PROTENAS II PARTE

I. OBJETIVOS:

Preparar casena. Realizar pruebas caractersticas de la casena. Realizar pruebas con protenas coagulables.

II. PRINCIPIOS TERICOS:La casena es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena) presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseingeno.Las casenas es un conjunto heterogneo de protenas por lo que es difcil fijar una definicin. Sin embargo, todas las protenas englobadas en lo que se denomina casena tienen una caracterstica comn: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la casena tambin se le suele denominar protena insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las protenas que se denominan casenas son especficas de cada especie, se clasifican en los siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electrofortica: s1-casena, s2-casena, -casena y -casena. Propiedades qumicas y fsicas de las casenasA diferencia de muchas otras protenas, incluso del queso, las casenas no precipitan por accin del calor. Por el contrario, precipita por la accin de una enzima proteasa presente en el estmago de los mamferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracasena. Si la precipitacin se realiza por la accin de cidos, se le llama casena cida. En la elaboracin de los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones.La secuencia aminoacdica de la casena contiene un nmero inusual de residuos del aminocido prolina: entre 10 en la -casena y 35 en la -casena. Como resultado, las casenas son relativamente hidrofbicas (poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria bien definidas. En la leche se encuentra como suspensin de partculas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeas esferas hidroflicas en el exterior e hidrfobicas en el interior). Estas micelas de casena se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofbicas.

III. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS:

3.1. Materiales:

Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 50 ml Una gradilla para tubos de ensayo Un erlenmeyer de 250 ml Un erlenmeyer de 150 ml Probeta de 50 ml Dos pipetas graduadas de 5.0 ml Dos pipetas graduadas de 1.0 ml Agitador de vidrio Embudo de vidrio mediano Vidrio de reloj Papel filtro Dos goteros de plstico Pinzas para tubos de ensayo

3.2 Reactivos: Agua destilada cido actico Carbonato de calcio HCl al 2% NaOH al 1% NaCl al 10% HNO3 (c) Hidrxido de calcio Reactivo de Biuret Reactivo de Fehling A Reactivo de Fehling B

3.3 EQUIPOS: Mquina de centrifugacin

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

1. AISLAMIENTO DE LA CASENA:

a) En un vaso de precipitados de 250 ml se colocaron 100 ml de leche pura de vaca, a la cual, previamente, se elimin la mayor cantidad de grasa posible, mediante centrifugacin durante 5 minutos a 3000 rpm. A continuacin, se midi el pH de la leche y por medio de la acidificacin con HCl al 20% se llevo el pH de la misma hasta 4.0.b) Posteriormente se dej reposar alrededor de 15 minutos aproximadamente hasta observar grumos en la superficie. Inmediatamente despus, el precipitado se reparti en cuatro tubos de centrifuga; se centrifug durante 10 minutos a 2000 rpm.c) Al trmino de la centrifugacin se retiraron los tubos y se separ en un tubo de ensayo el lquido de la superficie y se guard. Posteriormente, la leche descremada se puso en un vaso de precipitado y se homogenizo con 20 ml de agua destilada, la solucin se coloc en un solo tubo de centrifuga y en otro tubo agua para equilibrar con un mismo peso, se dejo 10 minutos a 2000 rpm, con el objeto de eliminar el HCl.d) Posteriormente, se elimin el sobrenadante y a la fase slida (leche descremada) se agregaron 10 ml de etanol, se homogeniz con una varilla de vidrio y al terminar se centrifug a 10 minutos a 2000rpm.

e) De la misma manera, se elimin el sobrenadante y a la fase slida se le agregaron 5 ml de acido actico y 5ml de ter, se homogeniz, al terminar se coloc en la centrifuga a 10 min a 2000 rpm. Por ltimo se elimin el sobrenadante y el precipitado se guard hasta que se secara; se peso el precipitado seco.f) SE SEPARA EL LIQUIDO DE LA SUPERFICIE Y SE GUARDAEQUILIBRA-MOS CON AGUA CON EL MISMO PESO EN UN TUBO DE ENSAYO15 minAADIMOS HCl HASTA QUE TENGA UN pH DE 4.0 Observamos el aspecto de la casena, pesar y calcular el porcentaje de casena en la leche experimentada.

SE PASA A UN TUBO DE ENSAYOLECHE DESCREMADA CON 20ml DE AGUA DESTILADACENTRIFUGAMOS POR 10 Min A 2000 rpmCENTRIFUGAMOS POR 5 Min A 3000 rpmLECHE PURA DE VACA

SE ELIMINA EL SOBRENADANTE

SE ELIMINA EL SOBRENADANTEEL PRECIPITADO SE GUARD HASTA QUE SE SEQUE PARA LUEGO PESARLOSE ELIMINA EL SOBRENADANTE

CENTRIFUGAMOS POR 10 Min A 2000 rpmFASE SLIDA + 5 ml de CIDO ACTICO + 5 ml DE TERCENTRIFUGAMOS POR 10 Min A 2000 rpmFASE SLIDA + 10 ml de ETANOLCENTRIFUGAMOS POR 10 Min A 2000 rpm

2. PROPIEDADES Y PRUEBAS CARACTERISTICAS DE LA CASENA2.1. Composicin elemental: presencia de C, H, O y NEn un tubo de ensayo pequeo limpio y seco pusimos 0.5 g de casena en polvo y cogiendo con una pinza lo calentamos directamente con la llama suave del mechero. Observamos y tomamos nota del cambio de color de la casena.

CASENA EN POLVOHUMOS BLANQUECINOS

GOTAS DE AGUA

RESIDUOS DE COLOR NEGRO

2.2. Solubilidad1. Marcamos 5 tunos de ensayo como: A, B, C, D y E. Pusimos a cada tubo una pequea porcin de casena.2. Agregamos a los tubos 5 ml de: al tubo A, agua destilada, al B, cloruro de sodio al 10%, al C, solucin de HCl al 0.2%, al D, solucin de NaOH al 1% y al E, solucin saturada de hidrxido de calcio. Agitamos los tubos y anotamos las observaciones relativas a la solubilidad de la casena.

INSOLUBLECASENA EN POLVO5 ml de AGUA DESTILADA

5 ml de CLORURO DE SODIO AL 10%

INSOLUBLECASENA EN POLVO

INSOLUBLECASENA EN POLVO5 ml de CIDO CLORHIDRICO AL 0.2%

SOLUBLECASENA EN POLVO5 ml de HIDRXIDO DE SODIO AL 1%

INSOLUBLECASENA EN POLVO5 ml de HIDRXIDO DE CALCIOREACCIONES:

+ NaOH al 1%CASENA 3 GOTAS DE CuSO42.3. Prueba del Biuret:De acuerdo a la prueba de solubilidad, se tomo el tubo D en el cual es ms soluble la casena y de acuerdo a ello, realizamos en esta solucin la prueba del Biuret. Observamos y tomamos nota.

PRUEBA POSITIVA2.4. Prueba Xantoproteica:Efectuamos la prueba Xantoproteica en una pequea porcin de casena. Observamos y tomamos nota.

+ HNO3

PRUEBA POSITIVACASENA

3. PROTENAS COAGULABLES:

a) En un tubo de ensayo mediano vertimos 5 ml de suero obtenido en 1c) y lo neutralizamos con unas gotas de solucin de NaOH al 1% (usamos papel indicador). Luego aadimos unas cuantas gotas de cido actico hasta una ligera acidez. Calentamos hasta ebullicin. Observamos y tomamos nota.b) Seguimos calentando el tubo hasta reducir su volumen a la mitad, y dejamos decantar. Separamos el slido obtenido y efectuamos la prueba de Fehling y la Xantoproteica, por separado. Anotamos nuestras observaciones.

3 gotas de cido actico 5 gotas de NaOH al 1%

SUERO

TOMA UN COLOR ROJOTOMA UN COLOR AMARILLO

CIDO NTRICO

SUEROREACTIVO DE FEHLINGSUERO

V. RESULTADOS:

1. AISLAMIENTO DE LA CASENASe obtuvieron 0.8 gramos de casena de 100 ml (equivalentes a 103 g si consideramos su densidad de 1,030 g/ml a 15C) de leche pura de vaca, por lo que se el rendimiento fue de 0.77% segn la siguiente frmula: Rendimiento=Peso seco de la casenaX 100%=0.8 gX 100%= 0.77 %

g de leche utilizados103 g

El rendimiento de casena obtenido en esta prctica es muy bajo al rendimiento reportado en la literatura (30 g por litro, 3%), es probable que esto se deba a que no se dej que la casena precipitara completamente o, a la eliminacin del sobrenadante en cada una de las centrifugaciones, proceso en el cual se pudieron arrastrar cantidades considerables de protena junto el agua utilizada para eliminar el HCl.Cabe mencionar que la protena no se precipit a pH de 4.6, solamente se observaron pequeos grumos a pH de 4.0, fue entonces cuando se llevo a cabo la primera centrifugacin. Los solventes orgnicos voltiles se utilizaron para eliminar el resto de grasa de la casena.2. PROPIEDADES Y PRUEBAS CARACTERISTICAS DE LAS PROTENAS:

2.1. Composicin elemental: presencia de C, H, O y NAl someter el tubo de ensayo que contena casena sobre la llama suave del mechero se formo un residuo de color negruzco indicando la presencia de Carbono, tambin se observo gotas de agua en las paredes del tubo de ensayo lo que indica la presencia de Hidrgeno y Oxgeno, y por ltimo se observo el desprendimiento de humos blanquecinos con un olor caracterstico a cuerno quemado lo que indica la presencia de Nitrgeno.2.2. SolubilidadDe los 5 tubos de ensayos marcados como A, B, C, D y E, solo fue soluble el tubo D, que contena casena con Hidrxido de Sodio al 1%; los dems tubos de ensayo nos dieron pruebas negativas con respecto a la solubilidad.2.3. FORMULA QUMICA DEL BIURETPrueba de BiuretNos dio una reaccin positiva, ya que el Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida.Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el medio alcalino necesario para que tenga lugar.2.4. Prueba XantoproteicaNos dio una reaccin positiva, ya que La reaccin xantoproteica es un mtodo que se puede utilizar para determinar la cantidad de protena soluble en una solucin, empleando cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos aromticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali, se torna color amarillo oscuro.3. PROTENAS COAGULABLESAl agregar NaOH al suero obtenido de la leche este cambio de color a un verde indico, indicando que fue neutralizado, pero al agregar cido actico formo un cuajo espeso blanquecino al fondo del tubo de ensayo, se separo el liquido que est en la superficie y se efectu la prueba de Fehling, dndonos de un color azul a un color rojo, lo que nos indica la presencia de glcidos tales como: lactosa y glucosa; luego realizamos la prueba de Xantoproteica y nos dio una coloracin amarilla indicando una prueba positiva.VI. CONCLUSIONES:

Es posible la purificacin parcial y el aislamiento de la casena de la leche, utilizando la poca solubilidad que esta protena tiene cuando se le lleva hasta su punto isoelctrico y la rapidez de sedimentacin de la misma al utilizar la centrifuga. No obstante, el rendimiento puede ser variado si se considera que los mtodos de purificacin son tambin variados. Al someter a la casena al calor suave del mechero se puede observar claramente su composicin elemental que son: C, H, O y N, a travs del residuo negruzco, los humos blanquecinos y las gotas de agua en las paredes del tubo de ensayo que se desprenden al someterlo a calentamiento suave. La casena es una protena y fue ms soluble con NaOH, es decir es soluble en solucin alcalina. La reaccin de Biuret es una reaccin que sirve para identificar los enlaces peptdicos de las protenas, ya que en las pruebas realizadas nos dio positiva dndonos coloraciones de color morado claro. La reaccin de Xantoproteica sirve para detectar compuestos aromticos presentes en la estructura de protenas, adems de que las protenas estn formadas por aminocidos, ya que en las pruebas realizadas nos dio positivas dndonos un color amarillo.

VII. CUESTIONARIO

1. Responda brevemente:a) Qu son: albminas, globulinas, seudoglobulinas y fosfoprotenas?

ALBUMINAS:La albmina es una protena que se encuentra abundantemente en la sangre del ser humano y es sintetizada en el hgado, representando el 54,31% de la protena plasmtica. Normalmente tiene una presencia en sangre humana de 3,5 a 5 gramos pordecilitro.

FUNCIONES:- Permite mantener la presin onctica, fundamental para la correcta distribucin de los lquidos corporales - entre compartimento intravascular y el extravascular, localizado entre los tejidos.- Transporta las hormonas tiroideas y las hormonas liposolubles.- Transporta cidos grasos libres y la bilirrubina no conjugada.- Transporta muchos frmacos.- Controla el pH.TIPOS DE ALBUMINAS: Seroalbmina: Es la protena del suero sanguneo. Ovoalbmina: Es la albmina de la clara del huevo. Lactoalbmina: Es la albmina de la leche. GLOBULINAS:Las globulinas son un grupo de protenas insolubles en agua que se encuentran en todos los animales y vegetales.

Entre las globulinas ms importantes destacan las seroglobulinas (de la sangre), las lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas (del huevo), la legmina, el fibringeno, los anticuerpos (-globulinas) y numerosas protenas de las semillas.

Las globulinas son un importante componente de la sangre, especficamente del plasma. stas se pueden dividir en varios grupos. Principales grupos de globulinas: globulinas alfa 1 y 2 globulinas beta globulinas gamma SEUDOGLOBULINAS:Son protenas solubles que pueden precipitarse de una solucin acuosa por saturacin de uno a tres cuartos con una sal acida. Las seudoglobulinas son menos frecuentes. La podemos encontrar en el suero de la leche se coagulan por calentamiento. FOSFOPROTENAS:Protenas combinadas con cido fosfrico, o un radical que contiene fsforo que no sea un fosfolpido ni cido nucleico. Ejemplo: casena.b) en qu consiste la desnaturalizacin y la precipitacin de protenas?Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin y se dice entonces que la protena se encuentra desnaturalizada. Ver figura.

c) A qu se llama punto isoelctrico?El punto isoelctrico es el pH al que una sustancia anftera tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminocidos y tambin en las protenas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa.

(Los pKa a considerar para esta ecuacin, en una tabla de pH, son los que contienen a la especie qumica con carga igual a cero, cuando tienen ms de un pKa).Las molculas complejas, tales como las protenas, se combinan con los iones hidrgeno y con otros iones presentes en la disolucin, dando lugar a la carga neta de la molcula. A la concentracin de iones hidrgeno, o al pH, para el cual la concentracin del ion hbrido de una protena es mxima y el movimiento neto de las molculas de soluto en un campo elctrico es prcticamente nulo, se le denomina punto isoelctrico.2. Exponga en forma ordenada todas sus observaciones sobre:

a) Preparacin de la casena. Qu es la casena y que propiedades presenta? Para qu sirve? Qu es suero obtenido?La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las protenas de la leche y el 2.7% en la composicin de la leche lquida. Y la propiedad que se vio claramente fue que las casenas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoelctrico (a temperatura ambiente)

El suero de leche es un lquido obtenido en el proceso de fabricacin del queso y de la casena, despus de la separacin de la cuajada o fase micelar. Sus caractersticas corresponden a un lquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco, dbilmente dulce, de carcter cido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del 5.5% al 7% provenientes de la leche.b) Qu elementos se detectaron en la casena? Cmo los certifica? Qu ensayo realizara para detectar la presencia de azufre?Se detectaron el C, H, O y N, esto se vio claramente al someter a la casena a la llama suave del mechero, se produjo un residuo negruzco (carbono), gotitas de agua en las paredes del tubo de ensayo (oxigeno e hidrogeno) y la presencia de humos blanquecinos (nitrgeno) y si tendramos que detectar la presencia de azufre tendramos que realizar la reaccin de la cistina, que consiste en aadir 2 gotas de solucin de acetato de plomo. Se obtiene un precipitado. Luego aadimos solucin de hidrxido de Sodio para disolver este y luego hervir. La solucin se torna pardo obscura (debido a la formacin de sulfuro de plomo).c) En cul de las soluciones empleadas fue ms soluble la casena? En la solucin alcalina de hidrxido de Sodio al 1%d) Fueron positivas las reacciones del Biuret y la Xantoproteica? Escriba sus reacciones correspondientesREACCION DE BIURET: la prueba fue positiva y su reaccin esta dado por:

SULFATO DE COBREHIDRXIDO DE SODIOCASENASULFATO DE SODIOCOMPLEJO TETRACOORDINADO DE COBRENa2 SO4CuSO4NaOHREACCION DE XANTOPROTEICA: la prueba fue positiva y su reaccin esta dado por:

DERIVADO ANARANJADODERIVADO AMARILLONaOH2HNO33. Exponga sus observaciones y deducciones de los ensayos sobre las protenas coagulables. Escriba las reacciones de Fehling y Xantoproteica. REACCIN DE FEHLING:Al someter el suero obtenido con el licor de fehling nos da una coloracin rojiza lo que nos indica la presencia de glcidos: como la lactosa y la glucosa.

PROTENA

REACTIVO DE FEHLING

PRECIPITADO ROJO LADRILLO

LACTOSA

GLUCOSAREACCIN DE XANTOPROTEICA:Al tubo de ensayo al agregarle cido ntrico e hidrxido de sodio notamos que nos da una coloracin amarillenta al ppdo.

PROTENACIDO NTRICOCOMPLEJO AMARILLENTO

VIII. BIBLIOGRAFIAS:Gua de prcticas: PROTENAS II, proporcionada por el profesor Mgr.Ral Paredes Medina

FACULTAD:INGENIERIA

ESCUELA:INGENIERA QUMICA

CURSO:BIOQUIMICA

NOMBRE:BRYAN MACHICADO FLORES

PROFESOR:Ing. RAUL PAREDES MEDINA

AO:SEGUNDO

FECHA DE ENTREGA:10 DE ENERO DEL 2012

TACNA - PERU