Pruebas Bioquímicas Microbiología

Laboratorio de Microbiología Práctica 1. Metabolismo Bacteriano 1

Fernando Cisneros, 22 de Octubre de 2013 Universidad de Guanajuato, División de Ciencias Naturales y Exactas,

Departamento de Biología, Laboratorio de Microbiología

PARTE I: DIGESTION DE MACROMOLECULAS

OBJETIVO

El alumno identificará y clasificará diversos grupos de organismos en base a sus actividades metabólicas. Realizará ensayos de degradación de polímeros como gelatina, almidón, fosfolípidos y proteínas por exoenzimas bacterianas. INTRODUCCIÓN

La gran diversidad metabólica que existe entre los microorganismos, incluso entre algunos muy cercanos filogenéticamente, permite la realización de los ciclos bioquímicos. Sin la intervención de los microorganismos no podrían llevarse a cabo los ciclos del carbono, nitrógeno,

azufre y oxígeno y la atmósfera de la tierra tendría una composición gaseosa muy diferente a la actual. La composición y cantidad “anormal” (en cuanto a que están alejados del equilibrio termodinámico) de los gases O2, N2, CO2, H2 y CH4 de la atmósfera actual solo se puede explicar por la actividad constante de los seres vivos y en particular de los microorganismos procarióticos, entre los que se encuentra la mayor diversidad de actividades metabólicas, incluyendo varias reacciones únicas entre los seres vivos.

Para que una célula crezca debe satisfacer todos sus requerimientos nutricionales a partir del medio que los rodea. Las fuentes a partir de las cuales las células satisfacen algunos de estos requerimientos nos permite clasificarlas fisiológicamente:

PrACTICA 5 METABOLISMO BACTERIANO

Universidad de Guanajuato -‐ DCNE

2 Laboratorio de Microbiología Práctica 1. Metabolismo Bacteriano

Tabla 1. Requerimientos nutricionales y clasificación fisiológica. Fuente de Proceso fisiológico

Energía Física (luz) Fototrofía Química Quimiotrofía

Carbono Únicamente CO2

Autotrofía

Orgánico Heterotrofía Donador inicial de electrones

Inorgánico Litotrofía Orgánico Organotrofía

Aceptor final de electrones

Orgánico Fermentación Inorgánico Respiración anaerobia O2 Respiración aerobia CO2 Autorofía, Fotosíntesis,

Metanogénesis.

Una célula con deficiencias a nivel de biosíntesis, incapaz de convertir los precursores biosintéticos en moléculas polimerizables, es llamada auxótrofa, para sustancias orgánicas de bajo peso molecular. Las sustancias capaces de sustituir estas deficiencias metabólicas y que por tanto favorecen el crecimiento se les llama factores de crecimiento. Una célula que no requiere de estos factores se denomina protótrofa.

Losmicroorganismos quimiooroganotróficos (heterotróficos) satisfacen sus requerimientos de energía, donador inicial de electrones y carbono a partir de una misma molécula orgánica, como azúcares y aminoácidos. En ocasiones, estos sustratos monoméricos no se encuentran directamente utilizables en el hábitat y los microorganismos tienen que liberarlos de estructuras poliméricas como la celulosa, quitina, almidón, ácidos nucleicos o proteínas. De hecho, estos sustratos son tan grandes que los microorganismos no pueden incorporarlos a su interior por lo que tienen que degradarlos con enzimas extracelulares:

Tabla 2. Polímeros biológicos y enzimas que los degradan Tipo de polímero Denominación de enzimas Polisacáridos Glicosidasas Proteínas Proteinasas, Proteasas o

polipeptidasas Lípidos Esterasas Acidos nucleicos Nucleasas

Cuando un sustrato polimérico es degradado, las moléculas más pequeñas producidas tienen que ser incorporadas al interior de la célula para ser metabolizadas. En la membrana plasmática de las células se encuentran transportadores específicos de tales moléculas.

Los polisacáridos son polímeros de alto peso molecular que pueden ser lineales o ramificados, están formados por azúcares (monosacárido) unidos por enlaces glicosídicos. Cuando están constituidos por un solo tipo de monosacárido se denominan homopolisacáridos y heteropolisacáridos cuando están constituidos por diferentes tipos.

La celulosa es el compuesto orgánico más abundante en la naturaleza, por lo que la capacidad de los microorganismos para degradarla es muy importante en el ciclo biogeoquímico del carbono. La celulosa es insoluble en agua y solo los microorganismos que producen celulasas pueden hidrolizarla. Algunos de estos microorganismos, tales como Mixobacterias, Actinomicetos, Clostridia y hongos, son los principales productores de celulasas.

El almidón es otro homopolisacárido que es degradado por amilasas, las cuales producen maltosa, un disacárido fácilmente asimilable por una gran variedad de microorganismos.

Las proteínas son polímeros de aminoácidos, de alto peso molecular unidos por enlaces peptídicos. Son degradados por proteasas extracelulares que las hidrolizan parcialmente a péptidos; los péptidos, a su vez, son degradados a aminoácidos por peptidasas.

Algunas bacterias pueden utilizar lípidos animales y vegetales, especialmente los triglicéridos que están compuestos de una molécula de glicerol esterificada con tres moléculas de ácido graso. Las enzimas capaces de degradar estos compuestos se denominan lipasas; el glicerol y los ácidos grasos resultantes son introducidos a la célula y utilizados para la biosíntesis de material celular nuevo o bien son oxidados para obtener energía. Las bacterias que degradan triglicéridos crecen bien en sustratos como mantequilla, manteca y aceites vegetales provocando su rancidez. Otro grupo de bacterias son productoras de fosfolipasas. Algunas de las hemolisinas bacterianas son fosfolipasas, las cuales rompen eritrocitos al destruir la integridad de la membrana celular.

Una gran variedad de exoenzimas de microorganismos patógenos son consideradas factores de patogencidad: la fosfolipasa producida por Clostridium perfringens degrada un lípido membranal de los glóbulos rojos y resulta responsable, en parte, del inicio del proceso


gangrenoso que ocurre en las heridas infectadas por este microorganismo.

En los últimos años se han desarrollado gran variedad de sistemas para la identificación de bacterias que permiten hacer identificación de estos microorganismos en poco tiempo.

Los sistemas miniaturizados API® son métodos rápidos que permiten la identificación de microorganismos a través de la realización de diferentes pruebas bioquímicas. Estos sistemas consisten en un dispositivo de plástico con varios microtubos que contienen diferentes medios de cultivo deshidratados o diferentes sustratos de enzimas de acuerdo al tipo de prueba que se requiere montar. Algunos de los sistemas API® que actualmente se encuentran en el mercado son: API® 20E (enterobacterias y otros bacilos gram negativos), API® 20 NE (bacilos gram negativos no enterobacterias), API® 20 A (bacterias anaerobias), API® STAPH (microorganismos pertenecientes al género Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria), API® 20 STREP, API® CAMPY, API® CORYNE, API® CANDIDA. Los métodos automatizados son los más rápidos y precisos en la identificación bacteriana, aunque también son los mas costosos. El sistema automatizado Vitek® consiste en una tarjeta de plástico delgado que contiene 30 pruebas bioquímicas además de un instrumento que lee la tarjeta. Varios tipos de tarjetas están disponibles incluyendo para identificación de bacterias Gram negativas (GNI) y Gram positivas (GPI). El sistema automatizado MicroScan® consiste de un panel con 26 pozos para pruebas bioquímicas y 60 pozos para pruebas de susceptibilidad a antibióticos, los pozos son inoculados con una suspensión bacteriana, durante la incubación, los pozos son periódicamente escaneados por un instrumento MicroScan®, un cambio de coloración indica resultado positivo o negativo, cuando los resultados coinciden con los de un organismo en su base de datos, el sistema imprime la identificación de las especies. Muchas bacterias patógenas crecen pobremente en medios sólidos y otras sólo lo hacen en medios líquidos, tornando difícil su identificación por los métodos clásicos, por otra parte, algunas especies bacterianas no pueden diferenciarse de especies muy cercanas. Para estas especies los métodos moleculares resultan ser los mas adecuados. El procedimiento consiste en

extracción de ADN que es sometido a PCR; después una separación electroforética nos ayuda a confirmar la reacción en un gel, si funcionó correctamente se procede a purificar el producto de PCR, una vez purificada la muestra todo el producto de la PCR contiene el ADN correspondiente al ARNr 16S y seguido de esto la muestra es secuenciada. MATERIAL

• Tubos de 13 mm X 100 mm con gelatina al 4%;

• Tubos de 13 mm X 100 mm con leche tornasolada;

• Cajas petri con tres divisiones que contengan: Agar almidón; Agar gelatina; Agar leche descremada; Agar yema de huevo; Agar sangre;

• HgCl2 al 12.5%; • Solución de lugol; • Baño de hielo o cuarto frío; • Cepas problema.

MÉTODOS Licuefacción de gelatina en tubo

1. Siembre los microorganismos por picadura con el asa recta en los tubos con medio de gelatina. Inocular con 3 o 4 asadas.

2. Incube a 37ºC por 24 h-‐48 h. 3. Ponga los tubos en un baño de hielo o a 4º C por 1 h.

4. Sí después del enfriamiento el contenido del tubo está líquido, la prueba es positiva, pero si solidifica, es negativa.

Digestión de gelatina y caseína en placa

1. Marque las secciones de las placas de agar gelatina y agar leche descremada con cada organismo que va a inocular.

2. Siembre los microorganismos por estría recta en el sector respectivo.

3. Incube los cultivos a 28º C-‐30º C por 48 h. 4. Añada HgCl2 a las placas y observe los halos transparentes de hidrólisis.

Hidrólisis de almidón



1. Etiquete y siembre las placas de agar almidón como en los puntos 1 y 2 de la prueba anterior.

2. Incube los cultivos a 37º C por 48 h. 3. Adicione solución de lugol a las placas y observe los halos transparentes de hidrólisis que se observan sobre fondo azul.

Hidrólisis de fosfolípidos

1. Etiquete y siembre las placas de agar yema de huevo y agar sangre como en los puntos 1 y 2 de las secciones anteriores.

2. Incube los cultivos a 37º C por 48 h. 3. Examine las placas de agar yema de huevo y determine la presencia de zonas de hidrólisis. Una zona opalescente indica hidrólisis de fosfolípidos.

4. Examine las placas de agar sangre y determine la presencia de zonas de hidrólisis. Un halo de color amarillo opaco o translúcida indica la hidrólisis de fosfolípidos de la membrana de eritrocitos. Si el halo es opaco indica hidrólisis de los enlaces éster fosfato con la acumulación extracelular de diglicéridos y al proceso se le denomina hidrólisis alfa. Si el halo es translúcido, indica la hidrólisis de los enlaces éster y la utilización de los productos de degradación; se denomina hidrólisis beta. A la ausencia de halo y no utilización de los fosfolípidos membranales de los eritrocitos se le denomina hidrólisis gama.

Digestión de proteínas y fermentación de leche tornasolada

1. Inocule los tubos con leche tornasolada con una asada de cada una de las cepas proporcionadas.

2. Incube los tubos a 37º C por 24 h. 3. Interprete los resultados como sigue: • Acidificación: se muestra un viraje del

indicador a color rojizo que indica la fermentación de la lactosa.

• Coagulación: Aparición de un coágulo semisólido que ocupa todo el tubo.

• Reducción: el medio pierde el color del tornasol y se torna blanco.

• Peptonización: el coágulo se observa fragmentado.

• Licuefacción del coágulo: el medio se licua por completo (adquiere la apariencia de agua con arena)

• Alcalinización: el medio vira a color violeta.

RESULTADOS Y CUESTIONARIO 1.-‐ Llene las siguientes tablas con los resultados obtenidos: Tabla 3. Hidrólisis de gelatina en tubo.

Microorganismo Crecimiento1 Hidrólisis2 24 h 48 h 24 h 48 h

A xx xxx -‐ + B x x -‐ -‐ C xxx xx -‐ -‐ D xx xxx -‐ + E x x -‐ -‐ F xx xx -‐ -‐

1relativo, medido en cruces; 2positiva = + negativa = -‐ Tabla 4. Hidrólisis de gelatina en placa.

Microorganismo Crecimiento1 Hidrólisis2 24 h 48 h 24 h 48 h

A xxx xx -‐ -‐ B x x -‐ -‐ C xx xxx -‐ -‐ D xx xxx -‐ -‐ E xxx xx -‐ + F xxx xx -‐ -‐

1relativo, medido en cruces; 2positiva = + negativa = -‐

Tabla 5. Hidrólisis de almidón y caseína en placa.

Microorganismo Crecimiento1 Hidrólisis2 Almidón Caseína Almidón Caseína

A xx xxx + -‐ B xx x -‐ -‐ C xxx xx -‐ -‐ D xxx xxx -‐ -‐ E xx xx -‐ -‐ F xx xxx -‐ +

1relativo, medido en cruces; 2positiva = + negativa = -‐ Tabla 6. Hidrólisis de fosfolípidos.

Microorganismo Crecimiento1 Hidrólisis2 A.

Yema de

huevo

Agar Sangre

A. Yema de

huevo

Agar Sangre

A x xxx -‐ + B x x -‐ -‐ C xx xxx + -‐ D xxx xxx -‐ -‐ E xx xxx -‐ -‐ F xx xx -‐ -‐

1relativo, medido en cruces; 2positiva = + negativa = -‐


Tabla 7. Acción sobre leche tornasolada.

Microorganismo

Acidificación

Coagulación

Reducción

Licuefacción

Alcalinización

Peptonización

A -‐ -‐ -‐ -‐ + -‐ B -‐ -‐ -‐ -‐ + -‐ C -‐ -‐ + -‐ -‐ -‐ D -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ + E -‐ -‐ + -‐ -‐ -‐ F -‐ -‐ -‐ -‐ + -‐

positiva = +, negativa = -‐.

2.-‐ Haga esquemas a color de los diferentes medios con resultados de pruebas positivas y negativas.



3.-‐ Explique el significado de los términos requerimiento nutricional, factor de crecimiento, autotrófico, auxotrófico y heterotrófico.

• Requerimiento nutricional

Es la cantidad de nutriente que debe suministrar la dieta con el fin de satisfacer la necesidad metabólica; abarca factores asociados a la digestión, absorción y biodisponibilidad celular[1].

• Factor de crecimiento

Los factores de crecimiento son un conjunto de sustancias, la mayoría de naturaleza proteica que desempeñan una importante función en la comunicación celular. La función principal de los factores de crecimiento es la del control externo del ciclo celular, mediante el abandono de la quiescencia celular (G0) y la entrada de la célula a la fase G1[2].

Los organismos que requieren un determinado factor de crecimiento son auxotróficos que ese compuesto. Por ejemplo, Lactobacillus arabinosus crece normalmente en presencia de 4-‐10mg/mL de biotina, pero en ausencia de esta vitamina.

Se clasifican en tres grupos: vitaminas, aminoácidos y factores misceláneos de crecimiento[2]:

Tabla 8. Algunos factores de crecimiento requeridos por los microorganismos.

Vitaminas Aminoácidos Factores Misceláneos

Tiamina Arginina Ácidos grasos Biotina Lisina Esteroles Ácido nicotínico

Triptófano

Riboflavina Metionina Piridoxal Cisteína

• Autotrófico

Son aquellos seres vivos capaces de sintetizar

las sustancias esenciales para su metabolismo a partir de sustancias inorgánicas. Los organismos autótrofos producen su masa celular y materia orgánica, a partir del dióxido de carbono, como única fuente de carbono, usando la luz o sustancias químicas como fuente de energía.

• Auxotrófico

Se dice que un microorganismo es auxótrofo cuando sólo es capaz de proliferar en un medio de cultivo si a éste se ha añadido alguna sustancia específica, que el tipo silvestre, llamado protótrofo, no requiere, porque es capz de sintetizarla.

La genética subyacente a una auxotrofia es la carencia de una ruta metabólica funcional que genere la sustancia de la que depende el auxótrofo. Esta carencia suele deberse a una mutación que genera un alelo nulo carente de capacidad biológica[3].

• Heterotrófico

Un organismo heterótrofo es aquel que obtiene su fuente de carbono y de nitrógeno a partir de la materia orgánica (glúcidos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) y en la mayoría de los casos obtiene energía de esta manera. A este grupo pertenecen todos los integrantes del reino animal, los hongos así como algunas bacterias. 4.-‐ ¿Qué significa el término hidrolítico literalmente?

Que tiene la capacidad para producir hidrólisis, es decir, de disociar moléculas de agua en el ion hidroxilo OH-‐ y un ion H+ (el cual es inmediatamente hidratado para formar el ion hidronio H3O+). En pocas palabras, que provoca el rompimiento de un enlace mediante hidrólisis. 5.-‐ Las enzimas extracelulares que degradan proteínas se llaman proteasas[4] las que rompen polisacáridos glicosidasas[4] y las que degradan lípidos son lipasas[4]. 6.-‐ Conteste falso (F) o verdadero (V) a las siguientes aseveraciones: [ V ] Muchas enzimas extracelulares son hidrolíticas, pero no todas las enzimas hidrolíticas son extracelulares.

[ V ] Las peptidasas son enzimas extracelulares que hidrolizan proteínas de alto peso molecular. [ V ] Las glicosidasas hidrolizan enlaces éster en los polisacáridos.


[ F ] Las membranas biológicas son sensibles a las lipasas.

7.-‐ Un ejemplo de polisacárido estructural lo constituye la quitina. Un ejemplo de polisacárido nutricional es el glucógeno.

8.-‐ La caseína es una proteína de origen animal, y la gelatina es de origen vegetal. 9.-‐ La descomposición de los alimentos por degradación de triglicéridos provoca producción de energía.

PARTE II: UTILIZACION DE CARBOHIDRATOS Y ACIDOS ORGÁNICOS

OBJETIVO

El alumno realizará pruebas bioquímicas para determinar la habilidad de los microorganismos para degradar y fermentar carbohidratos con la producción de un ácido o un ácido y gas. INTRODUCCIÓN

La identificación de microorganismos en base a su estructura colonial y microscópica no es concluyente, por lo que se tiene que recurrir a la identificación fisiológica. Para ello existen un gran número de pruebas metabólicas. El metabolismo es la suma de todos los procesos químicos que ocurren dentro de un individuo y para su estudio se divide en anabolismo y catabolismo. En el primero se analizan las reacciones bioquímicas que suceden en la célula para formar macromoléculas y el segundo representa las reacciones que están involucradas en la conversión de sustratos a formas más simples y, generalmente, más oxidadas con lo que se obtiene la energía requerida por el anabolismo. Los tres principales procesos que conducen a la obtención de energía y su conversión en ATP son: la fermentación, en la cual se obtiene ATP por fosforilación a nivel de sustrato, la respiración, donde el ATP se obtiene por fosforilación oxidativa y la fotosíntesis, donde se forma ATP por fotofosforilación. La fermentación es un proceso anaeróbico en el cual tanto los donadores como los aceptores de electrones son compuestos orgánicos, aminoácidos y otros más. Existen varios tipos de fermentaciones efectuadas por microorganismos. Los productos de la fermentación de carbohidratos

son principalmente ácidos orgánicos, alcoholes, cetonas y CO2.

Tabla 9 Tipos de fermentaciones y microorganismos que las realizan.

Tipo de fermentación

Productos principales

Microorganismos

Alcohólica Etanol y CO2 Algunas levaduras y Zymomonas

Homoláctica Ácido láctico Lactobacillus y Streptococcus

Heteroláctica Ácido láctico, etanol y CO2

Lactobacillus, Leuconostoc

Ácido mixta 2,3-‐butanodiol, butanol, succinato, lactato, acetato, formiato, H2 y CO2

Shigella, Salmonella, Klebsiella, Escherichia coli

Butírica Butirato, acetato, H 2 y CO2

Clostridium butyricum

Propiónica Propionato, acetato, CO2

Propionibacterium, Clostridium propionicum

Acética Acetato Clostridium aceticum, Acetobacterium.

MATERIAL

• Tubos de 13 mm X 100 mm con 3 ml de caldo glucosado;

• Tubos de 13 mm X 100 mm con 3 ml de caldo malonato;

• Tubos de 13 mm X 100 mm con campana de Durham, con 3 ml de caldo base, rojo de fenol y glucosa, sacarosa y manitol;

• Tubos de 13 mm X 100 mm con medio inclinado de Kligler;



• Tubos de 13 mm X 100 mm con medio inclinado de citrato de Simmons;

• Reactivo indicador rojo de metilo; • Reactivo de KOH-‐creatina; • Reactivo de a-‐naftol; • Cepas problema.

METODOS Fermentación de carbohidratos en tubos de Durham 1. Inocule con una asada de cada microorganismo los tubos de Durham con el caldo rojo de fenol diferentes glucosa, sacarosa y manitol. Tenga cuidado de no agitar el tubo de fermentación.

2. Incube a 37º C por 24 h. Es importante no sobre-‐incubar los tubos debido a que se puede provocar una confusión al momento de hacer la lectura debido a fenómenos de alcalinización del medio por acumulación de amonio.

3. Observe el resultado indicando para cada una de las cepas utilizadas con los diferentes carbohidratos lo siguiente: • Producción de ácido: la prueba es positiva

si el indicador vira a amarillo y negativa si no hay viraje.

• Producción de gas: la prueba es positiva si se forma una burbuja que desplaza el líquido dentro de la campana y negativa si el tubo o campana continúa lleno de líquido.

4. Registre los resultados en la tabla proporcionada.

Fermentación de carbohidratos en medio de Kligler 1. Inocule por picadura y en la superficie de los

tubos de Kliger cada una de las cepas indicadas.

2. Incube los tubos a 37º C por 24 h 3. Observe el resultado e interpretarlo como

sigue: • Fermentación de glucosa: viraje del

indicador a amarillo en la superficie del tubo.

• Producción de gas: formación de burbujas en el medio de cultivo

• Producción de H2S: formación de un precipitado negro en el tubo de cultivo

• Alcalinización: el indicador toma un color de rojo hacia púrpura.


Fermentación de carbohidratos. Pruebas de rojo de metilo y de Voges Proskauer 1. Inocule cada cepa en dos tubos de caldo

glucosado. Marque cada tubo como MR y VP respectivamente.

2. Incube los tubos a 37º C por 24 h. 3. Añada al tubo marcado como MR, 5 gotas de

reactivo de rojo de metilo sin agitar. La presencia de un anillo rojo estable en la parte superior del tubo es una prueba positiva de rojo de metilo. La prueba es negativa si no se forma el anillo rojo.

4. Añada al tubo marcado como VP, 6 gotas de reactivo de a-‐naftol y 2 gotas de KOH-‐creatina y agite suavemente. Déjelo reposar de 20 min a 30 min. La prueba positiva de Voges Proskauer se da por la aparición de un color rojo en el tubo (indica la producción de acetil-‐metilcarbinol).

Utilización de ácidos orgánicos 1. Siembre un tubo con agar-‐citrato de

Simmons por estría abierta en la superficie y uno de caldo malonato con una asada.

2. Incube los tubos a 37º C por 24 h 3. Observe el resultado. La prueba es positiva

cuando hay crecimiento y el color del indicador vira a azul y negativa si no hay ninguna de estas señales.

4. Registre los resultados en la tabla indicada. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 1.-‐ Anote en la siguiente tabla los resultados de las pruebas bioquímicas realizadas en la práctica. Tabla 10. Degradación y fermentación de carbohidratos y ácidos orgánicos.

Prueba A B C D E F Durham

Glucosa

Ácido -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ Gas -‐ + -‐ -‐ -‐ -‐

Sacarosa Ácido -‐ + + + -‐ -‐ Gas -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐

Manitol Ácido -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ gas -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐

Kligler

Glucosa -‐ + -‐ + + + Alcalinización + -‐ + -‐ -‐ -‐ Gas -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐


H2S -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ Otras

RM -‐ -‐ -‐ + -‐ -‐ VP -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ Citrato + -‐ -‐ -‐ -‐ + Malonato* -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐

Prueba positiva = +, prueba negativa = -‐. *En todos los tubos se observó crecimiento pero en ninguno hubo vire a azul

2.-‐ Indique cual es el fundamento de cada una de las pruebas bioquímicas realizadas. • Fermentación de carbohidratos en tubos de Durham

El caldo rojo de fenol es usado para diferenciar

miembros de Enterobacteriaceae y distinguirlos de otras bacterias Gram-‐negativas.

La producción de ácido a partir de la fermentación de los carbohidratos reduce el pH por debajo del rango neutro del indicador y cambia el color del medio a amarillo. La desaminación de los aminoácidos de la peptona produce amoniaco (NH3) lo que eleva el pH y vuelve rosa el medio. La producción de gas, también de la fermentación, es indicado por una burbuja en el tubo de Durham donde el caldo ha sido desplazado[6]. • Fermentación de carbohidratos en medio de Kligler

En el medio de cultivo, la peptona de carne y la

tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balanceosmótico. Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro generando el típico sulfuro de hierro de color negro[5].

• Fermentación de carbohidratos. Pruebas de rojo de metilo y de Voges Proskauer

- Rojo de metilo (MR)

Esta prueba sirve para determinar la

capacidad de un microorganismo para producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. La prueba rojo de metilo es cuantitativa para la producción de ácido y requiere que los microorganismos produzcan ácidos fuertes a partir de la glucosa, de forma que el pH del medio descienda a menos de 4.4. Esta distinción se hace a través del indicador rojo de metilo[6].

Fig. 1 Prueba rojo de metilo. A la izquierda Escherichia coli (MR-‐positivo) y del lado derecho Enterobacter aerogenes (MR-‐negativo).

- Voges-‐Proskauer (VP)

La prueba de Voges-‐Proskauer es usada para distinguir entre miembros de la familia Enterobacteriaceae y diferenciarlos de otros Gram-‐negativos. Esta prueba identifica organismos capaces de producir acetoina y 2,3-‐butanodiol a partir de la fermentación de la glucosa.

Adicionando el reactivo VP al medio después de la incubación oxida la acetoina (si esta presente) a diacetilo que a su vez reacciona con la guanidina presente en la peptona para producir el color rojo.

Fig. 2 Reacción de la prueba de Voges-‐Proskauer.



• Utilización de ácidos orgánicos

- Citrato

Algunas bacterias pueden suministrar energía en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico empleando citrato como única fuente de carbono. En las bacterias, el desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimático. Esta enzima se denomina citrasa (citrato oxalacetato-‐ liasa) o citrato permeasa. La enzima requiere un catión bivalente para su actividad, que es suministrada por el magnesio o el manganeso[5].

El agar citrato de Simmons es un medio definido que contiene citrato de sodio como única fuente de carbono y amonio como única fuente de nitrógeno. Un microorganismo que utiliza citrato y sales de amonio como únicas fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente, da como resultado amoníaco que alcaliniza el medio. El indicador de pH, azul de bromofenol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.[6]

Fig. 3 En presencia de la enzima citrato permeasa, el citrato es convertido a piruvato. El piruvato entonces es convertido a

una variedad de productos dependiendo del pH del medio ambiente.

- Malonato

Una de las muchas reacciones enzimáticas del ciclo de Krebs es la oxidación de succinato a fumarato. Esta reacción requiere la enzima succinato deshidrogenasa y la reducción de la coenzima FAD a FADH2.

El malonato (ácido malónico) es muy similar al succinato para remplanzarlo como sustrato en la reacción. Esta inhibición competitiva de succinato deshidrogenasa, en combinación con la subsecuente acumulación de succinato en la célula, cierra el ciclo de Krebs y mata al organismo a menos que puede fermentar o utilizar malonato como única fuente de carbono.

El caldo de malonato es el medio usado para hacer esta determinación. Si el organismo utiliza malonato, el medio se alcalinizará y el indicador cambiará de verde a azul[7].

Fig. 4 Inhibición competitiva de succinato. La fijación de malonato a la enzima succinato deshidrogenasa evita la fijación de succinato y por lo tanto la conversión de succinato a malonato.

PARTE III: METABOLISMO DE AMINOACIDOS OBJETIVO

El alumno determinará la habilidad de los microorganismos para metabolizar aminoácidos mediante pruebas bioquímicas. INTRODUCCIÓN

Los microorganismos además de requerir una fuente de carbono y una de energía, necesitan una fuente de nitrógeno para construir su propio material celular. Esta fuente de nitrógeno puede ser orgánica (proteínas, aminoácidos, bases nitrogenadas), o bien inorgánica (nitrógeno molecular, amonio, nitritos o nitratos). Dentro del metabolismo de los aminoácidos existen algunas enzimas capaces de descarboxilar, desaminar y


desulfurar aminoácidos o degradarlos completamente. La presencia o ausencia de dichas enzimas son criterios de identificación. La descarboxilación la sufren aminoácidos básicos como la lisina, ornitina y arginina y las enzimas responsables se denominan descarboxilasas. El proceso es anaeróbico, irreversible y requiere de un cofactor denominado fosfato de piridoxal. Existen también las reacciones denominadas de desaminación. En el caso de la arginina, la desaminación produce citrulina y amonio. La degradación de aminoácidos tales como cisteína o metionina lleva a la producción de ácido sulfhídrico. La enzima que libera el grupo sulfhidrilo de estos aminoácidos se denominan cisteinasa y metiona-‐reductasa respectivamente. Nota: Todas las pruebas bioquímicas para ser validadas necesitan tener testigos apropiados. Estos testigos son: a) un medio sin inocular e incubado bajo las mismas condiciones que los problemas, b) un testigo positivo, que el mismo medio inoculado con una cepa de referencia que se conoce da resultado positivo y c) un testigo negativo que es el mismo medio inoculado con una cepa la cual se conoce da un resultado negativo. MATERIAL

• Tubos de 13 mm X 100 mm con caldo triptona;

• Tubos de 13 mm x 100 mm con medio SIM; • Tubos de 13 mm X 100 mm con medio de

LIA; • Reactivo de Kovacs o Ehrlich; • Papel tornasol rosa; • Cepas problema.

METODOS Producción de ácido sulfhídrico e indol 1. Siembre por picadura en el medio de SIM cada

una de las cepas indicadas. 2. Incube los tubos a 37º C durante 24 h. 3. Observe el resultado e interprete como sigue:

• Producción de H2S: Presencia de un precipitado negro

• Movilidad: turbidez en regiones alejadas de la picadura de inoculación.

• Producción de indol: añadir de 3 gotas a 5 gotas del reactivo de Kovacs o Ehrlich. La aparición de un color rojo en la superficie del medio indica una prueba positiva.


Producción de amoniaco e indol 1. Inocule con una asada los tubos de caldo urea

con cada una de las cepas indicadas. 2. Coloque una tira de papel tornasol en la boca

del tubo sujetándolo con el tapón de algodón, sin que toque el medio de cultivo.

3. Incube los tubos a 37º C durante 24 h. 4. Observe el vire del papel tornasol (de rosa a

azul) que indica la liberación de amoniaco. 5. Añada de 3 gotas a 5 gotas del reactivo de

Kovacs o Ehrlich como en la sección anterior. 6. Registre los resultados en la tabla

proporcionada.

Producción de lisina-‐descarboxilasa 1. Inocule por picadura y estría un tubo con

medio de LIA con cada una de las cepas indicadas.

2. Incube los tubos a 37º C por 24 h. 3. Interprete los resultados como sigue:

• Descarboxilación positiva: color púrpura en el fondo del tubo.

• Descarboxilación negativa: color amarillo en el fondo del tubo.

• Desaminación positiva: color rojo naranja en la superficie del tubo.

• Desaminación negativa: sin cambio de color en la superficie.

• Producción de H2S: presencia de un precipitado negro.


RESULTADOS Y CUESTIONARIO 1.-‐ Registre los resultados obtenidos en las diferentes pruebas de metabolismo de aminoácidos en la siguiente tabla: Tabla 11. Pruebas bioquímicas para identificar metabolismo bacteriano de aminoácidos.

Prueba A B C D E F SIM

H2S -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ Indol -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐



Movilidad + + + + + -‐ Caldo1 urea

Amoniaco2 Indol -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐

LIA

Decarboxilación + -‐ + -‐ + + Desaminación -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ H2S -‐ -‐ -‐ -‐ -‐ -‐

Prueba positiva = +, prueba negativa = -‐. 1 El caldo triptona fue cambiado por el caldo urea. 2 No se realizó debido a que no se contaba con papel tornasol.

Fig. 5 Resultados de las pruebas bioquímicas aplicadas. Arriba, el medio SIM (movilidad), abajo a la izquierda el medio caldo urea después de añadir el reactivo de Kovacs para determinar producción de indol y por último el medio LIA donde no se presenta desaminación en ningún tubo pero si descarboxilación. 2.-‐ Indique las reacciones que se llevan a cabo en cada una de las pruebas bioquímicas que se realizaron en la práctica. • Medio SIM

- Producción de H2S

La reducción de sulfuro a H2S es una actividad anaeróbica y puede ser realizado por la bacteria en dos maneras diferentes, dependiendo de la enzima presente[9]. * La proteína cisteína desulfurasa cataliza la conversión del aminoácido cisteína a piruvato. * La enzima tiosulfato reductasa cataliza la reducción de sulfuro al final de la cadena transportadora de electrones de la respiración anaerobia. Ambos sistemas producen gas sulfuro de hidrógeno (H2S). Cuando la reacción ocurre en el medio SIM, el

H2S se combina con el hierro del medio para formar sulfuro de hierro (FeS), un precipitado negro.

H2S +FeSO4 !H2SO4 +FeS(s)

Fig. 6 A la derecha Escherichia coli (H2S-‐negativo) y del lado derecho Proteus mirabilis (H2S-‐positivo.)

- Producción de indol

La prueba de indol identifica bacterias capaces de producir indol usando la enzima triptofanasa. Esta prueba es realizada usando el medio SIM (SIM es un acrónimo de Sugar Indole Motility)

La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el grupo indol (presente en el triptofano) reacciona con el grupo aldehído del p-‐dimetilaminobenzaldehído, el cual representa el principio activo del reactivo de Kovacs[9].

Fig. 7 El reactivo de Kovacs es añadido al medio después de la incubación. Si el organismo es indol-‐positivo, un color rojo es producido por esta reacción.

• Medio caldo urea

- Producción de amoniaco

Esta prueba permite verificar si la bacteria degrada la urea a partir de las enzimas hidrolíticas llamadas ureasas. Las sustancias producto de la hidrólisis alcalinizan el medio haciendo virar el indicador rojo de fenol a un rojo grosella.

H2N !CO! NH2ureasa" #"" 2NH3 +CO2


- Producción de indol

Ver Fig. 7

• Medio LIA

- Descarboxilación

La fermentación de la glucosa (todas las Enterobacteriaceae fermentan glucosa) vuelve amarillo el medio debido a la acumulación de productos finales ácidos. El bajo pH y la presencia de aminoácidos induce en organismos carboxilasa-‐positivos la producción de la enzima.

La descarboxilación de los aminoácidos cambia el color del medio de cultivo a morado[8].

Fig. 8 Descarboxilación de aminoácidos.

- Desaminación La desaminación de la lisina puede ocurrir en

las bacterias pertenecientes a los géneros Proteus y Providencia.

Si el microorganismo produce lisina desaminasa, el resultado de la reacción de desaminación producirá compuestos que reaccionarán con el citrato de amonio férrico y generará un color rojo.

En este caso el grupo amino del aminoácido se transfiere a la enzima (lisina desaminasa), para generar el cetoácido correspondiente y la enzima aminada[10].

aminoácido+ enzima!! " cetoácido+ enzima" NH2

- Producción de H2S

El sulfuro de hidrógeno (H2S) es producido en el medio LIA (Lysina Iron Agar) por la reducción anaeróbica del tiosulfato. Los iones férricos en el medio reaccionan con el H2S para formar un precipitado negro en el fondo debido al sulfuro ferroso[5].

Reacción Global Bacteria+ Na2S2O3!H2S(g) H2S(g) +Fe

3+ ! FeS(s)

PARTE IV: RESPIRACION OBJETIVO

El alumno determinará la habilidad de los microorganismos para obtener electrones por el proceso de respiración con diferentes sustratos. INTRODUCCIÓN

La respiración es un proceso de fosforilación oxidativa, asociada a una cadena de electrones, genera un gradiente electroquímico, el cual es utilizado por la ATP sintetasa para acoplar ATP. La capacidad respiratoria se encuentra ampliamente distribuida entre los microorganismos. Todos los eucariotes, con excepción del grupo de los microesporidios (únicos que no tienen

mitocondrias) tienen capacidad de respirar usando al oxígeno como aceptor final de electrones. Como donadores de electrones usan compuestos orgánicos como el succinato, NADH y FADH que provienen del metabolismo de azúcares o aminoácidos. El azul de metileno actúa como un aceptor artificial de electrones el cual pasa de su forma oxidada (azul) a su forma reducida (incoloro) cuando se evita su reoxidación por el oxígeno del aire, utilizando para este propósito una capa de aceite mineral. Los procariotes, además de contar con respiración aeróbica, algunos grupos poseen también la capacidad de respirar anaeróbicamente y pueden usar NO3-‐, NO2-‐, (SO4)2-‐, CO2, Sº, Fe3+ o fumarato como aceptores finales de electrones.



Entre los procariotes litotróficos, los donadores de electrones pueden ser moléculas orgánicas (como las ya descritas) o inorgánicas entre las que se encuentran H2, H2S y NH3. MATERIALES

• Cajas de Petri con agar nutritivo; • Tubos de 16 mm X 150 mm estériles; • Tubos de 13 mm X 100 mm con 3 ml de

caldo nitrato; • Pipetas de 1ml, 5ml y 10 ml estériles; • Micropipetas de 1000mly 200 ml; • Puntas estériles para micropipetas; • Matraz erlenmeyer con 30 ml de leche

estéril con glucosa al 0,5%; • Solución de azul de metileno al 0,1%; • Aceite mineral estéril; • Reactivo de ácido sulfanílico; • Reactivo de a-‐naftil amina; • Agua oxigenada al 10%; • Reactivo de oxidasa; • Tiras de papel filtro; • Cepas problema.

METODOS Reducción de azul de metileno 1. Marque una serie de tubos de 16 mm X 150

mm del 1 al 4. 2. Añada 0,5 ml de azul de metileno al matraz

con leche 3. Añada a cada tubo la leche, suspensión

bacteriana y aceite, de acuerdo al orden que se señala en la siguiente tabla:

Tubo 1 2 3 4 5 Leche estéril con azul de metileno

4,5 ml

4,0 ml

3,5 ml

3,0 ml

2,5 ml

Suspensión bacteriana

0 0,5 ml

1,0 ml

1,5 ml

2,0 ml

Homogenizar suavemente el contenido de cada tubo Adicionar aceite mineral

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

0,5 ml

4. Incube todos los tubos en baño maría a 37º C

y anote el tiempo que tardan en decolorarse. 5. Anote los resultados en la tabla

proporcionada.

Reducción de nitratos a nitritos 1. Siembre 100 ml de cada uno de los cultivos de

las cepas en caldo nitrato. Guarde un tubo sin inocular como testigo.

2. Incube todos los tubos a 37º C por 24 h. 3. Determine la presencia de nitritos añadiendo

a cada tubo 3 gotas de α-‐naftol amina y 3 gotas de ácido sulfanílico.

4. Una coloración rojo ladrillo indica la presencia de nitritos (formación de un complejo diazóico).

Pruebas de citocromo oxidasa y catalasa 1. Siembre en una caja de agar nutritivo por

estría abierta las cepas indicadas. 2. Incube a 37º C por 24 h. 3. Para la prueba de la oxidasa, transfiera una

asada de cada cepa a una tira de papel filtro. Añada al papel una gota de reactivo de oxidasa, o aplique un disco que contenga el reactivo. El sistema citocromo oxidasa se encuentra por lo general en organismos aerobios y los hace capaces de utilizar el oxígeno como aceptor final de electrones y producir H2O2. Los microorganismos que poseen esta enzima, en presencia del O2 y del reactivo desarrollan un complejo de color púrpura.

4. Después de tomar la muestra para la prueba de oxidasa, añada sobre el crecimiento de las cepas, unas gotas de H2O2. La mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos tienen una enzima llamada catalasa, la cual descompone el agua oxigenada, evitando la acumulación de este metabolito tóxico. La aparición de burbujas en el cultivo, después de la adición del reactivo, indica una prueba positiva.


RESULTADOS Y CUESTIONARIO 1.-‐ Registre los resultados obtenidos en las diferentes pruebas realizadas durante la práctica en la siguiente tabla: Tabla 12. Pruebas bioquímicas para determinar el aceptor final de electrones en el proceso de respiración.

Tubo (P.aureginosa)

1 2 3 4 5

Azul de metileno

-‐ -‐ -‐ -‐ -‐


Prueba positiva = +, prueba negativa = -‐.

Cepa

Prueba Reducción de NO3-‐

Oxidasa Catalasa

A -‐ +/-‐ + B + + + C -‐ -‐ +/-‐ D + + + E -‐ -‐ + F -‐ -‐ + Prueba positiva = +, prueba negativa = -‐.

Fig. 9 Resultados de las pruebas bioquímicas. 2.-‐ Indique las reacciones que se llevaron a cabo en cada una de las pruebas realizadas

• Reducción de azul de metileno

La cadena respiratoria de las bacterias se

localiza en la membrana plasmática y es fácilmente accesible a los aceptores de electrones. Si se interrumpe la oxigenación del cultivo de una bacteria y se incorpora un indicador redox, como aceptor artificial de electrones, es posible estimar cualitativamente la actividad metabólica de esa población bacteriana, por el cambio de color del indicador.

Uno de estos aceptores es el azul de metileno, en su forma oxidada es de color azul, pero al recibir electrones, es este caso, de componentes de la cadena respiratoria bacteriana, se reduce y pasa a su forma incolora[9].

Fig. 10 Reacción de la reducción del azul de metileno.

• Reducción de nitratos a nitritos El caldo de nitrato es un medio indefinido de

extracto de carne, peptona y nitrato de potasio. Un tubo invertido de Durham es colocado en cada medio para atrapar la porción de cualquier gas producido. En contraste con mucho medios diferenciales no incluye indicador[7].

• Oxidasa

La prueba de la oxidasa es usada para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo c oxidasa[8].

Fig. 12 Esta prueba esta diseñada para identificar la presencia de citocromo c oxidasa. Esto es posible debido a que citocromo c oxidasa tiene la habilidad única de no solamente oxidar a citocromo c, sino también de catalizar su reducción por un agente cromogénico reducido llamado tetrametil p-‐fenilenediamina.

• Catalasa La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de

las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo, la excepción principal es el Streptococcus[5].

H2O2

catalasa! "!! H2O+O2 #



Si se deja acumular el peróxido de

hidrógeno, es tóxico para las bacterias y provoca su muerte. La catalasa descompone el peróxido de hidrógeno u oxida los sustratos secundarios, sin embargo, no tiene acción contra otros peróxidos[5].

Fig. 11 Si el nitrato es reducido a nitrito, se formará ácido nitroso (HNO2) en el medio. Entonces, el ácido nitroso reaccionará con el ácido sulfanílico para formar ácido diazosulfanílico, el cual reacciona con el α-‐naftolamina para formar p-‐sulfobenceno-‐azo-‐ α-‐naftolamina es cual es rojo. OBSERVACIONES Y DISCUSIÓN

Para lograr la identificación de un microorganismo es necesario aplicar un conjunto de técnicas y procedimientos, los cuales se pueden clasificar de acuerdo a[11]:

• Criterios macroscópicos (morfología) • Criterios microscópicos (tinción diferencial) • Pruebas bioquímicas • Tipificación con fagos • Pruebas serológicas • Detección molecular

Hasta ahora, a las seis bacterias

seleccionadas se les han descrito sus características morfológicas y microscópicas. Además, en cada de éstas bacterias ha sido evaluado su requerimiento de oxígeno y en base a los resultados se pudieron clasificar en aerobias, anaerobias, etc.

Sin embargo, éstos procedimientos nos dicen poco acerca de las relaciones filogenéticas entre las bacterias. Por lo tanto, el siguiente paso que se debe de realizar para aproximarse a la identificación de un microorganismo es la aplicación de pruebas bioquímicas.

Las pruebas bioquímicas, las cuales están basadas en las actividades metabólicas enzimáticas de los microorganismos, son ampliamente

utilizadas para diferenciar las bacterias, incluso las que están estrechamente relacionadas pueden ser separadas en especies diferentes.

En está práctica se evaluó la capacidad de los microorganismos para digerir macromoléculas, su habilidad para metabolizar carbohidratos y aminoácidos así como la capacidad de obtener

electrones de diferentes sustratos para usarlos en su proceso de respiración.

Respecto a las bacterias seleccionadas, aquellas que fueron marcadas como A, B, D y F, se seleccionaron del medio de cultivo

Czapeck (muestra de suelo), especial para el crecimiento de actinomicetos; y las colonias de bacterias rotuladas como C y E fueron tomadas del medio A-‐NVT.

Suponiendo que las bacterias tomadas del medio Czapeck, son precisamente actinomicetos, a reserva de que esto sea incorrecto, se sabe que son aerobios estrictos y cuando se aplica la prueba de la oxidasa permite poner de manifiesto el sistema citocromo-‐oxidasa, que se encuentra en organismos de este tipo. Los resultados de ésta prueba dieron positivo en B y D, en cuanto a la colonia A el resultado no fue concluyente, la colonia F fue negativa.

Respecto a la prueba de la catalasa, todas las bacterias produjeron hidrógeno debido a la descomposición del peróxido de hidrógeno, aunque en diferentes proporciones. Por lo tanto, algunas de éstas bacterias podrían ser de los géneros nocardia y streptomyces (catalasa-‐positivos) pertenecientes al filo actinomicetos. Estas bacterias se encuentran abundantemente en suelos realizando la fijación de nitrógeno atmosférico[12]. Además, los resultados de la prueba de reducción de nitratos (positiva en B y D) aumenta las posibilidades de ésta suposición, tomando en cuenta que los actinomicetos tienen la capacidad de reducir nitratos a nitritos.

Durante el desarrollo de la práctica no se utilizaron pruebas de referencia o testigo, lo cual dificultó, hasta cierto punto, la correcta interpretación visual de las pruebas.

En la prueba de reducción de metileno se uso una cepa de P. aureginosa y en los cinco tubos no se observó ningún cambio debido a que esta bacteria es aeróbica y al cortarle el suministro de


oxígeno, adicionado una capa de aceite mineral, éste microorganismo se murió. CONCLUSIONES

Los ensayos bioquímicos son pruebas simples que se desarrollan para demostrar características bioquímicas de las bacterias como presencia o ausencia de una actividad enzimática, grupo de enzimas o vías metabólicas, a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Por lo tanto, conociendo éstas características bioquímicas se puede lograr la identificación en género o especie de los microorganismos comparando las similitudes con características bioquímicas ya reportadas. REFERENCIAS [1] E.E. Ziegler y L.J. Filer, Conocimientos actuales sobre Nutrición, International Life Sciences Institute, 7ma Edición, (1998), España, pp 118. [2] A. Hernández y col., Micorbiología Industrial, Editorial Estatal a Distancia, 2da Edición, (2003), Costa Rica, pp 455, 456. [3] J.F. Griffiths y col., Genética, McGrawHill, (2002), EUA, pp 702. [4] W. Muller, Bioquímica Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida, Editorial Reverte, 2da Edición, (2008), España, pp 222 y 234. [5] J. F. Mac Faddin, Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, Editorial Médica Panamericana, 3ra Edición, (2003), Argentina, pp 104, 105, 113, 114 y 194. [6] A. E. Brown, Benson´s Microbiological Applications, McGrawHill, 11va Edición, (2009), USA, pp 330, 334, 335 y 340. [7] M. J. Leboffe y B. E. Pierce, Microbiology Laboratory Theory and Application, Morton Publishing Company, 2da Edición, (2006), USA, pp 256, 257, 260, 331. [8] M. J. Leboffe y B. E. Pierce, A Photographic Atlas for the Microbiology Laboratoy, Morton Publishing Company, 4ta Edición, (2011), USA, pp 63, 64, 73, 74, 75, 80, 81, 82, 83, 87, 96 y 98. [9] E. Rodríguez y col, Bacteriología General Principios y prácticas de laboratorio, Editorial Universidad de Costa Rica, (2008), Costa Rica, pp 105 7 106. [10] D. Voet y J. G. Voet, Bioquímica, Editorial Médica Panamericana, 3ra Edición, (2006), Argentina, pp 1024. [11] G.J. Tortora y col., Introducción a la Microbiología, Editorial Médica Panamericana, 9na Edición, (2007), Argentina, pp 292, 294 y 295. [12] L. M. Thompson y F. R. Troeh, Los suelos y su fertilidad, Editorial Reverte, 4ta Edición, (2004), España, pp 44. [13] B. Forbes, D. Sahm y A. Weissfeld, Bailey & Scott Diagnóstico Microbiológico, Editorial Médica Panamericana, 12va Edición, (2009), Argentina, pp 318.

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