Purificación de proteínas Métodos cromatográficos

M. en C. Esdras Israel Carrizosa Carbajal

Secuencia experimental típica para purificar una proteína:

Obtención de extractos libres de células

Seleccionar una fuente biológica. Tejido celular, proteína recombinante

Solubilización. Liberar la proteína de su fuente(lisis osmótica o enzimática,

ruptura mecánica) y solubilizarla en un amortiguador acuoso

Estabilización. Temperatura, pH, fuerza iónica, reducción residuos Cys

Separación. Fraccionar el extracto crudo por centrifugación

Precipitar selectivamente la proteína(Solventes, PEG, Sulfato de amonio)

Detección. Desarrollar un ensayo para identificar y cuantificar la proteína

deseada.

Aislamiento

Efectuar cromatografía de intercambio iónico (CARGA)

Efectuar cromatografía de filtración en gel(TAMAÑO)

Efectuar cromatografía de afinidad(AFINIDAD)

Determinar pureza y tamaño molecular por electroforesis en gel.

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

Aunque la tecnología de proteínas recombinantes puede aumentar la

concentración de una proteína específica dentro de la célula, el

problema de la separación la proteína deseada de todos los otros

componentes celulares permanece

• Biomoléculas son purificadas usando técnicas de cromatografía que separan de acuerdo a las diferencias en sus propiedades especificas.

Propiedad Técnica

TAMAÑO Cromatografía filtración en gel (GF)

CARGA Cromatografía de intercambio iónico (IEX)

BIORECONOCIMIENTO(ESPECIFICIDAD POR LIGANNDO)

Cromatografía de afinidad (AC)

Fraccionamiento por cromatografía en columna

• Fase estacionaria: material sólido y poroso colocado en una columna

• Fase móvil: solución tamponada que se hace fluir a través de la columna

a)El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel

hidratado.

b) El volumen de vacío (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel.

c)El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la

diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo.

Cromatografía de filtración en gel o exclusión

por tamaño Size Exclusion Chromatography (SEC)

• Fase estacionaria es un polímero poroso con poros de un rango de tamaño definido.

• Salen primero las mas grandes, luego las mas pequeñas. El tamaño de una proteína se define como su Masa molecular (en Daltones).

FUNDAMENTO TEÓRICO

Principio de exclusión molecular

Materiales para la filtración en gel

• Un gel es una red tridimensional cuya estructura estáentrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamizmolecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyascadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una redtridimensional.

• Los geles normalmente utilizados son : dextrano, agarosa ypoliacrilamida. El gel de dextrano (polímero ramificado deglucosa, entrecruzado y formado en pequeñas bolitas) secomercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintostipos, según el tamaño de poro, proporcionando límites deexclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos gelesse identifican por una denominación de G-10 hasta G- 200, loque se refiere a la capacidad de retención de agua del gelmultiplicada por 10.

Resinas superdex consisten de una base de matriz

compuesta de dextrano y agarosa. Esta

matriz combina las excelentes propiedades SEC de dextrano

con la física y química

estabilidad de la agarosa reticulada, lo que resulta en una

resina con excelente selectividad y alta

resolución.

Proceso de separación de SEC

Típico cromatograma de SEC

Akta pure Superdex 200 HR 10/30

Se puede calcular el tamaño de una proteína desconocida

Vol de elución

Existe una relación lineal entre el volumen de elución y el

logaritmo del peso molecular de las proteínas

Medir el volumen de elución de una proteína desconocida para

llevarlo a una recta de calibración permite determinar el peso

molecular

Diálisis y ultra centrifugación

Amicon® Ultra Centrifugal Filters

Permiten eliminar sales y concentrar proteínas

Tienen membrana de corte que va de los 10-100KDa

15 mL 4mL

500 µL

Cromatografía de intercambio iónico

Fundamento teórico• Se basa en la carga eléctrica de las proteínas.

• Se aplica en una matriz de carga opuesta a la de la proteína que se quiere purificar.

• Se debe tener un pH determinado.

• Las proteínas se eluyen de menor a mayor fuerza de unión.

• La fase estacionaria consiste de un polímero que tiene unido grupos cargados: carga

negativa intercambiador catiónico; carga positiva intercambiador aniónico.• Intercambiadores catiónicos: CM celulosa (con grupos COO-)

• Intercambiadores aniónicos: DEAE celulosa (con grupos NH+)

Suma de las cargas de las cadenas laterales de los aminoácidos, Dependen de: pH y pKa; ambiente que los rodea

• Se utiliza principalmente para separar una proteína de otroscontaminantes siempre que las diferencias entre las cargas seansuficientemente grandes.

• Separa aminoácidos, péptidos, nucleótidos y generalmente compuestosiónicos.

En laboratorios clínicos se utiliza para separación de hemoglobina,

isoenzimas y esteroides.

Usos

Cromatograma de intercambio iónico

Gradiente de elución linear Gradiente de elución escalonado

Matrices de cromatografía de intercambio iónico

Macro-prep High S de Bio rad

pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.

pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación

pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

Es una resina de intercambio catiónico fuerte que contiene grupos funcionales sulfonato que es ideal para purificar proteínas y péptidos básicos y neutros

Pasos de preparación y purificación

• Equilibración.

• Aplicación de muestra y lavado.

• Elución. Estrategias de elución. Para

romper las interacciones electrostáticas entre la proteína y la matriz, se eleva la concentración del contra-ion (sal). Contra iones (sodio o cloruro, bajo PM), -En concentraciones bajas : son desplazados por la proteína, -En concentraciones altas : compiten con la proteína.

• Otras estrategias de elución. Al cambiar

el pH del buffer, cambia la afinidad de unión

de la proteína.

• Regeneración.

pH solución> pI= proteína carga(-) por desprotonación.

pH solución< pI= proteína carga(+) por protonación

pH solución =pI =proteína carga(0) precipitado insoluble

Cromatografía de afinidad

• Un ligando específico es capaz de unirse a una proteína (No covalente)

• El ligando se une covalentemente a una matriz cromatográfica porosa e inerte.

Fundamento teórico

• Se basa en la afinidad biológica específica de cadaproteína hacia un ligando en

particular.

• Esta puede ser:

Proteína– Ligando

Enzima – SustratoReceptor – HormonaAnticuerpo-Antígeno

• La cromatografía de afinidad (AC) separa las biomoléculas sobre la base de una interacción reversible

• entre una biomolécula (o un grupo de biomoléculas) y un ligando específico acoplado a un

• matriz de cromatografía

Matriz cromatográfica• Químicamente inerte con un ligando que puede estar directa o

indirectamente acoplado

• Tiene alta porosidad y una extremadamente baja adsorción no

especifica

• Gran número de grupos funcionales capaces de formarenlaces covalentes con los ligandos

Buenas propiedades de flujo para rápida separación.

• El más usado: Agarosa, también se usan polímeros deacrilamida y sílices CPG.

• Estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales

tales como pH alto y bajo, detergentes y agentes disociantes

Pasos preparación de columna

1. El ligando se une covalentemente

a una matriz.

2. La mezcla de proteínas se hace

pasar por la matriz.

3. Se une sólo la que reconoce al

ligando (unión no covalente)

4. Las demás proteínas y el resto se

eluye.

Brazos espaciadoresA) Se observa una baja capacidad de unión debido a la interferencia estérica, es decir, el ligando no puede acceder a la unión sitio de la molécula objetivoB)En estas circunstancias, un "brazo espaciador" esinterpuesto entre la matriz y el ligando para facilitar la unión efectiva

El efecto de los brazos espaciadores

Estrategias de elución

Se desprende la proteína por adición de sal, pH, temperatura o exceso

de ligando libre.

Método 1:El caso más simple. Un cambio en la composición del buffer eluye la proteína unidasin dañarlo ni al ligando.

Método 2: pH extremos o altas concentraciones de agentes caotrópicos (daño )

Método 3 y 4:Elución específica mediante la adición de una sustancia que compite por el enlace

Resina Cibacron blue 3G-A DEAE affi-gel blue gel

Ventajas• Capacidad de explotar sus propiedades bioquímicas (únicas).

• Se evitan varios pasos de purificación que con otras técnicas clásicas.

• Normalmente se obtienen altos rendimientos y altaactividad especifica.

• Se pueden separar proteínas, enzimas, anticuerpos, membranas, receptores, vitaminas, antígenos incluso células enteras.

Conclusiones

• Técnica muy específica

• Altos rendimientos y eficiencia

• Purificación eficiente con menos pasos posibles

• Ampliamente usada en bioquímica para

medicina y farmacia

Paso de

purificación

Vol de fracción

(mL)

Proteína total

(mg)

Actividad (U) Actividad específica

(U/mg)

Extracto crudo

F1

1,400 10,000 100,000 10

Precipitación con

(NH4)2SO4 F2

280 3000 96000 32

Cromatografía

exclusión de

tamaño F4

Desalado

90 400 80,000 200

Cromatografía

intercambio

iónico

FIA,FIB,FIC

80 100 60,000 600

Cromatografía

de afinidad

FPA,FPB,FPC

6 3 45,000 15,000

Purificación de un enzima hipotético x

Manuales para diferentes columnas