PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. GENERALIDADES

1. TÍTULO:

Optimización de la producción de jarabe de glucosa a partir de almidón de

achira (Canna edulis Ker) variedad morada mediante Bialfa T y Glucozyme,

aplicando el método de superficie de respuesta.

2. PERSONAL INVESTIGADOR

2.1 AUTOR: Samuel Ebert Villarreal Bermudez. Egresado de la Escuela de

Ingeniería Agroindustrial de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la

Universidad Nacional de Trujillo.

2.2 ASESOR: Rodolfo Vegas Niño. Profesor adscrito a la Sede

Descentralizada de Huamachuco de la Universidad Nacional de Trujillo.

2.3 CO-ASESOR: Daniel Salvador Rodríguez. Profesor adscrito a la Sede

Descentralizada de Huamachuco de la Universidad Nacional de Trujillo

3. TIPO DE INVESTIGACIÓN

3.1 DE ACUERDO A LA ORIENTACIÓN:

Aplicada

3.2 DE ACUERDO A LA TÉCNICA DE CONTRASTACIÓN:

Experimental

4. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN:

Libre

5. SECCIÓN A LA QUE PERTENECE EL PROYECTO:

Escuela de Ingeniería Agroindustrial de la Facultad de Ciencias

Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo.

1

6. LOCALIDAD E INSTITUCIÓN DONDE SE REALIZARÁ EL

PROYECTO:

Universidad Nacional de Trujillo – Laboratorio Multifuncional – Sede

Descentralizada de Huamachuco – Av. Inca Garcilazo de la Vega 375

(Huamachuco)

Universidad Nacional de Trujillo – Laboratorio de Ingeniería Agroindustrial

Facultad de Ciencias Agropecuarias – Av. Juan Pablo II s/n. (Trujillo)

7. FECHA DE INICIO Y TÉRMINO:

7.1 FECHA DE INICIO : 15/03/10

7.2 FECHA DE TÉRMINO: 25/10/10

8. CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN DEL PROYECTO

En la Tabla 1 se presenta el cronograma de ejecución del proyecto.

Tabla 1: Cronograma de ejecución

ActividadesMESES

 1 2 3 4 5 6 7 8

Recopilación de información

X

Revisión de información XElaboración del proyecto X XPrueba experimental X XAnálisis de resultados X XPreparación y corrección de tesis

X X

Sustentación de tesis X

Semanas: 32

Horas/semana: 192

Total de horas: 6144

9. RECURSOS

2

9.1 RECURSOS DISPONIBLES

a) LOCALES:

El proyecto será ejecutado en las instalaciones del laboratorio

multifuncional de la UNT – Sede Descentralizada de Huamachuco,

laboratorio de Tecnología de Productos Agroindustriales de la Facultad

de Ciencias Agropecuarias y en los Laboratorios de la Facultad de

Ingeniería Química.

b) MATERIALES Y EQUIPOS

Materia prima: Almidón de achira variedad morada, extraída de los

rizomas del cultivo de achira (Canna edulis Ker), proveniente de la

serranía Liberteña, provincia de Sánchez Carrión, distrito

Sartimbamba.

Material enzimático: Enzima amilolítica liquida Bialfa T y enzima

amiloglucosidasa Glucozyme adquiridas de BIOCON (España).

Material de reacción:

Acido clorhídrico 1N

Glucosa anhidra

Hidróxido de sodio 1N

Hipoclorito de sodio

Licor de Fheling A

Licor de Fheling B

Sulfato de cobre

Azul de metileno

Fenolftaleina

EDTA u Oxalato de sodio

Agua destilada.

Materiales de laboratorio

3

Frascos de vidrio con tapa rosca 250 ml (140ºC)

Vasos de precipitación de 50, 500 y 1000 ml

Matraz de Erlenmeyer 250 ml

Buretas de 50 ml

Pipetas graduadas de 1, 2, 5 y10 ml y pipetas Pasteur

Fiolas de 50, 100 y 250 ml

Tubos de ensayo de 10 ml

Placa de Petri

Embudo de vidrio

Pisetas

Papel filtro

Equipos e instrumentos:

Balanza analítica marca RADWAG (± 0.0001)

Autoclave eléctrico capacidad de 50 L, marca FRAVIL

Estufa ECOCELL (hasta 250 ºC)

pH – metro digital INOLAB 720 SET marca WTW

Termómetros de mercurio (0-100 ºC)

Baño María marca LAUDA 30-95°C ± 0.2ºC

Refrigeradora marca COLDEX (hasta -10ºC)

Congeladora marca COLDEX (hasta -40ºC)

Centrifuga marca Hettich EBA20 (hasta 6.000 min-1)

Cocina eléctrica

Licuadora marca OSTER modelo 4655-50 (600 watts)

Material bibliográfico.- Libros, tesis, revistas científicas, internet.

C. Humanos

Tesista: Samuel Ebert Villarreal Bermudez

Asesor: Rodolfo Moisés Vegas Niño

Co-asesor: Daniel Salvador Rodriguez

10. PRESUPUESTO

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En la Tabla 2 se presenta la relación de recursos no disponibles para la ejecución de

este trabajo de investigación.

Tabla 2: RECURSOS NO DISPONIBLES

Material Unidad CantidadCosto

unitario (S/)Costo total

(S/)A. Gastos de experimentación        Rizomas de achira variedad morada kg 15 0,5 7,5Enzima Bialfa T ml 30 4 120Enzima Glucozyme ml 30 4 120Acido clorhídrico 1N ml 160 60 60Agua destilada L 25 1 25Azul de metileno al 1% ml 15 5 5Sulfato de cobre g 30 8 8Fenoltaleina ml 100 23 23Glucosa anhidra g 100 2 2Hidróxido de sodio 1N g 500 37,5 37,5Licor de Fheling A ml 160 45 45Licor de Fheling B ml 160 30 30Hipoclorito de sodio ml 150 1 1 EDTA  ml 150   15 15 Campana de incubación Unidad 3 50 150

Sub - total       589B. Material de escritorio        Papel bond A4 millar 4 25 100Lapiceros Unidad 4 1 4Cuadernos Unidad 1 2,5 2,5Fólder Unidad 6 0,5 3Resaltador Unidad 2 3 6Corrector Unidad 1 4,5 4,5CD-ROM Unidad 4 4 16Tinta de impresión negro/color Caja 3 45 135

sub- total       264C. Otros servicios        Internet Horas 350 1 350Copias Unidad 1000 0,05 50Escaneos Unidad 35 1 35Costo de envió       240Movilidad local       300Compra de información       100Anillado Unidad 3 5 15Empastado Unidad 3 8 24

Sub-total       1114Total       1967

11. FINANCIAMIENTO:

Financiamiento propio

II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

5

2.1 ANTECEDENTES

La hidrólisis enzimática de almidón es importante en la industria alimentaria por los

efectos fisicoquímicos y organolépticos que produce. Permite una disminución de la

viscosidad, mejora de la filtrabilidad, disminuye la tendencia a la cristalización,

clarificación y estabilización de los líquidos con vistas a su conservación, mejora en la

fermentabilidad, mejora de la estabilidad bacteriológica, mejora de la textura, aumento

del poder edulcorante entre otros (Wiseman, 1991).

La hidrólisis de almidón de yuca mediante acción enzimática es uno de los procesos

más estudiados. Díaz y col. (2000) estudiaron la acción de α-amilasa proveniente de una

cepa genéticamente modificada de Bacillus licheniformis. Las variables a analizadas

fueron: temperatura (80-90 °C), pH (5,5-6,5), concentración de almidón (30-40% p/p),

relación enzima-sustrato (0,583- 0,833 µl/g almidón) y la concentración de cofactor (50-

70 mg/l de CaCl2). Se obtuvo un equivalente de dextrosa (DE) hasta de 30 a las mejores

condiciones de trabajo. De todas las variables estudiadas, la temperatura y la

concentración de almidón tuvieron una mayor incidencia en las propiedades funcionales

de la maltodextrina.

Estudios de hidrólisis de torta de yuca (Manihot esculenta Crantz) y umarí (Poraqueiba

sericea Tulasne) han sido realizados utilizando enzimas comerciales alfa-amilasa

Fungamyl 5000 BG, proveniente de Aspergillus oryzae y amiloglucosidasa AMG 300 L

de Aspergillus níger. En el proceso hidrolítico se obtuvo productos con mayor

Equivalente de Dextrosa (ED) a una concentración de torta al 6% (p/p), tratamiento

térmico a 75ºC por 5 minutos, concentración de alfa amilasa de 0.1% p/p referida a la

torta. La acción de la amiloglucosidasa posterior a la alfa-amilasa demostró un aumento

del valor de ED, teniendo para la yuca un valor de 38.7 y para el umarí 37.7, a una

concentración para ambas enzimas de 0.1% p/p de la torta por 60 minutos (Paredes y

Vasquez, 2001).

6

Mera y Carrera (2005) también realizaron estudios de hidrólisis de almidón de yuca

empleando como medio enzimático, alfa-amilasa BAN 480 de Bacillus

amyloliquefaciens y amiloglucosidasa AMG 300 L proveniente de Aspergillus níger.

Después de realizado la hidrólisis el jarabe se filtró y fue sometido a concentración a

85ºC por 5 minutos obteniéndose un producto con un valor de Dextrosa Equivalente

(DE) cercano a 90% .

Otro de los almidones que han sido estudiados para la obtención de jarabe es el camote

(Ipomoea batata L.). Enzimas como la amilasa de Bacillus lichiniformis, Termamyl LC

y amiloglucosidasa de Aspergillus níger, AMG-E provenientes de Novozymes han sido

aplicados sobre este tipo de sustratos. Se determinó que para una eficiente hidrólisis de

la cadena de almidón se debe trabajar a concentraciones de sustrato del 5 % (p/p). Para

la enzima Termamyl se recomienda dosificaciones de enzima de 450 mg por cada kg de

almidón. En el caso de amiloglucosidasa (AMG-E) se recomienda una relación de

0.45 L por cada kg de hidrolizado (Chávez, 2002).

Si bien es cierto la acción de un medio buffer ayuda a tener una acción hidrolitica más

estable al accionar de la enzima. Yoshishige y col. (2000) comprobaron que no es

necesariamente estricto. Evaluaron la capacidad hidrolítica de glucozyme DB sobre el

alimidón de trigo, encontrando que a condiciones de pH 5 por adición de HCl,

temperatura de 60 ºC durante un periodo de 5 h tienen los mismos efectos que un medio

buffer.

El sinergismo de la acciòn de dos enzimas para la hidrólisis total de la cadena de

almidón ha siendo utilizada en trabajos de investigación. Asi lo demuestra los estudios

de Kolpakova y col. (2009) quienes evaluaron la acción de Thermamyl 120L y

Glucozyme L400 en la degradación del almidón de grano de arroz. Los parámetros

evaluados para Thermamyl 120 L fueron: relación enzima/sustrato de 0.006 – 0.16

unidades por gramo de almidón, temperatura de incubación de 80-90 ºC por un tiempo

de 1.5 – 2.5h. Posteriormente se incorporó la enzima AMG (Glucozyme L400)

evaluando los intervalos de pH 4.3–4.6 durante 2.5–3 h., a una relación enzima/sustrato

de 4-6 unidades por gramo de almidón. La función de Termamyl es la de la degradación

parcial de almidón a maltosas, pero no reduce a monomeros, sin embargo Glucozyme

rompe los enlaces 1-4 y 1-6 de la cadena del almidón (Hiroto y col, 1998).

7

La aplicación de amilasas y glucoamilasas también han sido probadas en la hidrólisis

del grano de trigo (Triticum aestivum). La relación liquido:sustrato de 5:1 fué sometida

a 90 ºC con el propósito de gelatinizar el almidón para posteriormente adicionar de

amilasa a 60ºC por 2 h. Transcurrido el tiempo de la primera enzima se adicionó la

AMG (Glucozyme), a 55 ºC por 14 h logrando la hidrólisis total de la cadena de

oligosacaridos (Vadehra yDharamvir, 1986).

El tratamiento de gelatinización también fue realizado para el almidón de camote.

Temperaturas cercanas a 100ºC produce la lixiviación de la amilosa, siendo los gránulos

más grandes los que primero gelatinizan. La dosificación de Thermamyl 60 L a una

relación enzima/sustrato de 0.75g por cada 16 kg. de almidón gelatinizado a 80 ºC por

30 min y la posterior intervención de Glucozyme F6 con una dosificación de 9.4 g a

55ºC complemento el proceso de sacarificación (General Intitute for Developing New

Energy, 1983).

Otro ejemplo de sinergismo enzimático se reporta en el estudio de obtención de bebidas

a base de arroz. Miwako y col, 1993 evaluarón la acción de amilasa AD y Glucozyme

F6 estableciendo valores óptimos para la primera enzima de temperatura y tiempo de 90

ºC por 30 minutos. Posteriormente se evaluó la acción de Glucozyme F6,

estableciendose condiciones idoneas a pH 5, temperatura de 55 ºC y tiempo de 1 h.

La acción en serie de enzimas amilolíticas y glucoamilasas también queda demostrado

en estudios como los realizados por Vasquez y col, (2009) quienes evaluaron la

hidrólisis de almidón de papa (Solanum tuberosum). Demostraron que no es

recomedable la acción individual de ambas enzimas debido a que independientemente

logran rendimientos de degradación bajos y similares a 0.42 g de glucosa/g de almidón.

Sin embargo, la acción en serie de ambas enzimas pueden llegar a rendimientos de 0.82

g/g.

Dentro de las técnicas analíticas que permiten cuantificar la presencia de glucosa en un

medio con almidón es la cromatografía de exclusión por tamaño molecular (HPLC-

SEC). Ensayos llevados a cabo por Yasuyuki y col, (1987) asi lo demuestran. La acción

de enzimas amiloglucosidasas como Glucozyme 6000 han sido utilizadas para la

degradación de almidón de trigo a 50 ºC por 72 h.

8

2.2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.2.1 ACHIRA

La achira pertenece a la familia de las Cannáceas. La planta presenta raíces

pequeñas de color blanco y de forma cilindrica sobre los rizomas. El tamaño de los

rizomas en pleno desarrollo fluctúa entre 5 a 15 cm de largo y de 4 a 10 cm de

ancho (Figura 1). Taxonomicamente la achira se clasifica de la siguiente manera

(Tabla 3):

Tabla 3: Clasificación taxonomía de la achira

Reino: VegetalSubreino: FanerogamasDivisión: Angiospermae.Clase: Monocotiledoneas.Orden: ScitamidalesFamilia: CannaceaeGénero: CannaEspecie: Canna edulis, Ker.

Fuente: Rodríguez y col. (2003)

Figura 1: Rizoma de achira (Canna edulis. Ker)

Evidencias arqueológicas no dejan duda de que esta planta tuvo su origen en el

área andina entre Colombia y Perú. En Huaca Prieta de Chicama (La Libertad) se

encontraron rizomas secos pertenecientes al nivel precerámico temprano.

Asimismo se encontraron vasijas moldeadas con forma de rizomas pertenecientes

a la cultura Chimú (Caicedo y col., 2003).

9

La achira es una planta que aporta múltiples beneficios para el ambiente y el

hombre, proporciona al suelo un promedio de 21 toneladas por hectárea de

biomasa al momento de la cosecha, conformada por las hojas, tallos y otras partes

vegetal contribuyendo a enriquecer y mejorar su fertilidad, estructura y textura. El

Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias de Quito (Ecuador)

determinó la composición de la achira considerando los siguientes intervalos:

materia seca (13,55 - 22,93%), proteína (2,61-8,17%), almidón (43,55-66,06%),

azúcares totales (1,96-10,89%) y azúcares reductores (1,21-10,53%). El intervalo

en los porcentajes se debe a la variedad de achira, las actividades agronómicas asi

como las condiciones edafoclimáticas. Se han realizado estudios en que el mayor

contenido en sólidos de achira es aquella que se cultiva en zonas de baja humedad

relativa (INIA, 1997a).

La achira no constituye fuentes ricas de saponinas triterpenoidales ni alcaloides

como sucede con quinua, alfalfa y soya. En comparación con ciertas raices

andinas como la mashua y la jicama, en la achira hay ausencia de compuestos

fenólicos (como taninos y compuestos polihidroxifenolicos) los cuales causan

empardeamiento en los alimentos; sin embargo hay presencia de polifenoloxidasa.

Estudios fitoquimicos hacen notar un abundante contenido de sesquiterpelactonas

de importancia por su accion citotoxica, antitumoral y analgésica (INIA,1997b).

En la Tabla 4 se presenta la composición promedio a nivel de componentes

macroestructirales de la achira.

Tabla 4: Composición de la achira por cada 100 g

Fuente:

Moreno, 2006

Componentes Cantidad ( base seca)

Agua 70 gCarbohidratos 25.7 gFibra 0.8 gCalorías 126 gCalcio 35 mgFósforo 33 mgProteínas 2.7 gLípidos 0.1 gAlmidón 16 gVitamina A 8 mgHierro 9.3 mg

10

Entre los aminoácidos, cabe destacar la presencia de fenilalanina y tirosina. En menor

proporción están presentes la isoleucina, valina, treonina y leucina. Valores

cuantitativos de dichos aminoácidos se detallan en la Tabla 5.

Tabla 5: Valores cuantitativos de aminoácidos presentes en la achira

AminoácidosPatrón

(mg/g proteína) AchiraHistidina 19 58,42Isoleucina 28 84,64Leucina 66 59,64Lisina 58 44,65Metionina + cisteina 25 2,96Fenilanina + tirosina 63 104Treonina 34 81,47Triptofano 11  Valina 35 84,28

Fuente: Espin, 1999

Entre los minerales cabe destacar la presencia de potasio. En menor proporción están

presentes el magnesio, fósforo, calcio y sodio. Componentes esenciales para fortalecer

los huesos (Espin, 1999)

2.2.2 ALMIDÓN DE ACHIRA

Canna edulis Ker es ampliamente cultivada en Sudamerica, Taiwan, Vietnam, Thailand

y China. El rizoma seco contiene un 70–80% de almidón, el cual es una materia prima

potencial para la producción industrial de almidón (Zhang y col., 2009)

El almidón de achira es de forma ovoide, de gran tamaño, de apariencia transparente y

sin coloración propia. Dentro de la diversidad de almidones, el de achira se identifica

con mayor facilidad por su considerable rapidez de sedimentación, proporcionada

principalmente por el mayor diámetro de partícula (Coca, 1998).

11

Los parámetros indicadores de la pureza y calidad del almidón de achira están

representados por tiempo de sedimentación de 6.2-16.5 minutos, tamaño de partícula

por granulometría 38 µm -75 µm y por microscopía 33.9 µm -97.6 µm, densidad 0.63 -

0.71g/cm3 y pH de 5.5 -6.2 (Arias y García, 1998).

El almidón de achira (Canna edulis ker) tiene mejores propiedades fisicoquímicas y

resiste más a los procesos estresantes (propios de los procesos industriales) que los

almidones provenientes del maíz o del trigo (CIAT, 1993).

Aprovechamiento del almidón de achira

En la industria alimenticia el almidón de achira es consumido como biscochuelos,

panecillos, como espesante en sopas instantáneas y coladas para niños, en la industria de

productos enlatados, en la elaboración de salsas, como relleno en productos dietéticos y

en la elaboración de gomas dulces. En la industria farmacéutica es muy utilizado como

rellenos en la elaboración de medicinas en pastillas. En la industria textil para lograr

adhesión de las fibras que constituyen las prendas. En la industria papelera y de

adhesivos, el almidón de achira no presenta toxicidad y no es obstáculo para el reciclaje

de papel (Fairlie, 1999).

En Colombia hay empresas agroindustriales que ya aprovechan el almidón de achira

como sucedáneo del trigo especialmente en las regiones de Tolima y Cundinamarca

(Caicedo, 2003).

a) Morfología y estructuración de los granos de almidón

El almidón (C6H10H5)n es uno de los más importantes carbohidratos presentes en la

naturaleza (Peat, 1954), es una mezcla de dos polímeros de glucosa: la amilosa que es

esencialmente lineal, unida a través de uniones (1,4)-α-D-glucosidasa y conformada

entre 200-2500 unidades de glucosa y la amilopectina, consistente en cadenas lineales

ramificadas unidas por enlaces 1,6-α-D-glucosidasa (Swinkels, 1985).

12

En su forma natural, el almidón está presente como partículas discretas llamadas

gránulos, las cuales tienen regiones amorfas y cristalinas en su estructura. El

calentamiento del almidón en agua ayuda a disolver su estructura granular

(gelatinización) y permite desintegrar los gránulos causando que el polímero sea

accesible al ataque enzimático.

La relación amilosa/amilopectina, el tamaño y la forma de los gránulos de almidón

depende de la fuente botánica. El almidón de trigo contiene 25% de amilosa y 75% de

amilopectina, y los gránulos (5-40 um) presentan una distribución bimodal.

La amilopectina constituye alrededor del 75% de los almidones más comunes. Algunos

almidones están constituidos exclusivamente por amilopectina y son conocidos como

céreos. La amilopectina de papa es la única que posee en su molécula grupos éster

fosfato, unidos más frecuentemente en una posición O-6, mientras que el tercio restante

lo hace en posición O-3.

La achira produce los gránulos de almidón mas grandes (30-100 micras de diámetro)

comparado con especies vegetales conocidas como maíz, trigo, yuca y papa, las cuales

presentan entre 10-30 micras de diámetro. Por esta razón es digerido fácilmente por el

organismo; además de ser resistente a la esterilización. El almidón de achira tiene

mejores propiedades fisicoquímicas y resiste más a los procesos estresantes (propios de

los procesos industriales) que los almidones provenientes de otras fuentes como el de

maíz y trigo (CIAT, 1993).

b) Hidrólisis de almidón

Los almidones se convierten con facilidad en azúcares reductores mediante una

hidrólisis, ya sea por calentamiento con ácido, base o por acción enzimática (Kirk y col.,

2000). En la hidrólisis de almidón por medio ácido (HCl o H2SO4) se corre el riesgo de

generar productos de degradación tales como furfural o hidroximetilfurfural debido a la

intensidad del tratamiento. Ante ello se prefiere el uso de enzimas debido a su acción

específica, alta pureza y mayor eficiencia (Kearsley y Dziedzic, 1995).

13

La hidrólisis de almidón consiste en la adición de agua a los enlaces glucosidicos para

producir jarabe de glucosa, la cual está conformada por D-glucosa, maltosa y otros

polímeros de glucosa que tienen un amplio uso en la industria. El grado de hidrólisis en

el jarabe es medido por el Equivalente de Dextrosa (DE), la cual es una medida del

poder reductor de derivados de polisacáridos/oligosacáridos comparado con la D-

glucosa sobre una base de peso seco (Kearsley y Dziedzic, 1995).

El grado de hidrólisis enzimática del almidón es fuertemente afectada si el almidón esta

como materia prima o gelatinizada, tal como ha sido observado en el almidones

provenientes de guisantes, maíz, trigo y papa (Godon, 1994). El proceso de hidrólisis

enzimática comprende 3 etapas sucesivas cuando se trata de materiales amiláceos:

gelatinizacion, licuefacción y sacarificación. La primera consiste en un calentamiento

progresivo de la suspensión de almidón para romper puente de hidrogeno de las

regiones cristalinas y conseguir un hinchamiento de los gránulos de almidón por

absorción de agua, estado en que se tornan susceptibles al ataque mecánico, químico y

biológico. En la licuefacción se efectúa una hidrólisis parcial y finalmente; en la

sacarificación, se completa la hidrólisis hasta obtener un jarabe de glucosa (Keim,

1983).

c) Enzimas que degradan la cadena de almidón.

Las alfa-amilasas

Este tipo de enzimas lo producen microorganismos como Bacillus acido aldaricuas, B.

amyloliquefaciences, B. caldoliticus, B. cuagulanas, B. lichiniformis, B.

stearothermofilus, Bacteroides amylophilus, Clostridium acetobulicum, Lactobacillus

amylophilus, Micrococcus halobtus.

La alfa 1,4-D-glucan glucano-hidrolasa hidroliza los enlaces glucosídicos alfa-1,4 de los

polisacáridos que poseen 3 o más unidades de D-glucosa en unión alfa-1,4. El ataque se

hace en forma no selectiva sobre varios puntos de la cadena simultáneamente, aunque

los primeros productos de la hidrólisis son siempre oligosacaridos de 5-7 unidades de

glucosa, o un número múltiplo. Dependiendo del tiempo de contacto se obtiene como

producto de esta reacción un conjunto de oligosacaridos variados, en parte ramificados,

14

denominados dextrinas, de peso molecular variable. Si se prosigue la reacción las

cadenas rectas se acaban convirtiendo en maltosa y maltotriosa (Braverman, 1980).

Bialfa-T es una enzima amilolítica líquida (EC. 3.2.1.1) producida por fermentación

sumergida de Bacillus licheniformis. Esta enzima hidroliza la cadena de almidón

produciendo dextrinas solubles y oligosacaridos. Es una enzima de calidad alimentaria

debido a que cumple con los requisitos del Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en

Aditivos Alimentarios (JECFA) y con el Código de Productos Químicos Alimentarios

(FCC).

Bialfa-T actúa bien a niveles bajos de pH, es muy activa entre pH 5 y 7. Es una enzima

termoestable, su actividad aumenta con la temperatura y alcanza un máximo en el

intervalo de 95-105ºC. En el caso concreto del uso para licuación de almidón, un pH de

5.5 es compatible con temperaturas tan altas como 108ºC durante cortos periodos. Es

conocido que la presencia de ciertos cofactores ayudan a la acción de la enzima. Bialfa-

T contiene calcio fuertemente ligado; pequeñas cantidades adicionales de calcio

estabilizan aún mejor la enzima a temperaturas superiores a 60ºC. Concentraciones de

calcio de 30 a 75 ppm son adecuadas para el uso de la enzima a temperaturas de hasta

110ºC (Biocon, 2008).

La concentración de almidón, expresado como materia seca, en un orden del 20-40% no

tienen especial efecto en la estabilidad de la Bialfa-T, sin embargo por debajo del 20%

la estabilidad de la enzima se ve afectada. Actualmente es utilizada en la producción de

jarabes, cerveceria y destilerias. Las dosificaciones recomendadas es de 0.5 a 1.0 g de

Bialfa-T por kilogramo de almidón (Biocon, 2008).

La amiloglucosidasa

La alfa-1,4-D-glucan glucohidrolasa es una exohidrolasa también conocida como

glucoamilasa, que hidroliza los enlaces glucosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6 de la amilosa y

la amilopectina separando unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la

cadena (Braverman, 1980).

15

Las β-glucoamilasas de Aspergillus níger es una glicoproteína (peso molecular 97 000)

cuya actividad óptima se manifiesta a un pH de 5 (Robinson, 1991). La actividad

hidrolítica de esta enzima se encuentra entre 48 a 72 horas, a tiempos superiores se logra

la estabilidad del proceso y hace indispensable la inactivación de la enzima (Quintero,

1998).

Glucozyme es un enzima amiloglucosidasa (E.C. 3.2.1.3) producido por la fermentación

de una cepa seleccionada de Aspergillus niger. La enzima cataliza la liberación de

sucesivas unidades de glucosa a partir del final de las cadenas de almidón licuado. La

preparación enzimática se caracteriza por tener un nivel muy bajo de actividad

proteinasa y cumple las especificaciones de la JECFA y la FCC, siendo un enzima de

calidad alimentaria (Biocon, 2008).

En ensayos llevados a cabo a 60ºC y a diferentes pHs, Glucozyme tiene un óptimo de

actividad a pH 4,7; sin embargo la enzima puede trabajar en el intervalo de 3,5-6,0. Los

ensayos efectuados a pH 4,3 y a diferentes temperaturas muestran una actividad óptima

a 65-70ºC ;sin embargo para períodos prolongados se recomienda una incubación a

60ºC. Dosificaciones recomendadas para procesos de sacarificación de almidón

dextrinificado para la obtención de jarabes o etanol son 0.5 a 1.0 g por kilogramo de

materia seca de sustrato (Biocon, 2008).

c) Conversión de almidón a glucosa

La producción del jarabe de glucosa a partir de almidón por medio de procesos

enzimáticos involucra tres etapas (Mera y col, 2003):

La gelatinización son las modificaciones que ocurren cuando los gránulos de almidón

se trata con calor y en medio acuoso. Se caracteriza por el hinchamiento de los gránulos

por absorción del agua desapareciendo la estructura cristalina de la amilopectina y

formandose una pasta (pasta de almidón) que tiene una elevada viscosidad. Si se sigue

calentando, llega un punto en el que los gránulos se fragmentan disminuyendo la

viscosidad drásticamente. Agitar la mezcla contribuye a que se fragmenten los gránulos.

Posteriormente tiene lugar la formación del gel o gelificación, el cual se forma por

16

puentes de hidrógeno entre las moléculas de amilosa y amilopectinas desenrolladas

dejando espacios en donde queda agua atrapada (Sevilla, 2005).

La licuefacción, se inicia con la gelatinización de la materia prima la cual entra en

contacto con una amilasa que puede provenir de los géneros Bacillus o Penicillun que a

una temperatura de 35 ºC y un pH próximo a 7 rompe los enlaces L-D del almidón

dando lugar a las dextrinas solubles (Frazier y Westhoff, 1993).

El desarrollo de amilasas termoestables han permitido mejorar la eficiencia del proceso

de licuefacción. Importantes avances de la tecnología del DNA recombinante para la

producción de enzimas industriales de este tipo permiten aumentar sus actividades

catalíticas y capacidad de operar a mayores temperaturas (Rutz y Janssen, 2007).

La sacarificación, se realiza utilizando como catalizador la glucoamilasa o pululanasa,

asi como una mezcla de enzimas, teniendo como sustrato dextrinas y como producto

final glucosa libre. La sacarificación puede llevarse a cabo a temperaturas bajas

(alrededor de 30ºC) siempre y cuando se trabaje con materiales y aparatos

perfectamente estériles. Por lo general, es mas conveniente trabajar a temperaturas entre

los 50–55 ºC debido a una mayor celeridad del proceso y menor probabilidad de

desarrollo de microorganismos mesófilos (Frazier y Westhoff, 1993).

2.2.3 JARABE DE GLUCOSA

La industria de los hidrolizados de almidón es una de las mayores potencialidades en el

campo de los productos alimenticios. Dada la amplia gama de productos que pueden

obtenerse a partir de esta materia prima, entre las cuales se tiene a las mermeladas,

caramelos, fruta confitada, almíbares para frutas en conservas, pastelería, helados,

compotas, jaleas y refrescos. No sólo la industria alimenticia es destinataria de los

diferentes jarabes o productos a partir del almidón, sino que otros procesos requieren en

buena medida de los mismos, y puede citarse como ejemplo la producción de sorbitol

para fines de producción de medicamentos. La glucosa neutraliza la insulina en las

personas diabéticas y es útil en el tratamiento de la obesidad. El jarabe de glucosa tiene

ventajas sobre la sacarosa, es de digestión más fácil y un 50 por ciento más dulce

(González y col., 2002).

17

Un factor importante en la producción de jarabes es lo que se conoce como los grados

de conversión dextrosa equivalente (DE). El grado de conversión dextrosa equivalente

(DE) es una medida del porcentaje de enlaces glicosídicos (entre glucosas) que han sido

hidrolizados. Después del tratamiento de una suspensión con ácidos el jarabe resultante

tiene un grado DE de 40. Después de tratar ésta suspensión con alfa y beta amilasas se

obtiene jarabes de maltosa de grados DE de 70 aproximadamente y con la glucoamilasa

de 92-95. Mientras más alto es el DE mayor es el dulzor del jarabe ya que el mismo

tiene mayor contenido de glucosa libre. Si se quiere jarabes de mayor dulzor parte de la

glucosa tiene que ser convertida en fructosa, un azúcar simple mucho mas dulce que la

glucosa. Esta conversión se logra enzimáticamente usando la glucosa isomerasa

(Borneo, 2009).

III. JUSTIFICACION

Las raíces andinas son herencia de nuestros antepasados y actualmente en su gran

mayoría no son consumidas por los pobladores del Perú. Estos cultivos ofrecen una

serie de ventajas ecológicas, están adaptadas a zonas donde otras especies no prosperan,

son resistentes a plagas, sequía y salinidad del suelo. Su aprovechamiento y/o

transformación permitirá su revaloración logrando un mayor valor agregado y una

alternativa de trabajo, ejemplo de ello es la achira (Canna edulis Ker).

La revalorización de la achira pasa en parte por el aprovechamiento de su rizoma. Su

transformación puede ser empleada en el sector alimentario como: almidón, dulces,

gomas, bizcochos, mazamorras, panes, galletas, keques, fideos, entre los más

importantes. En el Continente Sudamericano, Colombia aprovecha la achira en la

industria de la panificación. Sin embargo puede tener otros alcances como en la

industria farmacéutica, la cual puede ser utilizada para revestimiento de cápsulas o

como aditivo en cosméticos y maquillajes. En tecnología poscosecha el almidón o

jarabe obtenido de este último, puede ser empleado como recubrimiento comestible en

frutas.

En el Perú, la achira esta presente en jardines con fines ornamentales. Se aprovecha sus

hojas como envoltura de tamales. Sus rizomas constituyen un residuo agrícola que hasta

el momento no tiene transformación alguna. La transformación de este subproducto en

18

la obtención de aditivos o ingredientes alimentarios traerá consigo un ahorro económico

debido a que constituye una materia prima de bajo coste.

La industria en general y no sólo la alimentaria, están obligadas a realizar procesos

respetuosos con el medio ambiente. Ante ello los procesos catalizados por enzimas

cumplen con dicho requisito, debido a que son biodegradables y han desplazado a

proceso hidrolíticos en el cual hacen uso de ácidos o bases. Una de las principales

ventajas de las enzimas está asociado a su gran especificidad de acción que hace que no

se produzcan reacciones laterales imprevistas. Asimismo se pueden trabajar en

condiciones moderadas de presión, temperaturas y pH.

El consumo de edulcorantes naturales en el mundo se ha incrementado en los últimos

años y ocupa un alto porcentaje en el mercado total. Aunque la sacarosa continúa siendo

el edulcorante de mayor preferencia a nivel mundial, existe una tendencia a su

sustitución por otros (jarabe de glucosa), sobre todo los provenientes de materias primas

naturales proporcionando el mismo sabor dulce con reducción en calorías, útiles en el

control del peso y la glucosa sanguínea.

El jarabe de glucosa tienen una gama muy amplia de propiedades, lo que les permite ser

usados tanto en la industria confitera como en la industria farmacéutica; estas

propiedades son, la viscosidad (formador de cuerpos), higroscoposidad (humectancia),

aumento del sabor (transferencia), dulzura (formación balanceada), presión osmótica

(acción preservante), coloide protector (estabilizador de espuma), adhesividad (acción

aglutinante), solubilidad (emulsificación) y apariencia (brillo). Dentro de los múltiples

usos se tiene la producción de caramelos, frutas confitadas, helados, mermeladas, y

almíbares para frutas en conservas.

El proyecto de investigación propone la obtención de jarabe de glucosa a partir de un

residuo agrícola como es el rizoma de la achira, materia prima predominante en la

Sierra Liberteña y cuyo estudio contribuirá a la revaloración de un producto autóctono,

generando valor agregado en la obtención de un aditivo alimentario. En resumen, se

busca transformar un pasivo agricola en un activo agroindustrial.

19

IV. PROBLEMA:

¿Cuál será la relación liquido/sustrato (5 - 20), relación enzima/sustrato (bialfa: 0.01-1

g/kg ms y glucozyme: 0.01-1 g/kg ms) y tiempo de reacción (menores a 72h) que

óptimice la hidrólisis de almidón de achira con Bialfa T y Glucozyme en la mayor

producción de jarabe de glucosa utilizando el método de superficie de respuesta ?

V. HIPOTESIS:

Una relación líquido/sustrato de 7/1, relación enzima sustrato de Bialfa: 0.5 g/kg ms y

Glucozyme: 0.5 g/kg ms y tiempo de reacción de 48 y 60 h para Bialfa y Glucozyme

respectivamente permitirá obtener la mayor producción de jarabe de glucosa a partir de

almidón de achira.

VI. OBJETIVOS

6.1 OBJETIVO GENERAL

Determinar por metodología de superficie de respuesta los niveles óptimos de las

variables relación líquido/sustrato, relación enzima/sustrato y tiempo de reacción

para la hidrólisis con Bialfa T y Glucozyme en la producción de jarabe de glucosa a

partir de almidón de achira

6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar el rendimiento de obtención de almidón a partir del rizoma de

achira.

Determinar el rendimiento de obtención de jarabe a partir de almidón de achira.

Evaluar el efecto de la relación líquido/sustrato, relación enzima/sustrato y

tiempo de hidrólisis de almidón de achira por Bialfa T y Glucozyme.

20

VII. MATERIALES Y METODOS:

7.1 MATERIALES

7.1.1 MATERIAL DE PROCESO:

Materia prima.- Almidón de achira variedad morada, extraída de los rizomas

del cultivo de achira (canna edulis), proveniente de la serranía Liberteña,

provincia de Sánchez Carrión, distrito Sartimbamba.

Material enzimático.-Enzima amilolítico liquido Bialfa T y enzima

amiloglucosidasa Glucozyme adquiridas de BIOCON.

Alfa-amilasa proveniente de Bacillus lichiniformis y las condiciones

recomendadas para esta enzima son 5-7 de pH y 95-105o C de temperatura

La glucoamilasa se obtiene por fermentación del Aspergillus niger y las

condiciones recomendadas de pH de 3.5-6.0 y 60o C de temperatura.

7.1.2 REACTIVOS

Acido clorhídrico 1N

Glucosa anhidra

Hidróxido de sodio 1N

Hipoclorito de sodio

Licor de Fheling A y B

Sulfato de cobre

Azul de metileno al 1%

Fenolftaleina

EDTA u oxalato de sodio

7.2 METODOLOGÍA

7.2.1 Metodología experimental

Determinación de azucares reductores (Anexo 1).

Determinación de contenido de humedad (Anexo 2).

Determinación de contenido en cenizas (Anexo 3).

Determinación de fibra cruda (Anexo 04).

Determinación de pH (Anexo 05).

21

7.2.2 Obtención de almidón de achira

En la Figura 2 se muestra el diagrama de flujo para la obtención de almidón de

achira (Canna edulis Ker).

Figura 2: Flujograma de procesamiento del almidón de achira

22

Rizomas de achira

Clasificación

Lavado

Pelado

Sedimentado

Lavado

Almidón

Secado

Licuado

Eliminación de partículas: arena y tierra

Eliminación de afrecho

Eliminación de la cáscara

Eliminación de impurezas

Pudriciones

Molienda

Tamizado 2

Tamizado 1

Rizomas de achira

Clasificación

Lavado

Pelado

Sedimentado

Lavado

Almidón

Secado

Licuado

Eliminación de partículas: arena y tierra

Eliminación de afrecho

Eliminación de la cáscara

Eliminación de impurezas

Pudriciones

Molienda

Tamizado 2

Tamizado 1

Descripción del procesamiento del almidón de achira:

a) Clasificación: en esta etapa se seleccionará los rizomas que se encuentren en

perfecto estado sin ninguna parte en descomposición.

b) Lavado: en esta etapa se lavarán los rizomas con agua con el objeto de

eliminar las partículas de tierra y sustancias extrañas adheridas a su corteza.

Esta etapa se realizará eficientemente, debido a que la eliminación de la

arena es muy difícil de separar en otras operaciones del proceso y

pueden aparecer en el producto final siendo los precursores de un

color poco agradable. El lavado se realizará con agua proveniente

de la red pública hasta que los rizomas tengan un buen aspecto.

c) Pelado: en esta operación los rizomas serán pelados manualmente y sus

cáscaras eliminadas. La operación de pelado se realizará en solución de agua

con ácido cítrico al 0.1% p/p con el propósito de evitar el empardeamiento del

producto (Rodríguez y col., 2003)

d) Licuado: en esta operación los rizomas previamente pelados y cortados se

introducen a la licuadora con agua con la finalidad de liberar el almidón

presente en las células. La proporción en volumen de rizoma: agua será de 2:1.

e) Sedimentación: esta operación se realizará adicionando agua con la finalidad

de precipitar los gránulos de mayor tamaño, asi como eliminar cualquier

partícula extraña que se encuentre en suspensión. La proporción en volumen

de agua:almidon será de 3:1.

f) Tamizado 1: en esta etapa el almidón se pasará a través de una coladera

casera con la finalidad de eliminar residuos de fibra y trazás de cáscara.

g) Lavado: el agua en suspensión del paso anterior será eliminada, luego se

agregará nuevamente agua, esta operación se repite de 6 a 7 veces con la

finalidad de eliminar impurezas y obtener un almidón con mejores

condiciones.

h) Secado: Después del último lavado se realizará la operación de secado, para

eliminar parte de la humedad del almidón. El secado se realiza en exposición a

los rayos solares hasta llegar a una humedad final entre 8 a 10% en base

húmeda.

i) Molienda: el almidón secado en la etapa anterior pasa por una pequeña

molino tipo hélice, con el propósito de suavizarlo.

23

j) Tamizado 2: en esta etapa el almidón se pasará a través de un tamiz de malla

Nº 100 (Escala ASTM) con la finalidad de eliminar residuos de fibra y obtener

un producto morfologicamente homogéneo. Finalmente el almidón se pesará y

envasará en bolsas negras para su posterior uso, a fin de evitar la

contaminación por agentes ambientales y microbiológicos.

7.2.3 Obtención de glucosa a partir de almidón de achira En la Figura 3 se muestra el procesamiento jarabe de glucosa a partir de

almidón de achira.

Figura 3: Diagrama de flujo para la obtención de glucosa a partir de almidón de

achira (Canna edulis ker) mediante hidrólisis enzimática

Descripción del procesamiento jarabe de glucosa a partir de almidón de achira:

24

DILUCIÓN

GELATINIZACION

LICUEFACCIÓN

SACARIFICACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

FILTRACIÓN

ALMIDÓN

GLUCOSA

DILUCIÓN

GELATINIZACION

LICUEFACCIÓN

SACARIFICACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

FILTRACIÓN

ALMIDÓN

GLUCOSA

a) Dilución: En frascos de 250 ml de capacidad se introducirá agua destilada a pH

5.5 (obtenida con HCl) y almidón de achira. Se dispondrá la muestra logrando

tener relaciones líquido/sustrato (L/S) en el intervalo de 5 a 20 p/p teniendo en

consideración la humedad de la harina.

b) Gelatinizacíon: Esta etapa consiste en un calentamiento progresivo de la

suspensión con el propósito de romper los puentes de hidrógeno de las regiones

cristalinas de la cadena de almidón y conseguir un hinchamiento de los gránulos

por absorción de agua. Se realizará a 121 ºC por 10 min mediante autoclave,

logrando además la esterilización del medio permitiendo que las enzimas (las

que serán adicionadas posteriormente) tengan una mejor actividad sin tener que

competir con un microorganismo por el sustrato.

c) Licuefacción: Una vez terminada la etapa de gelatinización las muestras

previamente enfriadas y ajustandas a pH 5.5 se adicionará la enzima α-amilasa

(Bialfa T). Las recomendaciones de dosificación establecidas por el proveedor

establece en el intervalo de 0.5-1 kg de enzima por tonelada de almidón. La

muestra se someterá a incubación a temperatura de 95°C por un tiempo de 60 h

con agitación a 80 rpm. El producto de este tratamiento serán mayoritariamente

dextrinas, la cual será evaluada a lo largo de este periodo de tiempo.

d) Sacarificación: Determinada las condiciones óptimas de trabajo de Bialfa T se

proseguirá con la fase de sacarificación para lo cual se acondicionará el medio a

pH 4.7 por adición de HCl. Posteriormente se agregará la enzima glucoamilasa

(Glucozyme) teniendo en consideración las recomendaciones del proveedor, que

también coincide con los intervalos de Bialfa T: 0.5-1 kg de enzima por tonelada

de almidón.. Esta solución se incubará a temperatura de 60 ºC por un tiempo

límite de 72 h y a 80 rpm. El producto final mayoritariamente serán monómeros

de glucosa los cuales serán cuantificados a lo largo de este periodo de tiempo

e) Centrifugación: La solución de jarabe de glucosa obtenida será sometida a

centrifugación (2000 rpm x 10 minutos), con la finalidad de obtener dos fases,

un sobrenadante rico en jarabe de glucosa y la otra sólidos que no han sido

hidrolizados por acción de las enzimas.

f) Filtración: Se realizará con el propósito de retener por medio de papel de filtro

material resuspendido al momento de vaciar el contenido de los tubos de la

25

centrifuga. Al producto final se le medirá la cantidad de azúcares reductores y su

contenido en sólidos.

7.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

La secuencia experimental a seguir se muestra en la figura 4:

Donde:

L1/S1: Relación líquido sustrato (5 a 20 p/p).E1/S1: Relación enzima/sustrato (0.01-1 g Bialfa T/kg almidón).E2/S2: Relación enzima/sustrato (0.01-1 g Glucozyme /kg almidón).T1: Tiempo de reacción de Bialfa T (1 a 60 h)T2: Tiempo de reacción de Glucozyme (1 a 72 h)

Figura 4: Diseño experimental para la optimización en la obtención de jarabe de

glucosa a partir de almidón de achira.

26

DILUCIÓN

GELATINIZACIÓN

LICUEFACCI N

SACARIFICACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

FILTRACI N

ALMIDÓ

GLUCOSA

Ó

Ó

SACARIFICACIÓN

N

Ó

N

Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)

Controles:-Temperatura-Tiempo

Controles:-Relación de peso-pH

Evaluación: -Dextrosa Equivalente (DE)-Humedad-Cenizas-Fibra

Variable de Respuesta

Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)

Controles:-rpm-Tiempo

L1/S1

E1/S1

t1

E2/S2

t2

DILUCIÓN

GELATINIZACIÓN

LICUEFACCI N

SACARIFICACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

FILTRACI N

ALMIDÓ

GLUCOSA

Ó

Ó

SACARIFICACIÓN

N

Ó

N

DILUCIÓN

GELATINIZACIÓN

LICUEFACCI N

SACARIFICACIÓN

CENTRIFUGACIÓN

FILTRACI N

ALMIDÓ

GLUCOSA

Ó

Ó

SACARIFICACIÓN

N

Ó

N

Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)

Controles:-Temperatura-Tiempo

Controles:-Relación de peso-pH

Evaluación: -Dextrosa Equivalente (DE)-Humedad-Cenizas-Fibra

Variable de Respuesta

Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)

Controles:-rpm-Tiempo

Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)

Controles:-Temperatura-Tiempo

Controles:-Relación de peso-pH

Evaluación: -Dextrosa Equivalente (DE)-Humedad-Cenizas-Fibra

Variable de Respuesta

Controles: Temperatura, pH, agitación.Evaluación: Dextrosa Equivalente (DE)

Controles:-rpm-Tiempo

L1/S1

E1/S1

t1

E2/S2

t2

L1/S1

E1/S1

t1

E2/S2

t2

7.3 DISEÑO ESTADISTICO

La herramienta a utilizar es el método de superficie de respuesta (RSM). El

propósito inicial de esta técnica es diseñar un experimento que proporcione

valores razonables de la variable respuesta, para luego determinar el modelo

matemático que mejor se ajuste a los datos obtenidos estableciéndose los valores

de los factores que optimizen el valor de la variable respuesta.

En el experimento se eligió primero los factores o variables independientes.

Tanto Bialfa T como Glucozyme han sido estudiadas considerando como valores

óptimos de temperatura y pH: 95ºC, 5.5 y 60ºC, 4.7 para cada enzima

respectivamente; por tanto dichas variables quedan pre-establecidas (Biocon,

2003). Posteriormente se seleccionarón los intervalos de valores de cada factor,

los mismos que se muestran en la Tabla 6 y que han sido tomados en base a la

revisión bibliográfica.

Tabla 6: Variables e intervalos planteados en el modelo estadístico.

Variables independientes

Variables Intervalos

Primera etapa X1: Relación líquido sustrato. 5-20X2: Relación enzima sustrato (g Bialfa T/kg almidón)

0.01-1

X3: Tiempo de hidrólisis de Bialfa (h)

1-60

Segunda etapa X4: Relación enzima sustrato (g Glucozyme/kg almidón)

0.01-1

X5: Tiempo de hidrólisis de Glucozyme (h)

1-72

Variable dependiente (respuesta)

Y: Glucosa generada -

La forma de la función que determina la relación entre los factores y la variable

respuesta es, en general, desconocida, por lo que el primer objetivo de la RSM

consistirá en establecer experimentalmente una aproximación apropiada de la

función. Para ello, se propone un modelo de ecuación, generalmente polinómico,

en los “k” factores X1, X2, ..., Xk y se seleccionará un conjunto de tratamientos

sobre los que realizar las observaciones experimentales, las mismas que serán

27

utilizadas tanto para obtener estimaciones de los coeficientes en el modelo

propuesto (a través del método de mínimos cuadrados) como para obtener una

estimación de la variación del error experimental (se realizarán 2 observaciones

por cada tratamiento). Se realizarán, entonces, contrastes sobre las estimaciones

de los parámetros y sobre el ajuste del modelo y si el modelo se considera

adecuado.

Los polinomios que serán utilizados como funciones de aproximación son los de

órdenes uno y dos, que nos proporcionan, respectivamente los siguientes

modelos (Figueroa, 2003):

a) Un modelo de primer orden (lineal) sin interacciones o productos cruzados

b) El modelo lineal de primer orden con interacciones:

c) El modelo cuadrático o de segundo orden:

Donde ε representa el ruido o error observado en la respuesta

Se trabajará con un diseño experimental que comprende dos etapas. La primera,

que buscará la zona óptima en la fase de licuefacción por acción de Bialfa-T y

la segunda que comprende el proceso de hidrólisis por acción de Glucozyme.

Planteamiento Experimental:

A) Diseño experimental para la primera etapa de hidrólisis de almidón: la

28

licuefacción (acción de bialfa)

Se trabajará con un Diseño factorial 23+6 puntos axiales + 3 puntos centrales. Se

considerará como factores o variables independientes la relación liquido/sustrato

(L/S), la relación enzima/sustrato (E1/S1) y tiempo de hidrólisis (t1). En la

Tabla 7 se muestran los valores que serán utilizados en este planteamiento.

Tabla 7: Intervalo de los valores para cada nivel.

Nivel -1.68 -1 0 +1 +1.68

Relación E1/S1

(g bialfa /g materia seca)0.01 0.21 0.51 0.79 1

Relación L/S1 (g/g) 5 8 13 17 20

t1 (horas) 1 13 31 48 60

Para esta fase de la hidrólisis se tomará como variable respuesta la mayor

presencia de extremos reductores la cual será expresada como g glucosa /g

materia seca. La codificación de los factores se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8: Valores codificados máximos y mínimos de los factores.

Ensayo RelaciónE/S1 (g/g)

Relación L/S(g/g)

t1

(horas)Rendimiento

(g glucosa /g ms)

Código real Código real Código real1 -1 0.21 -1 8 -1 13 2 +1 0.79 +1 17 +1 483 -1 0.21 -1 8 -1 13 4 +1 0.79 +1 17 +1 48 5 -1 0.21 -1 8 -1 13 6 +1 0.79 +1 17 +1 487 -1 0.21 -1 8 -1 13 8 +1 0.79 +1 17 +1 489 -1.68 0.01 0 13 0 3110 +1.68 1 0 13 0 31

11 0 0.51 -1.68 5 0 31

12 0 0.51 +1.68 20 0 31

13 0 0.51 0 13 -1.68 1

14 0 0.51 0 13 +1.68 60

15 0 0.51 0 13 0 31

16 0 0.51 0 13 0 31

17 0 0.51 0 13 0 31

B) Diseño experimental para la segunda etapa de la hidrólisis del almidón:

la sacarificación (acción de glucoamilasa)

29

Se trabajará con un Diseño factorial 22+4 puntos axiales + 2 puntos centrales. Se

considerará como factores o variables independientes la relación enzima/sustrato

(E2/S2) y tiempo de reacción (t2). En la Tabla 9 se muestran los valores que serán

utilizados en este planteamiento.

Tabla 9: Intervalo de los valores para cada nivel.

Nivel -1.41 -1 0 +1 +1.41

Relación E2/S2

(glucoamilasa)0.01 0.15 0.51 0.86 1

t2 1 15 37 58 72

Para esta fase se tomará como variable respuesta la generación de monómeros de

glucosa, la cual será expresada como g glucosa /g materia seca y que constituye

el producto final, el jarabe de glucosa. La codificación de las variables

independientes se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10: Valores codificados máximos y mínimos de los factores

Ensayo Relación E/S2 (g/g)

t2

(Horas)Rendimiento

(g glucosa /g m.s)

Código real Código real1 -1 0.15 -1 152 +1 0.86 +1 583 -1 0.15 -1 154 +1 0.86 +1 585 -1.41 0.01 0 376 +1.41 1 0 377 0 0.51 -1.41 18 0 0.51 +1.41 729 0 0.51 0 3710 0 0.51 0 37

Validación experimental del modelo estadístico

Se tomarán valores óptimos y se realizarán tres experimentos. Los resultados

experimentales se compararán con el obtenido por el modelo estadístico.

Análisis de varianza (ANVA)

Para validar el modelo estadístico, se realizará un ANVA (Tabla 11) para las

respuestas y verificando si las variables son significativas (si p<0.05 o no si

30

p>0.05). Estos resultados indicarán la concordancia entre los valores

experimentales y previstos para el modelo.

Tabla 11: ANVA para la respuesta Y

Fuente de

variables

Grados

de

libertad

GL

Suma de

cuadrados

SQ

Media de

cuadrados

QM

F calc. p - valor

Regresión

lineal: RL k-1

QMRL/QMResResiduos:

Resn-k

Total n-1

En donde:

k : coeficiente de la regresión lineal.

n : número total de ensayos.

: respuesta estimada : respuesta de la media

VIII. BIBLIOGRAFIA:

31

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AGUDELO, I.; MONTENEGRO, J.; GURNI, A.; SCHIMPF, J. y VIGNALE, N. 2009. Análisis micrográfico de rizomas de Canna coccinea Mill. (Cannaceae). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, Vol. 8, Nº 4, pp. 312-316. Sociedad Latinoamericana de Fotoquímica, Chile.

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36

ANEXO 1

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES EN ALIMENTOS

(MÉTODO LANE EYLON)

FUNDAMENTO:

Este método se basa en determinar el volumen de la solución de prueba que se requiere

para precipitar totalmente todo el cobre presente en una cantidad de solución de Fheling

y se emplea en productos que contienen más del 10 % de azúcares reductores.

Equipos y materiales

Cocina eléctrica

Matraz Erlenmeyer de 100ml

Bureta de 50 ml

Fiolas de 100, 250 ml

Balanza analítica

Papel de filtro.

Reactivos

Solución de Fheling “A”

Solución de Fheling “B”

Glucosa anhidra

NaOH 20%

Azul metileno

HCl concentrado 6.35 N

Preparación de la muestra de azúcar

37

Se pesará 15 g de muestra problema en una fiola de 250 ml, luego se enrazará con agua

destilada, se agitará y posteriormente se filtrará en papel de filtro. El filtrado constituirá

la solución A.

Azúcares reductores iniciales

Se dispondrá la solución “A” en una bureta

Azucares totales

Se tomará de la solución “A” 10 ml y se dispondrá en una fiola de 100 ml.

Posteriormente se adicionará 10 ml de agua destilada y se mezclará suavemente.

Se adicionará 5 ml de HCl 6.35N.

Se colocará la muestra en baño Maria hasta una temperatura de 70 ºC.

Se adicionará 5 ml más del HCl 6.35 N.

Se retirará del baño María y se dejará reposar durante 30 min.

Se agregará 3-4 gotas de Fenoltaleina y se neutralizará con NaOH al 20 % hasta

viraje color rosado

Posteriormente se dejará enfriar y se aforará a 100 ml.

Titulación

Se dispondrá de 10 ml de solución de Fheling (5 ml de Fheling A y 5 ml Fheling

B) en un matraz

Se adicionará 15 ml de agua destilada, se mezclará y se llevará a ebullición por

2 min.

Transcurrido ese tiempo se adicionará 4 gotas de azul de metileno al 1% dando

una coloración azul.

Se titulará hasta viraje (color rojo ladrillo) y se anotará el gasto (si es menor a 15

ml se tomará menos cantidad de muestra de solución “A”).

Cálculos:

Azúcares reductores iniciales

38

G1 = gasto de la solución no hidrolizado (ml)

F = factor de azúcar reductor

W = peso inicial de muestra (g)

Azúcares reductores totales

W =peso inicial de muestra (g)

V = ml de alícuota tomada de solución “A”

G2 = gasto de solución hidrolizada

F = factor de azúcar reductor

DETERMINACIÓN DEL FACTOR DE FEHLING

Método

Se dispondrá 5 ml de solución Fheling A y 5 ml de solución

Fheling B en una fiola de 250 ml, añadiendo posteriormente 20

ml de agua destilada y algunas perlas de vidrio (por

triplicado).La solución preparada anteriormente llevar a

ebullición durante 2 min (recipiente 1).

En una bureta de 50 ml se añadirá una solución de glucosa al

0.5% p/p dejando caer dicha solución en el recipiente 1.

Se seguirá agregando pequeñas cantidades de solución de

glucosa hasta observar un precipitado rojo y el liquido

sobrenadante sea prácticamente incoloro.

39

Se tomará en cuenta el volumen de solución de glucosa

gastado en la titulación final y se calculará el titulo del licor de

Fehling expresado en mg. de glucosa anhidra.

Cálculos:

f = (ml de sol. Gastados * % sol. Glucosa * 10 ml de sol.

Fehling) / 1000

Como el titulo del licor de fehling (f) se realizará por triplicado, se

tomará el valor promedio de los valores obtenidos.

ANEXO 2

DETERMINACIÓN DE HUMEDAD (H)

FUNDAMENTO

Se determina por evaporación del agua de la muestra en estufa a 105 ºC hasta peso

constante. La desecación ha de hacerse a esta temperatura para evitar errores por

volatilización de componentes distintos al agua o por descomposición térmica de la

muestra. Los resultados se expresan en base húmeda.

Materiales

Material de vidrio de uso habitual en el laboratorio

Balanza analítica de 0.1 mg de precisión

Estufa a 105 ± 3 ºC

Desecador con silica gel, pinzas.

Procedimiento

Se pesará según la característica de la muestra, 1-2 g si las muestras son sólidas ó 4 g

para muestras líquidas en un recipiente de peso conocido, el cual se ha secado

previamente en la estufa hasta alcanzar peso constante. A continuación, se colocará el

recipiente con la muestra en la estufa durante 24 h. Posteriormente, con la ayuda de una

pinza se colocará la muestra en un desecador que contiene gel de sílice y se pesará.

40

Cálculos

El contenido en humedad (expresado como masa en gramos de agua por cada gramo de

muestra húmeda) se calculará de la siguiente forma:

Donde:

PRMH: peso del recipiente seco con la muestra húmeda inicial (g).

PRMS: peso del recipiente con la muestra seca (g).

PRS: peso del recipiente seco (g).

ANEXO 3

DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN CENIZAS (CC)

Fundamento

Gran parte de los productos alimenticios contiene cenizas que se determinan mediante

incineración a 575 ºC donde se calcina la materia orgánica. El producto resultante de la

incineración es materia inorgánica compuesta mayoritariamente por sales minerales.

Materiales

Mufla capaz de mantener 575 ºC

Balanza analítica de 0.1 mg de precisión

Desecador

Crisol de porcelana

Pinzas metálicas.

Procedimiento

En un crisol de peso conocido se colocará 5 g de muestra de humedad conocida. El

material será introducido previamente en una estufa a 100 ºC durante 24 h. Después se

llevará a un horno mufla a una temperatura de 200 ºC y se va subiendo poco a poco, a

intervalos de 100 ºC, hasta llegar a 575 ºC, donde se mantendrá a esta temperatura por

24 h. Transcurrido este tiempo, se retirará el crisol, se esperará a que se enfría en un

desecador con gel de sílice y se pesará.

41

Cálculos

El contenido en cenizas (CC) se expresará como gramos de cenizas en 100 g de muestra

en base seca.

Donde:

PRC: peso del crisol con cenizas (g)

PRS: peso del crisol seco (g)

PMH: peso de la muestra húmeda (g)

H: humedad

ANEXO 4

DETERMINACIÓN DE FIBRA CRUDA (AOAC, 1984)

Método gravimétrico, digestión ácida, alcalina e incineración de muestra

Fundamento

La fibra cruda es la pérdida de masa que corresponde a la incinerización del residuo

orgánico que queda después de la digestión con soluciones de ácido sulfúrico e

hidróxido de sodio en condiciones específicas. Es una medida del contenido de celulosa

y lignina en la muestra. El método es aplicable a granos, platos preparados, harinas,

alimentos para animales materiales que contienen fibra de los cuales la grasa ha sido

extraída para dejar un residuo adecuado o su contenido es mínimo.

Materiales

Aparato de calentamiento a reflujo

Balanza analítica

Crisoles de porcelana

Desecador

Dispositivo de succión al vacío

Embudo Büchner

Estufa a 103 ± 2ºC

Tamiz malla 1 mm

42

Mufla a 600 ± 15ºC

Placa calefactora

Reactivos

H2SO4 1,25% p/p; 200 ml

NaOH 1,25 % p/p: 200 ml

Eter de petróleo P.E. 40-60

Etanol 95 %

Procedimiento

Preparación de la muestra

Se homogeneizará la muestra y se dispondrá en una estufa a 103 ± 2ºC en

estufa hasta peso constante.

Se molerá la muestra y se pasará por un tamiz de malla 1 mm

Se extraerá con éter de petróleo si el contenido de grasa en la muestra es

superior al 1%.

Determinación

(Se realizará el análisis por triplicado).

Se pesará alrededor de 20 g de muestra preparada y será transferida al matraz

del aparato de calentamiento a reflujo

Se adicionará 300 ml de H2SO4 al 1,25 % p/p hirviente y perlas de vidrio

Se conectará el aparato de calentamiento a reflujo y se hervirá durante 30

minutos, agitando el matraz periódicamente.

Pasado este tiempo se desmontará el equipo y se filtrará a través de embudo

Büchner.

Se lavará con 50 ml de agua hirviente y se repetirá el lavado con 3 porciones

de 50 ml de agua o hasta que cese la reacción ácida.

Se retornará el residuo al aparato de calentamiento a reflujo y se agregará

200 ml de NaOH 1,25 % p/p hirviente.

43

Se conectará el aparato de calentamiento a reflujo y se hervirá exactamente

durante 30 minutos, agitando el matraz periódicamente.

Se desmontará el equipo y filtrará a través de embudo Büchner

Se lavará con 25 ml de H2SO4 al1,25 % p/p hirviente, con 3 porciones de 50

ml de agua hirviente y con 25 ml de etanol al 95%

Se removerá el residuo y será transferirlo al crisol, previamente pesado.

Se secará en estufa a 130 ± 2ºC por 2 horas, se dejará enfriar en desecador y

se pesará. (“m1”)

Finalmente se incinerará 30 minutos a 600 ºC ± 15ºC, se dejará enfriar en

desecador y se pesará. (“m2”)

Cálculos

% de fibra cruda en muestra molida

Donde: m1 = masa muestra digerida, g

m2 = masa muestra calcinada, g

m = masa muestra original

ANEXO 5

DETERMINACION DEL pH

Fundamento

Se determina la concentración de iones hidrogeno con un pH-metro calibrado.

Procedimiento

44

Se lavará bien los electrodos del pH-metro con agua desionizada, secándose con papel

absorbente.

Se calibrará el pH-metro a pH 7.0 y 4.0 con las correspondientes soluciones tampón. Se

lavará los electrodos con agua desionizada y finalmente se secará con papel absorbente.

Se introducirá los electrodos en la muestra liquida y se procederá a medir el pH.

45