por ejemplo en Gd2O3:

Er3+/Yb3+ (2%, 3%), figura 28(a) e Yb3+ (2%), figura 29(b), no tuvieron

luminiscencia a esta temperatura.

Como se puede apreciar en las transiciones mencionadas anteriormente, de

acuerdo a Li y colaboradores (2008), los iones de Yb3+ tienen una sección

transversal de absorción muy similar a la de Er3+ en 980 nm, por lo que los iones

de Er3+ pueden ser excitados del estado base 4I15/2 al estado excitado 4I11/2 por

transferencia de energía de los iones excitados Yb3+. En el dopaje de Er3+/Yb3+

(1%, 1%) la emisión en verde es más intensa debido a que hay más electrones

ocupando el nivel 4S3/2 que suben del 4I15/2. A concentraciones más altas, como

Er3+/Yb3+ (1%, 5%) y Er3+/Yb3+ (1%, 10%), el nivel con más electrones ocupados

es el 4F9/2, por lo que la emisión en rojo es más intensa que en verde.

El control de los porcentajes de dopaje en la muestra es muy importante, ya que si

sucede la saturación, la transición de electrones disminuye y por ende la emisión

(Blasee, et al, 1994). La emisión de color rojo para las muestras con mayor dopaje

de Yb3+ (5% y 10%) puede ser la relajación cruzada (cross relaxation, en inglés),

este proceso se puede expresar como sigue en la ecuación 5:

4F 7/2 (Er) + 4I13/2 (Er) → 4F9/2 (Er) + 4F9/2 (Er)

(5)

64

Este proceso aumenta la población electrones en el nivel 4F9/2 que conducen a la

emisión en rojo (Li, et al, 2008). La relajación cruzada sucede entre iones

idénticos, cuando hay intercambio de energía entre el ion del estado excitado 4F 7/2

con el del estado basal o estado intermedio, el 4I13/2, lo que resulta en que ambos

electrones pasan a un estado excitado intermedio, en este caso el nivel 4F9/2

En algunas de las muestras, las UCNPs sintetizadas por el método SG mostraron

más intensidad que las creadas por SC. Esto se debe a que el método SG

produce un sólido más puro y homogéneo, mientras que con el método SC puede

haber más impurezas y defectos en la estructura, estos defectos crean centros de

relajación no radiativa que ocasionan la emisión de un fonón en vez de un fotón.

A partir de los resultados de los análisis de luminiscencia, es posible concluir que

para la síntesis de UCNPs es mejor el método de SG. Por ejemplo, en el dopaje

Er3+/Yb3+ (2%, 3%), para el método de SC en la figura 28(a), las transiciones en

verde fueron menos intensas que las del método SG debido a posibles impurezas

en la estructura cristalina.

4.3 Análisis de la funcionalización de las nanopartículas

por APTES/TEOS

Las UCNPs seleccionadas para ser funcionalizadas y recubiertas con sílica por el

método de APTES/TEOS fueron las que presentaron mejor forma y luminiscencia

de todas las NPs aquí sintetizadas. A continuación se muestra el análisis de las

mismas.

4.3.1 Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Las UCNPs recubiertas con sílica (método APTES/TEOS) tienen un espesor de 3

a 5 nm en la nanopartícula, debido al uso del surfactante durante el proceso. Se

logró recubrir a las UCNPs de forma individual y no en aglomeraciones, lo cual era

65

necesario para poder funcionalizarlas de forma adecuada. Después de una

selección de las UCNPs, se decidió continuar con un dopaje para Gd2O3 con

Er3+/Yb3+ (1%,10%) y tres dopajes para Y2O3: Er3+/Yb3+: (1%,1%), (1%,5%) y

(1%,10%) como se muestra en la figura 31 para la síntesis por SC y SG.

a) b) c)

d) e) f) Figura 31. Imágenes de TEM de Y2O3 con sílica sintetizadas por SC y SG con los dopajes a)

Er3+

/Yb3+

(1%,1%) SG, b) SC, c) Er3+

/Yb3+

(1%,5%) SG, d) SC, e) Er3+

/Yb3+

(1%,10%) SG y f) SC.

En la figura 32, se muestran las UCNPs de Gd2O3 recubiertas de sílica

sintetizadas por los métodos de SC y SG con el dopaje Er3+/Yb3+ (1%,10%), éste

dopaje fue el que mejor intensidad presentó con respecto a las demás muestras

sintetizadas.

66

a)

b)

Figura 32. Imágenes de TEM de Gd2O3 con sílica sintetizadas por SG y SC con el dopaje

Er3+

/Yb3+

(1%,10%) a) SG y b) SC.

4.3.2 Análisis de espectroscopía de energía dispersiva (EDS)

Se realizó el análisis de EDS para algunas UCNPs seleccionadas con la finalidad

de confirmar la presencia de sílica en las NPs. La figura 33 muestra el escaneo

lineal de una NP de Y2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,1%) recubierta con sílica (figura 33-a),

además se analizaron los elementos contenidos en la muestra mediante rayos X.

En la figura 33-b se observan los elementos presentes y la figura 33-c muestra los

elementos contenidos en el análisis lineal de la figura 33-a.

67

En la figura 34, se muestra el análisis por EDS realizado para la muestra de

Gd2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) y en la figura 35 se observa el mismo análisis

hecho para las muestras de UCNPs de Y2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%). Como se

puede apreciar, en todas las muestras, está presente el silicio que era el objetivo

de la funcionalización con TEOS. Los demás elementos de las UCNPs también

están presentes como el Itrio o Gadolinio, Erbio e Iterbio, como se esperaba.

En la tabla 3, se presentan las muestras seleccionadas para los análisis de EDS,

luminiscencia, FTIR, funcionalización con APTES/TEOS, ácido fólico y para las

pruebas de citotoxicidad en líneas celulares.

Tabla 3. UCNPs seleccionadas para continuar con la investigación después de un análisis

de sus propiedades.

Número UCNPs Temperatura

de tratamiento

térmico

Tiempo de

tratamiento

térmico

Longitud de

onda de

emisión (nm)

1 Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%,1%) 1200C 2 h 563

2 Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%,10%) 1200C 2 h 661

3 Gd2O3:Er3+

/Yb3+

(1%,10%) 900C 2 h 661

68

a)

b)

c)

Figura 33. Análisis por EDS de Y2O3 con Er3+

/Yb3+

(1%,1%) en el cual se muestra a) la

nanopartícula con el escaneo lineal, b) elementos presentes en la muestra y c)

gráfica con la distribución de los elementos del análisis lineal.

Ytrio

Oxigeno

Silicio

Erbio

Yterbio

0 50 100 150 200 250 nm

69

a)

b)

c)

Figura 34. Análisis por EDS de Gd2O3 con Er3+

/Yb3+


nanopartícula con el escaneo lineal, b) elementos presentes en la muestra y c)

gráfica con la distribución de los elementos del análisis lineal.

Gadolinio

Yterbio

Erbio

Oxigeno

Silicio

0 50 100 150 200 250 nm

70

Figura 35. Análisis por EDS de Y2O3 con Er3+

/Yb3+


nanopartícula con el escaneo lineal y b) gráfica con la distribución de los

elementos del análisis lineal.

Ytrio

Erbio

Yterbio

Silicio

71


Las transiciones de las UCNPs, también están presentes en las NPs recubiertas y

funcionalizadas por el método APTES/TEOS. Se realizó otra selección de NPs con

las mejores cualidades, de las que solamente se analizaron 3, que son las que se

utilizaron para las pruebas de citotoxicidad en células y el resto de las

caracterizaciones, estas NPs son: Y2O3: Er3+/Yb3+ (1%,1%), (1%,10%) y Gd2O3:

Er3+/Yb3+ (1%,10%) sintetizadas por SG. Los espectros de estas UCNPs

seleccionadas se pueden observar en la figura 36.

c)

Figura 36. Análisis por fotoluminiscencia de Y2O3 con Er3+

/Yb3+

a) (1%,1%), b) (1%,10%) y c)

Gd2O3:Er3+

/Yb3 (1%,10%)

a) b)

72

4.3.4 Análisis de espectroscopía de infrarrojo por transformada de Fourier

(FTIR)

En este análisis se comprobó la presencia de los grupos amino (NH2) en la

funcionalización de las UCNPs seleccionadas. Los grupos amino se utilizaron para

favorecer la unión de las UCNPs al ácido fólico, el cual a su vez, se unirá de forma

específica a su receptor que está sobre-expresado en la superficie de algunas

células de cáncer. Se realizó el análisis de las UCNPs al desnudo con propósitos

comparativos. Se pueden observar las vibraciones N-H de los aminos secundarios

(3340-3363 cm-1), lo aminos primarios (1571-1591 cm-1) y la huella digital NH2

(669-793 cm-1). Las figuras 37, 38 y 39 muestran el FTIR de las UCNPs Y2O3:

Er3+/Yb3+ (1%,1%), (1%,10%) y Gd2O3: Er3+/Yb3+ (1%,10%) , respectivamente.

a)

b)

Figura 37. Análisis por FTIR de Y2O3 con Er3+

/Yb3+

(1%,1%) a) al desnudo y b) UCNPs funcionalizadas por APTES/TEOS.

73

a)

b)


/Yb3+


74

a)

b)

Figura 39. Análisis por FTIR de Gd2O3 con Er3+

/Yb3+


Como se aprecia en la figura 39, el pico a 544 cm-1 se refiere a los óxidos de iones

de tierras raras (grupo característico Gd-O) y también al óxido de Ytrio (grupo

característico Y-O) a 555 cm-1, indicado en las figuras 37 y 38. El otro grupo

característico presente es el Si-O-Si, con el modo vibracional de 810-1100 cm-1,

75

que se observa en las 3 muestras después de la funcionalización con APTES. Los

estiramientos a 1100 cm-1 indican enlaces C-N y también los efectos del

tratamiento térmico después de la funcionalización, lo que nos indica la presencia

de un enlace reforzado Si-O-Si. Los dobleces -NH2 de amino están presentes en

el modo vibracional simétrico de 1471 cm-1 y la vibración de tijera -NH2 presente

en 1591 cm-1. Hay cierta presencia de CO2 absorbido por la atmósfera con las

vibraciones 2846-2910 cm-1, en las UCNPs al desnudo y funcionalizadas. Es

importante observar la presencia de grupos –OH en las muestras al desnudo, ya

que juegan un rol importante en la recubierta de sílica por TEOS y la

funcionalización con APTES, en la vibraciones 3398-3420 cm-1.

4.4 Análisis de la funcionalización de las UCNPs con ácido

fólico

Después de comprobar que la funcionalización con grupos amino había sido

correctamente realizada, se procedió a la funcionalización con ácido fólico en la

superficie de las UCNPs. Las cuales fueron caracterizadas por TEM, FTIR y

espectroscopía de luminiscencia. Se confirmó que los grupos amino estaban

presentes en las tres UCNPs seleccionadas, de tal forma que serán utilizadas

posteriormente en los ensayos de citotoxicidad.

76

4.4.1 Análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM)

En la figura 40 se muestran las UCNPs de Y2O3 y Gd2O3 recubiertas de sílica y

funcionalizadas con ácido fólico, sólo para los dopajes seleccionados de Er3+/Yb3+

(1%,1%) y (1%,10%) sintetizados por SG.

a) b)

c) Figura 40. Imágenes de TEM de las UCNPs funcionalizadas con ácido fólico, sintetizadas por

SG a) Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%,1%), b) Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%,10%) y c) Gd2O3:Er3+

/Yb3+

(1%,10%)

77

4.4.2 Análisis de espectroscopía de infrarrojo por transformada de

Fourier (FTIR)

Para comprobar la funcionalización con ácido fólico (FA), se realizó el análisis

FTIR de las tres UCNPs seleccionadas. Se comprobó que los enlaces de FA están

presentes en la superficie de las NPs. En la figura 41, se pueden apreciar las

vibraciones del amino-FA (NH2-FA) entre 1512-1650 cm-1 y los FA están presentes

en las vibraciones de 2935-3331 cm-1 y 1606-1512 cm-1 para Y2O3:Er3+/Yb3+

(1%,1%) y (1%,10%) y en la figura 38 para Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%).

a)

b)


/Yb3+

al a)

(1%,1%) y b) (1%,10%) funcionalizadas con ácido fólico.

78

Figura 42. Análisis por FTIR de Gd2O3 con Er3+

/Yb3+

(1%,10%) funcionalizadas con ácido fólico.

4.4.3 Análisis de fotoluminiscencia de las UCNPs funcionalizadas

Se realizó el análisis de luminiscencia de las UCNPs funcionalizadas con FA y se

encontró que la intensidad es fuerte y las mismas transiciones electrónicas están

presentes. La figura 43 muestra las UCNPs de Y2O3 con Er3+/Yb3+ al (1%,1%) y

(1%,10%). En la figura 44 se observan los análisis de fotoluminiscnecia de las

UCNPs de Gd2O3 con Er3+/Yb3+ al (1%,10%) todas en comparación con las

UCNPs al desnudo.

79

a) b)

Figura 43. Análisis por fotoluminiscencia de Y2O3 con Er3+

/Yb3+

al desnudo y con FA de los

dopajes a) (1%,1%) y b) (1%,10).

Figura 44. Análisis por fotoluminiscencia de Gd2O3 con Er3+

/Yb3+

(1%,10%) al desnudo y con ácido fólico (FA).

80

4.5 Análisis biológico

4.5.1 Análisis de citotoxicidad por el ensayo MTT

Se realizó el análisis de la citotoxicidad de las UCNPs al desnudo, funcionalizadas

con aminos y funcionalizadas con ácido fólico en las líneas celulares de cáncer de

cervix HeLa y cáncer de mama MDA-MB-231 y MCF7. También se realizó el

análisis de las UCNPs con grupos amino con la línea celular de colorectal (CCl-

221) para fines comparativos, pero esta línea celular no tiene sobre-expresados

los FA en la superficie, razón por la que no se continuó con los estudios

posteriores de las nanopartículas con FA.

Para los ensayos de citotoxicidad in vitro, se considera que una NP es citotóxica

cuando ocasiona una muerte celular mayor o igual a 80%. Este ensayo de

citotoxicidad por métodos colorimétricos se realizó en las células HeLa, de cáncer

colorectal (DLD-1) y de cáncer de mama (MCF7).

4.5.1.1 Análisis de citotoxicidad de NPs al desnudo y funcionalizadas con

APTES/TEOS

En la figura 45, se muestran los resultados del análisis de citotoxicidad de las

UCNPs con aminosilanos (APTES/TEOS) en comparación con las UCNPs al

desnudo en células HeLa. Se puede observar que la viabilidad celular aumentó

significativamente después de que las UCNPs fueron funcionalizadas. Por

ejemplo, en el caso de la concentración 0.001 y 0.01 µg/mL para la muestra 45 (a)

de 80% de sobrevivencia, después de la funcionalización con APTES/TEOS, la

viabilidad celular fue casi del 100%. En el caso de las muestras 45 (b) y (c), de

una viabilidad celular del 60-70% de las NPs al desnudo, después de la

81

funcionalización con aminosilanos, ésta aumentó al 90-100%. En la concentración

de 1 µg/mL en las muestras 45 (a) y (c) la viabilidad aumentó del 80% al 90-95%.

En el caso de la incubación con células de cáncer colorectal (figura 46), las tres

muestras exhibieron un aumento en la viabilidad celular en todas las

concentraciones de las UCNPs funcionalizadas con aminosilanos. Estos

resultados corroboran que las UCNPs funcionalizadas con aminosilanos, no son

citotóxicas, por lo cual, son aptas para la posterior adición de ácido fólico.

82

Figura 45. Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con aminosilanos (barras grises) incubadas en células HeLa. a) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 10%).

Los resultados representan la media y desviación estándar de 3 ensayos independientes.*p<0.05; ** p<0.01 and ***p<0.001.

a)

b)

c)

83

Figura 46. Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con aminosilanos (barras rayadas) incubadas en células de cáncer colorectal DLD-1. a) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 1%) and

c) Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%, 10%). Los resultados representan la media y desviación estándar de 3 ensayos independientes.*p<0.05; ** p<0.01 and ***p<0.001.

Concentración de nanopartículas (µg/mL)

c)

b)

a)

84

4.5.1.2 Análisis de citotoxicidad de NPs funcionalizadas con ácido fólico

El ensayo MTT solo realizó con las UCNP-FA y las células HeLa y mama MCF-7,

ya que no se pudo realizar con las células de cáncer de mama MB-MDA-231,

debido a que estas células no pudieron crecer en las condiciones que se tenían

con la placa de 96 pozos.

En éste ensayo, se aprecia claramente en la figura 47 (a), que la viabilidad celular

de las UCNPs al desnudo es menor que la viabilidad celular ocasionada por las

NPs recubiertas. Para la figura 47 (b), el efecto en la viabilidad celular ocasionado

por las NPs al desnudo era de un 80% en algunas concentraciones y se

incrementó entre 95 a 100 %, después de la funcionalización de las NPs. En el

caso de la figura 47(c), la viabilidad celular incrementó cuando las células se

expusieron a las NPs funcionalizadas con aminosilanos y ácido fólico. Por lo que

se puede concluir que las UCNPs no son citotóxicas cuando están recubiertas con

sílica y funcionalizadas con ácido fólico.

En la figura 48 se observa la viabilidad celular de las MCF-7 con las UCNPs al

desnudo y funcionalizadas con FA, en el cual no se ve citotoxicidad en las células,

tanto en las UCNPs al desnudo como en las funcionalizadas con FA, con una

viabilidad celular mayor al 80%.

85

Figura 47. Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo (barras blancas) y con ácido fólico (barras negras) incubadas en células HeLa. a) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 10%).

a)

b)

c)

86

a)

b)

c) Figura 48. Ensayo de viabilidad celular con incubación por 24 hr de las UCNPs al desnudo

(barras blancas) y con ácido fólico (barras negras) incubadas en células de cáncer de mama MCF7. a) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 1%) and c)

Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%, 10%).

87

4.5.2 Análisis de citotoxicidad con azul tripano

El ensayo de viabilidad celular con el colorante azul tripano fue utilizado en la línea

celular de cáncer de mama (MB-MDA-231), debido a que no se pudieron incubar

en la placa con 96 pozos, por lo que se utilizó una placa con 12 pozos con 80,000

células por pozo. Las concentraciones utilizadas fueron 0.1 y 1 µg/ml y teniendo

como control positivo de crecimiento a las mismas células incubadas con medio

RPMI. Las UCNPs fueron incubadas con las células por 24 hr.

Como se aprecia en la figura 49, las UCNPs no presentan citotoxicidad en las

células de cáncer de mama al tener un porcentaje de células vivas del 83% para

Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%), para el Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,1%) el porcentaje de

células vivas es de 70-71% y para Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%,10%) es de 80.5% para la

concentración de 1 µg/mL y muestra una pequeña disminución del 65.7 % para la

concentración del 0.1 µg/mL.

88

a)

b)

c)

Figura 49. . Ensayo de azul tripano con incubación por 24 hr de las UCNPs con ácido fólico incubadas en células de cáncer de mama. En azul se muestra el porcentaje de células vivas respecto del porcentaje de células muertas (barras rojas) a) Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%,10%), b) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 1%) and c) Y2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 10%).

%Células muertas

% Células vivas

%Células muertas

% Células vivas

%Células muertas

% Células vivas

89

4.5.3 Análisis por microscopía confocal

Existen numerosos estudios publicados de bio-imagen de células y tejidos con

NPs (Sanchez-Sanchez, et al, 2015) y actualmente la imagen celular in vitro

involucra la localización de UCNPs hacia algunos componentes sub-celulares o

ligandos (Shen, et al, 2013).

En esta tesis, se logró la funcionalización de las UCNPs con ligandos de ácido

fólico para permitir su unión específica a los receptores de ácido fólico sobre-

expresados en la superficie de células de cáncer de mama y cervix. Las UCNPs (1

µg/mL) se incubaron por 24 hr con las células de cáncer. Posteriormente el núcleo

de las células fue teñido con DAPI. Las UCNPs fueron excitadas con un láser NIR

de 980 nm de longitud de onda y filtros EGFP (green fluorescent protein) en las

figuras 50 y 51 (b). La tinción del núcleo con DAPI fue excitada a 405 nm y

emisión de 461 nm, como se muestra en las figuras 50, 51, 53 y 54 (a) indicado

con la letra N.

Figura 50. Microscopia confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%, 1%) en células HeLa. a) Tinción nuclear con DAPI emitiendo a 461 nm, la letra N indica la posición del núcleo de las células, b) excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + EGFP, la flecha indica la localización de las nanopartículas en el citoplasma de la célula y c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en la región citoplasmática.

UCNP-NH2-FA (1 µg/mL)

Traslape

a) b) c)

Láser NIR 980 nm + láser EGFP

DAPI

90

Figura 51. Microscopía confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%, 1%) en células

de cáncer de mama MDA-MB-231. a) Tinción nuclear con DAPI emitiendo a 461 nm,

la letra N indica la posición del núcleo de las células, b) excitación de las UCNPs

con láser NIR 980 nm + EGFP, la flecha indica la localización de las nanopartículas

en la región citoplasmática de la célula y c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese

aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma.

Las UCNPs que emiten en rojo (660 nm) fueron excitadas con un láser NIR de 980

nm y filtro RFP (red fluorescent protein), como se muestra en las figuras 52 y 53

(b) e indicadas con una flecha. La tinción del núcleo con DAPI fue excitada a 405

nm y emisión de 461 nm, como se muestra en las figuras 53 y 54 (a) indicado con

la letra N.

Como se esperaba, las UCNP-NH2-FA se localizaron claramente en el citoplasma

de las células, en las imágenes se puede observar las emisiones de las UCNPs en

verde (figuras 50-c y 51-c) y rojo (figuras 52-c, 53-c, 54-c y 55-c). Las UCNPs de

Gd2O3 se observan con su emisión en rojo en las figuras 54 y 55. Además, se

muestra el traslape de las imágenes del núcleo y las UCNPs.


DAPI Traslape

N

N

N

Láser NIR 980 nm +

láser EGFP

N

N N

N

N

N

a) b) c)

91

Figura 52. Microscopia confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%, 10%) incubadas con células de cáncer HeLa. a) El colorante DAPI muestra la localización del núcleo, el cual emite a 461 nm, la letra N indica la posición del núcleo de las células, b) excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + RFP, la flecha indica la localización de las nanopartículas en el interior de las células c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma.

Figura 53. Microscopía confocal de las UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er3+

/Yb3+

(1%, 10%) incubadas con células de cáncer de mama MDA-MB-231. a) Se observa la tinción nuclear con DAPI, el cual emite a 461 nm, la letra N indica la posición del núcleo de las células, b)Se observa la excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + RFP, la flecha indica la localización intracelular de las nanopartículas y c) traslape de DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma , se agregó como referencia el fondo en campo claro de las células para apreciar mejor las UCNPs.

DAPI

N

N

N

DAPI Traslape

N

Traslape

Láser NIR 980 nm +

láser RFP


a) b) c)

N

N

N N

N

N

N

Láser NIR 980 nm +

láser RFP

a) b) c)


N

N

N

N N

N N

N

92

c

Figura 54. Micrografía confocal de las células de cáncer cevicouterino, HeLa, incubadas con UCNP-NH2-FA de Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 10%). a) La tinción nuclear con DAPI

emitiendo a 461 nm, se indica con la letra N b) La excitación de las UCNPs con láser NIR 980 nm + RFP, está indicada por una flecha y c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma celular.

Figura 55. Micrografía confocal de células de cáncer de mama MDA-MB-231 incubadas con UCNP-NH2-FA de Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 10%). a) Tinción nuclear con DAPI, “N” indica

la posición del núcleo de las células, b) la flecha indica la localización intracelular de las UCNPs excitadas con láser NIR 980 nm + RFP, y c) traslape de DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma, se agregó como referencia el fondo de las células para apreciar mejor las UCNPs.

DAPI

DAPI Traslape

N

N

N

N

N

Láser NIR 980 nm +

láser RFP Traslape


a) b) c)

N

N N


a) b) c)

Láser NIR 980 nm +

láser RFP

N

N

N

N

N

N

93

En la figura 56 se muestran las UCNPs Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%) de color rojo

dentro del citoplasma de las células de cáncer de mama MCF7, en la 57 se

precian las UCNPs Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) de color verde y en la 58 las UCNPs

Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 10%) de color rojo.

Figura 56. Micrografía confocal de células de cáncer de mama MCF-7 incubadas con UCNP-NH2-FA de Gd2O3:Er

3+/Yb

3+ (1%, 10%). a) Tinción nuclear con DAPI, “N” indica la

posición del núcleo de las células, b) la flecha indica la localización intracelular de las UCNPs excitadas con láser NIR 980 nm + RFP, y c) traslape de DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma, se agregó como referencia el fondo de las células para apreciar mejor las UCNPs.

Figura 57. Micrografía confocal de células de cáncer de mama MCF-7 incubadas con UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er

3+/Yb


posición del núcleo de las células, b) la flecha indica la localización intracelular de las UCNPs excitadas con láser NIR 980 nm + EGFP, y c) traslape de DAPI+NIR+EGFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma, se agregó como referencia el fondo de las células para apreciar mejor las UCNPs.

DAPI

Láser NIR 980 nm +

láser RFP Traslape

DAPI Láser NIR 980 nm +

láser EGFP Traslape

N

N

N N N

N

94

Figura 58. Micrografía confocal de células de cáncer de mama MCF-7 incubadas con UCNP-NH2-FA de Y2O3:Er

3+/Yb


posición del núcleo de las células, b) la flecha indica la localización intracelular de las UCNPs excitadas con láser NIR 980 nm + RFP, y c) traslape de DAPI+NIR+RFP, donde ese aprecia la célula completa con las UCNPs en el citoplasma, se agregó como referencia el fondo de las células para apreciar mejor las UCNPs.

Como se aprecia en las micrografías tomadas con el microscopio confocal, las

UCNPs de Y2O3:Er3+/Yb3+ (1%, 1%) de color verde y las de Gd2O3:Er3+/Yb3+ (1%,

10%) de color rojo, son las que presentaron una mejor penetración y luminiscencia

dentro del citoplasma de las células. En las figuras 50, 51, 54 y 55 se puede

apreciar que las UCNPs tienen una luminiscencia con intensidad que se puede

apreciar fácilmente en ambas células.

En las figuras 50, 52 y 54 se aprecia que existe una mayor cantidad de UCNPs en

el citoplasma de las células Hela, debido a que estas células tienen mayor

cantidad de receptores de ácido fólico en su superficie que las células de cáncer

de mama MDA-MBN-231, por lo que la cantidad de UCNPs que pueden captar es

mayor que las células de cáncer de mama tanto de MB-MDA-231 como MCF-7

(figuras 56 a 58). Este comportamiento con las células Hela se puede apreciar en

los tres tipos de UCNPs utilizadas.

Con estos resultados, se demostró que las UCNPs-NH2-FA tienen la capacidad

de unirse a las células de cáncer y ser internalizadas en el citoplasma sin efectos

DAPI Láser NIR 980 nm +

láser RFP Traslape

95

citotóxicos, lo cual es un requisito prioritario de un buen biomarcador. Con ello se

confirma que las UCNPs pueden ser utilizadas como bioetiquetadores de células

de cáncer de mama y cervix como una importante herramienta de diagnóstico de

cáncer.

96

5. Conclusiones

En este trabajo de investigación se sintetizaron y caracterizaron diferentes

materiales luminiscentes de conversión ascendente con las redes anfitrionas Y2O3

y Gd2O3, las cuales fueron dopadas con diferentes concentraciones molares de los

iones Er3+ e Yb3+. A partir de los resultados, se puede concluir lo siguiente:

Las UCNPs sintetizadas por sol-gel presentan una forma, en general,

esferoidal y con menos aglomerados que las sintetizadas por el método de

síntesis por combustión.

En cuanto a la luminiscencia se concluye que para la síntesis de

nanopartículas de conversión ascendente el método de sol-gel es mejor

que síntesis por combustión.

El tamaño promedio de las UCNPs en ambos métodos de síntesis fue: para

la red de Y2O3, de 70 nm ±10 nm y para la red de Gd2O3 se obtuvieron

nanopartículas con tamaño de 50 ±10 nm.

La difracción de rayos-X de las UCNPs obtenidas con ambos métodos para

la red anfitriona Y2O3 y Gd2O3 muestran una estructura cristalina cúbica.

En general, las temperaturas de tratamiento térmico más altas, muestran

una intensidad mayor en la luminiscencia de las UCNPs. Para las UCNPs

de Y2O3 fueron 1200C y para las de Gd2O3 fueron 900C, esto se debe a

una mejor formación de la estructura cristalina y a una mejor inserción de

los iones Er3+/Yb3+ dentro de la estructura de la red.

Las UCNPs con mejores propiedades de luminiscencia y tamaño fueron:

Gd2O3 con Er3+/Yb3+ (1%,10%) horneada a 900C y dos dopajes para Y2O3:

Er3+/Yb3+: (1%,1%) y (1%,10%) horneadas a 1200C.

La red Y2O3, el dopaje de Er3+/Yb3+ al (1%,1%) presentó emisión en color

verde, mientras que el dopaje de (1%,5%) emitió en color naranja y el de

(1%,10%) en rojo.

97

En el caso de la red de Gd2O3 el dopaje Er3+/Yb3+ al (1%,10%) presentó

una emisión en rojo, siendo el que mejor emisión e intensidad presentó.

Los dopajes de Er3+/Yb3+ al (1%,10%) y (1%, 5%) presentan más

transiciones en el nivel de energía 4F9/2 4I15/2 debido a la relajación

cruzada causada por el incremento del dopaje del Yb3+, por lo que la

emisión predominante es la de color rojo a 660 nm.

Se determinó por TEM, EDS, FTIR y espectrofluorómetro, que las UCNPs

están recubiertas con sílica y funcionalizadas con grupos amino con la

técnica APTES/TEOS.

Las UCNPs funcionalizadas con APTES/TEOS/FA, tuvieron las mismas

transiciones electrónicas presentes en el momento de ser excitadas a 980

nm que las probadas al desnudo, lo que confirma que la funcionalización no

afectó la intensidad luminiscente y conservan las mismas propiedades

ópticas.

Se comprobó la presencia de los grupos amino (-NH2) y de los ligandos de

ácido fólico (C19H19N7O6), con el análisis FTIR, presentes en la superficie de

las nanopartículas.

Las UCNPs funcionalizadas con aminosilanos y ácido fólico UCNPs-NH2-

FA, no son citotóxicas en las células de cáncer de cervix y de mama, por lo

que pueden ser utilizadas como biomarcadores de células de cáncer.

Las UCNP-NH2-FA fueron claramente localizadas en el citoplasma de las

células de cáncer de mama y cervix, por medio del microscopio confocal.

Con esta información se confirma que las UCNPs pueden ser utilizadas como

bioetiquetadores de células de cáncer de mama y cervix como una importante

herramienta nanométrica para el diagnóstico de diferentes tipos de cáncer, debido

a su capacidad de internalización en las células estudiadas.

98

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104

Apéndices

Apéndice A

Fichas de difraccion de rayos X de las bases de datos de JCPDS utilizadas

105

Apéndice B

Artículos publicados derivados del trabajo de investigación de la tesis:

1. Chávez D., Contreras O., Hirata G. (2016) Synthesis and upconversion

luminescence of nanoparticles Y2O3 and Gd2O3 Co-doped with Yb3+ and

Er3+. Nanomaterials and Nanotechnology, 6, 7-17. doi: 10.5772/62188

2. Chávez D., Juárez-Moreno K., Hirata G. (2016) Aminosilane functionalization

and cytotoxicity effects of upconversion nanoparticles Y2O3 and Gd2O3 Co-

doped with Yb3+ and Er3+. Nanobiomedicine, 3, 1-7. doi: 10.5772/62252.

3. Silica coated, aminosilane functionalization, upconversion emission and

cytotoxicity in cancer cell lines of the nanoparticles Y2O3 and Gd2O3 co-

doped with Yb3+ and Er3+ D. Chávez, K. Juárez-Moreno and G.A. Hirata.

Mater. Res. Soc. Symp. Proc. Vol. 1 © 201 Materials Research Society

DOI:10.1557/opl.201 . 6 6 817 44

Programa de Posgrado en Ciencias en Física de Materiales · funcionalizada capaz de unirse con los...

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