Pruebas bioquímicas de Pruebas bioquímicas de identificaciónidentificación

Bioq. María de los Ángeles SosaBioq. María de los Ángeles Sosa

Pruebas de Identificación Pruebas de Identificación rápidasrápidas

1.1.Prueba de la catalasaPrueba de la catalasa2.2.Prueba de la coagulasaPrueba de la coagulasa3.3.Prueba de PYRPrueba de PYR4.4.Prueba de oxidasaPrueba de oxidasa

Pruebas de Identificación para Pruebas de Identificación para Cocos Gram +Cocos Gram +

1.1. DNasaDNasa2.2. Prueba del manitol saladoPrueba del manitol salado3.3. Bilis esculinaBilis esculina4.4. CAMPCAMP5.5. Hidrólisis del hipuratoHidrólisis del hipurato6.6. Voges –ProskauerVoges –Proskauer

Pruebas de sensibilidad a ATBPruebas de sensibilidad a ATB

1.1. Disco de OptoquinaDisco de Optoquina2.2. Disco de novobiocinaDisco de novobiocina3.3. Disco de BacitracinaDisco de Bacitracina

catalasacatalasa

Prueba de la catalasaPrueba de la catalasaFundamentoFundamento: Detecta la presencia de la enzima : Detecta la presencia de la enzima

catalasa.catalasa.ProcedimientoProcedimiento: En portaobjetos colocar sobre una : En portaobjetos colocar sobre una

colonia unas gotas de Hcolonia unas gotas de H22002 2 3 %. 3 %. HH22002 2 HH220 + 00 + 022

Liberación de burbujas rápida y sostenida Liberación de burbujas rápida y sostenida indica indica la producción de oxígeno molecular la producción de oxígeno molecular = prueba (+)= prueba (+)

ConsideracionesConsideraciones: : No Agar sangre (No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).peroxidasa en los eritrocitos).

coagulasacoagulasa

Prueba de la coagulasaPrueba de la coagulasaFundamentoFundamento: Detecta un factor de agregación “clumping factor” en la : Detecta un factor de agregación “clumping factor” en la

superficie de la bacteriana.superficie de la bacteriana.ProcedimientoProcedimiento: : se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a

una especie de una especie de StaphylococcusStaphylococcus y se emulsifica en una gota de y se emulsifica en una gota de plasma de conejo.plasma de conejo.

InterpretaciónInterpretación: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto = prueba (+).: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto = prueba (+).Si el resultado es negativo ensayar la producción de coagulasa en Si el resultado es negativo ensayar la producción de coagulasa en

tubo.tubo.

ConsideracionesConsideraciones: : UU

tilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces tilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+).falsos (+).

LLas pruebas (-) luego de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar a as pruebas (-) luego de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma fibrinólisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC. prolongada a 35ºC.

Prueba de PYRPrueba de PYR

Prueba del PYR: Prueba del PYR:

Fundamento:Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para la identificación rápida de enterococos. la identificación rápida de enterococos.

ProcedimientoProcedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir : Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir un disco de PYR. un disco de PYR.

Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.

Tiempo de lectura: 5 minutos.Tiempo de lectura: 5 minutos.

InterpretaciónInterpretación: :

Disco rosado o rojo (+)Disco rosado o rojo (+)

Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).

ConsideracionesConsideraciones: Algunas especies de : Algunas especies de StaphylococcusStaphylococcus y los y los estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva. estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.

DNAsaDNAsa

Prueba de la DNAsaPrueba de la DNAsa

Fundamento:Fundamento: El El S. aureusS. aureus produce una DNAasa produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA.termoestable que hidroliza DNA. La producción de La producción de DNAsa puede determinarse incorporando ácido DNAsa puede determinarse incorporando ácido desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo .desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo .

ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo en en manchas densas sobre agar DNAmanchas densas sobre agar DNA y después de 18 a 24 y después de 18 a 24 hs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipita hs de incubación. Revelar con HCl al 1%, que precipita el DNA nativo del medio.el DNA nativo del medio.

InterpretaciónInterpretación: colonias rodeadas por una zona clara : colonias rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado = donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado = prueba (+)prueba (+)

Manitol saladoManitol salado

Agar Manitol saladoAgar Manitol salado

FundamentoFundamento: el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 : el medio contiene manitol (1%), cloruro de sodio (7,5 %), rojo de fenol y peptonas. %), rojo de fenol y peptonas. ProcedimientoProcedimiento: Sembrar la cepa e incubar : Sembrar la cepa e incubar 18 a 24 hs a 35ºC.18 a 24 hs a 35ºC. InterpretaciónInterpretación::

Crecimiento y viraje Crecimiento y viraje S. aureusS. aureus

Crecimiento sin viraje. Crecimiento sin viraje. S. epidermidisS. epidermidis

ConsideracionesConsideraciones: : La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto

enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para aislamiento). aislamiento).

Bilis EsculinaBilis Esculina

Prueba de la bilis-esculina:Prueba de la bilis-esculina:

Fundamento:Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias Se basa en la capacidad de ciertas bacterias (estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia (estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia de 1-4% de sales biliares.de 1-4% de sales biliares.ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo en la superficie de en la superficie de un pico de flauta. Incubarun pico de flauta. Incubar 24 hs. 24 hs. InterpretaciónInterpretación: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa : La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina se complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina se observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación hasta que la hidrólisis sea aparente.hasta que la hidrólisis sea aparente.ConsideracionesConsideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de : Es importante que el medio contenga 40% de bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos

Prueba de CAMPPrueba de CAMPFundamento:Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-hemolítica de hemolítica de S. aureusS. aureus (ATCC 25923) lo que causa un (ATCC 25923) lo que causa un acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis. acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis.

ProcedimientoProcedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estría de la : En placa de agar sangre sembrar una estría de la cepa de cepa de S. aureusS. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más cerca y perpendicularmente a ésta (lo más cerca posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en estudio.estudio.

Tiempo y Tº de incubaciónTiempo y Tº de incubación:: Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis (en CO2 aumentan los falsos positivos). (en CO2 aumentan los falsos positivos).

InterpretaciónInterpretación: El sinergismo se observa como un área de ß-: El sinergismo se observa como un área de ß- Hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona Hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona de desarrollo más cercana a ambas estrías. de desarrollo más cercana a ambas estrías.

Prueba de CAMPPrueba de CAMP

Prueba del hipurato de sodio Prueba del hipurato de sodio

Fundamento:Fundamento: Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina. hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina.

ProcedimientoProcedimiento::

Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%. el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%.

Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina.microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina.

InterpretaciónInterpretación: :

La formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos La formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos = prueba (+) Benzoato de sodio = prueba (+) Benzoato de sodio

La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina. La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.

Hidrólisis de hipuratoHidrólisis de hipurato

Prueba de la susceptibilidad a Prueba de la susceptibilidad a lala NovobiocinaNovobiocina

Fundamento:Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la novobiocina.novobiocina.ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo en en agar Mueller agar Mueller Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de Novobiocina (5 µg). Novobiocina (5 µg). InterpretaciónInterpretación: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro : Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro mayor o igual a 16 mm mayor o igual a 16 mm

Staphylococcus Staphylococcus RR MicrococcusMicrococcus S S

ConsideracionesConsideraciones: : Kirby Bauer (Difusión en disco)Kirby Bauer (Difusión en disco)Inoculo sin incubación previaInoculo sin incubación previaTiempo de lectura: 24 hs.Tiempo de lectura: 24 hs.Tº de incubación: 33º a 35ºTº de incubación: 33º a 35º

Prueba de la Bacitracina:Prueba de la Bacitracina:

Fundamento:Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la bacitracina.bacitracina.ProcedimientoProcedimiento: Se inocula el microorganismo: Se inocula el microorganismo en AS en AS según técnica según técnica de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U). de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U). InterpretaciónInterpretación: Sensible: Cualquier zona de inhibición del : Sensible: Cualquier zona de inhibición del desarrollo. desarrollo. ConsideracionesConsideraciones: : Kirby Bauer (Difusión en disco)Kirby Bauer (Difusión en disco)Inoculo sin incubación previaInoculo sin incubación previaTiempo de lectura: 18 a 24 hs.Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.Tº de incubación: 33º a 35º en CO2Tº de incubación: 33º a 35º en CO2Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a 50% de falsos negativos. 50% de falsos negativos.

Prueba de la BacitracinaPrueba de la Bacitracina

Prueba de la optoquinaPrueba de la optoquina

Pruebas de Identificación para Pruebas de Identificación para enterobacteriasenterobacterias

1.1. Prueba OFPrueba OF2.2. Prueba de la oxidasa o citocromooxidasaPrueba de la oxidasa o citocromooxidasa3.3. TSITSI4.4. SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad)SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad)5.5. Rojo de metilo - Voges –ProskauerRojo de metilo - Voges –Proskauer6.6. ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido)ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido)7.7. CitratoCitrato8.8. UreasaUreasa9.9. Fenil-alanina-desaminasaFenil-alanina-desaminasa10.10.DescarboxilasasDescarboxilasas

OxidasaOxidasa

NEG POS

CITOCROMOOXIDASA O CITOCROMOOXIDASA O PRUEBA DE LA OXIDASAPRUEBA DE LA OXIDASA

Fundamento:Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en El sistema citocromooxidasa, se halla en microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.

Procedimiento:Procedimiento: Hacer una suspensión del microorganismo con Hacer una suspensión del microorganismo con solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco solución fisiológica (inóculo) en un tubo de vidrio, agregar un disco (disco comercial de papel impregnado de(disco comercial de papel impregnado de tetrametil-para- tetrametil-para-difenilaminadifenilamina) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. ) se agita y antes de los 2 minutos se debe leer.

InterpretaciónInterpretación: Un cambio de color del disco a rosado o violeta = : Un cambio de color del disco a rosado o violeta = prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa prueba (+). Si no hay cambio de color el microorganismo es oxidasa negativo.negativo.

ConsideracionesConsideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias Esta prueba no puede realizarse con colonias que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar(tripteina-soya-agar))

Prueba OFPrueba OF

PRUEBA DE OXIDACIÓN PRUEBA DE OXIDACIÓN FERMENTACIÓN (O-F)FERMENTACIÓN (O-F)

Fundamento:Fundamento: Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de Determinan el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio O-F de un hidrato de carbono o su falta de utilización. Se usa el medio O-F de Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una Hugh y Leifson que contiene peptonas e hidratos de carbono en una relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, hay menor relación 1:5. Al ser menor la concentración de peptonas, hay menor producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a producción de productos de oxidación a partir de los AA que tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los elevar el pH y pueden neutralizar los ácidos débiles producidos por los microorganismos no fermentadores. microorganismos no fermentadores. ProcedimientoProcedimiento: Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la : Se utilizan 2 tubos con el medio O-F, se hace la siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los siembra con ansa de punta hasta el fondo de los dos tubos. Uno de los tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estéril.tubos queda expuesto al aire, y el otro se cubre con vaselina estéril.InterpretaciónInterpretación::Microorganismos oxidativo:Microorganismos oxidativo: producen ácido solo en el tubo abierto, producen ácido solo en el tubo abierto, expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al expuesto al O2 atmosférico. Por lo que solamente el tubo expuesto al aire atmosférico cambia su color original a amarillo.aire atmosférico cambia su color original a amarillo.Microorganismos fermentadoresMicroorganismos fermentadores: producen ácido en los 2 tubos. O : producen ácido en los 2 tubos. O sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.sea que los dos tubos viran del verde al amarillo.Bacterias sacarolíticasBacterias sacarolíticas: son inertes a este medio que conserva su pH : son inertes a este medio que conserva su pH alcalino después de la incubación, conservando su color original.alcalino después de la incubación, conservando su color original.

Triple Azúcar HierroTriple Azúcar Hierro

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR) AGAR)

Fundamento:Fundamento: Sirve para detectar la Sirve para detectar la fermentación de hidratos de carbono.fermentación de hidratos de carbono. El medio El medio contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa contiene: glucosa al 0.1%, lactosa 1%, sacarosa al 1% y peptonas; también tiene un indicador al 1% y peptonas; también tiene un indicador rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar rojo de fenol y sulfato de hierro para evidenciar la formación de SH2.la formación de SH2.Procedimiento:Procedimiento: El medio se fracciona en picos El medio se fracciona en picos de flauta con una capa basal profunda (2 cm. de flauta con una capa basal profunda (2 cm. por lo menos). Con el ansa en punta se siembra por lo menos). Con el ansa en punta se siembra por por punción y estríapunción y estría..

El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o El medio no inoculado es anaranjado-rojizo o rojo pálido. Incubar 24 hs a 35º C.rojo pálido. Incubar 24 hs a 35º C.

TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO TSI (TRIPLE AZÚCAR HIERRO AGAR) AGAR)

InterpretaciónInterpretación:: Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido)Fermentación de la glucosa (alcalino/ácido) Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo

ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente ácidos y virando totalmente el medio a color amarillo. Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs) glucosa que se halla en baja concentración se consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de los microorganismos comienzan a utilizar la peptonas con producción de amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el amoníaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en el pico, quedando el fondo ácido. pico, quedando el fondo ácido. Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido)Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (ácido/ácido)

Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la Como la lactosa y sacarosa están en una proporción 10 veces mayor que la glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se glucosa, en un período de 24hs., la lactosa y sacarosa, aún no se consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo. consumen quedando ácido el medio o sea totalmente amarillo. 3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un 3) No fermentación de lactosa, sacarosa ni glucosa (alcalino/alcalino). Un microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de microorganismo incapaz de obtener sus nutrientes de los hidratos de carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas carbono, lo obtiene de las peptonas. Cuando las peptonas son degradadas libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces libran amoníaco y alcalinizan el medio. Produciéndose entonces intensificación del color.intensificación del color.

Consideraciones del TSIConsideraciones del TSI

Es importante respetar el Es importante respetar el tiempotiempo de lectura, porque si el caso 1 se de lectura, porque si el caso 1 se lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si lee antes de las 24hs. se va a interpretar como ac/ac y no lo es. Si el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedan el 2 se lee después de las 24hs, los microorganismo ya se quedan sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas sin hidratos de carbono, entonces comienzan a utilizar las peptonas y se alcaliniza el medio. y se alcaliniza el medio. Con respecto al Con respecto al sulfhídricosulfhídrico pueden presentarse distintas pueden presentarse distintas modalidades:modalidades:Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas, Pico rojo, fondo amarillo con precipitado negro y formación de gas, esto se puede dar en esto se puede dar en SalmonellaSalmonella, se lee: alc/ac (SH2) (gas), se lee: alc/ac (SH2) (gas)También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee: También se puede ver totalmente amarillo y el fondo negro: se lee: ac/ac (SH2).ac/ac (SH2).Además se puede visualizar en el tubo la producción de Además se puede visualizar en el tubo la producción de gasgas por por parte del microorganismo, entonces en el medio se observan parte del microorganismo, entonces en el medio se observan burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo burbujas, resquebrajamiento, o si no todo el medio de cultivo aparece levantado.aparece levantado.

SIM

SIM (SULFHÍDRICO – INDOL – SIM (SULFHÍDRICO – INDOL – MOVILIDAD)MOVILIDAD)

FundamentoFundamento: Es un medio semi-sólido transparente que pone en evidencia la : Es un medio semi-sólido transparente que pone en evidencia la movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene:movilidad, la producción de triptofanasa y de SH2. Contiene:Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone de Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovacmanifiesto con el reactivo de Erlich o KovacCitrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2 ennegrecen Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2 ennegrecen el medio de cultivoel medio de cultivoSi los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se produce Si los microorganismos son móviles, al ser éste un medio semi-sólido se produce enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la punción.enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la punción.ProcedimientoProcedimiento: se inocula el microorganismo por : se inocula el microorganismo por punciónpunción con ansa de punta. con ansa de punta. Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se agregan unas Se deja incubar a 35ºC durante 24hs. y luego de este tiempo se agregan unas gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por las paredes del tubo. gotas del reactivo de Erlich o Kovac dejándolo resbalar por las paredes del tubo. InterpretaciónInterpretación::Triptófano (+)Triptófano (+): observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia brillante : observar la interfase, la aparición de un color rojo fucsia brillante por la formación de un complejo entre el indol y el p-dimetilaminobenzaldehido.por la formación de un complejo entre el indol y el p-dimetilaminobenzaldehido.M (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medioM (+) / SH2 (-) enturbiamiento del medioM (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medioM (+) / SH2 (+), se ennegrece todo el medioM (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estríaM (-) / SH2 (-) se observa crecimiento solamente en la estríaM (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no M (-) / SH2 (+), se observa precipitado negro alrededor de la estría (pero no ennegreciendo de todo el medio).ennegreciendo de todo el medio).

SIM

SH2+ Ind+ Mot+

SH2+ Ind- Mot-

SH2- Ind+ Mot+

SH2- Ind- Mot-

Prueba de VP y RMPrueba de VP y RM

ROJO DE METILO – VOGES ROJO DE METILO – VOGES PROSKAUER:PROSKAUER:

Fundamento:Fundamento: El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la El acido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto fermentación de la glucosa, es metabolizado aún mas a través de cierto numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción numero de vías metabólicas. Una de ellas da como resultado la producción de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En de acetoína (acetil-metil-carbinol) un producto final de reacción neutra. En presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo presencia de oxigeno e KOH al 40%, la acetoína es convertida en diacetilo y el y el αα naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo. naftol sirve como catalizador para producir un complejo de color rojo.ProcedimientoProcedimiento: Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos : Se usa el mismo caldo de enriquecimiento para las dos pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a pruebas (2ml), se hace la inoculación del microorganismo, y se lleva a incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..incubar a 35ºC durante como mínimo 24-72hs..Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la Luego se lo divide en dos partes, una para la prueba de RM y otra para la de VP.de VP.Rojo de metiloRojo de metilo: se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la : se agregan 3 gotas del reactivo de metilo, si en la superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) = superficie del medio aparece un color rojo intenso es RM (+) = microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH microorganismos que utilizan la glucosa fermentándola hasta llegar a un pH menor a 4,4.menor a 4,4.VPVP: Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es : Se agrega 0.6 ml de alfa-naftol seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude esencial que los reactivos se agreguen en este orden. El tubo se sacude suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color suavemente y luego se deja quieto de 10 a 15 min. La aparición de color rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).rojo = prueba (+) (presencia de acetil-metil-carbinol).

ONPGONPG

ONPG (O-NITROFENIL-β-ONPG (O-NITROFENIL-β-GALACTOPIRANÓSIDO)GALACTOPIRANÓSIDO)

Fundamento:Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y Lo microorganismos lactosa (+) tienen β-galactosidasa y permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de permeasa, dos enzimas necesarias para la formación de ácidos a partir de la lactosala lactosaLa permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa ingrese en la célula bacteriana.célula bacteriana.Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+).permeasa, pero sí tienen β-galactosidasa, en realidad son lactosas (+).Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-)

Procedimiento:Procedimiento: Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel Hacer un inóculo con SF estéril, agregar un disco de papel comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. InterpretaciónInterpretación: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo : Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo es productor de β-galactosidasa= prueba (+). es productor de β-galactosidasa= prueba (+). ConsideracionesConsideraciones Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se Se hace un inóculo del microorganismo en solución fisiológica estéril, se agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs. agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37ºC durante 24hs.

CitratoCitrato

CITRATOCITRATO

Fundamento:Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como única microorganismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol.

Procedimiento: Procedimiento: El color original del medio es verde, y El color original del medio es verde, y se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC. se hace por estría, se incuba 24-72hs a 35ºC.

InterpretaciónInterpretación: Si el microorganismo utiliza citrato, se : Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste produce alcalinización del medio de cultivo pasando éste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato.el citrato.

UreasaUreasa

Positivo Negativo

UREA:UREA:

Fundamento:Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima ureasa.microorganismo que poseen la enzima ureasa.

Procedimiento:Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta El medio fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra original del medio es amarillo (o sea ácido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35º C.

InterpretaciónInterpretación: Si el microorganismo es productor de : Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco, ureasa, desdobla la urea produciendo amoníaco, consecuentemente produce alcalinidad que se consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia.manifiesta porque el medio toma un color fucsia.

Fenilalanina

(-) (+)

FENIL-ALANINA-DESAMINASAFENIL-ALANINA-DESAMINASA::

Fundamento: Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima microorganismo que poseen la enzima FENIL-FENIL-ALANINA-DESAMINASA. ALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un El medio se prepara con un pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo.superficie del medio de cultivo.

Procedimiento:Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del Se siembra sobre la superficie del medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela con medio solamente, se incuba 24 hs a 35º C, se revela con cloruro férrico.cloruro férrico.

InterpretaciónInterpretación: El color original es amarillo, si el : El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la enzima, al agregar microorganismo es productor de la enzima, al agregar sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de sobre el medio cloruro férrico, ésta se pone de manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.

Lisina Decarboxilasa

AMINOÁCIDOS: AMINOÁCIDOS: DESCARBOXILASAS:DESCARBOXILASAS:

Fundamento: Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustrato-Las descarboxilasas son enzimas sustrato-específicas (presentes o no en los microorganismos) capaces de específicas (presentes o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de AA formando reaccionar con la porción carboxilo (COOH) de AA formando aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como aminas de reacción alcalina. Esta reacción, conocida como descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada descarboxilación, forma C02 como producto secundario. Cada descarboxilasa es específica para un aminoácido.descarboxilasa es específica para un aminoácido.Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina Lisina, arginina y ornitina son los aminoácidos evaluados de rutina en la identificación de enterobacterias. en la identificación de enterobacterias. El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más El medio Moeller es la base (semi-sólida) que se emplea con más frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es frecuencia. El aminoácido se agrega a la base. El color original es lila. lila. Procedimiento:Procedimiento: Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan con Se inoculan por punción 2 tubos y se sellan con aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no.InterpretaciónInterpretación: Si el aminoácido es descarboxilado, se forman : Si el aminoácido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. Si no es aminas alcalinas y el medio pasa a violeta más intenso. Si no es descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la formación de ácidosformación de ácidos

Lisina Hierro Agar (LIA)Lisina Hierro Agar (LIA)

LIA – SH2 - LIA + SH2 - LIA + SH2 -

LIA:Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa(LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificaciónde enterobacterias.► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivasque la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol,puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio decultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa.► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa,producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. Laincubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de lasuperficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje alvioleta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido.