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RESUMEN

Secciones de entrenudos tomados de plantas de Stevia rebaudiana establecidas en condiciones in vitrofueron inducidos a formar callos en presencia de diferentes concentraciones de Bencilaminopurina (BAP)combinadas con varias cantidades de ácido naftalenacético (ANA) evaluándose su efecto sobre el porcentajede inducción de callo, friabilidad y formación de órganos. Posteriormente, los callos inducidos fueronmultiplicados y el efecto de cuatro combinaciones de ANA y BAP sobre el incremento de masa frescaevaluado. Finalmente, los tallos proliferados fueron transferidos sobre medio de regeneración suplementadocon diferentes cantidades de BAP solo o en combinación con ANA con el fin de evaluar su efecto sobre laregeneración de brotes. Todos los tratamientos fueron distribuidos utilizando un diseño completamente alazar con un mínimo de 15 repeticiones por tratamiento. Los resultados demostraron que la presencia deANA es necesaria y suficiente para la formación de callo. La regeneración de brotes vía organogénesisocurre de forma independiente a la presencia de RCV en el medio. Los tratamientos aplicados no afectaronel incremento de masa fresca de callo como tampoco tuvieron ningún efecto sobre la regeneración deplantas a partir del callo proliferado. Los datos colectados permiten recomendar un suplemento combinadode 1.0 mg L-1 ANA + 4.0 mg L-1 BAP para obtener plantas de Stevia rebaudiana a través de organogénesis.

Palabras Clave: Stevia, organogénesis, callo, reguladores de crecimiento.

ABSTRACT

Nodal sections from in vitro established Stevia rebaudiana plants were cultured on medium independentlysupplemented with several NAA/BAP combinations to evaluate their effect on callus induction, friabilityand organ formation. Callus fresh weight as a result of NAA/BAP supply was determined and finally, BAP

PROPAGACIÓN IN VITRO DE Stevia rebaudiana BERT.(Asteraceae-Eupatorieae) A TRAVÉS DE ORGANOGÉNESIS

IN VITRO PROPAGATION OF Stevia rebaudiana BERT.(Asteraceae-Eupatorieae) VIA ORGANOGENESIS

Isidro E. Suárez1, José A. Salgado2

Recibido para evaluación: Diciembre 19 de 2007 - Aceptado para publicación: Abril 1 de 2008

1Universidad de Córdoba, Departamento de Ingeniería Agronó. Carrera 6 No. 76 -103 Tel (4) 790 8023 Email:[email protected] de Córdoba, Candidato a M.Sc. Biotecnología

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and BAP/NAA supply on shoot regeneration was evaluated. Treatments were distributed using a completerandomized design with at least 15 replicates per treatment. ANA turned out to be necessary and sufficientto induce callus formation. Shoot formation occurred during callus induction independently of PGR supply.PGR in the medium had neither effect on fresh weight increase nor on plant regeneration from proliferatedcallus. A 1.0 mg L-1 ANA + 4.0 mg L-1 BAP supply in the medium is recommended for Stevia rebaudianaplant regeneration vía organogénesis.

Keywords: Stevia, organogenesis, callus, growth regulators.

obligado a la utilización de técnicas demicropropagación para hacer mas eficiente elproceso de multiplicación (Taiariol, 1995;Cassacia y Alvarez, 2006; Suárez et al., 2006).

Las dificultades en la producción de semillasexual y la preferencia por el uso de materialvegetativo para siembra han limitado losprogramas de mejoramiento genético en estaespecie, arriesgando su evolución y el escapea limitantes del cultivo por medio de laresistencia genética. El cultivo de tejidos invitro vía organogénesis representa una buenaalternativa para aumentar las tasas demultiplicación de vegetales y una herramientapara inducir cambios en la estructura genética(Schwarz y Beaty, 2006). Existen pocosreportes de la micropropagación a través deorganogénesis de la especie en cuestión, porlo que el desarrollo de esta forma alternativade propagación podría también utilizarse enun futuro para la generación de variantes queampliarían su base genética. La realización delpresente trabajo de investigación, tuvo comoobjetivo, propagar in vitro plantas de Stevia através del proceso de organogénesis,propendiendo el desarrollo de un protocolode regeneración; que pudiera constituirsecomo una solución para la generación devariabilidad genética en esta especie.

MATERIALES Y MÉTODOS

Inducción y multiplicación de calloExplantes consistentes de segmentos de

INTRODUCCIÓN

Stevia rebaudiana Bertoni es una plantaperenne, semi-arbustiva perteneciente a lafamilia Asteraceae, originaria del noresteparaguayo, en los límites con Brasil, dondecrece en estado silvestre (Taiariol, 1995;Megeji et al., 2005); sus hojas contienenedulcorantes, esteviósidos y rebaudiósidos,que se estima poseen un poder endulzante quevaría de 100 a 400 veces mayor que lasacarosa (Bespalhok et al., 1993; Bespalhok yHattori, 1997; Soto y Del Vall, 2002). Estacapacidad endulzante ha conducido aconsiderarla como una buena alternativa parareemplazar edulcorantes que han sidocuestionados frecuentemente por su carácterartificial y sus efectos nocivos para la saludhumana en largo plazo, como la sacarina, elaspartame y al acesulfame-K, entre otros(Taiariol, 1995).

La reproducción sexual de Stevia presentaciertas desventajas que pueden afectar deforma negativa la eficiencia del cultivo comoson la alta heterogeneidad de las poblacionesresultantes de sus semillas, la baja eficienciade la germinación debido al alto porcentajede semillas estériles y la ineficiencia de larecolección de la semilla por ladesuniformidad en la f loración y lamaduración de la misma. Esta situación hapropiciado el uso de semilla vegetativa parala siembra de cultivos comerciales, la cual noestá exenta de problemas debido a las bajastasas de multiplicación por estacas, lo que ha

PROPAGACIÓN IN VITRO DE Stevia rebaudiana BERT. (Asteraceae-Eupatorieae). . .

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entrenudos de aproximadamente 1.5 cm delongitud sin meristemos y obtenidos de plantasestablecidas in vitro, fueron establecidos sobremedio de cultivo semisólido de Murashige ySkoog (1962) diluido a la mitad (1/2MS)suplementado con (en mg L-1) sacarosa(30,000), myo-inositol (100), tiamina HCl (0.4)y TC-agar (Sigma®). El pH del medio fueajustado a 5.7-5.8 previo a la adición del agary esterilizado a 121 °C y 1.1 kg cm-2 por 15minutos. Con el fin de determinar el mejortratamiento para la inducción de callomorfogénico, se evaluó el efecto de diferentesconcentraciones (0.0, 0.5, 1.0, 2.0 y 4.0 mg L-1)de bencilaminopurina (BAP) combinadas contres concentraciones (0.0, 0.5 y 1.0 mg L-1) deácido naftalenacético (ANA) para un total de15 tratamientos. Aproximadamente 30 ml demedio, independientemente suplementadocon los tratamientos mencionados, fueronvertidos en cada caja de Petri®; un explantefue establecido por cada recipiente, los cualesfueron sellado con Parafilm® y almacenadosen completa oscuridad durante cuatro semanasa una temperatura de 25 °C, al final de lascuales se evaluaron las variables de porcentajede inducción de callo, friabilidad y presenciao ausencia de órganos (tallos y raíces).Seguidamente, para determinar el efecto de lasconcentraciones de BAP en combinación conANA sobre el incremento de masa fresca decallo, los tejidos desarrollados en lostratamientos que indujeron los mayores nivelesde formación de callo fr iable fueronseleccionados y transferidos a medio frescocon la misma formulación y concentración dereguladores de crecimiento de la etapa deinducción. Cada tratamiento tuvo 20repeticiones distribuidas completamente alazar, donde una repetición consistió de unamuestra de tejido en una caja de Petri,registrándose el peso de cada una de lasmuestras establecidas. Los cultivos fueronalmacenados en condiciones similares a las dela etapa de inducción por un período de 4semanas, luego de las cuales se realizó un

nuevo pesaje, registrándose la diferencia depesos con relación al peso inicial. Los datosregistrados fueron analizados con una análisisde varianza con base en el modelo estadísticoYijk = m + ai + bj + (ab)ij + εijk; donde m es elpromedio general, ai representa el efecto delas concentraciones de BAP, bj representa elefecto de las concentraciones de ANA, (ab)ij

representa la interacción de BAP con ANA yεijk es el componente del error al azar.

Regeneración de plantasUna vez determinado el mejor tratamientopara incrementar la masa fresca de los tejidos,el callo producido fue proliferado y despuésde un subcultivo (cuatro semanas después deestablecido) transferido a medios semisólidoscon formulaciones similares a la fase deestablecimiento pero suplementadosindependientemente con diferentes niveles(0.0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 y 4.0 mg L-1) de BAP.Además se uti l izaron las siguientescombinaciones de ANA/BAP (en mg L-1) 0.5/2.0, 0.5/4.0, 1.0/2.0 y 1.0/4.0, con el fin deevaluar su efecto sobre la regeneración detallos. Aproximadamente 100 mg de tejido decallo fueron inoculados sobre medios decultivo y almacenados a una temperaturaaproximada de 25 °C en presencia de luzblanca fluorescente (40 µmol m-2 s-1). Al finalde la octava semana de cultivo se evaluó encada tratamiento el número de órganosdesarrollados con el fin de determinar el mejortratamiento de regeneración.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inducción y multiplicación de calloLos datos registrados permitieron observar quela presencia de auxina en el medio de cultivoes necesaria y suficiente para inducir laformación de callos en los explantes de Stevia.La figura 1 muestra que al menos el 80% delos explantes cultivados desarrollaron callosen presencia de ANA o ANA + BAP, mientras

TEMAS AGRARIOS - Vol. 13:(1) Enero - Junio 2008 (40 - 48)

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que menos de un 5% de los explantescultivados en la dosis máxima de BAP (4 mgL-1) desarrollaron algún tipo de cultivo. Tisserat(1985), demostró que la producción de callosestá íntimamente ligada a la adición de auxinasal medio de cultivo, y que este efecto podríaverse potencializado por la adición conjuntade auxinas y citocininas en el mismo mediode cultivo. Solange et al. (2002), encontraronque la ausencia de reguladores de crecimiento

en el medio de cultivo evitaba la formaciónde callos en Tridax procumbens, comparadocon medios suplementados con varias auxinas(2,4-D; IBA y ANA) en presencia de BAP, yobservando que el mejor tratamiento parainducir callos en la especie antes mencionadaera la combinación en igual proporción deANA y BAP (2.0 mg L-1), lo cual confirma quela combinación de auxinas y citocininaspromueve la formación de tejido calloso.

Figura 1. Efecto de diferentes concentraciones de ANA y BAP la formación de callos de Stevia rebaudianainvitro.

Los porcentajes de friabilidad de callooscilaron entre el 7% y el 60% (Figura 2,F igura 3a ) . E l mayor porcenta je defriabilidad se obtuvo en el tratamiento concombinaciones 0.5 mg L-1 de ANA + 4.0 mgL-1 de BAP, mientras que los valores masbajos en esta variable ocurrieron cuando elmedio estaba desprovisto de BAP. Los bajosporcentajes de friabilidad en presencia deANA solamente indica la necesidad de lainteracción de ambas hormonas en el mediopara obtener tejidos friables. Sánchez et al.(2005) evaluaron el efecto de auxinas ycitocininas en la producción de callo enexplantes de Tropaeolum tuberosum(Tropaeolaceae), obteniendo únicamentecallos compactos en tratamientos donde secombinaron diferentes concentraciones deANA con 0.5 mg L-1 de BAP.

La formación de brotes caulinares biendiferenciados y desarrollados con morfologíasnormales ocurrió en varios de los cultivos enpresencia de diferentes tratamientos,observándose la mayor formación cuando losexplantes fueron cultivados en presencia de1.0 mg L-1 de ANA + 4.0 mg L-1 de BAP (Tabla1). Los brotes mostraron una coloración inicialamaril lo-blanquecino producto de laoscuridad aunque rápidamente se tornaron decolor verde ante la presencia de luz (Figura3). De forma alterna, se observó el desarrollode estructuras radicales notándose un mayornúmero de estas cuando los explantes fueroncultivados en medios suplementados solo conANA (Tabla 2; Figura 3). Las variaciones en laformación de órganos en los diferentestratamientos no permitió establecer unacorrelación directa entre la formación de


Fo

rmació

nd

ecallo

s(%

)

BAP (mg L )-1

ANA (mg L )-1

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órganos con los tratamientos evaluados. Litzet al. (1983) afirman que la concentraciónde reguladores de crecimiento requeridospara la organogénesis puede variar de untejido a otro dentro de la misma planta, oentre plantas de la misma especie, lo cualsupone que la respuesta de un determinadoexplante puede variar de la respuesta de otroexplante bajo las mismas concentracionesde hormonas. Flick et al. (1983) reportaron

que a lgunas veces puede darese laocurrencia de organogénesis directa enexplantes cu l t ivados en medios quecontengan únicamente citocinina ya queesta depende de los niveles endógenos dereguladores de crecimiento vegetal en elmomento de la organogénesis. Capote et al.(2000) reconocieron la capacidad de ANAen la fo rmación de ra íces en ca l losinducidos a partir de explantes de cebolla

Figura 2. Efecto de diferentes concentraciones de ANA y BAP la formación de callos friables de Steviarebaudiana.

Figura 3. Orgaonogénesis de Stevia rebaudiana Bertoni; Callo (izquierda), regeneración de tallos (centro),regeneración de raíces (derecha).


Fri

ab

ilid

ad

(%)

BAP (mg L )-1

ANA (mg L )-1

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(Allium cepa) y admiten que este eventomorfogenético es indeseable en la etapa deinducción de callo, debido a que afecta elcrecimiento óptimo del mismo. Matos et al.(1995) , obtuvieron cal los y ra íces enexplantes fo l iares de Caprar ia bi f lora(Scrophulariaceae) al ser establecidos sobremedios de cultivo suplementados con ANA(1.0 mg L-1) tanto en condiciones de luzcomo en oscur idad; en un segundoexperimento, los mismos autores evaluaronla misma concentración de ANA combinadacon kinetina (0.1 mg L-1) observando solo laformación de callos; sin embargo, cuandose combinaron 1.0 mg L-1 ANA con 1.0 mgL-1 BAP hubo formación tanto de callossolamente como de callos, tallos y raíces enforma simultanea. Estos resultados respaldanlos datos obtenidos en el presente trabajo,comprobándose la influencia del ANA, soloy en combinación con citocininas en lainducción de cal lo y la formación deórganos adventicios, respectivamente.

Los resultados del análisis de varianza nopermi t ie ron de tec ta r d i fe renc iasestadísticamente significativas (Pr> 0.05);con respecto al incremento de masa frescaen las combinaciones seleccionadas; noobs tan te , los resu l tados obtenidospermitieron observar que el tratamiento con0.5 mg L-1 ANA + 1.0 mg L-1 BAP indujo elmayor incremento de masa fresca (313.4mg), mientras que el tratamiento con 1.0 mgL-1 ANA + 0.5 mg L-1 BAP reportó el menorcrecimiento (174.9 mg); los tratamientos con0.5 mg L-1 ANA + 2.0 mg L-1 BAP y 1.0 mg L-1

ANA + 4 .0 mg L -1 BAP repor ta ronincrementos de 232.4 mg y 176.7 mg,respectivamente. Las combinaciones deauxinas y ci tocininas han demostradocontribuir con la proliferación in vitro dete j idos de ca l lo en a lgunas especies .Montoya (1991), explica que además de lostipos de reguladores de crecimiento y lascantidades en que son suplementadas en elmedio son las interacciones cuantitativasent re los reguladores de c rec imientopresentes , las que mayor i ta r iamenteproporcionan el mecanismo de regulaciónde los fenómenos morfogenéticos durante elcultivo in vitro. Por su parte Villalobos yThorpe (1991) a rgumentan que ladiferenciación de novo está ligada a laproliferación celular y la organización delas nuevas células sigue una “programación”influenciada por las condiciones de cultivoin vitro conjuntamente con la ganancia depeso. So lange e t a l . (2002) no so loencontraron que la combinación de 2.0 mgL-1 de ANA + 2.0 mg L-1 de BAP promovía laformación de callos, sino también que lamisma combinación favorecía el incrementode masa f resca de ca l los en Tr idaxprocumbens (Asteraceae), y que a medidaque se incrementaban las concentracionesde auxina, decrecía el peso fresco de loscallos; lo cual presenta cierta concordanciacon los resultados obtenidos en este trabajodesde el punto de vista de la relación entrelos reguladores de c rec imiento , y e lincremento de masa fresca de los callosproliferados. Por su parte, Siddique et al.(2003) obtuvieron resultados semejantes al

Tabla 1. Efecto de diferentes concentraciones de ANA y BAP el número de tallos y raíces (tallos/raíces) deStevia rebaudiana regenerados in vitro.

ANA (mg L-1)0

0,51

1/4

1/44

0/40

0/1

3/1

0/0

0/1

0/2

1/2

0/3

3/0

0/0

0/0

3/2

9/0

0 0,5 1 2 4

BAP (mg L-1)


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inducir callos en explantes caulinares deHemidesmus indicus (Asclepiadaceae),encontrando que la combinación de 1.0 mgL-1 de ANA + 2.0 mg L-1 de kinetina favorecióconsiderablemente el incremento de pesofresco.

Regeneración de PlantasLos tratamientos aplicados no indujeron laregeneración de plantas de Stevia a partirde los tejidos de callo proliferados encondic iones in v i t ro . Los resu l tadosobtenidos en la fase de inducción, donde seobservó la regeneración de órganos, indicanque los tejidos tenían potencial morfogenéticosuficiente para llevar a cabo la organogénesis,y que la ausencia de respuesta a la formaciónde estructuras a partir del callo en la etapa finales posiblemente una consecuencia de ladisminución de este potencial como resultadode los continuos subcultivos realizados o lanecesidad de seguir experimentando hastaencontrar el ajuste adecuado en el medio decultivo que suministre las necesidades para laregeneración (Christianson y Warnik, 1985).La presencia de citocininas en el medio decultivo no garantiza la respuesta del callohacia la formación del brote. Krikorian (1991)reconoce que a pesar que en muchas especiesvegetales puede inducirse la proliferación detejido calloso y posteriormente la formaciónde brotes y raíces manipulando la relaciónauxina/citocinina aplicada exógenamente, nopueden universalizarse dichosacontecimientos, especialmente en cuanto ala respuesta morfogenética del callo comoconsecuencia de la adición exógena decitocininas. La ausencia de organogénesis apartir de callo es frecuente en variasespec ies , espec ia lmente en aquel lasconsideradas recalcitrantes para el cultivoin vitro (Yaya et al., 2005). Algunos estudiosseñalan un efecto inhibitorio del explantesobre la ocurrencia de organogénesiscuando el callo originado se mantieneadherido a este (Litz y Jarret, 1991); sin

embargo, los resultados obtenidos en elpresente estudio contradicen la anteriorpremisa puesto que la formación de losórganos regenerados en condiciones in vitroocurrió en los estados iniciales del procesocuando el tejido de callo desarrollado y elexplante se encontraban unidos en una mismaestructura. Adicionalmente, la separación delexplante inicial del tejido calloso durante laetapa de multiplicación y posterior intento deregeneración no contribuyeron con laformación de órganos. Es posible que el tipode explante utilizado tenga un efecto sobre losresultados obtenidos ya que existen reportesque sugieren la posibil idad de lograrorganogénesis en estevia utilizando tejidosfoliares como explante inicial (Sivaram yMukundan, 2003) por lo cual es necesariocontinuar las investigaciones teniendo encuenta estos resultados.

CONCLUSIONES

● La formación de nuevos brotes de Stevia invitro vía organogénesis es posible en losestados iniciales del proceso.

● La mayor regeneración de brotes ocurrió enla etapa de inducción de callo en presenciade 1.0 mg L-1 de ANA + 4.0 mg L-1 de BAP.

● El suplemento de ácido naftalenacético (ANA)en el medio de cultivo es necesario ysuficiente para inducir callo a partir deexplantes consistentes de entrenudos deStevia.

● La combinación de 0.5 mg L-1 de ANA y1.0 mg L -1 de BAP indujo la mayormultiplicación en callos de Stevia.

● La presencia de BAP en el medio de cultivono tuvo ningún efecto sobre la regeneraciónde brotes a partir de callos multiplicadosde Stevia en condiciones in vitro.


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