PRUEBA No RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS EN AGUA POTABLE. (FLORA HETEROTROFICA)

1. INTRODUCCION

El recuento total de organismos es utilizado como un análisis auxiliar en el control de la potabilidad del agua, control de agua de piscinas y control de las condiciones higiénicas de las diversas etapas en la planta de tratamiento.

Para el control de agua de consumo en reservorios y en la red de distribución se recomienda un máximo de 500 colonias promedio por mes.

Para asegurar alta precisión en los resultados se recomienda utilizar placas triplicadas de cada dilución de la muestra. Sin embargo, en el análisis de rutina es aceptable utilizar placas duplicadas para recuento total por cada dilución y cada temperatura de incubación.

2. OBJETIVO

Al finalizar la práctica el estudiante estará en capacidad de determinar la calidad microbiológica de muestras de agua potable mediante el recuento de la flora aerobia mesofílica.

3. MATERIALES

1 muestra de agua: Ya sea del grifo o de alguna otra fuente .8 cajas de petri vacías estériles100 mls de agar Plate count en erlenmeyer de 250 ml1 mechero con alcohol1 frasco con 99 ml de agua estéril5 pipetas de 2 ml estériles1 pera de caucho1 micropipeta con volumen de 100 microlitrosPuntas de pipeta amarillas1 jarra para descartar pipetasIncubadora a 35 ± 0.5 °CEstufa

4. PROCEDIMIENTO:

Homogenizar la muestra agitando varias veces.

Haga diluciones 10 0, 10 -1, 10-2, 10-3, o más si la muestra lo requiere.

Dilución 10 0: Agregue 1 ml de la muestra total a una caja de petri vacía, y de este modo se obtiene la primera dilución 10 0.

Dilución 10 -1: Agregue 0.1 ml ( 100 microlitros ) de la muestra total a una segunda caja de petri.

Dilución 10 -2: Agregue al frasco de dilución con 99 ml de agua destilada estéril 1 ml de la muestra total, y una vez homogenizado, sembrar 1ml en una tercera caja de petri para obtener la dilución 10 -2.

Dilución 10 -3: Del frasco anterior, siembre 0.1 ml ( 100 microlitros ) en una cuarta caja de petri, obteniéndose la dilución 10 -3.

Agregue a cada caja de petri 15 a 20 ml de Agar Plate Count fundido y a 44 °C. Mezcle bien rotando las cajas sobre la mesa.

Deje solidificar, invierta e incube a 35 ± 0.5 °C por 24 a 48 horas.

Cuente todos las cajas que presenten entre 30 - 300 colonias por caja. Si el número total de colonias desarrolladas a partir de 1 ml de la muestra es menor, no tenga en cuenta la regla anterior.

Calcule el número de bacterias y expréselo en UFC/ml

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALESNUMERO MÁS PROBABLE (NMP)

En este método preparamos diluciones del alimento igual que el recuento en placa, sin embargo

por ser un método estadístico los resultados son generalmente mas elevados que el recuento en

placa. Este método ofrece las siguientes ventajas:

- Es relativamente sencillo.

- Los resultados son coincidentes con los de otros laboratorios.

- Se pueden determinar el número de microorganismos específicos variando el medio.

- Es el método de elección para determinar la densidad de coliformes fecales.

El NMP es una técnica ampliamente utilizada en la determinación de la densidad de

microorganismos viables en una muestra. El método del NMP es un procedimiento indirecto y

estimado en contraste con la técnica en placa, este es un método mas eficaz en muestras de baja

población microbiana, menos de 10 células por mL.

Es una prueba que se aplica a la investigación de coliformes, pero variando el medio de cultivo se

emplea para recuento de Stafilococcus, Streptococcus, Vibrio, Salmonella, Bacillus cereus etc.

La metodología se basa en la siembra de volúmenes secuenciales de base 10(10, 1, 0.1, 0.01)

de la muestra sin diluir o de diluciones secuenciales, estas diluciones dependen del grado de

contaminación de la muestra y de los estándares microbiológicos del producto. Cuando el grado

de contaminación es desconocido se sugiere preparar de 4-5 diluciones. De cada dilución se

transfieren alícuotas de 1 ml a varios tubos de (3-5) con medio de cultivo. La relación volumen de

muestra medio de cultivo es de 1/10.

5.1 MATERIALES.

-Muestra a analizar.

-Balanza.

-Frascos y tubos con diluyente.

-Pipetas de 10, 5 y 1 mL.

-Diluciones de la muestra.

-Incubadora.

-Gradilla.

-Pipetas de 1 ml

-9 tubos de 150 x 16 mm conteniendo 10 ml de caldo bilis verde brillante con tubos de

fermentación.

5.2 PROCEDIMIENTO

_ Inocular de cada una de las diluciones 10-1 10-2 10-3 1 ml a cada uno de tres tubos

conteniendo caldo bilis verde brillante, incubar los tubos a 35o C durante 24 o 48 horas, observar

los tubos que presenten producción de gas y turbidez, comparar en la tabla de NMP e informar

como coliformes por gr. o ml.

CRITERIOS DE LECTURA: La lectura del NMP depende del medio de cultivo utilizado y del

microorganismo investigado.

1. Turbidez: Su presencia es indicadora de crecimiento bacteriano, si la muestra genera

turbidez en el medio es necesario emplear otro parámetro de lectura o utilizar pruebas

complementarias.

2. Productos metabólicos finales: La producción de gas por los microorganismos son

capturados y observados colocando tubos de Durham en el medio antes de la

esterilización. Una reacción positiva se evidencia por la presencia de burbujas en el interior

del tubo.

3. Detección de ácidos o bases: Determinando después de la incubación el pH 0 acidez

titulable en cada tubo o usando un colorante indicador de pH.

Entre las pruebas complementarias se pueden utilizar examen microscópico directo, subcultivo a

medios líquidos o sólidos.