PROYECTO FINAL DE INGENIERÍA PRODUCCIÓN LOCAL DE …

PROYECTO FINAL DE INGENIERÍA

PRODUCCIÓN LOCAL DE PROTEASA TEV

Rivero, Carla Ivanna – LU: 1017349 Licenciatura en Biotecnología

Tutor: Dr. Ghiringhelli, Pablo Daniel

LIGBCM (Laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular).

Universidad Nacional de Quilmes, UNQ.

Co-Tutor: Dr. Prada, Federico

Facultad de Ingeniería y Ciencias Exactas, UADE

Agosto 07, 2019

Universidad Argentina de la Empresa

Facultad de Ingeniería y Ciencias Exactas

Producción local de Proteasa TEV

Rivero, Carla Ivanna

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Agradecimientos Finalizando este paso tan importante que di en mi vida, quiero agradecer a

todas las personas que me acompañaron en este camino lleno de conocimientos,

compañerismo, aprendizaje, recaídas y todo lo que contempla llevar adelante un proyecto de

esta magnitud.

En primer lugar, quiero agradecer a todas las personas que trabajan en el

laboratorio de Ingeniería Genética y Biología Celular y Molecular de la Universidad de

Quilmes. Sin la ayuda constante de ellos este proyecto no sería posible. Agradecer en especial

a Daniel, mi tutor, por la enorme confianza brindada todo el tiempo que duró el proyecto y

por compartir su sabiduría día a día conmigo. Creo que no me alcanzarían las palabras para

agradecer realmente la posibilidad de trabajar dentro de su laboratorio, de donde me llevo

muchos lindos recuerdos y un enorme aprendizaje a nivel académico y humano. Además,

agradecer a Martin por ayudarme a ingresar al Laboratorio y por el asesoramiento inicial. A

Julián y Victoria por la enorme paciencia en explicarme los mejores métodos para realizar los

diferentes ensayos. A Cintia, por soportarme como vecina de mesada y por las enseñanzas

trasmitidas. A Alejandro, por ayudarme con tareas que se me dificultaban. A Manuel, por la

buena onda en prestarme las últimas placas para el clonado molecular. A Marcos y Cristina,

por el enorme aliento para realizar las tareas de purificación, gracias realmente ya que aprendí

mucho con ellos sobre purificación proteica. A Lucas por los buenos consejos y por la ayuda

constante con los geles SDS y el tratamiento de las proteínas. A Mariano por la enseñanza

vivaz que me dio plenamente. Y a Leticia que en el último tramo de este proyecto me brindó

mucha fuerza y ayuda.

En segundo lugar y no por ser el segundo es menor, quiero dar la gracias a

Alexis por acompañarme emocional y físicamente durante la duración de este proyecto.

Considerando la distancia que existe entre Quilmes y Zona Norte nunca dudó en

acompañarme a la universidad o irme a buscar. También acompañándome emocionalmente en

darme fuerzas para ir los fines de semanas hasta la universidad. Y además, por soportar el mal

humor cuando los resultados no eran satisfactorios.

En tercer lugar quiero agradecer a mi mamá que siempre de alguna forma me

ayudó a que los pasos resultarán más livianos con el fin de que pueda cumplir mis proyectos

de la forma más ágil posible.



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Por último, agradecer a mis amigos que supieron acomodarse a mis pocos

horarios para sociabilizar y soportar los momentos de plena emoción compartida de

cansancio.

Gracias realmente a todas las personas que compartieron los momentos

mientras este proyecto duró. Y estoy muy agradecida a la vida de las personas que conocí

gracias a esto, las cuales además de lo académico me enseñaron mucho en lo humano.



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Resumen

En este proyecto se describen ensayos para producir localmente una forma

soluble de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) en una cepa ingenierizada de

Escherichia coli, con el fin de utilizarla como reactivo para eliminar las etiquetas (tags) de

afinidad presentes en proteínas recombinantes.

La proteasa TEV, proteasa de inclusión nuclear del virus del grabado del

tabaco (TEV), reconoce como blanco de clivaje a la secuencia de aminoácidos ENLYFQ/G

(Glutamina–Asparagina–Leucina–Tirosina–Fenilanina–Glutamina/Glicina). Por lo tanto,

debido a su rigurosa especificidad en la secuencia de clivaje, se la considera un reactivo útil

para la escisión de proteínas de fusión generadas mediante modificación genética.

La proteasa TEV utilizada en este proyecto presenta una mutación (S219V)

que reduce su velocidad de autólisis y da lugar a una enzima con mayor eficacia catalítica que

la proteasa de tipo salvaje. Además se expresa como una proteína de fusión unida a la proteína

de unión a maltosa de Escherichia coli (MBP) brindando una forma soluble de la proteasa

evitando la formación de cuerpos de inclusión. También esta proteasa se encuentra marcada

con una etiqueta de Histidina y Arginina, en el N-terminal y C-terminal respectivamente. La

proteasa marcada con la etiqueta de Histidina permite la purificación utilizando cromatografía

de afinidad con metales inmovilizados (IMAC).



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Abstract

In this Project, assays to produce locally a soluble form of TEV protease, in an

engineered strain of Escherichia coli are described. The aim is to use this protein as a reagent

to remove affinity tags of recombinant proteins.

The TEV protease, nuclear inclusion protease of Tobacco etch virus (TEV),

recognizes the amino acid sequence ENLYFQ/G (Glutamine–Asparagine–Leucine–Tyrosine–

Phenylalanine–Glutamine/Glycine). Due to a rigorous specifity in a cleavage this enzyme is

an useful reagent for cleaving genetically modified fusion proteins.

This project used an S219V mutation in this protease that reduces the autolysis

rate, resulting in a highly catalytic enzyme efficiency compared to the wild-type protease.

Also, is produced as a C-terminus fusion to the E. coli maltose binding protein (MBP),

generating a soluble and active form and avoiding inclusion bodies formation. In addition,

this protease is labeled with Histidine tag in N-terminus and Arginine tag in C-terminus. The

His-tagged TEV protease can be purified in an immobilized metal affinity chromatography

(IMAC).



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Contenido

Agradecimientos ....................................................................................................................... 2

Resumen .................................................................................................................................... 4

Abstract ..................................................................................................................................... 5

1. CAPÍTULO 1 ........................................................................................................................ 8

ESTRUCTURA DEL PROYECTO, INTRODUCCIÓN, OBJETIVOS Y

RELEVANCIA DEL TEMA. .................................................................................................. 8

1.1. Estructura del Proyecto ............................................................................................................... 9 1.2. Introducción ................................................................................................................................ 10

1.2.1. Virus del grabado del tabaco TEV (Tobacco etch virus) ....................................................... 10 1.2.2. Estructura proteica de la proteasa TEV ................................................................................. 16 1.2.3. Especificidad de secuencia de la proteasa TEV ..................................................................... 19 1.2.4. Condiciones de reacción de la proteasa TEV ........................................................................ 20 1.2.5. Producción de la proteasa TEV en sistemas heterólogos ....................................................... 21 1.2.6. Descripción del plásmido pRK793 ........................................................................................ 22

1.3. Objetivos ..................................................................................................................................... 24 1.3.1. Objetivo general ..................................................................................................................... 24 1.3.2. Objetivos específicos: ............................................................................................................ 24

1.4. Relevancia del tema .................................................................................................................... 25 1.4.1. Alternativa de importación de la proteasa TEV ..................................................................... 25 1.4.2. Rendimiento de producción de la proteasa TEV ................................................................... 25 1.4.3. Especificidad de la proteasa TEV .......................................................................................... 25

2. CAPÍTULO 2 ................................................................................................................... 27

ANTECEDENTES ................................................................................................................. 27

2.1. Antecedentes. .............................................................................................................................. 28

3. CAPÍTULO 3 ................................................................................................................... 29

DESCRIPCIÓN ...................................................................................................................... 29

3.1. Descripción .................................................................................................................................. 30



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4. CAPÍTULO 4 ................................................................................................................... 31

MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 31

4.1. Materiales y Métodos ................................................................................................................. 32 4.1.1. Cuantificación de ácidos nucleicos ........................................................................................ 32 4.1.2. Electroporación y plaqueo ..................................................................................................... 32 4.1.3. Extracciones plasmídicas ....................................................................................................... 32 4.1.4. Expresión de la proteína en pequeña escala en E. coli .......................................................... 33 4.1.5. Electroforesis de proteínas ..................................................................................................... 34 4.1.6. Lisis celular ............................................................................................................................ 34 4.1.7. Purificación de proteasa TEV (condiciones nativas) ............................................................. 34 4.1.8. Cuantificación densitométrica de proteinas ........................................................................... 35

5. CAPÍTULO 5 ................................................................................................................... 36

RESULTADOS ....................................................................................................................... 36

5.1. Resultados ................................................................................................................................... 37 5.1.1. Transformación de cepas bacterianas .................................................................................... 37 5.1.2. Producción de plásmidos ....................................................................................................... 38 5.1.3. Expresión de la proteasa TEV ............................................................................................... 38 5.1.4. Optimización del rendimiento en la expresión proteica ........................................................ 40 5.1.5. Stock de bacterias transformadas ........................................................................................... 43 5.1.6. Cultivo celular para la producción de la proteasa TEV ......................................................... 44 5.1.7. Lisis celular ............................................................................................................................ 44 5.1.8. Purificación por columna de Ni-NTA ................................................................................... 46 5.1.9. Formulación del buffer de reacción ....................................................................................... 47

6. CAPÍTULO 6 ................................................................................................................... 48

DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS ........................................................................................ 48

6.1. Discusión ..................................................................................................................................... 49 6.2. Perspectivas ................................................................................................................................ 51

7. CAPÍTULO 7 ................................................................................................................... 52

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................... 52

7.1. Bibliografía ................................................................................................................................ 53



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1. CAPÍTULO 1

ESTRUCTURA DEL PROYECTO, INTRODUCCIÓN, OBJETIVOS Y

RELEVANCIA DEL TEMA.



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1.1. Estructura del Proyecto

En el siguiente proyecto se incluye un serie de apartados.

En la introducción se brinda información sobre el origen de la proteasa TEV,

indicando que pertenece a la familia viral de los potyvirus, luego se detalla el genoma general

de los mismos, la forma de infección de los potyvirus, el procesamiento postranscripcional, la

caracterización de la proteasa TEV perteneciente al procesamiento de la proteína Nla de 49

kDa, la estructura proteica de la proteasa TEV, el reconocimiento de la secuencia de clivaje,

inhibidores en el procesamiento, detalle del tipo de proteasa y las modificaciones que se

realizaron para la purificación y utilización en técnicas biotecnológicas para la purificación de

proteínas target.

Luego se detallan los objetivos, incluyendo a los objetivos específicos.

Seguidamente se detalla la relevancia del tema en estudio, en donde se

identifican tres principales aspectos. El primer aspecto está asociado con la alternativa de la

importación de la proteasa TEV. El segundo aspecto corresponde al alto rendimiento

escalable productivo. Y el tercer aspecto destaca la especificidad en el clivaje de la proteasa

TEV.

Además, se detalla la descripción del desarrollo involucrado en este proyecto.

Antes de los resultados obtenidos, se enumeran los materiales y métodos

utilizados a lo largo del proyecto.

En los resultados obtenidos se describen las tareas vinculadas a la producción

de la proteasa TEV, donde inicialmente se realiza una curva de optimización productiva. Para

la purificación se utiliza el plásmido pRK793 transformado en Escherichia coli RosettaTM

2(DE3)-pRIL. En la secuencia del plásmido, la secuencia de la proteasa se encuentra unida a

dos tags de purificación. En el extremo N-terminal posee un tag de histidina y el extremo C-

terminal un tag de Arginina (His6-TEV(S219V)-Arg5). Con el método de purificación por

columna de Ni-NTA se purifica bajo el tag de histidina y luego se evalúa la actividad in vivo

de la proteasa TEV.



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1.2. Introducción

1.2.1. Virus del grabado del tabaco TEV (Tobacco etch virus)

El virus del grabado del tabaco (TEV) es un miembro del grupo Potyvirus y de

la familia viral Potyviridae. Es un virus con genoma de ARN monocatenario de polaridad

positiva y 9496 nucleótidos de longitud. (Dougherty, 1983; Allison et al, 1986). Los

Potyvirus son el género más grande de virus de plantas, con alrededor de 180 miembros, que

causan pérdidas significativas en una amplia gama de plantas utilizadas para el cultivo

(Shukla et al, 1994). Estos tipos de virus son transmitidos por pulgones de manera no

persistente y algunos de ellos también son transmitidos por las semillas (Johansen et al, 1994;

Shukla et al, 1994).

Figura1. Nicotiana tabacum (tabaco). Las hojas inoculadas suelen desarrollar manchas

cloróticas indefinidas o anillos o arcos necróticos. Los síntomas sistémicos son limpieza de

venas y grabado necrótico.

(Fuente: Lindbo et al, 1993)

1.2.1.1. Infección con potyvirus

De manera similar a muchos otros virus de plantas con genoma ARN

monocatenario positivo, la infección por potyvirus explota la maquinaria de síntesis de

proteínas del huésped en la producción de proteínas virales; utilizando los sistemas de



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secreción celular y endomembrana en la formación de complejos de replicación viral y

plasmodesmos para permitir la propagación del genoma viral a otras células (Patarroyo et al,

2013).

La infección sistémica se produce cuando un virus puede moverse desde el

foco de la infección primaria hasta invadir las regiones distales de la planta (Lucas y

Gilbertson, 1994; Carrington et al, 1996). En la figura 2 se puede observar el mecanismo de

infección. Los polisomas traducen el ARN viral (1) y se asocian para la replicación (2). El

ARN viral replicado se transporta por los plasmodesmos para facilitar el movimiento de

célula a célula (3). Para lograr una infección productiva, la expresión del ARN viral continúa

a través de nuevas rondas de traducción/replicación (4). Los mecanismos de defensa de la

célula hospedadora que conducen a la degradación del ARN compiten activamente por los

sustratos del ARN viral con los mecanismos de defensa viral (5). La encapsidación de ARN

viral completa el ciclo de infección (6), lo que permite que el virus encapsidado se transporte

e infecte a las plantas vecinas. (Mäkinen y Hafrén, 2014)

Figura 2. Vías de ARN viral en células infectadas por potivyrus.

(Adaptado de Mäkinen y Hafrén, 2014)



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La proteína NIa, posiblemente como una proteína libre o unida a ARN como

VPg, puede interactuar con factores celulares para facilitar el paso a través de la vía de

transporte del floema. Alternativamente, NIa o el dominio VPg libre pueden funcionar para

suprimir una o más respuestas de defensa que limitan específicamente el movimiento a larga

distancia. En cualquier caso, se propone que el dominio NIa o VPg interactúa con factores

celulares para promover directa o indirectamente el movimiento a larga distancia, con

funciones específicas del genotipo del hospedador. Además, en TEV se obtuvo evidencia que

sugiere que el factor eIF4E proporciona un efecto positivo en la amplificación del genoma.

(Schaad et al, 2000; 1997b). La proteína NIa multifuncional de los potyvirus se requiere en

varios puntos del ciclo de infección del virus. La mitad N-terminal de NIa sirve como VPg

durante el inicio de la síntesis de ARN (Murphy et al, 1990; Shahabuddin et al, 1988). La

mitad C-terminal es una proteasa tipo picornavirus 3C que cataliza la mayoría de las

reacciones de escisión de la poliproteína viral (Dougherty y Semler, 1993) (Figura 3). Los

dos dominios están separados por un sitio de escisión de NIa subóptimo que deriva en un

procesamiento lento in vivo (Carrington et al, 1993). El dominio VPg también contiene

señales para el transporte nuclear en células infectadas (Carrington et al, 1991; Restrepo et al,

1990). Además, NIa interactúa con NIb, la ARN polimerasa codificada por el virus (Daròs et

al, 1999; Fellers et al, 1998; Hong et al, 1995; Li et al, 1997; Schaad, 1997a).

Figura 3. Mapa genómico del Tobacco etch virus.

(Adaptado de Adams et al, 2011)

1.2.1.2. Amplificación del genoma del potyvirus

La amplificación del genoma requiere de dos procesos fundamentales, uno es

la traducción del ARN viral para la síntesis de proteínas específicas del virus, incluída la

replicasa viral y el otro proceso fundamental es la autoreplicación del ARN. La mayoría de las

proteínas codificadas por los potyvirus funcionan en el proceso de replicación del ARN, como



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las proteínas de unión a ARN: P1 (Brantley y Hunt, 1993; Soumounou y Laliberté, 1994;

Merits et al, 1998), HC-Pro (Maia et al, 1996; Merits et al, 1998), proteína CI (Eagles et al,

1994; Fernández et al, 1995; Merits et al, 1998), NIa (Daròs y Carrington, 1997; Merits et al,

1998), proteína de inclusión nuclear b (NIb; replicase) y CP (Merits et al, 1998).

Debido a que la traducción eficiente de la mayoría de los ARNm eucarióticos

requiere que tengan 5′ cap y el 3′ polyA (Gallie, 1998), debe funcionar algún mecanismo

alternativo para los potyvirus. Gallie et al, (1995) ha demostrado que para el TEV, la región

larga no traducida (NTR) en 5′ sustituye a la 5′ cap en la interacción con la 3′ polyA y puede

actuar como un potenciador de la traducción cuando se coloca aguas arriba de marcos abiertos

de lectura heterólogos. Una función para el 5' cap es la unión de factores de traducción antes

del reclutamiento de los ribosomas. Por lo tanto, los 5' NTR y/o VPg cumplirían este rol

específico.

1.2.1.3. Productos proteicos del genoma de TEV

El cuerpo de inclusión nuclear (NI) de TEV es un co-cristal de dos proteínas

codificadas de 49 kDa y 58 kDa (Knuhtsen et al, 1974; Dougherty y Hiebert, 1980b).

La proteína de 58 kDa es una ARN polimerasa dependiente de ARN, mientras

que la proteína de 49 kDa es una proteína multifuncional. Se ha demostrado que una proteína

con un peso molecular previsto de 24 kDa, es inmunoreactiva con anticuerpos específicos del

sector medio del N-terminal de la proteína de 49 kDa. Sorprendentemente, la proteína de 49

kDa completa también se ha detectado unida covalentemente a una fracción menor del ARN

genómico examinado (Murphy et al, 1990). También se ha asociado una actividad proteolítica

con la proteína de 49 kDa y los análisis de deleción genética han mapeado esta actividad en

los 228 aminoácidos C-terminales (Carrington y Dougherty, 1987).

Al examinar las modificaciones postraduccionales de la proteína de 49 kDa se

ha detectado que existe un sitio de escisión interna en la proteína Nla de 49 kDa de TEV que

delinea bioquímicamente los dominios de VPg y una proteasa. La proteína NIa de 49 kDa

representa una poliproteína con dos dominios ya que se evidenció que la división de la

proteína TEV (49 kDa) entre los aminoácidos 189 y 190 probablemente esté mediada por la

actividad proteolítica asociada con la proteína de 49 kDa y que forma la unión entre los

dominios VPg y proteasa. Los 241 aminoácidos C-terminales (27 kDa) de la proteína NIa



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TEV de 49 kDa funcionan independientemente como una proteasa cuando se expresan como

parte de poliproteínas más grandes; mientras que el segmento N-terminal está involucrado en

la replicación y se encuentra asociado con el ARN genómico. Estas dos actividades no

interfieren entre sí y parece que hay una tolerancia considerable, ya que la proteína de 49 kDa

funciona fácilmente como una proteasa. De manera similar, el fragmento N-terminal de 21

kDa funciona como el VPg. Los estudios de determinación directa de la secuencia de

aminoácidos de la proteína de 27 kDa aislada de las preparaciones de NIa sugieren que se

produce una división específica en este sitio. (Dougherty y Parks, 1991)

Figura 4. Mapa genómico del genoma TEV y los productos derivados del ORF Nla de 49

kDa.

(Adaptado de Parks et al, 1995)

En la figura 4 se pueden observar a P1 y P3, las cuales corresponden a las

proteínas 1 y 3; HC-Pro que actúa como componente helper para la transmisión mediada por

áfidos y con actividad proteasa (Figura 5); Cl, proteína de inclusión citoplasmática con

actividad de helicasa (hel); Nla y Nlb, proteínas a y b de inclusión nuclear; Rep, proteína

replicasa putativa; Cap, proteína de la cápside; VPg, proteína ligada al genoma viral y Pro,

proteasa.



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Figura 5. Los potyvirus se retienen en la punta distal del estilete del insecto a través de una

unión helper-dependent. La unión del virión al estilete se realiza utilizando la única proteína

no estructural, en este caso HC.

(Adaptado de Dietzgen et al, 2016)

El almacenamiento prolongado a 4 grados de la proteína de 49 kDa, a partir del

ORF Nla (Figura 4), da como resultado la conversión de la proteína de 49 kDa en proteínas

de peso molecular más pequeño de 21, 25, 27 y 47 kDa. Las proteínas de 25, 27 y 47 kDa se

superponen y contienen secuencias encontradas en la mitad carboxiterminal de la poliproteína

Nla de 49 kDa. La transcripción libre de células y la posterior traducción de las secuencias de

ADNc de TEV Nla también dieron como resultado la formación del producto de 49 kDa

esperado y un producto de 47 kDa más pequeño (Dougherty y Parks, 1991; Rorrer et al,

1992). Esto ocurre de manera similar, con la expresión de la proteína de 27 kDa y una

proteína relacionada de 25 kDa. Se ha demostrado que las proteínas de menor peso molecular

derivan de un evento proteolítico mediado por la proteasa Nla que elimina los 24 aminoácidos

carboxiterminales de la secuencia Nla. Esta proteólisis no es un proceso aleatorio mediado por

proteasas exógenas, ya que un cambio aminoacídico puntual en el sitio activo evita el clivaje

carboxiterminal. Mediante estudios de dilución se concluyó que la escisión es autocatalítica o



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cis. A la vez se pudo purificar el péptido carboxiterminal de 2,8 kDa y determinar su

secuencia. Esto permitió mapear el sitio de escisión. (Parks et al, 1995)

1.2.2. Estructura proteica de la proteasa TEV

La proteasa TEV está clasificada como una proteína β, la cual adopta dos

dominios antiparalelos de barril β, una estructura típica de las serín proteasas, donde la hoja β

se pliega en el primer dominio para formar un barril β antiparalelo. Como las serín proteasas

del tipo tripsina, el barril β contiene un motivo de llave griega. (Bazan y Fletterick, 1988;

Phan et al, 2002) (Figura 6)

Figura 6. Diagrama de cinta del dímero de proteasas TEV encontrado mediante

cristalografía y difracción de rayos X. Las moléculas están orientadas de tal manera que el

sitio de unión del péptido se coloca en la parte inferior de la figura. Los residuos C-terminales

que forman una cadena β se muestran vinculados al sitio activo.

(Adaptado de Nunn et al, 2005)

Los residuos de la tríada catalítica His46, Asp81 y Cys151 están ubicados en la

interfaz entre los dominios. (Nunn et al, 2005).



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Se ha demostrado que la proteasa TEV experimenta una autoescisión que

genera una proteína truncada con actividad disminuida (Parks et al, 1995). La división se

produce cerca del extremo C de la proteasa TEV después del residuo 218, en un sitio que no

coincide con la secuencia canónica. Mediante mutagénesis dirigida, se hicieron esfuerzos para

producir una forma no escindible de la proteasa TEV que retendría la actividad enzimática de

tipo salvaje. (Kapust et al, 2001). Estos estudios también intentaron entender cómo y por qué

una enzima que de otra manera posee una tan alta precisión, sufre esta autoescisión. La

investigación cristalográfica previamente informada de las estructuras de la proteasa TEV

catalíticamente activa o inactiva reveló poca información sobre la región C-terminal de la

proteasa TEV (Phan et al, 2002).

Además, se encontró que los enlaces de hidrógeno participan en la unión y el

reconocimiento del sitio activo de la proteasa TEV por parte del extremo C-terminal (Figura

7). (Nunn et al, 2005).



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Figura 7. Los enlaces de hidrógeno participan en la unión y el reconocimiento del extremo C

al sitio activo. (a) Los enlaces de hidrógeno de la cadena principal implicados en la unión del

término C-terminal. Solo se muestran los átomos de la cadena principal para las dos cadenas

que forman el surco de unión al péptido y para los residuos C-terminales unidos al sitio. Los

enlaces de hidrógeno de la cadena principal de tipo b están denotados explícitamente por

líneas discontinuas y los átomos involucrados en la formación de estos enlaces están

etiquetados. (b) Los posibles enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas. La

Figura enfatiza las interacciones específicas de la cadena lateral de Gln242, la posición del

carboxilato C-terminal y los residuos de nitrógeno que se postuló que estaban involucrados en

la formación de un orificio de oxianión. Para mayor claridad, solo se muestran los residuos

seleccionados y los átomos del sitio activo.

(Adaptado de Nunn et al, 2005)



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La comparación con proteínas relacionadas revela que el pliegue de la proteasa

TEV es similar al de otras cisteín proteasas del tipo 3C dentro la familia Picornaviridae,

como el virus de la hepatitis A, el poliovirus, el virus de la fiebre aftosa y el rinovirus; las

mismas tienen una función similar a la proteasa TEV en sus respectivos virus. Además es

similar a la β-tripsina, la toxina epidermolítica A de Staphylococcus aureus, la proteasa de

unión específica a lisina proveniente de Achromobacter lyticus y la proteína humana de unión

específica a lisina, también conocida como azurocidin. Sin embargo, aunque la similitud entre

el plegamiento total de la proteasa TEV y el de las proteínas relacionadas es muy alta, las

coordenadas atómicas reales no son muy cercanas ya que la raíz cuadrada de la desviación

media (RMSD, Root Mean Square Deviation) entre los Carbonos alfa, en las áreas que

podrían alinearse oscila entre 2,4 y 3,5 Å, y los bucles restantes muestran poca similitud. En

cambio, la similitud en los sitios catalíticos de estas enzimas es bastante alta. (Phan et al,

2002)

1.2.3. Especificidad de secuencia de la proteasa TEV

Las proteínas codificadas por el virus del grabado del tabaco (TEV) derivan del

procesamiento proteolítico de una poliproteína precursora. La proteasa responsable de la

mayoría de estas escisiones es la proteína viral de 49 kDa. Todos los sitios de escisión

conocidos o predichos en la poliproteína TEV están flanqueados por el motivo de secuencia

conservada E-X-X-Y-X-Q-(G/S) (donde X es cualquier residuo). La poliproteína es clivada

después del residuo de Glutamina (Q) y, como resultado, el residuo de Serina (S) o Glicina

(G) se convierte en el nuevo N-terminal. (Carrington et al, 1988; Dougherty y Parks, 1991).

Los determinantes de especificidad de la secuencia blanco para la proteasa

TEV han sido investigados a fondo. Los primeros experimentos realizados por Dougherty y

sus colegas demostraron que existe una fuerte preferencia por el Glutámico (E) en la posición

P6, poca o ninguna selectividad en la posición P5, una preferencia moderada por Leucina (L)

en la posición P4, una fuerte preferencia por la Tirosina (Y) en la posición P3 , una tolerancia

aproximadamente igual para Fenilalanina (F), Cisteína (C) e Isoleucina (I) en la posición P2,

un fuerte sesgo a favor de la Glutamina (Q) en la posición P1 y un cierto grado de selectividad

en la posición P1’, siendo la Serina (S) la más favorable de los residuos analizados

(Dougherty et al, 1989). Estos resultados llevaron a la idea de que el sitio de escisión de la



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proteasa TEV "consenso" podría definirse como Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser/Gly y la suposición

de que esas posiciones denotadas como "X" podrían ser libremente sustituidas. Sin embargo,

experimentos más recientes han demostrado que la proteasa TEV es sensible incluso a

sustituciones conservativas de aminoácidos en las posiciones P4 y P2. (Tözsér et al, 2005)

En otro estudio, la especificidad en P1’ fue evaluada sistemáticamente en el

contexto de un modelo de proteína de fusión (Kapust et al, 2002). Estos investigadores

encontraron que la enzima era sorprendentemente tolerante con una amplia variedad de

residuos en esta posición. Los pequeños residuos alifáticos, como la Glicina (G), Alanina (A),

Serina (S), Metionina (M) y Cisteína (C), fueron excepcionalmente bien tolerados, mientras

que los residuos β hidrófobos con carga negativa y los ramificados inhibieron el

procesamiento. Estos hallazgos pusieron de relieve el concepto de que un residuo de Serina

(S) o Glicina (G) es esencial en la posición P1’, revelando que, como la enteropeptidasa y el

factor Xa, en muchos casos la proteasa TEV es capaz de generar productos de digestión con

Ns-terminales alternativos. (Figura 8)

Figura 8. Secuencia de reconocimiento de la proteasa TEV y numeración de los residuos.

(Adaptado de Kapust et al, 2002)

1.2.4. Condiciones de reacción de la proteasa TEV

La proteasa TEV es activa en diversas condiciones de reacción y en presencia

de diferentes aditivos. Es activa en un rango de pH entre 6 y 9 (Parks et al, 1995), y

relativamente insensible a concentraciones de NaCl entre 0,1 M y 2,0 M, aunque se observó

que la actividad era mayor en ausencia de sal monovalente (Nallamsetty et al, 2004). La

temperatura óptima para la actividad es entre 30 °C y 34 °C, aunque la enzima conserva una

actividad significativa a 4 °C (Nallamsetty et al, 2004; Polayes et al, 1998), y cae

bruscamente a temperaturas superiores a 37 °C (Nallamsetty et al, 2004). Por otra parte, la

proteasa de TEV es activa en presencia de un 2,5% de sacarosa o un 0,1% de Tritón X-100,



Página 21

pero inactiva en presencia de dodecilsulfato de sodio al 0,01% (Polayes et al, 1994; Vergis y

Wiener, 2011; Mohanty et al, 2003; Lundbäck et al, 2008). Además, la enzima es insensible a

inhibidores de proteasas tales como el PMSF, el AEBSF y la pepstatina A; y relativamente

tolerante a la aprotinina (hasta 0,3 mg/ml) y leupeptina (hasta 100 µM), y concentraciones de

urea hasta 0,5 M (Polayes et al, 1994; Dougherty et al, 1989). Por último, la proteasa TEV es

activa en presencia de agentes reductores como el ditiotreitol (DTT) o quelantes como el

EDTA, pero, inactiva en presencia de agentes alquilantes de tiol como la yodoacetamida

(Polayes et al, 1994).

1.2.5. Producción de la proteasa TEV en sistemas heterólogos

Los primeros esfuerzos para producir el dominio catalítico de 27 kDa de la

proteasa TEV en E. coli tuvieron un éxito limitado, obteniendo aproximadamente 4 mg de

proteína pura por litro de cultivo bacteriano (Parks et al, 1994). En un trabajo posterior, el

rendimiento mejoró al utilizar un compañero de fusión que aumentó la solubilidad (Kapust y

Waugh, 1999) junto con un plásmido accesorio que codifica ARNt o sustituciones de codones

sinónimos en el marco de lectura abierto de proteasa TEV (Kapust et al, 2002).

Posteriormente se realizaron mejoras adicionales en la producción de proteasas TEV solubles

marcadas con Histidina, que produjeron hasta 400 mg/l o 15 mg/g de pasta celular (Van den

Berg et al, 2006; Blommel y Fox, 2007). La proteasa TEV también se ha fusionado con una

serie de otros tags de afinidad, como la glutatión S-transferasa (Blommel y Fox, 2007), la

proteína de unión a maltosa (MBP) (Kapust y Waugh, 1999) y el Streptag II (Miladi et al,

2011). Las proteínas de fusión facilitan la detección y/o purificación de un compañero (Uhlen

et al, 1983; 1992). Por lo tanto, la solubilidad de una proteína recombinante puede mejorarse

fusionándola con una proteína altamente soluble. (Butt et al, 1989; Schein, 1989).

La proteína MBP tiene la capacidad de aportar solubilidad cuando se encuentra

unida a una proteína no soluble. (Kapust y Waugh, 1999). Dicha proteína interactúa de

manera preferencial con las proteínas desplegadas y promueve su plegamiento in vitro

(Richarme y Caldas, 1997). Aunque esta propiedad depende del orden en que se sintetizan los

dos dominios; las proteínas de fusión solubles se obtienen solo cuando las proteínas pasajeras

se fusionan al extremo C-terminal de MBP (Sachdev, 1998b).



Página 22

Por otra parte, un serio inconveniente para producir la proteasa TEV, es que se

autocliva en un sitio especifico generando una enzima truncada con actividad muy disminuida

(Parks et al, 1995; Cabrita et al, 2007). Sin embargo, este autoclivado pudo evitarse mediante

la introducción de sustituciones de aminoácidos en la vecindad del sitio de escisión interna

(Cabrita et al, 2007; Lucast et al, 2001). La autoproteólisis se produce entre Met218 y Ser219

en el dominio catalítico de la proteasa TEV (Parks et al, 1995). Para reducir o eliminar la

inactivación autoproteolítica de la proteasa TEV, se utilizó una estrategia ya empleada con

éxito en otras proteasas, para lo cual se construyeron y caracterizaron varios mutantes con

sustituciones de aminoácidos adyacentes al sitio de escisión interna (Kapust et al, 2001). En

algunos de los mutantes, se reemplazó la Ser219 con Glutamina (S219E), Valina (S219V) y

Prolina (S219P), lo que dió lugar a proteasas con mayor resistencia a la autoproteólisis.

(Kapust et al, 2001). Uno de estos mutantes (S219V) es aproximadamente 100 veces más

resistente a la autoinactivación que la proteasa de tipo salvaje y también posee una actividad

catalítica moderadamente mayor (Cabrita et al, 2007).

1.2.6. Descripción del plásmido pRK793

Este plásmido recombinante posee un fragmento de la proteasa,

comprendiendo los residuos 189–424 de la proteasa de inclusión nuclear madura (49 kDa)

(Dougherty et al, 1989). En los extremos N- y C-terminal se agregaron secuencias de

polihistidina (GHHHHHH) y poliarginina (RRRRR), respectivamente. El residuo 1

corresponde al residuo 189 de la proteasa NIa de 49 kDa TEV madura. Por consiguiente, los

residuos de la tríada catalítica, designados H46, D81 y C151, corresponden, respectivamente,

a las posiciones 234, 269 y 339 en la proteasa NIa de 49 kDa. Todas las construcciones de

His-TEV-Arg realizadas (pRK683, pRK651, pKM607, pRK794, pRK793) permiten generar

proteínas idénticas entre sí y a la proteína de tipo salvaje. (Kapust et al, 2001)

La inducción con IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) de E. coli

conteniendo el plásmido pRK793 permite producir una proteína de fusión a MBP (Figura 12)

que se autocliva in vivo para generar la proteasa His6-TEV(S219V)-Arg5 soluble. (Kapust y

Waugh, 1999; Kapust et al, 2001)



Página 23

Figura 12. Representación esquemática (no a escala) del vector de expresión de proteasa

TEV pRK793 y su producto de proteína de fusión.

(Adaptado de Methods in Molecular Biology: High Throughput Protein Expression and

Purification, vol. 498, Chapter 19)



Página 24

1.3. Objetivos

1.3.1. Objetivo general

• Desarrollar y producir localmente la proteasa TEV (Tobacco Etch Virus).

1.3.2. Objetivos específicos:

• Optimizar la producción, maximizando la producción proteica por unidad de

Biomasa.

• Purificar la proteasa TEV.



Página 25

1.4. Relevancia del tema

1.4.1. Alternativa de importación de la proteasa TEV

Considerando el alto costo al importar un insumo como la proteasa TEV, la

producción de manera local de este insumo genera la obtención de un producto a un costo

menor y paralelamente el desarrollo del Know-How productivo da lugar a la optimización del

proceso, lo cual reduce aún más los costos.

Además, la producción local genera reducción de los costos de transporte y

ausencia de intermediarios. También, se genera una reducción de los embalajes en su

transporte, ya que un producto que viaja poco no debe protegerse tanto.

Actualmente existe un ajuste presupuestario en Ciencia y Tecnología por el

Gobierno de la Argentina, por lo cual esta alternativa en la importación de un insumo de alto

costo, redunda en mayores posibilidades de uso por parte de los proyectos científicos.

1.4.2. Rendimiento de producción de la proteasa TEV

Gracias al aporte de solubilidad generando una proteína de fusión unida a la

proteína MBP y a la eliminación del autoclivaje de la proteasa TEV, se puede obtener una

producción más eficiente de dicha proteasa. Además, se ha demostrado que se pueden obtener

hasta 140 mg de proteína por litro de cultivo con un 98% de pureza (Wu et al, 2009).

Demostrando de esta forma un buen comportamiento a baja escala, pudiendo incrementar la

producción a escalas más grandes.

Considerando el tipo de producción, en donde el huésped es Escherichia coli

(huésped procariota) y el medio de cultivo es Luria Bertani (LB) con los antibióticos

Ampicilina más Cloranfenicol, se puede diseñar a partir de este proyecto un diseño productivo

que requerirá insumos convencionales en primera instancia.

1.4.3. Especificidad de la proteasa TEV

La proteasa TEV posee una alta especificidad, la cual garantiza la selectividad

en los clivajes proteolíticos. La especificidad de secuencia es mucho más estricta que la del



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factor Xa, la trombina o la enteroquinasa. Por lo tanto la proteasa TEV es un reactivo muy útil

para escindir proteínas de fusión, en donde la eliminación de las etiquetas de afinidad siempre

ha sido el talón de Aquiles de cualquier estrategia de expresión recombinante.

Por lo tanto, teniendo en cuenta la alta especificidad de la proteasa TEV y la

buena tolerancia a una amplia variedad de residuos en la posición P1’ en el sitio de

reconocimiento, junto con la facilidad y economía de producción y la disponibilidad

inmediata de vectores de expresión de fuentes abiertas (incluidas variantes etiquetadas para

purificación por afinidad), esta proteasa es probablemente la mejor endoproteasa a considerar

para la eliminación de las etiquetas de afinidad N-terminal. (Waugh, 2011)



Página 27

2. CAPÍTULO 2

ANTECEDENTES



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2.1. Antecedentes.

En Methods in Molecular Biology: High Throughput Protein Expression and

Purification, vol. 498, Chapter 19 (Tropea et al, 2009) se describió un método para

sobreproducir una forma soluble de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) en

Escherichia coli y purificarla hasta la homogeneidad. Considerando que la proteasa se

produce inicialmente como una fusión en el C-terminal de la proteína de unión a maltosa de

E. coli (MBP), lo que hace que se acumule en una forma soluble y activa. La proteína de

fusión se escinde posteriormente in vivo para eliminar la MBP, liberando el dominio catalítico

de la proteasa TEV soluble con una etiqueta de polihistidina N-terminal. La proteasa TEV

marcada con His se puede purificar en dos etapas utilizando cromatografía de afinidad con

metales inmovilizados (IMAC), seguida de filtración en gel. La mutación S219V en la

proteasa reduce la velocidad de autólisis aproximadamente 100 veces y da lugar a una enzima

con mayor eficacia catalítica que la proteasa wild-type.



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3. CAPÍTULO 3

DESCRIPCIÓN



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3.1. Descripción

La proteasa TEV es una proteína de un tamaño de 27 kDa, perteneciente al

dominio catalítico de la proteína de inclusión nuclear (Nla) codificada por el virus del grabado

del tabaco (TEV).

La estructura de la proteasa TEV es similar a la de las serín proteasas (Phan et

al, 2002). Al igual que las serín proteasas, la proteasa TEV utiliza una “Tríada catalítica” de

residuos para generar la hidrólisis del péptido blanco. La tríada catalítica es Cis-Asp-His (C-

D-H).

La proteasa TEV reconoce específicamente una secuencia de siete aminoácidos

Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln/Gly (ENLYFQ/G), y es útil para eliminar etiquetas de afinidad en

las proteínas de fusión. La proteasa TEV es una versión mejorada de la proteasa wild type del

virus del grabado del tabaco (TEV), significativamente más estable y con mayor

especificidad.

Características de la proteasa TEV producida:

• Es activa en un amplio intervalo de temperaturas (4 °C a 34 °C)

(Nallamsetty et al, 2004; Polayes et al, 1998).

• Es activa en un amplio intervalo de pH (6,0 a 9) (Parks et al, 1995).

• Posee dos tags, uno de seis histidinas en el N-terminal y otro de cinco

argininas en el C-terminal para facilitar la purificación. (Kapust et al,

2001).

Figura 13. Esquema representativo del clivaje de la proteasa TEV.



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4. CAPÍTULO 4

MATERIALES Y MÉTODOS



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4.1. Materiales y Métodos

4.1.1. Cuantificación de ácidos nucleicos

Para la cuantificación de ácidos nucleicos (ADN), se utilizó el equipo

NanoDrop ND-1000 (Thermo) que cuantifica el ADN (ng/µl) a una absorbancia de 260 nm.

Para llevar a cabo la cuantificación con el NanoDrop se utilizó 1 µl de muestra, con el equipo

previamente calibrado con el blanco correspondiente. Para la medición de la muestra se

realizaron diluciones del plásmido (1/10, 1/100 y 1/1000).

4.1.2. Electroporación y plaqueo

Se utilizó el equipo Gene Pulser II (BioRad), electroporando 1 ng de plásmido

puro. En todas las ocasiones se emplearon alícuotas de 75 µl de bacterias electro competentes

adecuadas según el plásmido utilizado, siguiendo protocolos estándar. Las bacterias

transformadas fueron incubadas 1 hora a 37 °C y 220 rpm en medio LB líquido sin

antibiótico. Posteriormente se sembraron en placas de Petri con LB sólido (agregado de 15 g

de agar por litro de LB líquido) y el antibiótico correspondiente.

4.1.3. Extracciones plasmídicas

Las mini preparaciones se realizaron utilizando la técnica estándar de lisis

alcalina (Sambrook et al, 1989). La calidad y rendimiento de las mismas fueron verificadas

mediante electroforesis en geles de agarosa y visualizadas por tinción con bromuro de etidio.

En los casos de recuperación de ADN a partir de geles de agarosa se utilizó el método de

adsorción a matriz de sílica (Gel extraction, Productos Bio-Lógicos).

Se evaluaron varios métodos de obtención de plásmidos y se optó por el más

eficiente en cuanto a la cantidad de ADN obtenida. El mismo consistió en la incubación de un

cultivo de bacterias conteniendo el plásmido de interés en 5 ml de medio LB (5 g extracto de

levadura; 10 g de peptona, 10 g de NaCl; volumen final 1 litro) con los correspondientes

antibióticos, incubando durante 12 horas a 37 °C y 220 rpm.



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Una vez desarrollado el cultivo se centrifugaron 3 ml del mismo para obtener

un pellet bacteriano, en dos tandas de 1,5 ml durante 1 minuto a 16000 xg (Centrífuga

Eppendorf 5418).

El pellet obtenido fue resuspendido en 200 µl de solución isotónica de lavado

(Solución I de Miniprep), utilizando un vortex y se centrifugó durante 1 minuto a 16000 xg,

descartando el sobrenadante. El pellet obtenido fue resuspendido en 200 µl de solución

isotónica de lavado (Solución I de Miniprep) utilizando el vórtex y se agregaron 2 µl de

RNAsa A (25 mg/ml). Luego se agregaron 300 µl de solución de ruptura celular (Solución II

de Miniprep preparada al momento del uso) y se mezcló por inversión hasta la completa

clarificación de la solución. A continuación se agregaron 300 µl de solución de neutralización

(Solución III de Miniprep), y se agitó enérgicamente. El resuspendido se incubó a temperatura

ambiente durante 15 minutos. Luego de la incubación se centrifugó durante 15 minutos a

16000 xg y se recuperó el sobrenandante. Al mismo se le agregó 1 volumen de cloroformo, se

agitó enérgicamente, y se centrifugó a 300 xg durante 5 minutos a 4 °C (Centrífuga Eppendorf

5415 R). Se recuperó la fase acuosa, a la cual se le agregó 1 volumen de isopropanol frío (-20

°C). Luego de incubar la mezcla durante 20 minutos a -20 °C, se centrifugó a 1800 xg durante

20 minutos a 4 °C, se descartó el sobrenadante, y el pellet obtenido se lavó con 500 µl de

etanol 70%. Por último, el precipitado se resuspendió en 20 µl de agua desionizada estéril,

incubado 5 minutos a 50 °C.

Todas las soluciones y reactivos fueron preparadas según los protocolos

descriptos por Sambrook et al, 1989.

4.1.4. Expresión de la proteína en pequeña escala en E. coli

Para expresar la proteasa TEV se utilizó la cepa RosettaTM 2(DE3)-pRIL de E.

coli. Las células transformadas se cultivaron en 50 ml de medio LB conteniendo Ampicilina

(1 X concentración final) y Cloranfenicol (1 X concentración final), a 37 °C y 220 rpm.

Cuando la absorbancia del cultivo alcanzó un valor de 0,5 (a 600 nm), las células fueron

inducidas con IPTG (1 mM concentración final) incubando a 37 °C durante diferentes

tiempos. Las bacterias fueron cosechadas mediante centrifugación a 40 xg durante 10

minutos, y se resuspendieron en el buffer de lisis específico. Luego de la ruptura se separaron



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las fracciones solubles e insolubles y se analizaron por SDS-PAGE (el buffer de siembra 4 X

contiene 200 mM Tris-HCl, 8% de SDS, 40% de glicerol, 0,4% azul de bromofenol y 400

mM de DTT, pH 6,8). Los análisis mediante SDS-PAGE se realizaron de acuerdo a Laemmli

et al, 1970, utilizando geles de acrilamida de 12%, que fueron revelados mediante tinción con

azul de Coomassie R250.

4.1.5. Electroforesis de proteínas

Para el análisis de proteínas se realizaron electroforesis en geles de

poliacrilamida 12% utilizando el sistema de buffer Tris-Glicina en el equipo vertical

Miniprotean III de BIO-RAD. Las muestras se sembraron utilizando el buffer de siembra 4 X

(azul de bromofenol 0,4%, glicerol 40%, SDS 8%, DTT 400 mM, Tris 200 mM pH 6,8),

realizando una incubación previa en presencia del buffer de 5 min a 90 °C. La corrida se

realizó a 35 mA por gel durante 30 minutos y la tinción de los geles se realizó con Coomasie

brilliant blue R250 (Sigma). Todas las soluciones, reactivos y geles fueron preparados según

los protocolos descriptos por Sambrook et al, 1989. Los patrones de peso molecular utilizados

fueron PageRuler Prestained Protein Ladder (Thermo) y ARCOIRIS Pre-stained Protein

Marker (Productos Bio-Llógicos).

4.1.6. Lisis celular

4.1.6.1. Lisis por método físico

Se realizó la lisis mediante French Press. El pellet de células obtenido a partir

de un cultivo saturado de 50 ml, se resuspendió en 10 ml de buffer de carga (50 mM

NaH2PO4, 30 mM NaCl, 3 mM Imidazol). La prensa se utilizó con una presión de 7000 a

10000 psi y se realizó un ciclo de ruptura. Se centrifugó a 40 xg durante 10 minutos, en una

centrífuga de mesa Marca Geler (Rotor G-650).

4.1.7. Purificación de proteasa TEV (condiciones nativas)



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La fracción soluble obtenida, luego de la lisis bacteriana se incubó durante 60

minutos a temperatura ambiente con una resina de Ni2+ (Ni-NTA Agarose, Qiagen),

previamente equilibrada con el buffer de lavado (50 mM NaH2PO4, 30 mM NaCl, 3 mM

Imidazol). Luego se lavó y las fracciones se eluyeron con concentraciones crecientes de

Imidazol (3 mM a 250 mM).

4.1.8. Cuantificación densitométrica de proteinas

La intensidad de las bandas proteicas se midió mediante un análisis

densitométrico utilizando el programa Image J (NIH, Bethesda, USA).



Página 36

5. CAPÍTULO 5

RESULTADOS



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5.1. Resultados

5.1.1. Transformación de cepas bacterianas

Para la transformación del plásmido pRK793 se utilizaron las células

electrocompetentes RosettaTM 2(DE3)-pRIL de E. coli.

Figura 14. Mapa del plásmido pRK793.

Mediante la electroporación, se realiza la transformación del plásmido pRK793

en las bacterias E. coli electrocompetentes “RosettaTM 2(DE3)-pRIL”. Las bacterias

transformadas fueron incubadas para su recuperación debido al stress sufrido durante el shock

eléctrico y posteriormente se sembró en placas de Petri con LB sólido. La placa de LB agar

contiene los antibióticos Cloranfenicol y Ampicilina. El Antibiótico Cloranfenicol

corresponde a la selección de las bacterias, resistencia radicada en el plásmido pRIL propio de

la cepa bacteriana y el antibiótico Ampicilina corresponde a la selección del plásmido

pRK793, el cual posee resistencia a dicho antibiótico. La concentración final de los

antibióticos fue de 1X.



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Figura 15. Esquema representativo de transformación del plásmido pRK793 en

RosettaTM 2(DE3)-pRIL. (A) Electroporación del plásmido pRK793 en RosettaTM 2(DE3)-

pRIL. (B) Recuperación y posterior siembra de RosettaTM 2(DE3)-pRIL transformadas.

5.1.2. Producción de plásmidos

Para la obtención de plásmidos a una escala mayor, para ser utilizados en los

ensayos de expresión de proteínas, se utilizó el método de purificación de lisis alcalina.

5.1.3. Expresión de la proteasa TEV

Con el objetivo de obtener la proteasa TEV, se evaluó la expresión de la misma

utilizando el plásmido pRK793 en la cepa RosettaTM 2(DE3)-pRIL.

Por lo tanto, de las bacterias transformadas con el plásmido pRK793, se tomó

una colonia con un ansa estéril y se inició un cultivo líquido a saturación conteniendo

Ampicilina (1X concentración final) y Cloranfenicol (1X concentración final),

Se tomaron 500 µl del cultivo overnight y se inocularon en 50 ml de medio LB

(dilución 1/100 del cultivo a inducir). El cultivo de 50 ml se dejó incubando hasta que la

absorbancia del cultivo alcanzó un valor de 0,5 (a 600 nm). Luego, las células fueron

inducidas con IPTG (1 mM concentración final).



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Figura 16. Esquema representativo del método de cultivo para la expresión del plásmido

pRK793 en RosettaTM 2(DE3)-pRIL

De forma posterior se realizó una siembra en un gel SDS-PAGE 12% para

verificar la expresión de la proteasa ( Figura 17).

Figura 17. SDS-PAGE del resultado de expresión de pRK793 en E. coli RosettaTM

2(DE3)-pRIL. El recuadro rojo indica la zona correspondiente al peso molecular donde se

espera observar la banda de sobrexpresión. (M) corresponde al marcador de peso molecular

ARCOIRIS Pre-stained Protein Marker (Productos Bio-Lógicos). (1) Clon sin inducido vs. (2)

inducido, de pRK793 en E. coli RosettaTM 2(DE3)-pRIL.



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En la figura 17 se observa el resultado de la expresión para la proteasa TEV en

E. coli RosettaTM 2(DE3)-pRIL. En el recuadro rojo de la figura se muestra la región donde se

espera obtener la sobrexpresión. Por lo tanto, se observa que la inducción con IPTG produce

la expresión de la proteasa TEV.

Para la evaluación de la expresión de la proteasa TEV se utilizaron 4 horas de

expresión con IPTG, pero con el fin de verificar el tiempo óptimo de expresión se realiza

posteriormente una cinética de expresión de la proteasa TEV en E. coli RosettaTM 2(DE3)-

pRIL.

5.1.4. Optimización del rendimiento en la expresión proteica

La optimización del rendimiento en la expresión proteica se realizó mediante la

toma de muestras a diferentes tiempos luego de la inducción con IPTG.

Luego de la inducción se tomaron muestras del cultivo cada 30 minutos,

considerando que aproximadamente cada 20 minutos ocurre la duplicación bacteriana. En las

tomas de muestra realizadas para la medición de la absorbancia, siempre se trabajó bajo

condiciones asépticas en mechero preservando la esterilidad del cultivo y además cada

alícuota se mantuvo en hielo con el fin de frenar el crecimiento de las bacterias.

El proceso de toma de muestra consistió en tomar 500 µl del cultivo inducido,

del cual se utilizaron 100 µl para medir la absorbancia de la muestra y 400 µl para la siembra

en geles SDS-PAGE. Cada alícuota de 100 µl de cultivo fue llevada a 1 ml de volumen final

con LB líquido y se midió la absorbancia. Con el valor de absorbancia obtenido de cada

muestra se cálculó que volumen correspondía a un valor de absorbancia de 0,2 (a 600 nm).

Dicho volumen se utilizó para la siembra en un gel SDS-PAGE.

Se realizaron 13 tomas de muestras con una diferencia de 30 minutos entre

ellas. (Figura 18)



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Figura 18. Curva de crecimiento del cultivo de pRK793 en RosettaTM 2(DE3)-pRIL.

En la figura 18 se muestra un gráfico de crecimiento, medido por DO600, en

función del tiempo de un cultivo de pRK793 en RosettaTM 2(DE3)-pRIL. En el mismo se

observa un aumento del crecimiento del cultivo hasta el T11 (5,5 horas), posterior a este

tiempo se observa un retardo en el crecimiento, probablemente como consecuencia del gasto

energético involucrado en la sobrexpresión de las proteínas MBP y His6-TEV(S219V)-Arg5

(proteasa TEV).

Para evaluar un buen rendimiento productivo de la proteína His6-

TEV(S219V)-Arg5, se evaluó la inducción a diferentes tiempos con el fin de determinar el

tiempo de expresión mínimo que muestre una mayor producción del la proteína His6-

TEV(S219V)-Arg5. El resultado mostrado en el figura 19 evidencia que la expresión de

His6-TEV(S219V)-Arg5 óptima se encuentra entre los tiempos T7, T8 y T9. En base a esto,

se procede a la cuantificación densitométrica sobre la imagen del gel SDS-PAGE de la puesta

a punto de la expresión de la proteasa TEV con el fin de determinar específicamente el tiempo

óptimo de expresión.

0,0000,0500,1000,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500,500

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13

Densidad

optica(DO

600)

Tiempodecultivo

CurvadecrecimientodeRosettaTM2(DE3)-pRIL



Página 42

Figura 19. SDS-PAGE del resultado de la puesta a punto de la expresión de la proteasa

TEV. Se evaluaron las condiciones 1mM IPTG a 37°C, tomando muestras a las 0 horas (T0),

30 minutos (T1), 1 hora (T2), 1,5 horas (T3) y así sucesivamente hasta el T13. (M)

corresponde al marcador de peso molecular PageRuler Prestained Protein Ladder, (Thermo).

El análisis sobre la imagen del gel SDS-PAGE de la puesta a punto de la

expresión de la proteasa TEV consistió en la medición de la densidad integrada de las bandas

a 27 kDa mediante el Software ImageJ. La medición de la densidad integrada de cada banda

de 27 kDa fue divida por la densidad integrada de la calle en cuestión obteniendo una

densidad normalizada (Ecuación 1).

𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎 𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎 = !"#$%&'& !"#$%&'(' !" !"#$" !" !" !"#!"#$%&'& !"#$%&'(' !" !"##$ !"#$%&'(

(1)

La relación resultante devolvió un valor el cual se dividió por el valor de

relación obtenido en la calle 1 (T0) (Ecuación 2).

𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 = !"#$%&'& !"#$%&'(' !"#$%&'(%)% !"##$ ! !"#$%&'& !"#$%&'(' !"#$%&'(!"! !"##$ !

(2)

Estas mediciones se hicieron por triplicado y se utilizó el promedio de las

mismas. Por lo tanto se obtuvo un gráfico de cinética de expresión relativa de la proteasa TEV

en la figura 20.



Página 43

Figura 20. Cinética relativa de expresión del plásmido pRK793.

En la cinética relativa de expresión del plásmido pRK793 se puede observar

que hasta el T7 (3,5 horas) la expresión crece exponencialmente llegando a un punto de

inflexión. Posterior a este tiempo, la expresión se mantiene prácticamente constante hasta la

muestra T13 (6,5 horas). Por lo tanto no se obtendría una mejora sustantiva incubando más

allá de las 3,5 o 4 horas. En un proceso productivo seriado, la incubación durante 4 horas

permitiría obtener una cantidad acumulada de producto mayor que con mayores tiempos de

incubación.

En base a los resultados detallados previamente en las Figura 18, 19 y 20, se

seleccionó como condición de expresión 4 horas de expresión a 37 °C utilizando 1 mM de

IPTG en la cepa RosettaTM 2(DE3)-pRIL de E. coli.

5.1.5. Stock de bacterias transformadas

De un cultivo líquido overnight a saturación de 5 ml de medio LB conteniendo

Ampicilina (1X concentración final) y Cloranfenicol (1X concentración final), se realizaron

stocks de bacterias con glicerol para poder almacenarlas a -80 °C.

Para la realización del stock de bacterias transformadas se tomaron 500 µl de

cultivo saturado y se agregó 88 µl de glicerol. Luego se almacenaron los tubos a -80 °C.

1

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13

Densidad

integrad

arelativ

a

Tiemposdeexpresión

CinéticarelativadeexpresióndepRK793



Página 44

La importancia de la creación de un stock de bacterias radica en la utilización

de un mismo cultivo de bacterias descartando la variabilidad entre los diferentes ensayos.

Además, de un tubo de stock de bacterias se logran largar varios cultivos Overnight de bajo

volumen con el fin de inocular volúmenes mayores.

5.1.6. Cultivo celular para la producción de la proteasa TEV

Para la producción de la proteasa TEV se largó un cultivo overnight a partir de

un stock de bacterias. Por lo tanto, se tomó la bacteria almacenada a -80 °C, teniendo el

cuidado de que el cultivo dentro del tubo no se descongele.

Se cultivaron en 5 ml de medio LB con Ampicilina (1X concentración final) y

Cloranfenicol (1X concentración final), conteniendo un pequeño volumen del stock de

bacterias. Posteriormente se dejó incubando durante 12 horas (Overnight) para poder inocular

el cultivo final. Paralelamente se preparó un erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de LB agar.

Transcurridas las 12 horas de incubación del cultivo saturado se realizó la

inoculación del cultivo de 50 ml. Quinientos microlitros del cultivo overnight (saturado)

fueron inoculados en los 50 ml de medio de cultivo (dilución 1/100). Luego, se incubó

durante 2,5 horas para alcanzar un valor de absorbancia de 0,5 (a 600 nm). Transcurridas este

tiempo las células fueron inducidas con IPTG (1 mM concentración final).

Para realizar la medición de la absorbancia se tomó 1 ml de cultivo. Y se

tomaron 5 ml de cultivo para utilizarlo como cultivo no inducido con IPTG. Por lo tanto, el

volumen final de cultivo inducido con IPTG fue de 44 ml. Los cultivos inducido y sin inducir

fueron incubados.

5.1.7. Lisis celular

5.1.7.1. Lisis por método mecánico

La ruptura celular por métodos físicos es ampliamente utilizada, pero poseen

algunas desventajas. Dado que las células sufren una ruptura completa, todos los materiales

intracelulares se liberan al medio, lo que produce una mezcla de componentes solubles más

compleja y viscosa, como producto de la liberación de los ácidos nucleicos. Por otro lado,



Página 45

métodos de ruptura mecánicos exponen las células y su contenido a condiciones extremas de

temperatura y/o presión, produciendo en muchos casos la desnaturalización del producto.

En este trabajo se utilizó un método físico mecánico, el cual rompe la

membrana plasmática de las células a través del pasaje de las mismas por una válvula estrecha

a alta presión (French Pressure Cell Press).

Para la realización de la lisis celular por método mecánico se centrifugaron 44

ml de un cultivo de bacterias transformadas inducido con IPTG. Luego de la centrifugación se

descartó el sobrenadante y se obtuvo un pellet bacteriano. El pellet bacteriano se resuspendió

en 10 ml de Buffer de carga.

A partir del lisado por método mecánico, se obtuvieron 9,5 ml de lisado. El

cual se centrifugó durante 10 minutos a 4 °C y se tomó 1 ml del sobrenadante para la

purificación de la proteasa TEV.

Figura 21. Esquema representativo de los métodos de lisis por Prensa Francesa.



Página 46

5.1.8. Purificación por columna de Ni-NTA

La purificación se llevó a cabo utilizando una resina de Ni+2 (IMAC, Qiagen).

Para maximizar la eficiencia de la purificación se trabajó en batch.

Inicialmente se realizó la unión a la matriz Ni-NTA, sintéticamente 1 ml de

sobrenadante proveniente de la lisis se mezcló con la resina Ni-NTA mediante rotación

continua. Luego se centrifugó durante 2 minutos a 5000 xg y se tomó el sobrenadante para

control. Al pellet de resina se le agregaron 500 µl de Buffer de lavado. Luego de cada lavado

se tomó el sobrenadante para control. Los lavados se realizaron con baja concentración de

Imidazol (50-125 mM Imidazol). Posteriormente se realizó la elución incrementando la

concentración de Imidazol a 250 mM.

Figura 22. Esquema representativo del método de purificación por columna de Ni-NTA



Página 47

Los resultados obtenidos con el sobrenadante mediante la lisis mecánica se pueden ver

en la Figura 23.

Figura 23. SDS-PAGE de la purificación de pRK793 por IMAC en batch. Purificación de

sobrenadante de lisis en Prensa Francesa. En la parte superior de la figura se indican las

concentraciones de Imidazol utilizadas en cada condición. (M) corresponde al marcador de

peso molecular ARCOIRIS Pre-stained Protein Marker (Productos Bio-Lógicos).

En la figura 23 se puede observar que la condición de lavado con 125 mM de

Imidazol es capaz de eluir la proteína His6-TEV(S219V)-Arg5 y que incrementando la

concentración de Imidazol a 250 mM se eluye mayor cantidad.

5.1.9. Formulación del buffer de reacción

El buffer estándar de reacción de la proteasa TEV es 50 mM Tris-HCl (pH

8.0), 0,5 mM EDTA and 1 mM DTT.

La duración estándar de la reacción de clivaje normalmente es overnight,

aunque la mayor tasa de escisión ocurre en las primeras horas. La máxima actividad de la

proteasa TEV es a los 34 °C, pero se recomienda realizar la digestión a temperatura ambiente

(20 °C) o 4 °C ya que la proteasa es solo tres veces menos activa a 4 °C que a 20 °C

(Nallamsetty et al, 2004)



Página 48

6. CAPÍTULO 6

DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS



Página 49

6.1. Discusión

Este trabajo tuvo como objetivo principal el desarrollo y producción local de la

proteasa TEV. El sistema propuesto fue la expresión del plásmido pRK793 en la cepa

RosettaTM 2(DE3)-pRIL de E. coli.

Inicialmente se realizó una curva de expresión de la proteasa TEV en la cepa

ya nombrada, con el fin de determinar un tiempo óptimo de expresión. Al realizar esta curva,

se observó que el máximo de expresión se obtuvo a las 4 horas, con escaso incremento en

tiempos posteriores.

Utilizando el método de lisis mecánica, se observó un buen rendimiento en la

obtención de la proteasa TEV. Por lo tanto, se recomienda en futuros proyectos, una puesta a

punto de este método de lisado y la posterior purificación. La realización de este tipo de lisis

requiere contar con una prensa mecánica, lo que genera un costo de inversión que luego se

refleja en el costo de final de la proteasa TEV.

Posterior a la lisis del pellet bacteriano, se realizó la purificación utilizando una

resina de Ni+2 (IMAC, Qiagen). Si bien se ensayó la purificación por cromatografía en

columna, para maximizar la eficiencia de purificación se trabajó en batch. En los resultados

de purificación se observó que se pudo obtener en buena concentración la proteasa TEV

(banda en 27 kDa). Además se puede visualizar la banda de la proteína MBP (banda en 42

kDa) que deriva del clivaje in vivo por la proteasa TEV.

Mediante la realización de este proyecto quedaron evidencias claras sobre la

expresión y purificación de una proteasa TEV soluble y estable (His6-TEV(S219V)-Arg5) en

la cepa ingenierizada RosettaTM 2(DE3)-pRIL de E. coli. Con los resultados de este proyecto

se puede realizar y escalar un diseño productivo con el fin de comercializar a nivel local la

proteasa TEV, considerando el buen comportamiento durante el crecimiento bacteriano, la

lisis celular y la purificación.

El método de lisis deberá ser seleccionado teniendo en cuenta el

costo/beneficio. La lisis mediante prensa mecánica (French press) requiere la inversión inicial

de la adquisición del equipamiento. Sin embargo, el costo de esta inversión puede diluirse si

en el emprendimiento se expresan y purifican múltiples proteínas recombinantes.

Con respecto al control del clivaje de la proteasa TEV purificada en este

proyecto, se obtuvo en evidencia el correcto funcionamiento de la proteasa TEV mediante el



Página 50

clivaje in vivo de la proteína de fusión MBP-His6-TEV(S219V)-Arg5, lo cual permite obtener

una proteasa TEV soluble y estable en comparación con su versión wild-type.



Página 51

6.2. Perspectivas

Los resultados obtenidos en este proyecto son alentadores para la producción

local de la proteasa TEV y se considera como un buen punto inicial para que a nivel local se

produzcan insumos con impacto en ciencia y tecnología.

Para seguir con una producción a nivel local se debería desarrollar en primer

lugar una proteína blanco con el fin de utilizarla para el control de calidad. Dicha proteína

debe poseer, al menos, un sitio de clivaje interno para la proteasa TEV.

Con respecto a la parte productiva de la proteasa TEV, se debe poner a punto la

purificación de la proteasa determinando la concentración máxima de lavado y la mínima de

elución e incorporar ensayos de cuantificación proteica con el fin de aumentar el rendimiento

en esta etapa de downstream.

Además, se debería definir una formulación de almacenamiento de la proteasa

TEV considerando que la estabilidad del producto dependerá de su composición. Por lo tanto,

con el fin de conservar las propiedades químicas, físicas y reactivas se tendrán que efectuar

ensayos de estabilidad que garanticen la conservación de estas propiedades.

Finalmente se debería desarrollar una formulación del buffer de reacción de la

proteasa TEV con la finalidad de obtener un buen rendimiento de reacción.



Página 52

7. CAPÍTULO 7

BIBLIOGRAFÍA



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PROYECTO FINAL DE INGENIERÍA PRODUCCIÓN LOCAL DE …

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