Metodología para la evaluación y control de planta micorrizada con hongos del

genero Tuber mediante caracteres morfológicos de la micorriza.

Autores: Marcos Morcillo, Mónica Sánchez

MICOLOGIA FORESTAL APLICADA www.micofora.com

INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES

En España el aprovechamiento de la trufa en masas naturales forestales, ha sido

tradicionalmente una fuente importante de ingresos en el medio rural, suscitándose en los

últimos años un gran interés por el establecimiento de truferas artificiales a partir de planta

micorrizada con Tuber melanosporum Vitt., sobre todo a raíz de la nueva política de la

PAC, que estableció subvenciones importantes para las actividades de reforestación.

A pesar de lo anterior, en España no se dispone todavía de una metodología oficial que

permita certificar la calidad de las plantas micorrizadas con hongos del género Tuber spp..

La evaluación del nivel de micorrización producida de modo artificial mediante inoculación

de distintas especies vegetales con el hongo Tuber spp., se realiza actualmente por

distintos métodos, dependiendo del país considerado, sin que exista hasta la fecha dentro

de la Unión Europea, una norma que regule la certificación de este tipo de material

biológico.

Este trabajo recoge protocolos y criterios básicos de los trabajos publicados para dicha

certificación (Fisher & Colinas 1998, Palazon et al. 1997, Reyna 2002, Bencivenga et al.

1996) basados en los caracteres morfológicos de la micorriza.

El siguiente método de evaluación garantiza la validez de la planta micorrizada para su

uso en truficultura, pero no la producción en campo de trufas.

METODOLOGÍA

Control del inóculo

Existen diferentes tipos de inóculos esporales y miceliares para la producción de planta

micorrizada con Tuber spp. En nuestro país actualmente y a nivel comercial, sólo se

trabaja con inóculos esporales.

Existen fenómenos de convergencia en la morfología de la micorriza que hacen difícil o

imposible la diferenciación de ciertas especies de Tuber spp.,entre ellas:

T. melanosporum vs. T. indicum

Methodology for the evaluation and control of plant micorrizada with fungi

of the genus Tuber using morphological characters of mycorrhizal fungi.

Authors: Marcos Morcillo, Mónica Sánchez

MICOLOGIA FORESTAL applied www.micofora.com

INTRODUCTION AND BACKGROUND

In Spain the use of truffles in natural forests, has traditionally been an

important source of income in rural areas, raising in recent years a great

interest in the establishment of artificial truffle from plant micorrizada with

Tuber melanosporum Vitt., especially as a result of the new policy of the

CAP, which established important subsidies for reforestation activities.

Notwithstanding the foregoing, in Spain it is still of an official methodology

that allows to certify the quality of the mycorrhizal fungi of the genus

Tuber plants spp...

The assessment of the level of mycorrhization produced artificially by

inoculation of different plants with the fungus Tuber spp., is done currently

by different methods, depending on the country concerned, unless it exists

to date within the European Union, a norm that regulates the certification of

this type of biological material.

This work includes protocols and basic criteria for papers published for

such certification (Fisher & hills 1998, Palazón et al. 1997, Reyna 2002,

Bencivenga et al. 1996) based on morphological characters of mycorrhizal

fungi.

The following method of assessment ensures the validity of the plant

micorrizada for use in truficultura, but not the production in field of truffles.

METHODOLOGY

Control of inoculum

There are different types of esporales Inoculants and miceliares for the

production of plant micorrizada with Tuber spp. In our country today and at

the commercial level, only working with esporales inocula.

Phenomena of convergence in the morphology of mycorrhizal fungi that

make difficult or impossible the differentiation of certain species of Tuber

exist spp., including:

T. melanosporum vs. T. indicum

T. borchii vs. T. magnatum

T. brumale vs. T. brumale var. moschatum

T. aestivum vs. T. uncinatum

En otras especies (T. panniferum...) los cistidios y/o espinulas no están presentes. Es por

consiguiente necesario un análisis microscópico previo del material (cuerpos fructíferos)

con el que se realizará el inóculo.

Para que el método sea expeditivo y económicamente viable, el contaje posterior uno a

uno de los ápices micorrizados se realiza a la lupa, donde no es factible diferenciar a

nivel de especie de Tuber. Un análisis previo del inóculo, prácticamente nos garantiza que

las micorrizas que estamos contando son de la especie de Tuber inoculada.

Se proporcionará a los viveros tubos de ensayo para que recojan muestras de la gleba

(esporas) que van a utilizar para inocular los lotes. Cada tubo se identificará anotando la

especie fúngica y número de trufa correspondiente, guardando las trufas por separado

hasta su determinación. Las muestras se depositarán en el Centro de Certificación Oficial,

donde se les añadirá FAA conservante hasta la observación microscópica de las

ascosporas.

Asimismo el viverista deberá certificar la procedencia andaluza de las trufas utilizadas.

Identificación del lote homogéneo

Se considerará un lote homogéneo cuando todas las plantas del mismo tengan idénticos:

- procedencia de la bellota, con origen identificado procedente de Andalucía.

- fecha de siembra.

- substrato de cultivo.

- tipo de inóculo, con origen identificado procedente de Andalucía.

- proceso, método y fecha de inoculación (en un intervalo de 10 días).

- régimen de riego.

Toma de muestras

La calidad comercial de las plantas será el primer factor a considerar, por lo que las

partidas estarán formadas, como mínimo, por un 95% de plantas que cumplan los criterios

necesarios (Apendice 1, Peñuelas, 1993) para este fin. Esto es muy importante pues las

plantas que no los cumplan, pueden excluirse del conteo de ápices micorrizados que se

realizará posteriormente.

El tamaño de la muestra está condicionado por el alto precio de las plantas y por la

laboriosidad del análisis que se realiza sobre las mismas. Existe una metodología de

certificación no destructiva (Reyna 2000), con la ventaja adicional de tener en cuenta el

T. borchii vs. T. magnatum

T. brumale vs. T. brumale var.. moschatum

T. aestivum vs. T. uncinatum

In other species (T. panniferum...) the cistidios or espinulas are not present.

A previous microscopic analysis of material (fruiting bodies) that will take

place the inoculum is therefore necessary.

The method is to be expeditious and economically viable, later counting

one of the apexes micorrizados is done at magnifying glass, where it is not

feasible to differentiate species of Tuber level. A preliminary analysis of the

inoculum, practically guarantees us that Mycorrhizae which we are

expecting are inoculated Tuber species.

It will be provided nursery test tubes so that they collect samples of

serfdom (spores) that they be used to inoculate the lots. Each tube shall be

identified scoring the fungal species and number of corresponding truffle,

saving the truffles separately until its determination. The samples shall be

deposited in the center of official certification, where is added preservative

FAA until the microscopic observation of the ascospores.

Also the nursery must certify the Andalusian origin of used truffles.

Homogeneous batch identification

Shall be considered a homogeneous batch when all plants of the same are

identical:

-origin of the Acorn, with identified source coming from Andalusia.

-planting date.

-substrate cultivation.

-type of inoculum, with identified source coming from Andalusia.

-process, method and date of inoculation (in an interval of 10 days).

-irrigation regime.

Sampling

The commercial quality of the plants will be the first factor to consider,

what items will be formed, as a minimum, by 95% of plants that meet the

required criteria (Appendix 1, Peñuelas, 1993) for this purpose. This is very

important because the plants that do not comply with them, be excluded

count apices micorrizados which will be held later.

The sample size is conditioned by the high price of the plants and the

industriousness of the analysis carried out on them. There is a non-

destructive (Reyna 2000) certification methodology, with the added

advantage of taking into account the

número total de micorrizas por planta; es más rápida y por tanto económica. Este método

se ha testado para encina, coincidiendo los resultados con otros protocolos porcentuales

(Fisher & Colinas 1996). Por tanto el protocolo volumétrico de Reyna (2000) se utilizará

preferentemente para la certificación de encinas (Quercus ilex), mientras que, aunque

también valido para encina, se seguirá un protocolo porcentual descrito más adelante

para los demás huéspedes utilizados en menor grado en truficultura (Quercus pubescens,

Q. faginea, Q. robur, Q,cerris, Corylus avellana, Ostrya carpinifolia, Tilia cordata, Populus

alba, Salix caprea, Pinus pinea).

En ciertos periodos del año o debido a las condiciones de irrigación, los cistidios y/o

espínulas característicos de cada especie de Tuber no están presentes o pueden

desaparecer. Por este motivo los análisis del estado de micorrización se efectuarán

preferentemente en otoño, pudiendo realizarse también en primavera. Debe tenerse en

cuenta que hayan pasado 4-5 meses desde la inoculación.

La identificación de las micorrizas de Tuber spp puede realizarse siguiendo las claves y

descripciones, entre otros, de Meotto et al. (1995), Zambonelli et al. (1993) y Etayo y De

Miguel (1998), Verlhac et al. (1990), Granetti (1995).

Es esencial que la toma de muestras de las plantas sea desarrollada por el agente de

control y que sea totalmente aleatoria para evitar cualquier tipo de desviación y satisfacer

los requerimientos de los métodos estadísticos utilizados. Las plantas, o muestras de

sustrato, deben ser transportadas al laboratorio de certificación refrigeradas y

almacenarse a 4ºC hasta que sean examinadas, preferiblemente en un plazo de 2

semanas desde la toma de muestras en vivero.

El tamaño de muestra se estima en un 5 p.1000 como mínimo, aunque se recomienda

que, en los primeros años de certificación se empiece con un 8 p.1000.

El número de plantas a muestrear por lote, no será nunca inferior a 8, independiente del

tamaño del lote.

1. Método volumétrico Reyna (2000) para encina

1.1 Toma de muestras

Las plantas seleccionadas al azar se etiquetan y numeran por si fuera necesario realizar

alguna comprobación posterior en las mismas.

El muestreo en volumen de los cepellones se realiza del siguiente modo: del cepellón de

cada planta cultivada en contenedor, se extraen con un sacabocados dos muestras

cilíndricas de 1,4 cm de diámetro en la zona media del contenedor y una longitud

equivalente a la anchura de éste a esa altura, que varía con el tipo de contenedor. La

total number of Mycorrhizae for plant; It is faster and therefore economical. This method has been tested for encina, coinciding the results with other percentage protocols (Fisher & hills 1996).

Therefore volumetric Reyna (2000) protocol is used preferably for certification of holm oaks

(Quercus ilex), while, although also valid for encina, a percentage protocol described later for

other guests used to a lesser extent in truficultura will be followed (Quercus pubescens, q. faginea,

q. robur, Q, cerris, Corylus avellana, Ostrya carpinifolia, Tilia cordata, Populus alba, Salix

caprea)(, Pinus pinea).

In certain periods of the year or due to irrigation conditions, characteristic of each species of

Tuber the cistidios and/or espinulas are not present or may disappear. For this reason the analysis

of mycorrhization status shall be carried out preferably in autumn, and can also be performed in

spring. It must be taken into account that last 4-5 months from inoculation.

Identification of Mycorrhizae of Tuber spp. can be carried out according to the keys and

descriptions, among others, Meotto et to the. (1995), Zambonelli et to the. (1993) and Etayo and

Miguel's (1998), Verlhac et to the. (1990), Granetti (1995).

It is essential that samples of the plants be developed by control agent and be totally random to

avoid any type of deviation and satisfy the requirements of the statistical methods used. Plants, or

substrate samples, must be transported to the laboratory of certification refrigerated and stored at

4 ° C until they are examined, preferably within a period of 2 weeks from sampling in the nursery.

The sample size is estimated at 5 p.1000 minimum, although it is recommended that, in the early

years of certification begins with an 8 p.1000.

The number of plants to be sampled per lot, are never less than 8, independent of the size of the

lot.

1. Volumetric method Reyna (2000) for oak

1.1 Takes samples

The plants selected at random are labeled and numbered if necessary to perform any subsequent

check in them.

Sampling in volume of the root balls is performed in the following way: from the root ball of each

plant cultivated in container, two cylindrical samples of 1.4 cm in diameter are extracted with a

punch in the middle of the container and a length equal to the width to that height, which varies

with the type of container. The

segunda muestra se gira 90º el contenedor y se extrae justo encima o debajo de la

anterior, sacando dos cilindros en forma de cruz.

Cada cilindro extraído supone un volumen muestreado del orden de 7 a 9 cc., que

equivale, aproximadamente, a un 2% del volumen del contenedor. La muestra cilíndrica

se extrae en sentido horizontal. Para ello se saca la planta del envase y se coloca en otro

en el que se ha realizado ya una perforación a media altura, y se introduce el

sacabocados imprimiendo una rotación constante para procurar el corte de las raíces y

evitar su desgajamiento o rotura. Las muestras extraídas en la zona media del contenedor

se consideran suficientes, ya que en ensayos previos no se obtuvieron diferencias

significativas entre el estrato medio y el superior, ni entre el medio y el inferior, para una

muestra de 10 plantas.

1.2 Lavado de las muestras de encina

Para la certificación se analiza uno de los dos cilindros de cada planta. Se procede a

introducir la porción del cepellón en un envase de plástico y se pesa en el laboratorio con

precisión de 0,1 gramos. Se incorporan unos 100 cc. de agua a cada muestra junto a un

detergente comercial (Calgón). Las muestras se someten a un baño de ultrasonidos de 15

minutos. A las 24 horas se da un nuevo baño de ultrasonidos y se pasa el contenido del

envase a un vaso de precipitados de 0,5 l. incorporando agua hasta completar los 500 cc.

Se realizan varias decantaciones sucesivas incorporando agua y decantando al cabo de 1

minuto. Con ello se logra la eliminación de arcillas, limos y parte de la materia orgánica.

La manipulación se hace con el máximo cuidado para evitar la pérdida de ápices

radiculares.

El producto se recoge sobre un tamiz de 1 mm de luz y se vuelve a lavar por inmersión

lenta en un vaso de precipitados. El producto decantado en el fondo del vaso se observa

nuevamente con el fin de comprobar que no se han perdido ápices micorrizados.

1.3 Conteo de ápices

El producto del tamiz se observa a la lupa binocular, contándose todas las micorrizas de

la trufa inoculada, ápices sin micorrizar y micorrizas contaminantes.

Todas las referencias se calculan en volumen, la alternativa de referirlo a peso de la

muestra daba mayores diferencias debido a la diferente humedad, huecos o falta de

uniformidad del substrato.

Con este conteo obtenemos el porcentaje de micorrizacion respecto al número total de

ápices contados y el número total de micorrizas si extrapolamos al volumen total del

contenedor.

second sample is rotated 90 ° container and removed just above or below the previous one, by removing two cylinders in a cross.

Each extracted cylinder assumes a sampled volume in the order of 7 to 9 cc., which equals

approximately 2% of the volume of the container. The cylindrical sample is extracted in a

horizontal direction. This removed the plant from the container and is placed in another which has

been already a perforation at medium altitude, and is introduced the punch printing a steady

rotation to ensure the cutting of the roots and prevent its desgajamiento or breakage. Samples

drawn in the middle of the container are considered sufficient, since no significant differences

between the upper and the middle stratum, or between the middle and the bottom, for a sample of

10 plants were obtained in previous tests.

1.2 Washing of the samples of oak

For certification discusses one of the two cylinders from each plant. It is to enter the portion of the

root ball in a plastic container and weighed in the laboratory with precision of 0.1 grams. About

100 cc are incorporated. of water to each sample next to a commercial detergent (Calgon). The

samples are subjected to sonication for 15 minutes. A new ultrasonic bath is given within 24 hours

and passed the contents of the container into a beaker of 0,5 l. incorporating water until

completing the 500 cc. Several successive incorporating water and decanted within 1 minute

decantations are performed. This is achieved the Elimination of clays, silts, and part of the organic

matter. Manipulation is done with utmost care to avoid loss of root apices.

The product is collected on a sieve with 1 mm of light and becomes washed by immersion slow in

a beaker. Product opted in the bottom of the vessel is observed again in order to check that apexes

micorrizados have not lost.

1.3 Apices count

Product of the sieve is observed to the binocular Loupe, counting all mycorrhizal inoculated

truffle, apices without micorrizar and polluting Mycorrhizae.

All references are calculated by volume, the alternative refer to sample weight gave greater

differences due to different humidity, gaps or lack of uniformity in the substrate.

With this counting we get the percentage of mycorrhization with respect to the total number of

counted apexes and the total number of mycorrhizal if we extrapolated to the total volume of the

container.

1.4 Criterios de validez para una planta micorrizada

Se considera por distintos autores (Bencivenga et al 1995, Fischer & Colinas 1997,

Palazon et al, 1997) que a partir de un 25% de micorrización, según unos, y hasta un 33%

de micorrización, según otros, la planta ya es de calidad. Dado que estos datos se

obtienen, siempre sobre una observación mínima de 250 ápices, aunque en algún caso

esto no se indica, por tanto este tipo de criterio únicamente garantizaría entre 62 y 82

micorrizas por planta.

Consideraremos esta cifra, redondeada hasta 100, como nivel mínimo para calificar una

planta como micorrizada, un número inferior se considera insuficiente.

En el conjunto de los 7 lotes estudiados por Reyna (2000) mediante muestreo en volumen

el percentil 10 se sitúa en 260 micorrizas de T. melanosporum por planta y

consideraremos este valor como el mínimo admisible para que la planta tenga una

calidad mínima aceptable. Para acotar el resto de niveles de calidad se utilizan los

percentiles 25% (516 micorrizas/planta), 50% (1512 micorrizas/planta), 75% (2479

micorrizas /planta) y 85 % (2892 micorrizas /planta), que redondeados, quedarían las

categorías indicadas en la tabla siguiente:

Grados de calidad de planta micorrizada con Tuber spp

nº de micorrizas por planta Calidad de la micorrización

1-100 Insuficiente

101 –250 Escasa

251-500 Aceptable

501- 1500 Buena

1500-3000 Muy buena

> 3000 Excelente

La presencia de cualquier otro Tuber, distinto a la especie inoculada implicará el rechazo

inmediato del lote. Este hecho debería ser anecdótico si se realiza el análisis previo de las

trufas utilizadas para la elaboración del inóculo.

El porcentaje máximo de ápices contaminados, no debe superar el 30%. La diferencia

entre el % de ápices micorrizados con la trufa deseada y el % de ápices contaminados

debe ser superior o igual a 20.

Si en la observación de muestras de substrato se encuentra alguna sin micorrizas, debido a que para validar un lote sólo se acepta un 5% de plantas sin ninguna micorriza de la trufa inoculada, antes de rechazar el lote, se analizará la replica extraída de la misma planta. En el caso que tampoco se observe ninguna micorriza, se pedirá al viverista el

1.4 Criteria of validity for a plant micorrizada

He is considered by different authors (Bencivenga et 1995, Fischer & hills 1997, Palazón et al.,

1997) that from 25% of mycorrhization, according to some, and up to a 33% of mycorrhization,

according to others, the plant already is quality. Since these data are obtained, always on a

minimum of 250 apices observation, although in some cases this is not indicated, therefore this type

of criterion only guaranteed between 62 and 82 Mycorrhizae per plant.

We will consider this figure, rounded up to 100, as minimum level to qualify a plant like

micorrizada, a lower number is considered insufficient.

Altogether 7 batches studied by Reyna (2000) by sampling volume the 10th percentile stands at 260

Mycorrhizae of T. melanosporum per plant and will consider this value as the admissible minimum

so that the plant has a minimum acceptable quality. 25% Percentiles (516 Mycorrhizae per plant),

are used to delimit the rest of quality levels 50% (1512 Mycorrhizae per plant), 75% (2479

mycorrhizal plant) and 85% (2892 mycorrhizal plant), rounded, would the categories shown in the

following table:

Grades of quality of plant micorrizada with Tuber spp

number of Mycorrhizae for plant quality of mycorrhization

1-100 Insufficient

101-250 Sparse

251-500 OK

501-1500 Buena

1500-3000 Very good

> 3000 Excellent

The presence of any other Tuber, different from the inoculated species will involve the immediate

rejection of the batch. This fact should be anecdotal if the prior analysis of truffles used for the

preparation of the inoculum.

The maximum percentage of contaminated apices, must not exceed 30%. The difference between %

of micorrizados with the desired truffle and apices apexes contaminated % must be greater than or

equal to 20.

If observation of substrate samples is one without Mycorrhizae, owing that to validate a batch is

accepted only 5% of plants without any Mycorrhizae of inoculated truffle, before rejecting the

batch, will analyze it replica extracted from the same plant. In the case nor observed no mycorrhizal

fungi, are prompted to the nursery the

envío de dicha planta, anteriormente etiquetada, para observar en el sistema radical

entero si existen o no micorrizas.

2. Método porcentual para roble, avellano, encina y demás huéspedes

2.1 Lavado de las plantas

Las plantas deben de ser cuidadosamente extraídas del contenedor con el cepellón

completo y sumergidas en un baño de agua para empapar el sustrato. Después, se

procederá a eliminar el sustrato de las raíces de las plantas, una por una, en una bandeja

de agua con agitaciones suaves para no romper los ápices cambiando el agua

frecuentemente y sin aplicar la presión directa de un chorro de agua. Los restos de

sustrato que quedan adheridos a las raíces se pueden eliminar con pinzas finas bajo el

microscopio estereoscópico.

2.2 Primera observación a la lupa

Una vez lavada la planta, se sumerge horizontalmente en un recipiente con agua. El

recipiente puede ser transparente o de algún color en la base, que contraste con la

coloración de la raíz, si ello facilita la observación.

Los detalles a considerar en esta primera observación son los siguientes:

- presencia o ausencia de micorrizas

- cantidad de las mismas

- lugar de concentración (en el cuello de la raíz, sector medio o sector apical) o

distribución homogénea.

-al microscopio, la presencia, desarrollo y apariencia general de las micorrizas de Tuber

inoculado, y la presencia de contaminantes. En esta etapa el analista tiene que

examinar al microscopio óptico los ápices cuyo estado micorrícico sea incierto para

facilitar el conteo posterior.

Otro problema que afecta a la calidad de la planta es el de la ausencia o escasez de

raíces tróficas que puede conducir a valores poco fiables del porcentaje de micorrización,

hecho que el observador debe tener muy en cuenta y consecuentemente rechazar esa

planta de la muestra.

2.3 Conteo de las micorrizas

Inmediatamente después de realizar la primera observación procedemos a sacar la planta

de su recipiente, colocándola sobre la mesa, próxima a una regla o plantilla que nos

permita dividir el aparato radicular de la planta en tres sectores (S1=superior, S2=medio y

S3=apical), aproximadamente de la misma longitud.

2. Percentage method for oak, Hazel, oak and other guests

2.1 Washing plants

The plants should be carefully extracted from the container with the entire root ball and dipped in a

bath of water to soak the substrate. Then, will be to remove the substrate of the roots of plants, one

by one, in a pan of water with agitations soft to not break the apices changing the water frequently

and without applying direct pressure of a stream of water. The remains of substrate that remain

attached to the roots can be removed with tweezers under a stereoscopic microscope.

2.2 First observation to the magnifying glass

Once washed the floor, horizontally immersed in a container with water. The container can be

transparent or some color at the base, which contrast with the coloration of the root, if this

facilitates the observation.

To be considered in this first observation details are as follows:

-presence or absence of Mycorrhizae

-amount of the same

-place of concentration (in the neck of the root, middle sector or apical sector) or homogeneous

distribution.

-microscope, the presence, development and overall appearance of the Mycorrhizae of inoculated

Tuber, and the presence of contaminants. At this stage the analyst must examine the apices whose

state micorricico is uncertain to facilitate subsequent count optical microscope.

Another problem affecting the quality of the plant is the absence or scarcity of trophic roots which

can lead to unreliable the percentage values of mycorrhization, the observer should take into

account and consequently reject this plant of the sample.

2.3 Count of Mycorrhizae

Immediately after the first observation proceed to remove the plant from its container, placing it on

the table, next to a rule or template that allows us to divide the root device of the plant in three

sectors (S1 = top, S2 = medium and S3 = apical), approximately the same length.

En Placas Petri con agua se cortan distintos fragmentos de raíz, pertenecientes a los 3

sectores.

De cada placa se toman al azar varias raíces en las que se cuentan, con ayuda de la lupa

binocular, los ápices micorrizados en 50 ápices. Según Bencivenga et al., (1995) existe

una correlación positiva muy estrecha en el porcentaje de micorrización de los primeros

50 ápices contados y los primeros 100 ápices. Si al final del contaje existe una alta

heterogeneidad en los porcentajes de micorrización, con el fin de contener el error dentro

del 5%, con el 95% de probabilidad, se deberían analizar al menos la mitad de los ápices

radicales de la planta.

Al final se obtienen, pues, 3 porcentajes, de los que se calcula la media aritmética, que

corresponde al porcentaje de micorrización (PM) de la planta analizada. Todos los datos

obtenidos desde la recepción del lote serán recogidos en un estadillo evaluación

(Apendice 3) que facilite el control de los mismos.

2.4 Criterios de validez para una planta micorrizada

Se trata de fijar unas condiciones mínimas, a sabiendas de que en algunos casos pueden

resultar insuficientes y en otros excesivas. Esto puede explicarse claramente si tenemos

en cuenta que la planta micorrizada, va a transplantarse en un terreno definitivo, lleno de

competidores biológicos y en el que su proporción de ápices micorrizados por la trufa

seleccionada sólo es un factor más, dentro de la complejidad del ecosistema en el que se

va a desarrollar, para decidir en qué sentido se va a desarrollar dicha simbiosis. Un

porcentaje de micorrización (PM) del 20 p.100, es realmente escaso, aunque puede ser

suficiente si el terreno definitivo cumple una serie de características, que hagan la

competencia hacia la trufa seleccionada muy difícil. En el caso contrario podríamos tener

plantas con un 40 p.100 de micorrización, cuya simbiosis va a sufrir una recesión

importante debida al exceso de organismos y especies competidoras, pudiendo incluso

desaparecer con el paso del tiempo. Es pues evidente que las características de la planta

micorrizada son muy importantes, aunque no se debe perder de vista la importancia de

otros factores como el suelo, su textura, su química, su microbiología, la climatología, y

las prácticas culturales, que condicionarán el éxito de una plantación trufera.

Las condiciones fijadas han sido las siguientes:

- el porcentaje mínimo de ápices micorrizados con la especie de Tuber inoculada debe

ser superior o igual al 30% (PM 30).

Different root fragments, belonging to 3 sectors are cut in Petri plates with water.

Each plate are taken at random several roots which have, with the help of the binocular Loupe, the

micorrizados in 50 apices apexes. According to Bencivenga et al., (1995) there is a very close

positive correlation in the percentage of mycorrhization of the first 50 numbered apices and the first

100 apices. If at the end of the counting there is a high heterogeneity in the percentages of

mycorrhization, in order to contain the error within 5%, with 95% probability, at least half of the

root tips of the plant should be analysed.

At the end you get, well, 3 percentages, which calculates the arithmetic mean, which corresponds to

the percentage of mycorrhization (PM) of the analyzed plant. All the data obtained from the

reception of the batch will be collected in physical assessment (Appendix 3) that facilitates the

control of them.

2.4 Criteria of validity for a plant micorrizada

It set minimum conditions, knowing that in some cases may be insufficient and others excessive.

This can clearly be explained if we bear in mind that the plant micorrizada, going to transplant in a

final, full of competitors biological terrain and its proportion of apices micorrizados by selected

truffle is only one factor more, within the complexity of the ecosystem in which will be to develop,

to decide in what sense is going to develop such symbiosis. A percentage of mycorrhization (PM)

of the 20 p.100, is really scarce, although it may be enough if the definitive terrain meets a number

of features, which make towards selected truffles very difficult competition. Otherwise we could

have plants with a 40 p.100 of mycorrhization, whose symbiosis will undergo a major recession due

to the excess of organisms and species competing, and may even disappear with the passage of

time. Is therefore clear that the characteristics of the plant micorrizada are very important, but it

should not lose sight the importance of other factors such as soil, its texture, its chemistry, its

microbiology, climatology, and cultural practices, which will condition the success of a truffle

plantation.

The conditions laid down have been the following:

-the minimum percentage of apices micorrizados inoculated Tuber species must be greater than or

equal to 30% (PM 30).

- la presencia de cualquier otro Tuber, distinto a la especie inoculada implicará el

rechazo inmediato del lote. Este hecho debería ser anecdótico si se realiza el análisis

previo de las trufas utilizadas para la elaboración del inóculo.

- el porcentaje máximo de ápices contaminados, no debe superar el 30%. La diferencia

entre el % de ápices micorrizados con la trufa inoculada y el % de ápices

contaminados debe ser superior o igual a 20.

Criterios de validez para un lote de planta micorrizada para ambos protocolos

Será valido para truficultura el lote de plantas homogéneo, donde al menos un 80% de las

plantas superan los criterios de validez para una planta y donde solo un 5% de las plantas

estén privadas de micorrizas de la trufa inoculada. No debe haber ninguna planta con

micorrizas de una especie de Tuber distinta a la inoculada.

Período de validez de la certificación para ambos protocolos

Si el lote no supera el control, la planta que lo constituye puede cultivarse en el vivero por

un segundo año. Si al segundo año el lote continúa siendo no valido, ninguna planta que

lo constituye podrá ser certificada como idónea para la truficultura.

Se estima un período de validez de la certificación de 6 meses después del análisis de

micorrización. Dado que la certificación se realizará con preferencia en otoño, la

distribución y comercialización de la planta deberá realizarse en el invierno o primavera

siguiente.

Con la permanencia de la planta en vivero, el estado de micorrización puede modificarse

en sentido negativo, por la entrada de hongos extraños. En caso que la planta no se

comercialice dentro de este período, deberá pasar un nuevo control.

BIBLIOGRAFÍA

Amicucci A, Potenza L, Guidi C, Rossi I, Bertini L, Zambonelli A, Stocchiv. 2002. Molecular

techniques for the identification of the edible mycorrhizal mushrooms.

Bencivenga, M., Donnini, D., Tanfulli, M., y Guiducci, M. 1995. Tecnica di campionamento delle

radici e degli radicali per valutazione delle piante micorrizate. Mic. Ital., 2: 35-47.

Di Batista C. 1999. Identification of the black truffle, T. melanosporum, in ectomycorrhizal roots of

nursery seedlings by PCR-based assays. Actes du V congres international Science et culture de la

truffe. Aix en Provance, 60-63.

Etayo, M.L.; De Miguel A.M. 1998 Estudio de las ectomicorrizas en una trufera cultivad situada en

Olóriz Navarra. Publicaciones de Biología, Universidad de Navarra, Serie Botánica, 11:55-114.

Fischer C, Colinas C. 1997. Propuesta de metodologia para la certificación de planta de Quercus

ilex inoculada con Tuber melanosporum para aplicación comercial. Reunión sobre truficultura.

Zaragoza.1997.

-the presence of any other Tuber, different from the inoculated species will involve the immediate

rejection of the batch. This fact should be anecdotal if the prior analysis of truffles used for the

preparation of the inoculum.

-the maximum percentage of contaminated apices, must not exceed 30%. The difference between %

of micorrizados with the inoculated truffle and apices apexes contaminated % must be greater than

or equal to 20.

Criteria of validity for a lot of plant micorrizada for both protocols

The homogeneous batch of plants, where at least 80% of the plants exceed the criteria of validity for

a plant and where only 5% of the plants are deprived of Mycorrhizae of inoculated truffle will be

valid for truficultura. There should be no plant with mycorrhizal fungi in a sort of different to the

inoculated Tuber.

Period of validity of certification for both protocols

If the batch does not exceed the control, the plant which constitutes it can be grown in the nursery

for a second year. If the second year the batch continues being invalid, any plant which constitutes

it may be certified as suitable for the truficultura.

It is estimated a period of validity of the certification of 6 months after the analysis of

mycorrhization. Given that the certification be carried out preferably in autumn, the distribution and

marketing of the plant must be carried in the winter or next spring.

Mycorrhization status can be modified with the permanence of the plant in the nursery, in negative

sense, by the entry of foreign fungi. If the plant is not marketed within this period, you must pass a

new control.

BIBLIOGRAPHY

Amicucci a., Potenza L, Guidi C, Rossi, Bertini L, Zambonelli, Stocchiv. 2002. Molecular

techniques for the identification of the edible mycorrhizal mushrooms.

Bencivenga, M., Donnini, D., Tanfulli, M., and Guiducci, M. 1995. Tecnica di campionamento

delle radici e degli radicali per valutazione delle piante micorrizate. MIC. Ital., 2: 35-47.

Di Batista C. 1999. Identification of the black truffle, T. melanosporum, in ectomycorrhizal roots

of nursery seedlings by PCR-based assays. Actes du Congrès international Science V et culture de

la truffe. Aix en Provance, 60-63.

Etayo, M.L.; Miguel A.M. 1998 study of the ectomycorrhizas in a truffle cultivate located in

Olóriz Navarra. Publications de Biología, Universidad de Navarra, Botany series, 11:55-114.

C Fischer, hills C. 1997. Proposed methodology for the certification of plant of Quercus ilex

inoculated with Tuber melanosporum for commercial application. Meeting on truffle farming.

Zaragoza.1997

Meotto F.; Nosenzo C.; Fontana A.; 1995. Le micorrice pregiate di Tuber. L’Informatore Agrario

31/95, 41-45.

Palazón C, Delgado I, Cartié G, Barruso. 1997. Metodología del análisis de planta micorrizada con

Tuber melanosporum. Reunión sobre truficultura. Zaragoza.

Peñuelas J., 1995. Calidad de la planta forestal: normativa y control. Jornadas sobre nuevas

técnicas de producción de planta forestal. Junta de Castilla y León. Molinos de Duero, Soria. 7-10

de octubre 1995.

Peñuelas J. 1993. Calidad de la planta forestal para el plan de reforestación de tierras agricolas.

Montes, 33: 84-97.

Reyna S, Boronat J, Palomar E. 2002. Quality control of plants mycorrhized with Tuber

melanosporum Vitt. In: Hall I, Wang Y, Danell E, Zambonelli A (eds) Edible mycorrhizal

mushrooms and their cultivation. Proceedings of the Second International Conference on Edible

Mycorrhizal Mushrooms. CD ROM Crop & Food Research. New Zealand.

Reyna, S., Boronat, J.; Palomar, E. 2000. Control De Calidad En La Planta Micorrizada Con Tuber

Melanosporum Vitt Producida Por Viveros Comerciales. Revista MONTES nº 61 pag 17-24.

Rubini A, Paolocci F, Granetti B, Arcioni S. 2001. Morphological characterization of molecular-

typed Tuber magnatum ectomycorrhizae. Mycorrhiza 11: 179-185.

Verlhac A, Giraud M, Leteinturier J. 1990. La truffe, guide pratique. Ctifl.

Zambonelli A, SaiI S, Pisi A.; 1993 Caraterizzacione anatomo-morfologica delle micorrice di Tuber

ssp. su Quercus pubescenns Willd. mic. Ital.1993, 3 , 73-90.

Meotto F.; Nosenzo C.; Fontana a..; 1995 Le micorrice pregiate di Tuber. L' L'informatore

agrarian 31/95, 41-45.

Palazón C, Delgado I, G, Barruso Cartie. 1997 Methodology of analysis of plant infected with

Tuber melanosporum. Meeting on truffle farming. Zaragoza.

Peñuelas j., 1995. Quality of the forest floor: regulation and control. Symposium on new

techniques of production of forest plant. Junta de Castilla y León. Molinos de Duero, Soria.

October 7-10, 1995.

Peñuelas j. 1993. Quality of the forest floor to the plan of reforestation of agricultural land.

Montes, 33: 84-97.

Reyna S, Boronat J, Palomar e. 2002. Quality control of plants mycorrhized with Tuber

melanosporum Vitt. In: Hall I, Wang and, Danell E, Zambonelli, a. (eds) Edible mycorrhizal

mushrooms and their cultivation. Proceedings of the Second International Conference on Edible

Mycorrhizal Mushrooms. CD ROM Crop & Food Research. New Zealand.

Reyna, S., Boronat, J.; Palomar, e. 2000. Quality control in plant infected with Tuber

Melanosporum Vitt produced by commercial nurseries. Magazine MONTES nº 61 17-24 pag.

Rubini A, Paolocci Granetti, F B, Arcioni S. 2001. Morphological characterization of molecular-

typed Tuber magnatum, ectomycorrhizae. Mycorrhiza 11: 179-185.

Verlhac A, Giraud M, Leteinturier j. 1990. La truffe, guide pratique. CTIFL.

A Zambonelli, SaiI, Pisi S.; 1993 Caraterizzacione anatomical-morphologic delle micorrice di

Tuber ssp. its Quercus pubescenns Willd. MIC Ital.1993, 3, 73-90.

Apéndice 1: Criterio de evaluación de calidad de planta para Quercus ilex en

contenedor. Peñuelas (1993,1995).

Las plantas deberán cumplir todos los requisitos siguientes:

1) La altura de la parte aérea no puede superar el doble de la longitud del

cepellón.

2) El diámetro de cuello debe tener más de 2 ó 3 mm (para plantas de 1 ó 2

años, respectivamente).

3) La raíz pivotante debe estar bien repicada sin bucles o ángulos inferiores

a 110°.

4) No debe tener raíces secundarias ascendentes.

5) Debe tener raíces secundarias a lo largo de la raíz pivotante, con una

abundancia de raíces tróficas.

6) La planta debe estar sana tanto en la parte aérea como en la parte

radicular sin pudriciones ni desecación.

7) La planta debe haber pasado un periodo de endurecimiento y tener el

cuello lignificado.

Appendix 1: criterion of evaluation of quality of plant for Quercus ilex in container. Peñuelas

(1993,1995).

Plants must meet all the following requirements:

1) Aboveground height may not exceed twice the length of the root ball.

(2) The diameter of the neck should be longer than 2-3 mm (for plants of 1 or 2 years, respectively).

(3) The tap root should be well stumped parets without loops or angles below 110 °.

(4) It must be ascending secondary roots.

(5) You must have secondary roots along the tap root, with an abundance of trophic roots.

(6) The plant must be healthy both aboveground and the root part without rotting or drying out.

(7) The plant must have passed a period of hardening and the lignified neck.

Apendice 2: MODELO DE ESTADILLO PARA LA EVALUACION DE PLANTA DE

ENCINA MICORRIZADA POR Tuber spp. Según protocolo Reyna (2000).

Productor............................................................................................................... Lote nº..................................................Fecha de evaluación................................ Planta huésped............................................ Origen ............................................ Hongo.....................................................Procedencia .......................................... Nº plantas del lote...........................Nº plantas analizadas.................................... Estado fenológico 1 savia 2 savias Criterios de calidad según normativa CEE Cumple No cumple Sistema de propagación ............................. Tipo de inóculo................................. Fecha siembra .................................... Fecha inoculación ................................

Primera observación en vivero

Análisis en laboratorio

Raíces tróficas abundantes

Nº de ápices con Tuber inoculado

% de micorrizacion con Tuber inoculado

% de micorrizas contaminantes

Planta 1

Planta 2

Planta 3

Planta 4

Planta 5

Planta 6

Planta 7

Planta 8

Planta 9

Planta 10

VALORACIÓN FINAL

ADMITIDO RECHAZADO PDTE. NUEVA VALORACION

OBSERVACIONES

Appendix 2: MODEL of physical for the evaluation of plant of ENCINA infected by Tuber spp. According to

Protocol Reyna (2000).

Productor...............................................................................................................

Lote nº..................................................Date of evaluation...

Host plant... Origen ............................................

Hongo.....................................................Origin...

No. lot plants...No. plants analyzed...

Been phenological 1 SAP 2 SAPs

Quality according to Regulation EEC meets No criteria compliance

Propagation system... Type of inoculum...

Sowing date... Inoculation date...

First observation in nursery analysis in laboratory

Trophic roots

abundant number of apexes with Tuber inoculated % of mycorrhization with % of contaminants

mycorrhizal inoculated Tuber

Plant 1

Plant 2

Plant 3

Plant 4

Plant 5

Plant 6

7Th floor

Plant 8

Floor 9

Plant 10

ADMITTED REJECTED PENDING FINAL VALUATION. NEW VALUATION

Apendice 3:

MODELO DE ESTADILLO PARA LA EVALUACION DE PLANTA (AVELLANO Y ROBLE) DE MICORRIZADA POR Tuber spp. Según el

segundo protocolo.

Productor............................................................................................................... Lote nº..................................................Fecha de evaluación................................ Planta huésped............................................ Origen ............................................ Hongo.....................................................Procedencia .......................................... Nº plantas del lote...........................Nº plantas analizadas.................................... Estado fenológico 1 savia 2 savias Criterios de calidad según normativa CEE Cumple No cumple Sistema de propagación ............................. Tipo de inóculo................................. Fecha siembra .................................... Fecha inoculación ................................

Primera observación Nºápices T.melanosporum/100

% Contaminantes

Raices tróficas

abundantes

Colonización >10%

Contaminación <50%

S1 S2 S3 Media

Planta 1

Planta 2

Planta 3

Planta 4

Planta 5

Planta 6

Planta 7

Planta 8

Planta 9

Planta 10

VALORACIÓN FINAL

ADMITIDO RECHAZADO PDTE. NUEVA VALORACION

OBSERVACIONES

Appendix 3: MODEL of physical for the evaluation of plant (Hazel and Oak) infected by Tuber spp. According

to the second Protocol.

Productor...............................................................................................................

Lote nº..................................................Date of evaluation...

Host plant... Origen ............................................

Hongo.....................................................Origin...

No. lot plants...No. plants analyzed...

Been phenological 1 SAP 2 SAPs

Quality according to Regulation EEC meets No criteria compliance

Propagation system... Type of inoculum...

Sowing date... Inoculation date...

First observation No. apices

T.melanosporum/100% pollutant

Trophic roots

abundant colonization

> 10% contamination

< 50% S1 S2 S3 Media

Plant 1

Plant 2

Plant 3

Plant 4

Plant 5

Plant 6

7Th floor

Plant 8

Floor 9

Plant 10

ADMITTED REJECTED PENDING FINAL VALUATION. NEW VALUATION