PROLIFERACIÓN celular EN LA RETINA DEL PEZ CEBRA ADULTO

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

I

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….……pág.1

1.1. Anatomía de la retina del pez cebra………………………………………….……..pág.1

1.2. Neurogénesis en la retina del pez cebra adulto……………………………….……pág. 2

1.3. Regeneración en la retina del pez cebra adulto……………………………….……pág.5

1.4. Caracterización de los progenitores de la retina del pez cebra adulto……….……..pág.6

1.4.1 Zona periférica germinal…………………………………………………....pág.6

1.4.2 Linaje de bastones……………………………………………………….….pág.9

1.5. Marcadores de proliferación………………………………………………………..pág.10

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS…………………………………………………..pág. 12

3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….pág.13

3.1. Animal de experimentación………………………………………………………...pág.13

3.2. Grupos de experimentación………………………………………………………...pág.13

3.3. Extracción de los ojos………………………………………………………………pág.14

3.4. Axotomía…………………………………………………………………….……..pág.14

3.5. Procesamiento histológico………………………………………………………….pág.15

3.6. Inmunohistoquímica de fluorescencia……………………………………………...pág.15

3.7. Análisis de imagen…………………………………………………………………pág.17

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………...pág.18

4.1. Detección de células en división……...……………………………………………pág.18

4.2. Localización de células en división…...……………………………………………pág.18

4.2.1 Grupo de experimentación 1…………………………………………………pág.18

4.2.1 Grupo de experimentación 2…………………………………………………pág.19

4.3. Colocalización de Prox1 con BrdU……...…………………………………………pág.23

4.4. Investigaciones futuras…………………...………………………………….……..pág.25

5. CONCLUSIONES…………………………………………………………………….pág.27

6. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………...………………pág.28

II

ABREVIATURAS

bHLH: Dominio Hélice-Bucle-Hélice

básico.

BrdU: 5-bromo-2-desoxiuridina.

CCG: Capa de las células ganglionares.

CFNO: Capa de las fibras del nervio

óptico.

CM: Células de Müller.

CNE: Capa nuclear externa.

CNI: Capa nuclear interna.

CPE: Capa plexiforme externa.

CPI: Capa plexiforme interna.

EGF: Factor de crecimiento epidérmico.

EP: Epitelio pigmentario.

FGF: Factor de crecimiento de los

fibroblastos.

GFAP: Proteína glial fibrilar ácida.

GS: Glutamia sintetasa.

HD: Homeodominio.

Hh: Hedgehog.

H3P: Histona H3 fosforilada.

MLE: Membrana limitante externa.

MLI: Membrana limitante interna.

PBS: Tampón fosfato salino.

PCNA: Antígeno nuclear de células en

proliferación.

SF: Capa de los segmentos de los

fotorreceptores.

SNC: Sistema nervioso central.

TP: Tampón fosfato.

ZPG: Zona periférica germinal

INTRODUCCIÓN

1. INTRODUCCIÓN

El pez cebra (Danio rerio), al igual que otros peces teleósteos y anfibios, crece durante toda la

vida. Este aumento de tamaño, afecta a todo el cuerpo, incluyendo también el ojo y sus

componentes. En este trabajo, nos centraremos en cómo se lleva a cabo ese crecimiento a nivel de la

retina, y también en su capacidad de regeneración.

1.1 ANATOMÍA DE LA RETINA DEL PEZ CEBRA.

La retina forma parte del Sistema Nervioso Central (SNC). Deriva del tubo neural por una

evaginación par del prosencéfalo que forma las vesículas ópticas, posteriormente éstas dan lugar a

las copas ópticas y finalmente se forma la retina. La retina, es la capa más interna del globo ocular y

su función es la recepción y procesamiento inicial de la información visual.

La retina se organiza en 8 capas, que de la más externa a la más interna son las siguientes

(Fig.1):

- Epitelio pigmentario (EP): Monocapa de células epiteliales cargadas de pigmentos y unidas

entre sí por uniones complejas. Sus células presentan en la parte apical procesos alargados que

se interdigitan con los segmentos externos de los fotorreceptores. Sus funciones principales son

formar la barrera hematorretiniana, fagocitar los segmentos externos de los fotorreceptores para

permitir su continua renovación, y almacenar el retinol que forma parte de los fotopigmentos.

- Capa de los segmentos de los fotorreceptores (SF): Formada por los segmentos externos e

internos de los fotorreceptores, conos y bastones. Es donde se localizan los pigmentos

fotosensibles. A los segmentos se unen expansiones esclerales de las células de Müller para

formar la membrana limitante externa (MLE).

- Capa nuclear externa (CNE): Constituida por los núcleos de los fotorreceptores, es decir, los

cuerpos celulares de los fotorreceptores.

- Capa plexiforme externa (CPE): Lugar de localización de las sinapsis entre los

fotorreceptores y las interneuronas (células bipolares, interplexiformes y horizontales).

También se puede encontrar microglía.

- Capa nuclear interna (CNI): Capa que contiene los somas de las interneuronas y el cuerpo

celular de las células de Müller.

Capa plexiforme interna (CPI): Contiene los axones de las células bipolares y las dendritas

de las células amacrinas, interplexiformes y ganglionares. Es el lugar donde se establecen las

sinapsis entre las células bipolares y las ganglionares. También se puede encontrar microglía.

- Capa de las células ganglionares (CCG): Formada por los somas de las células ganglionares

y las células amacrinas desplazadas.

- Capa de las fibras del nervio óptico

(CFNO): Capa constituida por los axones de las

células ganglionares, que al salir de la retina

constituyen el nervio óptico. También hay células

gliales y en la parte más vitreal encontramos la

membrana limitante interna (MLI), formada por la

membrana basal de las células de Müller.

La luz incidente debe atravesar todas las capas

de la retina hasta llegar a los fotorreceptores, donde

se produce la fototransducción. La información es

conducida a las células bipolares y de éstas, pasa

finalmente a las células ganglionares y a las fibras

del nervio óptico. La información visual, a lo largo

de esta transmisión vertical, sufre una modulación

por parte de las interneuronas que constituyen la vía

horizontal (Kandel, 2001).

1.2 NEUROGÉNESIS EN LA RETINA DEL PEZ CEBRA ADULTO.

El proceso de neurogénesis es variable en el SNC adulto entre los distintos grupos animales, en

mamíferos está bastante limitado (Ceverny et al., 2011). Sin embargo, en los peces teleósteos, como

el pez cebra, se han descrito entre 50 y 60 zonas proliferativas en el SNC adulto. La presencia de

células mitóticamente activas es lo que les permite crecer de forma continuada a lo largo de la vida,

y su capacidad de regeneración tras una lesión.

Figura 1. Estructura de la retina.

Representación gráfica de las distintas capas

de la retina. Extraído de Sánchez-González,

2009.

El crecimiento continuo de la retina se

debe a dos mecanismos, adición de nuevas

células y expansión del tejido maduro. Este

último es el más importante, y consiste en

un estiramiento gradual del tejido maduro

existente, aumentando el tamaño del globo

ocular, lo que provoca una disminución de

la densidad celular en la retina, pero la

agudeza visual se mantiene (Morris y

Scholz, 2008). Por otro lado, en la retina

adulta, se generan nuevas células a partir de

dos poblaciones de retinoblastos, la zona

periférica germinal (ZPG) y el linaje de los progenitores de bastones (Fig.2) (Stenkamp, 2011).

Zona periférica germinal Es un neuroepitelio pseudoestratificado, procedente de la copa

óptica embrionaria, con células que mantienen su capacidad mitótica durante la vida adulta. Se

encuentra formando un anillo de células multipotentes en la periferia de la retina. Por un lado se

continúa con la retina neural y por su extremo periférico con el estrato no pigmentado del epitelio

ciliar (Stenkamp, 2011). Se describió inicialmente en los trabajos de Müller (1952) y Lyall (1957).

Posteriormente han sido muchos los estudios que han confirmado su papel en la neurogénesis

(Johns, 1977; Meyer, 1978).

Desde la ZPG, se van añadiendo en la retina, anillos concéntricos de células, que maduran y se

diferencian, aumentando el tamaño de la retina. De esta forma, las células que se encuentren en las

regiones más periféricas de la retina serán las más jóvenes. Las nuevas capas van desplazando a las

ya formadas, habiendo así una zona de transición donde la laminación no está aún establecida y las

células se están diferenciando. Desde la ZPG se forman todos los tipos celulares retinianos excepto

los bastones (Ottenson y Hitchcock, 2003).

En otros vertebrados como el pollo, se pueden encontrar células proliferativas en la ZPG

hasta 4 meses después de la eclosión, pero tienen una capacidad de neurogénesis más limitada y

no responden frente a lesiones (Ottenson y Hitchcock, 2003).

Linaje de los bastones: En el pez cebra los bastones se forman 2 ó 3 días después de la

eclosión, de manera que hasta ese momento la CNE está formada por conos en diferenciación

(Stenkamp, 2011).

Figura 2. Localización de los progenitores en la retina

del pez cebra. A, ZPG en la zona más periférica. B,

progenitores de bastón de la retina central. Modificado

de Otteson et al., 2001

La presencia de una fuente de células proliferativas en los peces, generadoras de bastones, se

conoce desde hace aproximadamente 30 años (Stenkamp, 2011). Los primeros estudios se

realizaron en carpín (Johns, 1982) y más tarde en tenca y pez cebra (Raymond et al., 2006). A pesar

de ello, el verdadero origen de las células del linaje de bastones se ha conocido recientemente. En

un primer momento, se describieron como células inmaduras procedentes de la ZPG, que se

mantienen indiferenciadas y dan lugar a progenitores de bastones que después se diferencian en

bastones (Ottenson y Hitchcock, 2003). Actualmente, se ha demostrado que su origen está en las

células de Müller (Bernardos et al., 2007), localizadas en la CNI y con una baja tasa de

proliferación, excepto cuando se trata de la respuesta frente a una lesión (Morris y Scholz., 2008).

Según el modelo propuesto por algunos autores (Otteson et al., 2001; Otteson y Hitchcock,

2003), las células gliales de Müller se originan a partir de células madre de la ZPG a medida que va

creciendo la retina (fig.3A). Éstas, se localizan en la CNI, y mantienen cierta capacidad de

proliferación, aunque menor que las células de la ZPG, lo que les permite, mantener su propia

población y dar lugar a las células del linaje de bastones. Así pues, las células de Müller se

consideran células madre modificadas, ya que expresan el gen pax6. En la progenie que originan ya

no se encuentra expresión de pax6, pero comienzan a expresar factores de transcripción

característicos de fotorreceptores, mientras migran por los procesos gliales hacia la CNE. Una vez

allí, siguen proliferando, expresando de forma coordinada múltiples factores de transcripción,

característicos de los fotorreceptores,

y tras la última mitosis se diferencian

en bastones (fig. 3B). Por tanto, las

células de Müller no son sólo un

soporte estructural para la migración

de los progenitores de bastón, sino

que además son su fuente de origen

(Stenkamp, 2011).

Dentro del linaje de bastones

tenemos que diferenciar tres tipos de

progenitores (Stenkamp, 2011):

- Células madre de la CNI: Son

células indiferenciadas, fusiformes, con un núcleo esférico, y su tasa de proliferación es muy

baja. Se encuentran en la parte más vitreal de la CNI y expresan Pax-6 (Stenkamp, 2011). Su

Figura 3. Linaje de bastones. A, Formación del linaje de

bastones desde la ZPG. B, Generación de nuevos progenitores

de bastón a partir de una célula de Müller. Extraído de

Sánchez-González, 2009.

división sirve para mantener su población y para formar los progenitores que migrarán a la

CNE.

- Progenitores en migración: Tienen una morfología alargada, con uno o dos procesos

vitreales y uno escleral (Sánchez-González, 2009). La migración se produce siguiendo los

procesos de las células de Müller hasta llegar a la CNE (Stenkamp, 2011).

- Precursores de bastón: Células con uno o dos procesos esclerales que no sobrepasan la MLE.

Dentro del linaje de bastones son las que tienen una mayor actividad mitótica y por ello

fueron las primeras en ser descritas. Son los que finalmente se diferencian en bastones.

1.3 REGENERACIÓN EN LA RETINA DEL PEZ CEBRA ADULTO.

La capacidad de regeneración de la retina en los peces teleósteos se conoce desde hace varios

años. Para su estudio, se han utilizado diversos métodos que dañan la retina, como la escisión

quirúrgica, destrucción con agentes químicos como la tunicamicina, fototoxicidad y lesión por

calor. A pesar de conocerse desde hace tiempo, y de que se han hecho numerosos experimentos para

estudiarla, es muy poco lo que se conoce acerca de los mecanismos moleculares que regulan la

regeneración (Morris y Scholz, 2008). En el caso de los mamíferos, la regeneración está muy

limitada, se restringe a una hipertrofia de las células gliales sin formación de nuevas células

(Stenkamp, 2011).

Tras numerosos estudios se ha podido demostrar que las células de Müller (CM) localizadas en

la CNI, son las responsables de la regeneración retinal (Bernardos et al., 2007; Stenkamp, 2011). Su

tasa de proliferación aumenta tras producirse una lesión en la retina, dando lugar a progenitores

multipotentes que pueden reponer cualquier tipo celular de la retina (Thummel et al., 2008) (fig. 4).

Para intentar comprender mejor el proceso de regeneración se han realizado estudios produciendo

lesiones experimentalmente, o bien, con peces mutantes, que presentan degeneración de uno o

varios tipos celulares retinianos. Este último caso ha permitido que se pueda estudiar la

regeneración a lo largo de la vida del animal, en lugar de tener sólo un breve periodo de tiempo tras

la lesión (Morris y Scholz, 2008). Un ejemplo de esto es el pez cebra transgénico XOPS-mCFP que

sufre una degeneración selectiva de los bastones, sin afectación de otros tipos celulares (Morris y

Fadool, 2005).

Las CM de la retina tienen funciones similares a las del resto de células gliales, sirven de

soporte estructural y metabólico, regulan la concentración iónica y contribuyen a la homeostasis de

los neurotransmisores, pero además, se comportan como células madre, en caso de lesión, con

capacidad de división que le sirve para mantener su propia población y formar progenitores neurales

(Fleisch, 2011). Ello implica una desdiferenciación, en la cual dejan de expresar marcadores

específicos de CM como la GFAP (proteína glial fibrilar ácida) y GS (glutamina sintetasa) y

comienzan a expresar marcadores característicos del desarrollo embrionario y/o de las células madre

de la ZPG (Fleisch, 2011).

Como hemos visto, las CM responden en casos de lesión,

formando nuevas neuronas. Se ha descrito que el proceso

implica importantes cambios en la expresión génica. Cuando

se produce la lesión, las CM adquieren características

fenotípicas de células madre, haciéndose más similares a las

células de la ZPG.

1.4 CARACTERIZACIÓN DE LOS PROGENITORES DE LA RETINA DEL PEZ CEBRA

ADULTO.

El proceso de proliferación en la retina implica una serie de señales complejas, intrínsecas y

extrínsecas, que regulan todo el proceso. En los mamíferos, también están presentes las CM y una

zona periférica similar a la ZPG de teleósteos. Por ello la comprensión de los mecanismos

moleculares que regulan la re-entrada de dichas células en el ciclo celular es fundamental para el

desarrollo de posibles terapias, que podrían aplicarse para la regeneración de la retina de mamíferos.

Actualmente, ya se ha conseguido que, en cultivos celulares, las células de la ZPG humana entren

de nuevo en división, usando EGF (factor de crecimiento epidérmico), aunque falta mucho por

conocer acerca de los mecanismos de regulación (Fleisch, 2011).

1.4.1 ZONA PERIFÉRICA GERMINAL

Las células progenitoras de la ZPG se caracterizan por la expresión de diferentes genes. Dentro

de ella podemos distinguir varias regiones (periférica, medial y central), ya que la expresión de

Figura 4. Linaje de bastones. Capacidad de respuesta de las

células progenitoras del linaje de bastones, en una retina intacta

y en una retina lesionada. Modificado de Morris et al., 2008.

genes varía a medida que nos acercamos a la retina ya formada. En los estados más indiferenciados

de estos progenitores celulares su patrón de expresión génica es bastante similar al que presentan las

células durante la retinogénesis embrionaria.

Las señales intrínsecas conocidas más importantes que participan en la regulación de la

proliferación en la ZPG son:

• Pax6: Se considera un gen clave para el desarrollo del ojo y es indispensable para mantener la

multipotencialidad de las células de la ZPG. Además es un activador transcripcional de varios

genes bHLH (dominio Hélice-Bucle-Hélice básico) que determinan los destinos de los

progenitores retinianos. Dentro de la ZPG, su expresión es mucho más marcada en la región

más periférica, próxima al epitelio ciliar, donde se coexpresa con otros factores de transcripción

de tipo HD (con homeodominio), como rx1 (Raymond et al., 2006).

• Rx1: Se expresa tanto en la región más periférica de la ZPG, como en la capa de los

fotorreceptores. Es un factor importante en la diferenciación de dicho tipo celular. Su expresión

en la ZPG junto a pax6 indica el carácter multipotencial de dichas células (Raymond et al.,

2006).

• Factores de transcripción de tipo HD, como Vsx2/Chx10 o como six3 y sox, cuya expresión es

intensa en la periferia de la ZPG (Raymond et al., 2006).

• N-cadherina: Las células de la ZPG presentan una expresión difusa de esta proteína, a lo largo

de la membrana plasmática, cuya función es mediar las uniones celulares. Forma uniones

homofílicas dependientes de calcio. En la ZPG, las células en proliferación presentan

interacciones celulares mediadas por la cadherina (Raymond et al., 2006).

• BLBP (brain lipid binding protein/proteína cerebral de unión a lípidos): Se expresa en la ZPG y

en las células de Müller más próximas a la ZPG. Esto nos indica que su expresión disminuye

con la maduración de la glía (Raymond et al., 2006).

• ascl 1a: Factor de transcripción bHLH que se expresa moderadamente en la periferia de la ZPG

y después disminuye hasta estar ausente en la parte central (Raymond et al., 2006).

• Neuro D: Participa en etapas tardías de la diferenciación especificando el destino de los

fotorreceptores. En la periferia de la ZPG su expresión es baja, pero en la parte central se

incrementa fuertemente, ya que es donde se diferencian los fotorreceptores (Raymond et al.,

2006).

• Nestina: Se expresa en las zonas de proliferación de la retina del pez cebra adulto. Se ha

propuesto que interviene en la regulación de la proliferación, la supervivencia y la

diferenciación celular. En el ojo, se ha observado que su bloqueo implica un aumento de

apoptosis en la retina (Chen et al., 2010).

• Componentes de la vía de señalización Notch-Delta: Es una vía de señalización muy

importante que interviene en el mantenimiento del estado diferenciado o indiferenciado de las

células. En la ZPG, se expresan tanto los receptores (notch1a, notch1b, nocht3), como sus

ligandos deltaA, deltaB, deltaC, y deltaD. Su expresión es moderada en las células de la región

más periférica de la ZPG y más baja en regiones centrales (Raymond et al., 2006).

Por otro lado, se conocen numerosas señales extrínsecas que afectan a los procesos de

proliferación y diferenciación que acontecen en la ZPG.

Los procesos de proliferación celular en la retina están influenciados por distintos factores de

crecimiento como EGF (factor de crecimiento epidérmico), e IGF (factor insulínico de

crecimiento) (Morris y Scholz, 2008).

Los factores de crecimiento de los fibroblastos (FGFs) ejercen un efecto mitógeno. El bloqueo

de los FGFs conduce a una degeneración y desorganización de los fotorreceptores, causando muerte

celular en la CNE. Su pérdida desencadena la proliferación de las CM de la CNI que terminan

generando nuevos fotorreceptores. Por tanto, FGF se requiere para el mantenimiento de los

fotorreceptores y para favorecer la proliferación de las CM durante la regeneración (Hochmann et

al., 2012).

La vía de señalización Wnt/b-catenina también interviene en los procesos de proliferación y

diferenciación. Está formada por las Wnts, glicoproteínas secretadas que poseen una distribución

característica de residuos de cisteína. Su función es inhibir la degradación de la b-catenina para que

ésta se acumule en el núcleo y actúe como activador de la transcripción de los genes diana (Huang

y Klein, 2004). En la retina, los posibles genes diana de esta ruta de señalización son cmyc (cerca de

la fuente de producción de Wnt) y ccnD1 (lejos de la fuente de producción), que se expresan en los

progenitores de la retina (Ceverny et al., 2011).

Los genes de la familia Hedgehog (Hh), como Sonic Hedgeghog (Shh), codifican proteínas

lipídicas glicosiladas encargadas de modular la longitud de las fases del ciclo celular. Estas

moléculas (Hh) se sintetizan en las células cercanas a la ZPG y sus receptores se expresan en las

células madre de la ZPG. Dicha localización espacial, favorece que se pueda llevar a cabo una

regulación por gradiente de concentración, haciendo que se pase de una velocidad lenta a rápida en

el ciclo celular de los progenitores retinianos.

Se ha descrito que las señales del entorno, la mayoría de ellas procedentes de neuronas ya

diferenciadas, influyen en la regulación de la proliferación y diferenciación de los progenitores de la

ZPG (Ceverny et al., 2011) (fig. 5).

1.4.2 LINAJE DE BASTONES

Las células del linaje de bastones presentan distintos patrones de expresión de genes en función

del tipo de progenitor del que se trate.

Las células madre de la CNI, es decir, las células de Müller desdiferenciadas, expresan Pax6, lo

que sugiere que Pax6 es necesario para el mantenimiento de la población de células madre

indiferenciadas (Stenkamp, 2011).

Durante el proceso de migración la expresión de pax6 va disminuyendo, mientras que las

células expresan otros genes como rx1 y/o NeuroD cuya expresión aumenta (Stenkamp, 2011).

Los factores de transcripción bHLH, como NeuroD, que se expresa en los conos y bastones en

diferenciación, probablemente regulen el ciclo celular de los fotorreceptores. Estudios en los que se

bloquea NeuroD la proliferación se ve incrementada. NeuroD no se coexpresa con pax6 (Stenkamp,

2011).

Pax6 tampoco coexpresa con rx1, al contrario de lo que sucede en la ZPG. Esto le otorga a las

CM un papel unipotencial. La función que desempeña rx1 en el linaje de bastones es favorecer la

diferenciación de los fotorreceptores, pero no afecta a la proliferación (Stenkamp, 2011).

Cuando los progenitores de bastones alcanzan la CNE expresan distintos genes como NeuroD,

rx1, crx y Nr2e3. Crx, (the cone-rod homeobox), gen homeótico de conos y bastones, codifica para

Figura 5. Posible modelo de la regulación del ciclo

celular en la ZPG. Según este modelo la retina central

es la encargada de regular el ciclo celular y la

diferenciación de los progenitores de la ZPG por

mecanismos de feedback. Extraído de Ceverny et al.,

2010.

un factor de transcripción que regula la expresión de genes específicos de fotorreceptores. Se

encuentra en algunas células del linaje de bastones localizadas en la parte más externa de la CNI.

Otro factor de transcripción específico de fotorreceptores que aparece en la CNE es Nr2e3

(Stenkamp, 2011).

Una vez que se produce la última mitosis y comienzan a diferenciarse a bastones, expresan

todos esos marcadores, al menos de forma transitoria, y además se expresa nrl. Dicho gen, se

considera la última pieza de la red de factores de transcripción que se requieren para el desarrollo

del pez cebra.

Recientemente, en un estudio con carpín (Cid et al., 2010), se ha descrito un nuevo factor de

transcripción que expresan las células de Müller y los progenitores de bastón en migración, Prox1.

Se trata de una proteína que presenta un homeodomio y en el extremo C-terminal, una región

conservada denominada prospero, que podría participar en la unión al ADN o a otras proteínas.

Además, se expresa en la ZPG, las células horizontales, células amacrinas y células bipolares.

También se sabe que está implicado en el desarrollo de varios órganos como el hígado, el páncreas,

la vasculatura linfática y participa en la retinogénesis del pez cebra (Cid et al., 2010). Sin embargo

no hay datos acerca de su expresión en la retina del pez cebra adulto, ni de sus cambios en caso de

lesión.

1.5 MARCADORES DE PROLIFERACIÓN.

Se han descrito distintos tipos de marcadores de proliferación que se han ido utilizando en los

estudios histológicos de los últimos años. Éstos pueden ser proteínas implicadas en el ciclo celular,

nucleótidos marcados o análogos de nucleótidos. A continuación veremos los ejemplos más

utilizados y cuáles son sus principales diferencias.

Los primeros estudios de proliferación se hicieron con timidina tritiada. Este marcador es un

análogo de la timidina, de manera que las células lo incorporan durante la síntesis de ADN en lugar

de la timina. De esta forma, se marcan las células que se encuentran en fase S en el momento de la

aplicación de la timidina tritiada. Este fue el método utilizado en los primeros estudios, pero

actualmente está en desuso debido a los peligros de la radioactividad (Henken y Yoon, 1989).

Actualmente, son muchos los estudios que se realizan con BrdU (5-bromo-2-desoxiuridina), un

nucleótido sintético halogenado, análogo de la timidina. Con su uso se consigue una sustitución casi

total, del 99,8-100% de la timidina por BrdU, en aquellas células que se encuentren en la fase de

síntesis de ADN en el momento de la aplicación. Este método permite observar las células que se

han dividido desde la aplicación del tratamiento. La desventaja de la BrdU frente a otros

marcadores, es que se debe aplicar mediante una inyección in vivo y eso implica cierto estrés para el

animal. Además, se ha observado que puede actuar como mutágeno y alterar los patrones de

transcripción del ADN de la célula (Montuenga et al., 2009; Sánchez-González, 2009)

Otro tipo de marcadores que se utilizan para el estudio de la proliferación son algunas de las

proteínas que intervienen en el ciclo celular.

En primer lugar, la PCNA, Antígeno Nuclear de Células en Proliferación, de 35 kDa que actúa

como cofactor de la ADN polimerasa δ. Su expresión es necesaria para la síntesis de ADN en la

horquilla de replicación y en procesos de reparación de ADN. Además, participa en el control del

ciclo celular al reclutar proteínas específicas a los sitios de replicación del ADN (Maga y Hübscher,

2003). La PCNA comienza a sintetizarse durante la fase G1 tardía del ciclo celular y sus niveles se

hacen máximos en la fase S y descienden durante las fases G2 y M (Bravo et al., 1987).

Otro de ellos es la histona H3 fosforilada (H3P) implicada en la regulación del nivel de

condensación del ADN. Esta proteína se fosforila en el residuo de serina 10 de su extremo N-

terminal durante la mitosis (Prigent y Dimitrov, 2003). Su expresión comienza en la fase G2 tardía,

en la heterocromatina pericéntrica, y se extiende por todo el núcleo durante la transición a la fase M.

Durante la anafase y la telofase se desfosforila (Hendzel et al., 1997).

Por último, otro marcador, Ki-67, es un antígeno nuclear relacionado con la proliferación

celular. Participa en las fases G1 tardía, S y G2/M, por tanto las únicas células que no se marcan son

las que se encuentra en G0 o G1 temprana. Su marcaje nos permite observar las células que se

encuentran en división aunque dará un número mayor de células que otros métodos más específicos,

como BrdU que se restringe a la fase S del ciclo celular (Montuenga et al., 2009).

Para detectar células progenitoras en la retina de peces teleósteos se ha utilizado principalmente

BrdU. En algunas especies, como tenca y carpín, también se ha empleado la detección de PCNA y

de la histona H3 foforilada. Sin embargo, en el pez cebra se ha utilizado fundamentalmente la BrdU.

JUSTIFICACIÓN Y

OBJETIVOS

2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS

La presencia de proliferación en la retina de teleósteos a lo largo de toda la vida se conoce desde

1952, cuando fue descrita por Müller. Se han hecho numerosos estudios para tratar de comprender

dónde y cómo suceden esos procesos (Johns, 1982; Bernardos et al., 2007). También se ha

estudiado con interés la capacidad de regeneración de la retina y recientemente, se han descrito

como principales responsables de esta capacidad, las células de Müller, cuyos somas se localizan en

la CNI. La comprensión de estos procesos es fundamental para poder desarrollar terapias celulares

que puedan ser aplicadas en el hombre con el objetivo de mejorar la capacidad visual de personas

con patologías degenerativas, como retinitis pigmentosa o distrofia retinal (Stenkamp, 2011).

En la mayoría de los trabajos realizados en pez cebra para el estudio de la proliferación, se ha

utilizado BrdU como marcador de células en división. Dicho marcador tiene la ventaja de poner de

manifiesto cualquier célula que se haya dividido durante el tiempo de tratamiento, permitiendo

medir la proliferación que sucede en un cierto periodo de tiempo tras una lesión. Sin embargo, es

una técnica que implica cierto estrés para el animal y se debe calcular muy bien la dosis

administrada porque puede resultar tóxica. En carpín y tenca también se han realizado estudios que

emplean PCNA y H3P, pero son muy escasos en pez cebra.

Por otro lado, en vista de la información existente acerca de Prox1 en carpín (Cid et al., 2010),

pensamos que las células en división en la retina del pez cebra podrían expresar este factor de

transcripción que podría estar implicado en la regulación del proceso de proliferación. Además, en

carpín se ha descrito colocalización de Prox1 con PCNA y H3P, lo que nos induce a pensar que en

nuestro animal de experimentación también podría suceder.

El objetivo general de este trabajo es determinar si PCNA y H3P pueden ser utilizados como

marcadores de proliferación en la retina de pez cebra adulto y si las células en división marcadas

coexpresan Prox1. Para ello se describen varios objetivos concretos:

1. Comprobar que los anticuerpos para PCNA y H3P son capaces de detectar células

mitóticamente activas en la retina de pez cebra adulto y describir su localización.

2. Describir las células que expresan PCNA y H3P en la retina de peces cebra adultos tras una

lesión unilateral del nervio óptico.

3. Comparar los resultados con los obtenidos mediante el uso de BrdU.

4. Realizar un estudio de la localización de la proteína Prox1 en la retina del pez cebra adulto

y su posible colocalización con H3P y PCNA, tanto en animales control como lesionados.

MATERIALES Y MÉTODOS

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 ANIMAL DE EXPERIMENTACIÓN.

El animal utilizado para la realización de este trabajo ha sido el

pez cebra, Danio rerio (Hamilton-Buchanan, 1822) (fig.7). Los

ejemplares utilizados eran adultos, procedentes del acuario del

Instituto de Neurociencias de Castilla y León (INCyL).

Todos los animales adultos fueron mantenidos en un rack donde

la temperatura del agua es constante, 28,5 ºC y se controlan los

niveles de pH, de forma diaria. El fotoperiodo está controlado, ajustando la luz de la sala para que

tengan ciclos de 14 horas de luz y 10 de oscuridad. El agua tiene una aireación y recirculación

constante y se renueva diariamente un 15% del agua total del rack. Se trata de agua desionizada

suplementada con sales Instant Ocean® (Aquarium Systems, Mentor, Ohio; EE.UU.) a una

concentración de 0,3 g/l.

El pez cebra es un modelo de experimentación muy utilizado en la actualidad. Se trata de un

vertebrado, de pequeño tamaño, lo que hace que sea más fácil el mantenimiento de los animales.

Tiene un rápido desarrollo, sus embriones son transparentes y de cada puesta se pueden obtener

entre 100 y 200 embriones. Además, tiene un mantenimiento relativamente sencillo y su coste no es

muy elevado.

En lo que se refiere a la retina, en el pez cebra tiene una estructura similar a la de los

mamíferos, y además presenta capacidad de regeneración y proliferación durante toda la vida del

animal. Esto le convierte un modelo de gran interés para intentar comprender los mecanismos de

dichos procesos.

Cada uno de los experimentos se realizaron bajo anestesia de los animales, sumergiéndolos en

una solución de metanosulfonato de tricaína (MS-222, SigmaAldrich, Inc., St. Louis, MO, EE.UU.)

a una concentración de 0,3 g/l. Según la operación a realizar posteriormente, los animales fueron

sacrificados mediante decapitación o bien reanimados en agua adecuada a sus necesidades.

Todos los protocolos de mantenimiento, manipulación y sacrificio de los animales se llevaron a

cabo cumpliendo las directrices del Consejo de las Comunidades Europeas (86/609/EEC y

2003/65/EC) y de la legislación española (RD 1201/2005 de 10 de octubre, BOE de 21 de octubre

de 2005) vigentes para el uso y cuidado de animales de experimentación, y bajo la supervisión del

Servicio de Experimentación Animal de la Universidad de Salamanca.

Figura 6. Danio rerio.

3.2 GRUPOS DE EXPERIMENTACIÓN

En el presente trabajo se han determinado 2 grupos de experimentación. Por un lado, peces

cebra adultos, cuyos ojos se extraen sin ninguna modificación previa (GRUPO 1). Por otro, peces

cebra adultos a los que se les realiza una lesión en el ojo derecho y se sacrifican a las 72 horas

(GRUPO 2). En este grupo, distinguimos los ojos contralaterales a la lesión, como grupo 2.1 y los

ojos lesionados, grupo 2.2 (tabla 1).

Grupo 1 Grupo 2

3 individuos 3 individuos

Controles Contralaterales (ojo izquierdo) Lesionados (ojo derecho)

Tabla 1. Grupos de experimentación.

3.3 EXTRACCIÓN DE LOS OJOS

Una vez sacrificado el animal, se lleva a cabo la extracción de los ojos. Debido al pequeño

tamaño de los animales, es conveniente colocarlos bajo la lupa, y con la ayuda de dos pinzas se

procede a la extracción. En primer lugar, se rompe el tejido conjuntivo de la cavidad ocular y

después se corta la musculatura extraocular y el nervio óptico. Con el fin de facilitar después la

realización de secciones histológicas en criostato, se extrae el cristalino. Se realiza una pequeña

incisión en la córnea, que se rasga con ayuda de las pinzas, para abrir un agujero que permita la

salida del cristalino al ejercer una leve presión sobre el ojo.

3.4 AXOTOMÍA

El inicio del proceso de axotomía es similar al de la extracción

del ojo (fig.7), se saca el ojo de la cavidad y se rompe un poco el

tejido conjuntivo que lo rodea hasta visualizar el nervio óptico. El

siguiente paso es separar el nervio óptico de la arteria central que va

junto a él, para evitar dañarla, y cortarlo con unas tijeras de precisión.

Por último, una vez comprobado que se ha seccionado de forma

correcta, se coloca de nuevo el ojo en su posición. Finalmente, se

reanima al pez en un tanque con agua y se sacrifica a las 72 horas.

Figura 7. Axotomía.

3.5 PROCESAMIENTO HISTOLÓGICO

Una vez extraídos los ojos se introducen en paraformaldehído al 4% (PFA) para su fijación. Se

dejan en agitación, durante 4 horas a temperatura ambiente o una noche a 4ºC. El siguiente paso es

la crioprotección. Para ello se realizan varios lavados con tampón fosfato al 0,1%, pH 7,4 (TP), 3

lavados de 10 minutos y 4-5 lavados de 15 minutos. Una vez lavados se pasan a una solución de TP

con sacarosa al 30%. En esta solución se dejan 12 horas, a 4ºC en agitación.

Como nuestro objetivo era realizar secciones de la retina en el criostato, era necesario

encastrar los ojos. Utilizamos moldes de plástico que se rellenan con OCT®

, una cantidad

suficiente como para cubrir el ojo. Después se introduce el ojo en el molde y se orienta. Lo

adecuado es que quede en el centro del molde, y con la parte superior del ojo hacia arriba. Se puede

distinguir la parte superior de la inferior porque la superior es negra y la inferior plateada. Una vez

debidamente orientado e identificado se congela con nitrógeno líquido. En ese momento se pueden

cortar o mantener a -20ºC hasta su utilización.

Se obtuvieron secciones de 12 µm de grosor en un criostato Thermus Scientific Microm HM

560, a una temperatura de -28ºC. La orientación de las secciones fue horizontal (fig.9), para poder

obtener secciones de todas las capas de la retina y la salida del nervio óptico. Se recogieron en

portaobjetos Thermo Scientific superfrost ultra plus y se mantuvieron a -40ºC hasta su uso.

3.6 INMUNOHISTOQUÍMICA FLUORESCENTE EN SECCIONES

Para poder comprobar la proliferación de las células de la retina, tanto en condiciones normales,

como tras la lesión, realizamos una técnica inmunohistoquímica para los marcadores PCNA e

Histona H3 fosforilada. El método utilizado fue indirecto, mediante un anticuerpo secundario

conjugado con una molécula fluorescente. Este sistema permite analizar dos antígenos en la misma

sección de tejido, combinando anticuerpos primarios obtenidos en especies diferentes, y los

Bloque de OCT

Figura 8. Esquema de la orientación de las secciones realizadas.

Modificado de Sánchez-González, 2009.

respectivos anticuerpos secundarios conjugados con moléculas de distintos espectros de absorción y

emisión.

En primer lugar, se descongelan los portaobjetos con las secciones de interés a temperatura

ambiente durante 15 minutos. Después se perfila alrededor de las secciones con un rotulador de cera

y se lavan los portaobjetos en cubetas con tampón fosfato salino 0,1M, pH 7,4 (PBS) para eliminar

el OTC®

. Se realizaron 3 lavados de 10 minutos. Para detectar el antígeno PCNA, después del

primer lavado con PBS se da un lavado de 5 minutos con metanol y H2O2 al 0,2%.

A continuación las secciones se incuban con la solución de preincubación, compuesta por suero

de cabra al 5% (debido a que los anticuerpos secundarios utilizados se obtienen de cabra y así se

aumenta la especificidad de la unión, y se evita que el anticuerpo reconozca otras proteínas del pez,

además de para las que está diseñado), DMSO al 1% (ayuda a que las proteínas atraviesen las

membranas) y Triton X-100 al 0,2% en PBS, durante una hora a temperatura ambiente, dentro de

una cámara húmeda. El volumen de solución que se aplica sobre cada portaobjetos es de 200 µL.

Tras la preincubación se añade la solución de incubación. Esta solución consta de los mismos

componentes que la solución de preincubación pero además se añade el anticuerpo primario y se

deja durante una noche a temperatura ambiente, dentro de una cámara húmeda. En el caso de que se

vaya a realizar un doble marcaje (detección de los dos antígenos en la misma sección) es importante

utilizar anticuerpos primarios obtenidos en especies diferentes para evitar interferencias. Las

concentraciones utilizadas de anticuerpos se recogen en la tabla 2.

Después de la incubación se lavan tres veces con PBS durante 5 minutos en agitación y a

continuación se añade una nueva solución de incubación durante una hora. Ésta incluye el suero de

cabra, DMSO y Triton en las mimas proporciones, más el anticuerpo secundario fluorescente a una

dilución de 1/250 y 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Sigma) a 1:104 (marcador de ácidos

nucleicos, que marcará los núcleos de las células de la retina) en PBS. Las secciones se mantienen

en una cámara húmeda totalmente opaca para evitar la incidencia de la luz y la consecuente pérdida

de fluorescencia.

Una vez pasada la hora de incubación, se realizan varios lavados en PBS y gelatina de pez que

sirve para eliminar la autofluorescencia de la muestra. Por último, se montan los portaobjetos con la

solución Prolong®

Gold Antifade Reagent (Invitrogen) que permite la colocación del cubreobjetos

sin dañar el tejido. Las secciones se conservan a 4ºC en oscuridad hasta el momento de su

observación al microscopio de fluorescencia.

PRIMARIOS

Antígeno Anticuerpo Dilución Casa comercial

PCNA IgG de ratón 1/500 Santa Cruz

Biotechnology

H3P IgG de ratón 1/4.000 Abcam

Prox 1 IgG conejo 1/500 Covance

SECUNDARIOS

Antígeno Anticuerpo Conjugado Casa comercial

IgG de ratón IgG de cabra Cy2 Jackson

IgG de ratón IgG de cabra Cy2 Jackson

IgG de conejo IgG de cabra Cy3 Jackson

Tabla 2. Concentraciones de los anticuerpos utilizadas.

3.7 ANÁLISIS DE IMAGEN

Todas las imágenes obtenidas durante la realización del presente trabajo de fin de grado se

consiguieron con la utilización del fotomicroscopio de campo claro y epifluorescencia Olympus

Provis AX70 que se encuentra conectado a una cámara digital Olympus DP70. El programa

informático utilizado fue DP controller y DP manager 2002 Olympus OPTICAL CO. LTD. Para la

optimización de las imágenes se utilizó el programa Adobe Photoshop® CS6.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 DETECCIÓN DE CÉLULAS MITÓTICAMENTE ACTIVAS.

Para la detección de células proliferativas en la retina de pez cebra adulto hemos realizado la

técnica inmunohistoquímica en secciones obtenidas de los ojos del grupo 1 y 2. En la primera

prueba se hizo una inmunohistoquímica doble usando un anticuerpo para PCNA obtenido en ratón y

uno para H3P obtenido en conejo. Los resultados fueron negativos para ambos antígenos.

En la siguiente prueba, escogimos un anticuerpo para H3P obtenido en ratón y realizamos la

técnica inmunohistoquímica simple en distintas secciones. En este caso, los resultados para H3P

fueron positivos, lo que nos confirma que este anticuerpo funciona en el pez cebra. Los resultados

para PCNA realizando una inmunohistoquímica simple, seguían siendo negativos.

En las primeras pruebas realizadas, se aplicó un lavado con metanol durante 5 minutos,

después del primer lavado en PBS. Sin embargo, analizando la bibliografía comprobamos que en

algunos estudios con PCNA empleaban una solución de metanol con H2O2 al 0,2% para recuperar la

antigenicidad. Con este último cambio, conseguimos poner de manifiesto las células que presentan

PCNA.

4.2 LOCALIZACIÓN DE CÉLULAS EN DIVISIÓN.

Durante la observación al microscopio de las secciones obtenidas, se realizaron fotografías de

todas aquellas secciones en las que aparecía marcaje. A continuación se describen los resultados

obtenidos en cada grupo de experimentación.

4.2.1 GRUPO DE EXPERIMENTACIÓN 1.

En este grupo se encontró un número muy bajo de células en división respecto al número de

secciones observadas. Dichas células aparecen tanto en la ZPG (fig.9A) como en la retina central,

concretamente en la CNE (fig.9B). En ocasiones se observa también alguna célula ganglionar en

división (fig.9B). Lo más común es verlas en la CNE, aunque en general son muy poco abundantes

en todas las capas. Respecto a las diferencias entre los marcadores empleados, PCNA y H3P, no se

han encontrado importantes diferencias. Con ambos se pone de manifiesto el mismo número de

células y en las mismas regiones de la retina.

Comparando estos resultados, con los obtenidos en los estudios realizados con BrdU (Ogueta-

Gutiérrez, 2013) observamos algunas similitudes y diferencias. Con BrdU la mayoría de células

detectadas se encuentran también en la CNE. Además, a diferencia de nuestros resultados, se ven

células en la CPE y en la CNI, siendo en esta última minoritarias. También se han descrito células

positivas para BrdU en la CPI, CCG y CFNO, pero en un número mucho menor. Finalmente, se han

visto grupos de células marcadas con BrdU en la ZPG, fusiformes, en número y tamaño variado. En

nuestro trabajo, las células marcadas tanto para PCNA como para H3P en la ZPG son muy escasas

y en todas las ocasiones se han encontrado como células aisladas.

Teniendo en cuenta que cada antígeno marca una fase diferente del ciclo celular, era de esperar

que los resultados variasen. PCNA e H3P aparecen en fases concretas del ciclo celular, fase S y M,

respectivamente. Por ello, sólo se marcan las células que en el momento del sacrificio se encuentren

en esa determinada fase. Por otro lado, la BrdU es incorporada por las células durante la fase S y

transmitida a las células hijas durante las siguientes divisiones. Esto permite realizar estudios en

diferentes tiempos, para ver cómo varía la proliferación. Ello podría explicar por qué en nuestro

trabajo el número de células marcadas en la ZPG es tan escaso. Por tanto, si se pretende realizar un

trabajo en el que se necesite marcar el mayor número de células en división, y con especial interés

en la ZPG de la retina, la BrdU parece ser un método más eficaz. En la retina central también se ven

diferencias pero quizás no de una forma tan marcada como en la ZPG.

4.2.2 GRUPO DE EXPERIMENTACIÓN 2.

Dentro de este grupo distinguimos dos subgrupos. En primer lugar, los ojos contralaterales a la

lesión (2.1) (izquierdos) y en segundo lugar, los ojos lesionados (2.2) (derechos). La lesión realizada

fue la axotomización del nervio óptico y los peces se sacrificaron a las 72 horas de efectuar la

Figura 9. Controles. A: Localización de células positivas para H3P en Grupo 1. Célula

en división en la ZPG. B: Localización de células positivas para PCNA en Grupo 1.

Célula positiva en la CNE y en la CCG. Escala 200 µm.

A B

lesión. Esta lesión afecta directamente a las células ganglionares que son las que, con sus axones,

forman el nervio óptico. La lesión provoca la muerte de algunas de estas células, pero también

afecta al resto de la retina, ya que todas ellas están conectadas en una red de interacciones

sinápticas.

En los ojos contralaterales a la lesión los resultados fueron similares a los descritos en los

ojos control (Fig.10). Las células en división que se encontraron fueron poco abundantes,

apareciendo principalmente en la CNE y también en la ZPG. Cabe destacar, que en este caso, se

encontró alguna célula en proliferación en la CCG y en la CNI. El menor número de células

encontradas en esta capa puede ser debido a su baja tasa de proliferación.

En los ojos lesionados se encontró un número considerablemente mayor de células en división

en la retina central, tanto con H3P como con PCNA, en comparación con los contralaterales a la

lesión y los controles normales (fig.11). Respecto a la ZPG no se observaron cambios importantes

en el número de células en proliferación encontradas, salvo en una única sección en la que aparece

un pequeño grupo de células marcadas para PCNA (fig12.). La mayoría de las células en división

marcadas con H3P se encuentran en la CNE y presentan un núcleo grande y globoso (fig.13, A).

También se encuentra alguna célula positiva en la CNI, con núcleos redondeados y grandes,

correspondientes, posiblemente, con las células de Müller que se han desdiferenciado y divido

(fig.13, B). Cuando analizamos el marcaje para PCNA se observan muchas más células en la CNI

que con la H3P, con núcleos redondeados y también células cuyos núcleos presentan una

morfología alargada, pudiendo corresponderse con células en migración hacia la CNE, y en alguna

Figura 10. Contralaterales. Localización de células en división en el grupo 2.1. A Célula

positiva para H3P en la ZPG. B Célula positiva para PCNA en la CNI. Escala 200 µm.

A B

ocasión hacia la CCG (fig.14). En las secciones marcadas para H3P también se encontraron algunas

células con esa morfología, pero no tan abundantes como en el caso de la PCNA (fig.15).

B

C

A A’

B’

C’

Figura 11. Células en división encontradas en cada grupo. A, Controles, Grupo 1. B,

Contralaterales a la lesión, Grupo 2.1. C, Lesionados, Grupo 2.2. Se observa un aumento en el

número de células proliferativas en C, respecto de A y B. Escala 200 µm.

Figura 13. Localización de células H3P positivas en ojo lesionado. A, Se observan varias células

marcadas en la CNE y una en la CCG. B, Células marcadas en la CNE, y una en la CNI. Escala 200 µm.

A B

Figura 14. Localización de células PCNA positivas Ojo Lesionado. Células en la

CNI con núcleos redondeados y grandes, y núcleos alargados migrando hacia la CCG

y hacia la CNE. Escala 200 µm.

Figura 12. Ojo lesionado, PCNA. Grupo de células positivas en la ZPG que expresan

PCNA. También vemos células en la CNI, algunas de ellas migrando hacia la CCG. Escala

Se observa también una respuesta diferente a la lesión, en función de la región de la retina

analizada. En la parte más dorsal, se encuentra un mayor número de células en división que en

zonas más centrales del ojo.

En vista de los resultados, podemos afirmar que tras la lesión del nervio óptico se produce un

claro aumento de la proliferación celular en la retina central, siendo especialmente importante en la

CNI cuando utilizamos PCNA y en la CNE al usar H3P. En el trabajo de Ogueta-Gutiérrez (2013)

también realizaron lesiones, en ese caso pinzamiento del nervio óptico, y describen un aumento de

la proliferación celular, aunque no describen las zonas concretas en las que lo encuentran.

El aumento de células positivas para H3P es más evidente en la CNE. Esto puede ser debido a

que las células de Müller de la CNI tienen una tasa de proliferación más baja que los progenitores

de la CNE y por tanto, cuando se sacrificó a los animales, se encontraban en una fase del ciclo

celular previa a la mitosis, donde se expresa la H3P. Sin embargo, como PCNA se expresa durante

la fase de síntesis del ADN, sería más fácil detectarla en la CNI.

Figura 15. A, Célula positiva con un núcleo con morfología alargada entre la CNI y la

CNE. B, Se ven células H3P positivas en la CNE, en la CCG y la ZPG. Además vemos

un núcleo alargado migrando hacia la CNE. Escala 200 µm.

A

B

4.3 COLOCALIZACIÓN DE Prox1 CON PCNA Y H3P.

Realizamos inmunohistoquímicas dobles en todas las secciones, para comprobar que Prox1 se

expresa en el pez cebra y analizar si ésas células también expresan PCNA o H3P.

Observando todas las secciones se pudo confirmar que Prox1 se expresa en pez cebra y que

algunas de ésas células también expresan PCNA, pero de forma esporádica. Algunas de ellas se

localizan en la CNI y otras en la CCG. Las células positivas en la CNI presentan núcleos pequeños

y fusiformes y las de la CCG tienen los núcleos más grandes y redondeados (fig.16). No se encontró

ninguna célula que coexpresara H3P y Prox1. Al comparar los distintos grupos de experimentación

no se encontraron diferencias en el número de células positivas para Prox1 y PCNA. Tampoco se

observaron diferencias en el número de células positivas para Prox1 tras realizar la lesión del nervio

óptico, en comparación con los controles y las retinas contralaterales a la lesión.

Las células Prox1 positivas se localizan en la CNI, siendo células horizontales, perfectamente

reconocibles por su morfología, y posiblemente, los núcleos situados en la parte más interna de esta

capa, con una morfología redondeada, se correspondan con células de Müller. También se ven

núcleos con una morfología alargada, que podrían ser progenitores de bastón. Además, se

encuentran en la CCG y en ZPG (fig.17). Estos resultados se corresponden con los descritos en

estudios anteriores en carpín (Cid et al., 2010).

Comparando este trabajo con el estudio de colocalización realizado en carpín (Cid et al., 2010),

vemos que la cantidad de células doblemente marcadas es mayor y que se localizan

mayoritariamente en la CNI y también en la CNE. También describen la presencia células Prox1 y

PCNA positivas en la ZPG, en el límite con la zona de transición.

El hecho de no encontrar células que coexpresen Prox1 y H3P podría ser debido a que la

mayoría de las células marcadas con H3P se localizan en la CNE donde no hay expresión de Prox1.

Lo mismo sucedería en la ZPG, como únicamente se marcan células aisladas, la posibilidad de que

también expresen Prox1 es mucho menor.

Por último, el hecho de no encontrar diferencias en la expresión de Prox1 entre los ojos

controles y los lesionados, no implica que no participe en la regulación de la proliferación celular.

Esto puede deberse al tiempo postlesión en el que se sacrifica a los animales, puede que Prox1

cambie su expresión en otro momento del proceso de regeneración. En otros estudios de carpín sí

encontraron variación en la expresión de Prox1 (Cid et al., 2010). Sin embargo, la lesión realizada

afectaba a la ZPG y no al nervio óptico.

Figura 16. Colocalización Prox1 y PCNA. A, (Ojo lesionado) Marcaje para PCNA en una célula

ganglionar. B, Vista de la misma sección marcada para Prox1, aparece marcada la misma célula

ganglionar que expresaba PCNA. C, Fotografía montada para observar los dos marcajes al mismo

tiempo más DAPI. Escala 200 µm. D, (Ojo control) Sección con PCNA y DAPI, célula en división en

la CNI. E, Prox1más DAPI, se observa la misma célula marcada para Prox1. F, Fotografía montada

para observar los dos marcajes al mismo tiempo. Escala 100 µm.

A

B

C F

E

D

4.4 INVESTIGACIONES FUTURAS.

Para completar nuestro estudio con los marcadores H3P y PCNA, sería adecuado realizar las

mismas pruebas de este trabajo, pero sacrificando a los animales en diferentes tiempos. En estudios

con BrdU (Ogueta-Gutiérrez, 2013), se ha visto que la proliferación aumenta desde el día 1 pos-

lesión y se detecta hasta el día 28, aunque cada vez en menor medida. El descenso en el número de

células positivas para BrdU, se debe, en parte, a que el producto se diluye en cada división celular y

llega un momento en que la cantidad que hay en cada célula no es detectable. Por tanto, podría ser

de utilidad describir cómo ocurre esa variación con H3P y PCNA, para poder elegir el marcador

más adecuado a la hora de realizar los estudios de proliferación.

También sería importante realizar un conteo del número de células marcadas por sección, con

cada marcador y a diferentes tiempos postlesión, para que los resultados obtenidos sean lo más

objetivos posibles. Ello facilitaría la comparación con los resultados obtenidos utilizando BrdU y

daría una mayor fiabilidad al estudio.

Por otro lado, para poder determinar si en el pez cebra, las células marcadas con Prox1 en la

CNI son células de Müller, células amacrinas o bipolares, se deberían realizar inmunohistoquímicas

dobles utilizando un marcador específico de cada tipo celular y Prox1. Por ejemplo, en el caso de

las células de Müller se podría emplear como antígeno la Glutamina Sintetasa (GS), específico de

este tipo celular, como hicieron en el estudio en carpín de Cid et al., 2010. Además, se debería

realizar una cuantificación de las células Prox1 positivas en los controles y los lesionados para ver si

realmente hay o no variación.

Figura 17. Localización de células Prox1+. A, Núcleos en la CNI alargados posiblemente

de progenitores y Müller; núcleos redondeados, células amacrinas y bipolares. En la CPE los

núcleos marcados corresponden con células horizontales. En la CCG se marcan las células

ganglionares. B, Células Prox1 positivas en la ZPG. Escala 200 µm.

A B

CONCLUSIONES

5. CONCLUSIONES

Las conclusiones más relevantes que podemos obtener tras el análisis de los resultados del

presente trabajo son:

- La técnica inmunohistoquímica para H3P y PCNA pone de manifiesto células en

división en la retina del pez cebra adulto, aunque en menor número que tras la utilización del

BrdU.

- Son necesarios más estudios con H3P y PCNA para describir con mayor precisión

cómo funcionan en el pez cebra y así poder escoger, según el estudio a realizar, los

marcadores más adecuados.

- El número de células proliferativas en la retina del pez cebra adulto aumenta tras la

lesión del nervio óptico.

- Algunas células en división presentan también el factor de transcripción Prox1,

aunque su expresión no se modifica tras la lesión del nervio. La implicación de Prox1 en los

procesos de proliferación celular en la retina del pez cebra adulto deberán ser analizados con

más detalle.

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Universidad de salamanca

En el presente trabajo de fin de grado, bibliográfico y experimental, se

realiza una revisión de los conocimientos actuales acerca de la proliferación

celular en la retina del pez cebra adulto y se aborda una parte experimental,

necesaria para cumplir los objetivos del trabajo, relacionada con los

marcadores de proliferación existentes.

NOELIA MUÑOZ MARTÍN

PROLIFERACIÓN celular EN LA RETINA DEL PEZ CEBRA ADULTO

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