ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Proyecto: Aislamiento de Azospirillum a partir de raíces de

gramíneas

ASIGNATURA :

Microbiología de Suelos

DOCENTE :

Dr. Nelly Ramírez de Jiménez

ALUMNOS:

Rómulo Aycachi IngaAlex M. Chafloque MillonesCinthya Paz Acuña

CICLO :

2007- I

Lambayeque, junio 2007.

GENERALIDADES

Título del proyecto: “Aislamiento de Azospirillum a partir de raíces de gramíneas”

Personal investigador: Autores:

Aycachi Inga RómuloChafloque Millones Alex M.Paz Acuña Cinthya

Patrocinador o Asesor:

Dra. Nelly Ramírez de Jiménez

Carrera profesional / Especialidad:

Biología / Microbiología y Parasitología

Tipo de investigación :

- De acuerdo al fin que se persigue: APLICATIVO- De acuerdo a la tecnica de contrastación: EXPLICATIVA

Régimen de investigación: Orientada al área de Microbiología del Suelo

Localidad o Institución donde se desarrollará el proyecto:

Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Duración del proyecto: 8 semanas aprox.

Fechas probables de inicio y terminación:

- Inicio: 23 de julio del 2007 - Terminación: 10 de setiembre del 2007

Cronograma de trabajo:

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDADESMESES

2007

JULIO AGOSTO SETIEMBRE

SEMANAS1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

FASE DE PLANEAMIENTO                                                  

Revisión Bibliografica                          Elaboración del Proyecto                          Presentación del Proyecto                          Aprobación del Proyecto                          Implementacion del Proyecto                          

FASE DE EJECUCION                                                  

Aislamiento de Azospirillum                          Toma de muestra                          Procesamiento de la muestra                          Registro de datos                          Analisis estadístico de datos                          

FASE DE COMUNICACIÓN                                                  

Analisis e intepretacion                          Elaboración del informe                          Presentación del informe                          

Recursos disponibles

Personal:- Técnicos del Laboratorio de Microbiologia- Docente del area de Microbiología del Suelo

Equipos e instrumentos:- Microscopiso electricos- Centrifugas- Estufa

Materiales y reactivos- Placas de Petri- Asa de Kolle- Tubos de ensayo- Agua destilada esteril- Medio de cultivo NFb semigelificado “libre” de nitrógeno y con malato

como fuente de carbono- Material biológico (gramineas)- Pinzas- Mecheros bunsen

Local:- Laboratorio de Microbiología de Suelos – Facultad de Ciencias

Biológicas

Presupuestos

Bienes:

- Material de escritorio:

CANTIDAD DESCRIPCION PRECIO100 Papel bond S/. 6.00 3 Lapiceros S/. 5.50 1 Corrector S/. 2.00 1 Marcador indeleble S/. 2.80 1 Juego de reglas S/. 2.50 1 Resaltador S/. 2.80

1 (clips) Clips S/. 2.50 3 Fólder Manila S/. 1.50

TOTAL S/. 25.60

- Material de laboratorio:

CANTIDAD DESCRIPCION PRECIO8 Placas de Petri S/. 40.00 12 Tubos de ensayo medianos S/. 8.00 1 Gradilla S/. 5.00

1 (caja) Laminas porta objetos S/. 7.00 1 Mechero de vidrio S/. 8.00

1 L. Ron de quemar S/. 3.50 ½ L. Alcochol de 96º S/. 1.50

1 Bolsa de algodon S/. 3.00 1 Asa de Kolle S/. 5.00

TOTAL S/. 81.00

- Material biológico:

Material para procesamiento de datos:

Costo total del proyecto: S/. 152.10

Financiamiento: Autofinanciamiento

Maíz …………. S/. 1.00 Arroz …………. S/. 1.50 Trigo …………. S/. 2.00

Total S/. 4.50

Rollo fotografico S/. 8.00

Cartuchos para tinta S/. 25.00

Otros S/. 8.00

TOTAL S/. 41.00

PLAN DE INVESTIGACION

Realidad problemática

Aún cuando Spirillum lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta bacteria estuvo olvidada por varias décadas. Son las observaciones de Peña-Cabriales y Döbereiner en 1973 las que iniciarían la época moderna de esta bacteria. Estudios taxonómicos de S. lipoferum conducen a su reclasificación en un género nuevo, Azospirillum.

Actualmente son reconocidas seis especies en el género Azospirillum. Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo éstas las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense y A. largomobile siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile. Pocos años antes ésta especie fue considerada como un sinónimo de la especie A. lipoferum. Recientemente, en honor de quien impulsara los estudios con este género bacteriano y descubriera otros diazótrofos, se ha propuesto la especie candidata A. doebereinerae.

Pocos años después del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de 1993, este género fue el mas estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovió numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria.

Los azospirilla muestran una muy amplia distribución geográfica alrededor del mundo. Aún cuando son mas abundantes en las regiones tropicales, también se les encuentra en las regiones templadas, frías y desérticas. En las regiones templadas del sur de Brasil, los Estados Unidos y Kenia la presencia de Azospirillum es menor al 10% en las muestras analizadas. El pH del suelo juega un papel importante en la presencia de las especies del género Azospirillum. Las especies de A. brasilense y A. lipoferum se encuentran en mayor abundancia en suelos con valores de pH cercanos a la neutralidad, aún cuando a pH abajo de 5 se les encuentra en forma esporadica y no lográndose su aislamiento de suelos con pH menor a 4.5.

Un estudio en el que se evaluaron 23 tipos de suelos con características diferentes mostró que algunos factores abióticos tales como porcentaje de arcilla, contenido de materia orgánica, capacidad de retención de agua y contenido de nitrógeno afectan positivamente la sobrevivencia de A. brasilense, en tanto que el tamaño de las partículas de arena y especialmente la alta concentración de carbonato de calcio afectan negativamente la sobrevivencia de esta especie en ausencia de plantas. No obstante, la sobrevivencia de A. brasilense en la rizosfera es independiente de la aridez del suelo.

Las bacterias del género Azospirillum han sido aisladas de la superficie de la raíz de una muy amplia variedad de plantas y de su rizosfera, incluyendo cereales como maíz, trigo, arroz, sorgo, avena, pastos forrajeros como Cynodon dactylon, Poa pratensis, Festuca arundinacea, de diferentes especies de Pennisetum y Panicum. Especies de Azospirillum fueron aisladas incluso del henequén [Agave fourcroydes], y plantas cactáceas que incluyen diferentes especies de Opuntia y Stenocereus. En algunos casos se logró confirmar el

aislamiento de A. brasilense y A. amazonense de semillas de pastos esterilizadas superficialmente. Aun cuando no fueron identificados al nivel de especie, algunas cepas de Azospirillum fueron aisladas de esporocarpos de los hongos ectomicorrízicos Hebeloma crustuliniforme, Laccaria laccata y Rhizopogon vinicolor.

Ante la información obtenida anteriormente por las investigaciones realizadas, se haria de vital importancia determinar si en nuestra localidad se encuentra tambien como un simbionte rizosférico el género Azospirillum y sobre todo proveer información de que especies en concreto de dicho género estan presentes en la agricultura de gramíneas de la localidad.

Justificación e importancia

La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de colonización son las areas de elongación celular y las bases de los pelos radicales. Sólo algunas células de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. La inoculación de raíces de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostró que en los primeros días de la asociación las células bacterianas colonizan específicamente los sitios de emergencia de las raíces laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raíz primaria como de las raíces secundarias y posteriormente la superficie de la raíz. En plantas de trigo fue observado que la inoculación de Azospirillum induce cambios en la morfología de los pelos radicales, siendo éstos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mínimos. Además, fue observado que la inoculación con 105 a 106 células de Azospirillum causa tanto la elongación como el aumento de la superficie total de la raíz, en tanto que la inoculación de 108 a 109 células causan la inhibición del desarrollo de ésta.

Considerando la capacidad de Azospirillum para asociarse con plantas de interés agrícola, así como su capacidad para fijar N2 en medios de cultivo, se diseñaron numerosos experimentos para evaluar el efecto de la inoculación sobre el crecimiento de las plantas. No existen reportes que indiquen efectos patogénicos en las plantas causadas por la inoculación de Azospirillum. El único reporte existente en esta dirección indica que ninguna de las especies de Azospirillum causa sintomas visibles de enfermedad sobre la raíz o las hojas de plantas de trigo, algodón o tomate. Con la inoculación de Azospirillum se observó frecuentemente un mayor desarrollo del sistema radical el cual se traduce en mayor superficie de absorción de nutrientes, así como en mayor desarrollo de la parte aérea de las plantas. También fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno, fósforo, potasio y otros minerales en las plantas inoculadas. Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos países para evaluar su efecto sobre el rendimiento de los cultivos.

Frecuentemente se observó que la inoculación de los cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los fertilizantes sin que exista disminución en el rendimiento de la cosecha.

Recientemente fueron observados incrementos en la biomasa de pastizales naturales inoculados con A. brasilense aun bajo condiciones de crecimiento subóptimas.

Algunas compañias en diferentes países han registrado inoculantes de Azospirillum para maíz y otros cultivos. Burdman y col. refieren que en Sudafrica se lleva a cabo la producción de inoculantes a base de Azospirillum para 150,000 hectáreas de maíz y 12,000 de trigo. Algunas características de la producción de inoculantes a base de Azospirillum han sido discutidas.

Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en México la aplicación de ésta bacteria en diferentes cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros países. En el ciclo agrícola primavera-verano (PV) del año 1999 la Secretaría de Agricultura, a través de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundación Mexicana para la Investigación Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboración con el Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno-UNAM, llevó a cabo la inoculación de alrededor de 450,000 hectáreas de maíz y 150,000 hectáreas de sorgo, cebada y trigo, empleando cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos.

En la actualidad hacen falta muchos estudios de investigación básica, tanto sobre la bacteria como en su interacción con la planta, para un mejor entendimiento de la asociación Azospirillum-planta. No obstante, la aplicación de Azospirillum como bioestimulante que incrementa la producción de los cultivos deberia extenderse a todos aquéllos lugares donde la aplicación de fertilizantes es nula o escasa (caso existente en muchas zonas agrícolas pobres del país, sobre todo en la serranía). En las regiones donde se practica una agricultura moderna, la inoculación con Azospirillum permitiría reducir las elevadas cantidades de fertilizantes que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el costo de producción como los problemas derivados de su uso, principalmente la contaminación, sin detrimento de la producción.

En nuestro caso, como parte del proyecto, solo se trataría de aislar e indentificar especies del genéro Azospirillum, que son propias de la localidad.

Objetivos

- Aislar bacterias del genéro Azospirillum a partir de raíces de gramíneas.

- Realizar la identificación de especie de las bacterias aisladas.- Realizar tincion flagelar y otros tipos de tinciones que

demuestren la morfología típica de la bacteria.

Material y métodos (procedimiento)

Materiales

- Placas de Petri

- Asa de Kolle- Tubos de ensayo- Agua destilada estéril- Macetas- Suelo estéril- Raíces de gramíneas diversas (arroz, maíz, trigo)- Semillas pregerminadas de gramíneas- Láminas porta objetos- Reactivos para tinción- Mecheros

Métodos

Aislamiento de Azospirillum

- Realizar el lavado de las raices previamente cortadas a 1 cm de longitud en agua destilada estéril tres veces.

- Depositar con el asa de Kolle las raíces en los tubos conteniendo medio de cultivo.

- Llevar a incubar durante tres días a una temperatura de 28º C.

- Luego de la incubación en el tubo se debe observar una zona de interfase (microaerofilia).

- Luego proceder con el sembrado en placa para aislar y poder observar las colonias características

- Realizar tinción de Gram y coloración de flagelos.

Experimento

- Con las cepas aisladas, coloreadas y comprobadas, preparar tres macetas con suelo estéril y con inoculación de Azospirrillum en semillas pregerminadas en pasto sudan y dos macetas controles (sin inoculación).

- Regar las macetas por 30 días con agua hervida fría y verificar la humedad (al escarbar).

- Luego aislar Azospirillum de los maceteros y observar los cambios y diferencias producidas entre los maceteros control y los maceteros inoculados.

Referencias

- A. CURA, Jóse y otros. (2002). Utilidad de las bacterias

promotoras del crecimiento y fijadoras de nitrógeno en el

cultivo del arroz durante las primeras etapas del desarrollo.

Depto. Biología Aplicada y Alimentos, Facultad de

Agronomía. Universidad de Buenos Aires.

- CABALLERO MELLADO, Jesús. (2001). El género Azospirillum.

Programa de Ecología Molecular y Microbiana, Centro de

Investigación sobre Fijación de Nitrógeno, UNAM. México.

- LABANDERA, C. y otros (2002) Aislamiento y caracterización

de microorganismos fijadores de nitrógeno en plantas de

avena y arroz. CONICYT-BID. INIA.

- M. da Silva Brasil y Divan Baldani, V. L. (1999). Efeitos da inoculação

de bactérias diazotróficas em gramíneas forrageiras do Pantanal.

EMBRAPA Agrobiología. Brasil.

- SOLEDAD DACCARO, Betina y otros (2002). Inoculación con

Azospirillum brasilense en el Cultivo de Maíz. Area de

Microbiología Agrícola U.N.L.