Indice

1. Resumen Abstract 2. Introduccin 2.1. Descripcin de la trufa 2.2. Antecedentes histricos (usos y tradiciones) 2.3. Origen de la truficultura 3. Tipos de trufas y taxonoma 3.1. Principales especies 3.2. Gnero Tuber 3.3. Descripcin de especies comestibles 3.4. Composicin orgnica y mineral de las trufas 3.5. Aromas y propiedades organolpticas 4. Biologa de la trufa 4.1. Las micorrizas 4.1.1. Tipos de micorrizas 4.1.2. Funciones de las micorrizas y usos por el hombre 4.2. Ciclo biolgico de la trufa 4.2.1. Diseminacin de esporas 4.2.2. Germinacin de las esporas 4.2.3. Infeccin de races 4.2.4. Formacin de trufas 4.2.5. Fase saprfita 4.2.6. Resumen del ciclo biolgico 4.3. Fijacin de CO2 por el ascocarpo 5. Ecologa 5.1. Distribucin mundial 5.2. Simbiontes de T. melanosporum 5.3. Suelos truferos 5.3.1. Condiciones geolgicas 5.3.2. Caractersticas fsicas (profundidad, textura, estructura, pedregosidad) 5.3.3. Caractersticas qumicas (pH, materia orgnica, nutrientes, relacin C/N, Ca intercambiable, caliza, conductividad elctrica) 5.4. Clima 4.4.1. Temperaturas 4.4.2. Precipitaciones 5.5. Condiciones geogrficas

1 2 3 3 5 7 9 9 10 12 13 14 16 16 16 23 25 25 25 26 27 30 31 33 34 34 35 36 36 37 39

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6. Cultivo de la trufa 6.1. Produccin de plantas micorrizadas 6.1.1. Tcnicas de inoculacin 6.1.2. Control del mtodo y proceso de inoculacin 6.1.3. Control de calidad de la planta micorrizada 6.1.3.1. Control cualitativo 6.1.3.2. Control cuantitativo 6.2. Plantacin 6.2.1. Seleccin del sitio 6.2.2. Eleccin de la especie hospedera 6.2.3. Preparacin del terreno 6.2.4. Marco de plantacin 6.2.5. Fecha de plantacin 6.2.6. Plantacin 6.3. Cultivo y manejo de la plantacin 6.3.1. Laboreo del suelo 6.3.2. Control de malezas 6.3.3. Podas 6.3.4. Riego (sistemas de riego) 6.3.5. Fertilizacin y enmiendas 6.3.6. Acolchado (mulching) 6.3.7. Plaguicidas y fitosanitarios 6.4. Seguimientos de la plantacin 6.5. Cosecha 7. Produccin y mercados de la trufa 7.1. Aspectos de produccin 7.2. Aspectos comerciales 7.2.1. Producto 7.2.2. Demanda 7.2.3. Precios 7.2.4. Comercializacin 7.2.5. Ventajas de Chile y posibles barreras comerciales 7.3. Rentabilidad de una plantacin 7.3.1. Criterios y supuestos utilizados en el anlisis 7.3.2. Costos de implantacin 7.3.3. Costos de mantenimiento 7.3.4. Ingresos 7.3.5. Tasa de descuento 7.3.6. Flujo de caja e ndices de rentabilidad 7.4. Situacin actual y perspectivas para el cultivo de trufas en Chile 7.5. Resumen de los puntos crticos 8. Literatura citada

46 46 46 49 51 53 57 58 58 60 60 61 63 63 64 65 66 66 67 69 70 71 72 73 76 76 78 78 79 80 81 82 84 84 86 87 89 90 90 94 95 97

Estado del arte del cultivo de la trufa negra (Tuber melanosporum Vitt.) y perspectivas para su cultivo en Chile

1. Resumen

Las trufas son los cuerpos fructferos de un grupo de hongos ascomicetos que forman ectomicorrizas con varias especies vegetales leosas. Dentro de las especies que dan origen a las trufas, Tuber melanosporum Vitt. es la ms codiciada por su altsimo valor gastronmico y por ende econmico. El clima ptimo para su desarrollo es el templado lluvioso, con temperaturas extremas que no superen los -9 y 42 C, y precipitaciones que sobrepasen los 600 mm anuales. Requieren de un suelo de tipo calcreo con un pH ptimo de 7,9. La trufa se puede cultivar inoculando especies forestales en la etapa de vivero, con un perodo improductivo de cuatro a seis aos. La produccin mxima es de aproximadamente 80 kg/ha y se alcanza a partir del dcimo ao. En la presente investigacin se presentan los principales requisitos tcnicos para el cultivo de esta especie en Chile y se muestran los resultados de un estudio econmico. Se simul un proyecto de dos hectreas de plantacin de avellano y encino, con plantas inoculadas en vivero. Utilizando una tasa de descuento del 12% y con una inversin inicial de $23.641.820, se estim el Valor Actual Neto en $26.037.656, y la Tasa Interna de Retorno (TIR) en 16%. El Perodo de Recuperacin de la Inversin (PRI) fue de 11 aos.

Summary

Truffles are the fruiting bodies of certain ascomycetes fungi forming ectomicorrhizae with several woody plant species. Among the truffle species, Tuber melanosporum Vitt. is the highest valuated for its culinary quality, reaching the best prices in the market. The ideal climate is rainy temperate, with extreme temperatures not exceeding -9 and 42 C, and an annual rainfall higher than 600 mm. It requires calcareous soils with optimum pH of 7.9. Truffles can be grown by inoculating tree species during the nursery stage, harvesting the first crop after 4 to 6 years. The maximum yield of 80 kg/ha can be reached by the tenth year. This report shows the main technical requirements for cultivating truffles in Chile, including an economic evaluation. A two-hectare plantation was simulated, using hazelnut and oak trees that are inoculated at the nursery. Using a 12% interest rate, and an initial investment of CLP 23,641,820, the Net Current Value was estimated in CLP 26,037,656, and the Internal Revenue Rate was 16%. The investment is paid-off after 11 years.

2. Introduccin

2.1.Descripcin de la trufa

La trufa negra Tuber melanosporum Vitt., es uno de los productos culinarios mas apetecidos en el mundo. Es catalogado como uno de los productos ms caros de la gastronoma internacional junto con el azafrn, caviar y foie gras.

Las trufas son los cuerpos fructferos de varias especies de hongos ascomicetos y cumplen la funcin de produccin y dispersin de esporas sexuales. Dichos cuerpos crecen bajo el suelo (hipgeos), y dependen fuertemente de animales que las consuman para as dispersar las esporas a travs de sus fecas. Consecuentemente, estos hongos han desarrollado estructuras reproductivas que emiten fuertes aromas y de esta manera atraen a los animales que las detectan y consumen (Lefevre y Hall, 2001).

La trufa negra es la de mayor valor comercial, recibe tambin el nombre de trufa negra del perigord o trufa negra de invierno. Es de forma globosa, algo irregular, a veces lobulada, su tamao es variable oscilando normalmente entre 3 y 6 cm de dimetro, si bien,

excepcionalmente, puede alcanzar tamaos muy superiores. Se caracteriza por un ascocarpo negro pardo cuando est maduro, con el peridio adherido a la gleba que no se desprende fcilmente. Figura 1. El peridio que suele ser negro brillante, posee a veces algn tono rojizo marrn entre las hendiduras de las irregularidades. Es de estructura generalmente pseudoparenquimatosa, de aspecto variable: liso, aterciopelado, papiloso o verrugoso, con escamas poligonales de 3 a 5 mm de altura, deprimidas en su pice, finamente estriadas. En

ocasiones se presenta una fosa basal ms o menos pronunciada, que puede llegar a ser hasta una notable cavidad interna. La gleba en los individuos inmaduros es blanca y se va tornando oscura con la madurez pasando de un gris ms o menos tenue al marrn oscuro y al negro violceo. Est recorrida por numerosas venas blancas o blanquecinas, finas y ntidas, que cuando alcanza la plena madurez o hipermadura acaban por desaparecer al adquirir el color del conjunto de la gleba. Las venas estn muy ramificadas, confusamente, dndole un aspecto marmreo. Poseen un olor muy caracterstico, intenso y persistente. (Reyna, 2000).

Fuente: Callot (1999). Figura 1. Esquema de Tuber melanosporum Vitt. en el que se aprecian diferentes estructuras. A: ascocarpo; B: detalle de las escamas del peridio; C: corte de un ascocarpo adulto en el cual se aprecia la gleba. Escala: 2 mm.

Esta trufa se encuentra en el sur de Francia, en Italia y en Espaa, y a veces tambin en el valle del Loira y en el Noreste de Francia. En su madurez presenta un olor especfico, que la convierte en la especie ms requerida por los gastrnomos franceses (Olivier, 1997)

Segn las observaciones de Ceruti, citado por Reyna, (2000) las ascas son globosas, pedunculadas con dimensiones de 90 - 140 x 80 - 120 . En su interior encierran de una a cuatro esporas, rara vez hasta seis. Las esporas poseen forma elipsoidal y son opacas, marrones ornamentadas con acleos o espnulas cortas y rgidas. El tamao oscila 29- 3555 x 22- 26- 35 (Reyna, 2000). Figura 2.

Fuente: Reyna (2000). Figura 2. Esporas de T. melanosporum en el interior del asca.

2.2. Antecedentes histricos

Conocida desde la antigedad, la trufa ha despertado gran inters por parte del hombre. Pitgoras la cita en el siglo VI a. C. Posteriormente Teofrasto (siglo III a. C.) atribuye el origen de las trufas a los truenos. Unos siglos mas tarde, Dioscrides sostuvo que eran races tuberificadas, Cicern supuso las trufas hijos de la tierra, mientras Porfirio las consider hijos de los dioses (Etayo y De Miguel, 1998). Segn Pacioni (1987), Plinio el Viejo las consider callosidades de la tierra y milagro de la naturaleza. Y Reyna (2000), seala que Brillat-Savarin en su libro Fisiologa del gusto calific la trufa como el diamante de la cocina.

No es de extraar, que se considerara algo de generacin espontanea o que su origen se buscara como indica Teofrasto (siglo III a. C.), en los truenos (en buena medida no iba desencaminado ya que los mejores aos truferos se dan en los veranos con tormentas abundantes) (Reyna, 2000). Galeno la recomendaba para producir una excitacin general que dispone a la voluptuosidad. Y Plinio, en su Historia Natural, indica que es una planta que crece y vive sin tener ninguna raz, es una callosidad de la tierra, nace espontneamente y no puede sembrarse (Reyna, 2000).

Su conocimiento y utilizacin se remonta, al menos, al principio de nuestra era, existen numerosas citas romanas y griegas al respecto en las que se pondera su valor gastronmico. Delmas (1983) dice que aparte de su reconocido valor culinario, se le han atribuido poderes mgicos y afrodisiacos. ltimamente, se han concretado en la deteccin en la trufa de feromonas de jabal, que a su vez, segn Cline (2005) contiene esteroides similares a los localizados en la secrecin axilar humana.

En frica y Oriente Medio, las trufas del desierto, probablemente servidas a los faraones, y mencionadas en el Talmud judo, eran especies de Terfezia, Tirmania, y Phaeangium. Los bedunos hoy en da usan las trufas como comida, y como medicina para los ojos inflamados (enfermedad comn en el desierto) y, en el caso de Phaeangium lefeburei como cebo para atrapar pjaros. Los bosquimanos del desierto de Kalahari del Sur de frica han recolectado Terfezia pfeilii desde el inicio de los tiempos (Trappe, 1990).

En la base del Himalaya se sabe que se recolecta Tuber indicum. Se puede encontrar en los mercados de esta zona, lo mismo que otras trufas de dificil clasificacin taxonmica. En Nepal poseen una tradicin oral respecto a la recoleccin y comida de los hongos hipgeos. En Japn, una regin es famosa por su sopa de Rhizopogon sp (Trappe, 1990).

En Australia y Nueva Zelanda los aborgenes recolectaban hongos hipgeos. Los Maores de Nueva Zelanda apreciaban ciertas especies hipgeas. En Norte Amrica y Sudamrica

abundan los hongos hipgeos, pero el nico testimonio de su utilizacin viene de los indios de Mxico. Los nativos americanos debieron tener conocimiento de las trufas pero se han perdido los usos (Trappe, 1990).

En Europa, son apreciadas por sus cualidades gastronmicas sobretodo en Francia y en Italia, y tambin en Espaa y Grecia. Principalmente se consume T. melanosporum, pero tambin las especies Tuber aestivum y Tuber magnatum (Trappe, 1990).

Pacioni (1987), seala que curiosamente se da el hecho de que el primer libro impreso de micologa fuera el Opusculum de Tuberis de Ciccarelli que trata precisamente de trufas. La trufa es por tanto, un hongo que por su inters gastronmico a lo largo de siglos y su propio misterio, ha dado lugar a multitud de posibilidades de investigacin. El estudio de las micorrizas comenz con la trufa, con sus mltiples lneas actuales, y tambin en cierto modo, el estudio de los hongos. La investigacin inicial estuvo encaminada a develar el misterio de su origen, formacin y desarrollo, dirigido a lograr su cultivo y produccin, para no depender solo de de la naturaleza (Etayo y De Miguel, 1998).

A lo largo de los siglos XVIII y XIX, se increment bastante el consumo de trufas como manjar culinario, uso que se ha extendido hasta nuestros das, y que es junto con la escasez, el causante del alto precio que alcanzan las trufas en el mercado (Etayo y De Miguel, 1998).

2.3. Orgenes de la truficultura

El descubrimiento de la relacin simbitica entre los rboles y los hongos, se debe al estudio realizado por Frank en 1885 para promover el desarrollo en Prusia de la produccin de trufa. Dicho autor, acu el trmino micorrizas utilizado hasta nuestros das (Etayo y De Miguel, 1998).

Sourzat (1983), dice que histricamente los mayores avances tcnicos en el campo de la truficultura se han producido en Francia, como consecuencia de la bsqueda de alternativas al cultivo de la vid, luego de que la filoxera se convirtiera en una plaga primaria. Pacioni (1987), afirma que, a principios del siglo XIX, el agricultor, Joseph Talon, descubri la relacin entre la trufa y los robles, planteando la necesidad de establecer plantaciones de dicha especie vegetal para obtener trufas. Y Delmas (1983), agrega que en el siglo XIX se publican tratados de truficultura, siendo los ms destacados los de Chatin en 1869 La truffe. Etude des les conditions de gnerles de la production truffire y Bosredon, en 1887, Manuel de trufficulture.

Los inicios de la truficultura tanto en Italia como en Francia fueron muy paralelos, siempre encaminados hacia una truficultura racional, tratando de optimizar el cultivo, con multitud de trabajos sobre micorrizacin en vivero y ecologa de las diversas especies de trufas. Actualmente Italia se centra fundamentalmente en el estudio de las condiciones ecolgicas para el posible cultivo de Tuber magnatum (Etayo y De Miguel, 1998).

Los avances en truficultura disminuyen mucho desde principios de siglo hasta los aos 60, en que comienzan a desarrollarse metodologas y tcnicas de inoculacin controlada entre Tuber aestivum, T. melanosporum y avellano, que son perfeccionadas en etapas sucesivas hasta desarrollar sistemas de produccin de plantas micorrizadas con trufa de manera comercial (Reyna, 2000).

Fue despus de 1973, con el control de la fase de micorrizacin, que naci una verdadera truficultura, asociando el dominio de las plantas con un manual que tomaba en cuenta el contexto edafo-climtico y prcticas especficas de cultivo. Durante los aos 80, se

extendieron las plantaciones y se intensificaron la experimentacin, con el objetivo de racionalizar los mtodos de produccin (Olivier, 1997).

Despus de un perodo de produccin abundante en Francia, se ha observado una lenta regresin. La produccin de trufa esta en decadencia continua despus del inicio de siglo

XX. Las causas resultan de la conjuncin de factores humanos, tecnolgicos y climticos: xodo rural, desaparicin de recolectores de trufa por las guerras, cierre de las truferas naturales, incendios forestales, contaminacin ambiental y lluvia cida. En las ltimas dcadas una serie de factores han provocado el descenso de la produccin, como lo es tambin la recoleccin agresiva (Reyna, 2000).

En la ltima dcada, se ha producido un importante aumento en la actividad del sector trufero tanto en el mbito de la investigacin. En la actualidad existen al menos 10 grupos de investigacin en distintas universidades y centros, como en la preocupacin que se advierte en las Administraciones Autonmicas de Espaa y en la presin que ejerce la iniciativa privada (Reyna, 2000).

3. Tipos de trufas y taxonoma

3.1. Principales especies

Los hongos hipgeos son macro-hongos que evolutivamente han desarrollado mecanismos para evitar la desecacin que supone el medio terrestre. Desarrollan y retienen sus cuerpos fructferos productores de esporas bajo tierra. La mayora de las especies, de cualquier subdivisin, producen cuerpos fructferos que son relativamente simples en estructura, globosos o irregulares, con una regin interna productora de esporas, la gleba, rodeada y protegida por la capa externa, el peridio (Etayo y De Miguel, 1998).

En casi todas las subdivisiones del reino Fungi, se encuentran especies que producen cuerpos fructferos bajo tierra, similares a las trufas. Entre ellos: Zygomycotina, Basidiomycotina (rdenes Agaricales, Boletales, Cortinariales, Phallales, Russulales, Stereales) y Ascomycotina (Elaphomycetales y Pezizales). Incluso los Deuteromycotina pueden formar estructuras hipgeas que se asemejan a cuerpos fructferos, por ejemplo Cenococcum geophilum, que debido a la similitud del hbitat, ha resultado en un parecido superficial a la forma del cuerpo fructfero de las trufas (Etayo y De Miguel, 1998).

Los Zygomycotina esporocrpicos hipgeos, se encuadran dentro de los Mucorales y Endogonales y slo se consideran trufas a aquellas especies macroscpicas que parecen anlogas a las verdaderas (Ascomycotina) o las falsas trufas (Basidiomycotina). Los Deuteromycotina como hongos imperfectos no presentan estado sexual, aunque generan esporas asexuales o conidios. A este grupo pertence el hongo Cenococcum geophilum caracterizado por esclerocios de 1 a 5 mm de dimetro, globosos, lisos, con aspecto de corcho de color caf oscuro a negro, llamados tambin trufas anamrficas (Etayo y De Miguel, 1998).

Mucho ms importantes desde el punto de vista de la abundancia, son las falsas trufas de la subdivisin Basidiomycotina. Todas las especies hipgeas de estas subdivisin pertenecen a la subclase Holobasidiomycetidae. El hbito subterrneo de estas falsas trufas presenta similitudes con la estructura y apariencia de los gasterocarpos, es decir, una capa externa protectora o peridio que rodea a una regin interna productora de esporas o gleba (Etayo y De Miguel, 1998).

Las especies de trufas ms apetecidas por su valor gastronmico y las que en sentido estricto debieran ser las nicas llamadas como tales, son las que se enmarcan dentro del gnero Tuber, familia Tuberaceae, orden Pezizales, clase Ascomycetes, subdivisin Ascomycotina, divisin Eumycota, reino Fungi. La familia Tuberaceae la componen el gnero Tuber y el gnero Paradoxa (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

Algunos autores han englobado las trufas en el orden Tuberales que incluira tres familias; la Geneaceae con los gneros Hydnocystisy y Genea; la familia Terfeziacea con los gneros Birmania, Terfezia, Mattirolomyces, Delastria y Picoa y por ltimo la familia Eutuberaceae con los gneros: Stephensia, Pachyphloeus, Choromyces, Balsamia y Tuber (Reyna, 2000).

3.2. Gnero Tuber

Dentro de la familia Tuberaceae el gnero Tuber constituye el bloque fundamental y de mayor importancia dadas sus connotaciones econmicas, por lo que hasta el da de hoy es el mas estudiado, pero tambin ha dado lugar a numerosas sinonimias y confusiones en los nombres cientficos de las especies que comprende (Reyna, 2000).

Segn los autores Ceruti (1960), Delmas (1983), Paccioni (1987), Montecchi (1993), Manjon et al. (1995), Garca Montero (1997), Astier (1998) y Zambonelli (1999), citados por Reyna (2000), el gnero Tuber estara representado en Europa, por varias especies Cuadro 1.

Aparte de las especies mencionadas en el Cuadro 1, Callot (1999), incluye las especies Tuber texense (de Texas) y Tuber canaliculatum (del Noreste de Estados Unidos).

Cuadro 1. Especies comestibles pertenecientes al gnero Tuber. Especies de inters econmico Tuber albidum Pico Tuber aestivum Vitt. Tuber borchii Vitt. = T. albidum Pico Tuber brumale Vitt. Especies sin inters econmico Tuber asa Tul. Tuber bituminatum = T. mesentericum Vitt. Tuber dryophhilum Tul. & Tul. Tuber excavatum Vitt.

Tuber brumale Vitt. forma moschatum Tuber excavatum Vitt. forma fulgens Qul. Ferry Tuber magnatum Pico Tuber melanosporum Vitt. = T. nigrum Bull Tuber mesentericum Vitt. Tuber rufum Pico Tuber uncinatum = T. aestivum uncinatum Tuber excavatum Vitt. Forma

Monticellianum Vitt. Tuber ferrugineum Vitt. Tuber foetidum Vitt. Tuber fulgens Quelet Tuber gibbosum Harkness Tuber hiemalbum Tuber himalayense BC Zang & Minter Tuber indicum Cooke & Mass Tuber lucidum Tuber malenoni Tuber maculatum Vitt. Tuber macrosporum Vitt. Tuber murinum Tuber nitidum Vitt. Tuber oligospermum (Tul. & Tul.) Trappe Tuber panniferum Tul. & Tul. Tuber puberulum Bk. & Br. Tuber regianum Mont. & Iazz. Tuber rufum Pico var. nitidum Fischer Tuber rufum Pico forma ferrugineum (Vitt.) Montechi & Lazzari Tuber rufum Pico forma lucidum (Bonnet) Montechi & Lazzari Fuente: Reyna (2000).

3.3. Descripcin de algunas especies comestibles

A continuacin se presenta, en el Cuadro 2, las principales caractersticas que diferencian a las especies comestibles del gnero Tuber.

Cuadro 2. Resumen de caractersticas de algunas especies comestibles de trufas.Especie T. aestivum T. uncinatum T. borchii T. brumale T. mesentericum Forma ascocarpo Tamao ascocarpo Tipo Peridio Color Peridio Color Gleba Consistencia Gleba Finas y Venas abundantes, circunvoluciones Cavidad ascocarpo Tipo Ascas N esporas por asca Forma esporas Ornamentacin esporas Color esporas Olor Amarillo-caf claro Agradable, malta tostada, persistente Amarillo-caf claro Agradable, suave, poco persistente Caf plido a caf claro Agradable poco persistente Amarillentas, caf plido Fuerte, algo agrio almizclado Alquitrn, tintura de yodo Agradable, fuerte muy persistente Escaso, slo muy madura, a hongo Elpticas subglobosas Reticuladas Elpticas subglobosas Reticuladas Elpticas subglobosas Reticuladas Elpticas subglobosas Espnulas Reticuladas incompleto Caf plido Caf oscuro Caf claro Espnulas Elpticas Elpticas Elpticas subglobosas Espnulas 1-6 1-6 1-4 2-5 1-3-4 16 1-5 Globosas Globosas Globosas Globosas Globosas Globosas Sacata globosa No Finas y abundantes, circunvoluciones No No No Casi siempre Anchas y escasas Caf claro avellana Carnosa ligera Carnosa ligera Carnosa Caf Caf Gris, negro prpura Carnosa pesada Anchas y escasas Finas y numerosas Ligera, seca Gris, caf Caf, prpura negro Consistente carnosa pesada Finas y numerosas, circunvoluciones No Anchas y escasas convergentes No Negro-caf Negro-caf Caf al ocre rojizo Negro Gris-caf Negro-caf Caf, rojizo, negro Anaranjado caf Consistente Verrugoso Verrugoso Liso Verrugoso Verrugoso Verrugoso Liso Subgloboso lobulado 1 - 10 cm Subgloboso lobulado 1 - 10 cm Subgloboso globoso lobulado 1 - 10 cm 0.5 5 cm Subgloboso Subgloboso lobulado 1 - 10 cm T. melanosporum Subgloboso lobulado 1 - 10 cm Subgloboso lobulado 0.5 - 2 - 4 T. rufum

Fuente: Reyna (2000).

3.4. Composicin orgnica y mineral de las trufas

Las trufas jvenes son ricas en cidos aminos (cido -aminobutrico, treonina, cido glutmico, etanolamina). Por su parte, el metabolismo de los lpidos se modifica en el curso del desarrollo del ascocarpo, estando dominado en los primeros estados por el esterol ergosterol y luego por el esterol brasicasterol. Presentan una fuerte actividad metablica debido a los intensos fenmenos respiratorios y una fuerte demanda de oxgeno, por lo que el ascocarpo debe desarrollarse en un micro-ambiente bien aireado (Callot, 1999).

Con el anlisis de trufas negras provenientes de varias regiones, se pudo constatar que los niveles de elementos minerales son constantes y bastante elevados en comparacin con otros hongos y vegetales. Comparando trufas de distintos lugares se determin que no existen diferencias significativas en su composicin, entre trufas que se desarrollaron en suelos ricos en elementos minerales como en las que se desarrollaron en suelos pobres. Las trufas son bastante energticas, tomando en cuenta que su contenido en compuestos ntricos es cuatro veces mayor que los championes comunes, cultivados en lechos o camas. Adems, poseen elevados contenidos de fsforo, potasio y silicio y curiosamente pobres en calcio, siendo que se desarrollan en terrenos calcreos (Callot, 1999).

En los Cuadros 3 y 4, se muestra la composicin promedio de los ascocarpos de T. melanosporum y una comparacin de la reparticin de elementos minerales, en la parte central del ascocarpo (gleba) y en la capa superficial (peridio). Se observa que la concentracin de fsforo y potasio son mayores en la gleba, por el contrario, los niveles de fierro, cobre y calcio son ms elevados en el peridio.

Cuadro 3. Composicin media de ascocarpos de T. melanosporum.

Agua Materia seca Nitrgeno Cenizas

75 % 25 % 47% 57% Cenizas (%)

cido fosfrico Potasio (K2O) Calcio (CaO) Silicio (SiO2) cido carbnico y prdidas Fuente: Callot (1999).

20 30 10 28 5 10 15 25 8 10

Cuadro 4. Niveles comparados de los elementos minerales en las cenizas del peridio y de la gleba de T. melanosporum. Peridio Gleba Cenizas (%) Fsforo total (%) Azufre total (%) Calcio total (%) Magnesio total (%) Potasio total (%) Cobre total (mg/kg) Fierro total (mg/kg) Fuente: Callot (1999). 7,41 0,850 0,43 0,850 0,07 1,456 112 296 63 73 8,03 1,051 0,40 0,09 0,08 3,24

3.5. Aromas y propiedades organolpticas

Los distintos tipos de trufas poseen aromas diferentes. Las ms estudiadas, debido a su intenso y exquisito aroma y por lo tanto las ms caras son la trufa blanca en Italia (T. magnatum) y en Francia la trufa negra (T. melanosporum) (Reyna, 2000).

La trufa blanca posee aromas penetrantes, fuertemente aliceos. Una muy pequea cantidad es suficiente para otorgar un sabor delicioso a los platos preparados. El componente responsable del aroma de esta trufa es el bi(metil)biometano. Se ha demostrado que las moscas de las especie Suillia univittata, que vienen a aovar encima de esta trufa, tienen dos generaciones en la temporada, en la primera infectan el ajo y en la segunda la trufa blanca (Callot, 1999).

La trufa negra tiene aromas sutiles y muy diferentes segn sus terroirs (condiciones de clima y suelo particulares). Su perfume incluye ms de 50 compuestos (aldehdos, alcoholes, esteres, compuestos azufrados). Los compuestos aromticos se desarrollan en el cuerpo fructfero despus de la detencin del crecimiento de ste, en la maduracin. Entre los compuestos voltiles, el dimetil-sulfuro y el metil-2 butanol, son los principales, siendo escencialmente el dimetil-sulfuro el que reconocen, por el olor, los perros truferos.

4. Biologa de la trufa

4.1. Las micorrizas

La relacin simbitica denominada por el profesor A. B. Frank como Mykorhiza, hacia 1885, del griego mykos (hongo) y del latn rhiza (raz) ya haba sido reconocida anteriormente por Hartig (1840), en sus caractersticas estructurales y ecolgicas e ilustr una ectomicorriza y una endomicorriza orquidoide. Tambin Kamienski fue uno de los pioneros en describir la naturaleza de la micorriza monotropoide en 1882 (Etayo y De Miguel, 1998).

La simbiosis, se define como el estado resultante cuando dos organismos viven en contacto ntimo. De Bary (1887), citado por Allen (1991), describe varios tipos de simbiosis incluyendo parasitismo, comensalismo, amensalismo, neutralismo y mutualismo, segn la relacin entre estos sea negativa, neutra o positiva.

La asociacin micorrcica es una simbiosis mutualista entre la planta y el hongo, la cual est localizada en una estructura similar a la raz en la que la energa se mueve primariamente de la planta al hongo, y los recursos inorgnicos se mueven desde el hongo a la planta (Allen, 1991).

4.1.1. Tipos de micorrizas

La micorriza est constituida por una raicilla muy fina rodeada y penetrada en mayor o menor grado por el micelio del hongo. Las micorrizas se clasifican en funcin de hasta que punto se produce esta fusin. Las trufas pertenecen al grupo de hongos, de tipo simbitico, formador de ectomicorrizas, y se asocian a ciertas plantas superiores como las encinas y robles, sin las cuales son incapaces de sobrevivir (Reyna, 2000).

a) Endomicorrizas

El micelio penetra hasta el interior de las clulas de la raz y solo es apreciable mediante la observacin de secciones de la misma al microscopio (Reyna, 2000). El hongo penetra en las clulas corticales y no forma una capa fngica externa (Figura 3). Este grupo a su vez se subdivide en: ericoides, orquidiodes y vesiculo-arbusculares o VA (Etayo y De Miguel, 1998).

El 80-90% de las especies vegetales y hongos Zygomycotina, forman micorrizas tipo vesculo-arbusculares. Se caracterizan porque el hongo se desarrolla en el interior de la raz, las hifas externas no forman manto, el micelio es inter e intracelular y las hifas intracelulares forman arbsculos y vesculas. A diferencia de stas, las endomicorrizas ericoides, formadas por plantas de la familia de las Ericceas, el hongo (Ascomyceto o basidiomyceto) forma pelotones dentro de las clulas corticales. Por otro lado, estn las orqudeas que forman unas micorrizas con una fisiologa especial con hongos Basidiomycotina llamadas endomicorrizas orquidoides (Etayo y De Miguel, 1998).

Hifas del hongo Clulas corticales de la planta

Fuente: Reyna (2000). Figura 3. Esquema de una micorriza del tipo VA. Se aprecia como las hifas penetran las clulas corticales de la raz.

b) Ectomicorrizas

Se definen como aquellas en las que la relacin con el hongo es externa, del punto de vista que el hongo no penetra las clulas de la raz sino que forma una estructura llamada manto o vaina, la cual envuelve la raz y penetra intercelularmente en las primeras capas de clulas formando el retculo de Hartig (FIGURA 4). Desde el manto salen hifas o rizomorfos hacia el sustrato en forma radial (Etayo y De Miguel, 1998).

Son el tipo ms corriente de micorrizas en el ambiente de tipo forestal y a l pertenecen las micorrizas de la trufa. Entre un 3 y 5 % de los vegetales forman micorrizas ectotrficas sin embargo su importancia forestal es enorme. Prcticamente todos los rboles forestales forman este tipo de micorriza en unin a diversos hongos, muchos de ellos apreciados por su inters gastronmico como Lactarius sp., Bolletus sp., Russula sp., Amanita sp., Cantarellus sp., Morchella sp., Tuber sp., etc. Los hongos capaces de formar este tipo de asociacin pertenecen a los Basidiomycotina, Ascomycotina y raramente a los Zygomycotina. Las principales familias de planta que son huspedes de estos hongos son: Betulaceae, Fagaceae, Pinaceae, Tiliaceae, Juglandaceae, Salicaceae, Ulmaceae, Corylaceae, Rosaceae y Fabaceae (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

Hifas del hongo Clulas corticales rodeadas por las hifas

Fuente: Reyna (2000). Figura 4. Esquema de una ectomicorriza. Aqu se muestra como el micelio del hongo se desarrolla entre las clulas del crtex sin penetrar las clulas vegetales. La estructura de las ectomicorrizas esta formada, bsicamente, por el manto miceliar, el retculo de Hartig y las espnulas (Figura 5). Esta asociacin se produce en las races ms finas de la planta, pices radiculares, y es difcil de apreciar a simple vista ya que las raicillas micorrizadas no suelen superar los 2 3 mm de longitud y 0,3 a 0,5 mm de dimetro. Externamente las ectomicorrizas producen un engrosamiento de las raicillas terminales, debido al recubrimiento del manto fngico, adems de provocar una intensa divisin radicular otorgndole a la cabellera de races un aspecto coraloide (Reyna, 2000).

Fuente: Reyna (2000). Figura 5. Esquema de una ectomicorriza en la cual se aprecian sus estructuras (manto, retculo de Hartig y espnulas).

El manto puede tener diversos colores y consistencias segn las especies en cuestin. Superficialmente presenta diferentes tipos de dibujos en funcin de la estructura que formen sus hifas. Bsicamente se distinguen dos tipos de manto: el plectenquimtico que constituye una malla ms o menos fibrosa en la que se aprecian claramente las hifas del hongo. Y el manto pseudoparenquimtico en el que se forma una estructura de aspecto celular parecido a los parnquimas vegetales. Aqu ya no se aprecia la forma alargada o fibrosa de las hifas, sin embargo, se estructura con ciertos tipos de dibujos distintivos que son fundamentales para reconocer las diferentes especies de micorrizas, como el manto en puzzle o el manto poligonal, siendo ste ltimo el correspondiente a Tuber melanosporum (Reyna, 2000).Retculo de Hartig Manto

Hifas

Fuente: Reyna (2000). Figura 6. Seccin de una ectomicorriza. Se aprecia el manto en color negro rodeando la raz y el retculo de Hartig (hifas oscuras que penetran hacia el interior por entre las clulas de la raz).

En la Figura 7, se aprecian los diferentes tipos de mantos, el plectenquimtico y los dos tipos de manto pseudoparenquimticos; el manto en puzzle y el manto poligonal.

1.

2.

3. Fuente: Reyna (2000). Figura 7. Tipos de mantos desarrollados por las ectomicorrizas al recubrir la raz de la planta infectada. 1: manto plectenquimtico; se aprecian claramente las hifas el hongo. 2: manto en puzzle; no se aprecia la forma fibrosa de las hifas. 3: manto poligonal; aspecto de parnquima vegetal.

El retculo de Hartig esta formado por las hifas del manto que penetran intercelularmente las primeras capas de clulas (cortex) de la raicilla, no llegando stas a penetrar la clula misma. Finalmente, hacia el exterior del manto se extienden hifas, ms o menos largas que reciben el nombre de espnulas, que se extienden por el perfil del suelo. La forma y tamao de las espnulas vara con las diferentes especies de hongos y tambin es clave para determinar a que especies corresponde (Reyna, 2000).

Fuente: Callot (1999). Figura 8. Comparacin entre el pice de una raz de roble (Quercus robur) no micorrizada y el de una raz de roble micorrizada con T. melanosporum. A la izquierda: raz de roble no micorrizada. A la derecha: raz de roble (Q. robur) micorrizada por T. melanosporum; notar la reduccin de la cofia (C), el desarrollo del manto (m) y el alargamiento de las clulas corticales (Co). El meristema (me) es poco visible en la foto. Escala: 50 m. c) Ectendomicorrizas

stas corresponden a un tipo intermedio entre las endomicorrizas y las ectomicorrizas, ya que por un lado forman manto y retculo de Hartig, y adems se produce la entrada del hongo en el interior de la clula (Reyna, 2000). Los hongos que forman este tipo de micorriza pertenecen a los Basidiomycotina. Las ectendomicorrizas arbutiodes se asocian con plantas de los gneros Arbutus, Arctostaphylos y Vaccinium (arndano) (Etayo y De Miguel, 1998).

Hifas del hongo

Clulas corticales de la planta

Fuente: Reyna (2000). Figura 9. Esquema de una ectendomicorriza. Se aprecia como el micelio del hongo penetra entre las clulas corticales formando retculo de Hartig y manto y adems penetra dichas clulas.

4.1.2. Funciones de las micorrizas y usos por el hombre

Los rboles micorrizados obtienen una serie de ventajas de gran importancia para prosperar en el medio natural, ya que la micorriza otorga una serie de ventajas tanto a la planta como al suelo y su entorno ecolgico.

La planta micorrizada posee una mejor capacidad de absorcin de nutrientes ya que al ser mayor el volumen radicular aumenta la superficie de contacto entre raz y suelo, puesto que la micorriza induce a la divisin radicular y al engrosamiento de sta. Adems el sistema radical se ampla a travs del micelio extendido en el suelo, el cual es capaz de absorber sustancias simples, que luego pasan a la raz y al rbol, mejorando el nivel de asimilacin de macronutrientes, absorcin de agua y oligoelementos. Entre esos nutrientes es el fsforo el que mejora ms los niveles de asimilacin, en este sentido se citan incrementos de hasta

10 veces mayor asimilacin de fsforo en plantas micorrizadas versus no micorrizadas. Por lo tanto, el efecto positivo ms evidente, es un crecimiento ms rpido que se traduce de una forma general por un aumento de la biomasa producida (Etayo y De Miguel, 1998; Callot, 1999; Reyna, 2000). La planta micorrizada es ms competitiva para captar agua del suelo, por consiguiente es mas tolerante a las situaciones de estrs en casos de sequas. Las micorrizas tambin otorgan a la planta un sistema de defensa contra enfermedades criptogmicas, tanto por la mayor vitalidad de la planta al estar mejor nutrida, como por la capa biolgica de proteccin constituida por el manto fngico que supone ya una barrera de entrada a los agentes parasitarios. Asimismo, en ciertos casos como la trufa, la produccin de ciertos compuestos aleloqumicos evita la competencia de otras especies vegetales (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

Segn Etayo y De Miguel (1998), las micorrizas mejoran el enraizamiento y el establecimiento de las plantas, incrementan la captacin de iones lentos, con lo que aumentan el crecimiento, facilitan el reciclaje de nutrientes en el sistema suelo-plantaatmsfera, mejoran las propiedades fsico-qumicas del suelo como la textura y estructura.

En la fase de vivero las micorrizas propician un mejor crecimiento y acumulacin de reservas que sitan a la planta en mejor posicin para la futura plantacin. Adems, el desarrollo radicular ms acentuado hace las plantas soporten mejor la fase de trasplante y aclimatacin al campo (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

En las comunidades naturales se ha desarrollado con el tiempo un equilibrio entre las plantas y sus hongos micorrcicos, pero en sistemas degradados se limitan las fuentes de propgulo, por lo que se hace necesaria la introduccin de hongos micorrcicos. Actualmente en todas las estrategias de reforestacin se tienen en cuenta las micorrizas como factor importante a la hora de favorecer el establecimiento de las plantas. La micorrizacin controlada, es tambin utilizada para facilitar las plantaciones de proteccin u ornamentales en condiciones difciles, como por ejemplo la reforestacin de suelos

perturbados de zonas de minera, excavaciones en obras pblicas o terrenos inestables de montaa (Etayo y De Miguel, 1998).

Por ltimo, se puede recurrir a las asociaciones micorrcicas con el objetivo de obtener carpforos comestibles, como es el caso de las ectomicorrizas productoras de trufas o como tambin es el caso de los Boletus edulis ssp (Etayo y De Miguel, 1998).

4.2. Ciclo biolgico

4.2.1. Diseminacin de esporas

El carpforo (trufa) alcanza su madurez plena desde mediados de invierno a principios de primavera. Debe liberar las esporas que encierra, lo que es facilitado por su intenso aroma que atrae a muchos animales que las consumen como alimento y tambin numerosos insectos e invertebrados, algunos de los cuales poseen una vinculacin especfica con la trufa. El jabal por ejemplo excava la tierra en busca de la trufa y puede transportar pequeas porciones de trufa adheridas a los labios o al pelo, hasta otros lugares. Otro consumidor, no tan voraz, pero si muy especializado en ellas, es la mosca de la trufa (Suillia fuscicornis y S. gigantea) de la familia Heliomyzidae, que ovipone en las trufas maduras, alimentndose sus larvas de sta; contribuye activamente a la diseminacin al quedar adheridas a las pilosidades de los adultos numerosas esporas. La dispersin real se produce cuando las esporas salen de las ascas, cuando el carpforo esta en una etapa de hipermadurez o casi putrefaccin. Mientras las esporas no se liberan de las ascas no se puede producir una verdadera diseminacin, ya que stas no germinan en el interior de las ascas por efectos de inhibidores de la germinacin (Callot, 1999; Reyna, 2000).

4.2.2. Germinacin de las esporas

Las esporas liberadas de las ascas, una vez que alcanzan el suelo, son arrastradas hacia su matriz por efecto de las lluvias, siendo lixiviados los inhibidores germinativos. Cuando alcanzan la temperatura y humedad adecuada (a mediados de la primavera), la espora comienza a germinar emitiendo un finsimo filamento de micelio que se ramifica rpidamente, suceso que ha sido muy escasamente observado, in vitro o in situ. El micelio derivado de los tubos germinativos nacidos de las ascosporas, podra tener dos destinos distintos: una es la va vegetativa, que acaba en la formacin de micorrizas, al entrar en contacto con races cortas; y la otra corresponde a la via sexual, cuando los filamentos reproductores que inducen la formacin de un primordio, se hallan en la vecindad de ciertas races largas (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Fuente: Reyna (2000). Figura 10. Espora de T. melanosporum germinando.

4.2.3. Infeccin de races

El filamento miceliar emitido por la espora comienza a explorar el suelo en busca de alguna raicilla a la cual infectar. Dicho crecimiento posee un tiempo limitado por el agotamiento de las reservas energticas. Al ponerse sta en contacto con la raicilla de algn hospedero adecuado, se comienza a formar la micorriza, proceso conocido como infeccin primaria. El micelio se desarrolla penetrando en el interior del cortex de las races formando el retculo de Hartig y en el exterior forma el manto del que se originan nuevas hifas que van a

infectar las raicillas ms cercanas. Estas nuevas raicillas infectadas (o expansin de la micorriza) se denominan infeccin secundaria. En ciertas zonas del sistema radical la infeccin micorrcica provoca una abundante divisin radicular y una acumulacin o glomrulo de micorrizas bastante compacto. Todo el proceso de infeccin se extiende por el suelo y el sistema radical, hasta alcanzar una cierta biomasa crtica de micorrizas, a partir de la cual, si las condiciones son adecuadas, se puede producir la fructificacin. Bajo condiciones de cultivo, con planta inoculada, se ha establecido que el ciclo completo requiere de entre 5 a 10 aos. Dentro de esta fase, en la que se produce una clara simbiosis, tambin se produce la colaboracin de bacterias que mejoran y estimulan el proceso micorrcico, puesto que ayudan a acidificar el medio favoreciendo el desarrollo en extensin del micelio (Callot, 1999; Reyna, 2000). Cuando las races van cesando en su crecimiento producto de un dficit hdrico, van pasando de color blanco a un color caf claro. Este cambio de color se produce por modificaciones anatmicas ligadas a depsitos de lignina, complejos tanino-protenas, compuestos fenlicos con incorporacin de aminocidos y pptidos en la pared celular, sobretodo en el sber y la endodermis, proceso conocido como metacutinizacin, que permite a las races resistir a condiciones ms secas. Esta acumulacin de lignina y taninos ricos en nitrgeno, es muy importante, puesto que stas son las sustancias nutricionales ms favorables para el desarrollo de la trufa y para la mantencin de una buena micorrizacin (Callot, 1999).

4.2.4. Formacin de trufas

A partir de los meses de octubre-noviembre, parte de los filamentos miceliares empiezan a diferenciarse, agrupndose y compactndose hasta dar lugar a la formacin de un pequeo ncleo o primordio de la futura trufa (Reyna, 2000). Los primordios jvenes poseen tres partes; una parte basal, que constituye el pie, que produce varios filamentos que recubren la estructura en formacin, una parte media ascogonial, con un citoplasma denso, envuelto por filamentos jovenes y una parte terminal o tricogino, enrollado alrededor de una hifa

miceliar o filamento estril a modo de sujecin. Estos primordios de color claro, se vuelven globulosos en el transcurso de su crecimiento y se transforman en bosquejos conteniendo, por definicin, un centro frtil y una cobertura. sta se tie progresivamente de un color anaranjado (Figura 11) que facilita su localizacin desde la tierra (Callot, 1999).

Fuente: Callot (1999). Figura 11. Evolucin morfolgica de los primordios de T. melanosporum. rl: raz larga; *: crter.

Desde el punto de vista morfolgico, el joven primordio muestra una polaridad, a menudo subrayada por el hecho de que su base est en contacto con una raz larga, con un ensamble que presenta la forma de una pipa (Figura 11). El polo apical presenta una cavidad que, en el curso de su desarrollo, se llena progresivamente de filamentos formando un enfurtido blanquecino, esta cavidad abierta hacia el exterior se halla tapizada de una empalizada de paraphyses o clulas alargadas (Figura 12). La periferia primero lisa y amarillenta ocre, se tiende a colorear anaranjada. Correlativamente las escamas prominentes se forman progresivamente a partir de la base hacia la parte superior, constituyendo ellas el inicio del peridio. A lo largo del crecimiento del primordio, en la base de ste, los restos de filamentos ascogoniales, producen los primeros elementos del aparato esporoftico (Callot, 1999).

Fuente: Callot (1999). Figura 12. Estructura detallada de un primordio de trufa en estado apotecioide. La cavidad est a punto de cerrarse y se aprecian en el interior las venas estriles (ms claras) rodeando las venas frtiles (sp) y el peridio escamoso envuelve el porimordio. c: canal; e: escamas; pr: parfises; sp: aparato esporoftico.

Luego, comienzan a acercarse los bordes de la cavidad para posteriormente sellarse, cerrndose as la cavidad. El primordio se vuelve globuloso y se conforma la estructura caracterstica de un ascocarpo juvenil que contiene un delgado peridio escamoso alrededor de una voluminosa gleba interna. Esta se halla formada por venas estriles sinuosas y ramificadas, correspondiendo a restos de la cavidad, y por venas frtiles estrechamente moldeadas entre las venas estriles que contienen el aparato esporoftico, que producir las ascas cuando llegue a su madurez (Callot, 1999).

4.2.5. Fase saprfita

De acuerdo con Callot (1999) y Reyna (2000), a finales de la primavera principios de verano, se inicia una fase saproftica en la trufa. En esta etapa, el carpforo se independiza de la micorriza y se alimenta a partir de sustancias orgnicas presentes en el suelo a travs de hifas miceliares presentes en la punta de las escamas. Al mismo tiempo comienza un engrosamiento considerable de la trufa y es necesaria una cierta cantidad de lluvia para que los carpforos lleguen a madurar y alcancen un tamao ostensible. A finales del verano comienzan a diferenciarse las esporas. A medida que prosigue la maduracin se produce la emisin de aromas, llegando a su mximo cuando la trufa alcanza la plena madurez. En esta etapa el peridio constitudo por escamas piramidales de base poligonal se tornan completamente negras y las ascas se han formado en la gleba otorgndole un color caf oscuro a las venas frtiles. El ciclo de crecimiento del cuerpo fructfero de la trufa dura aproximadamente ocho meses a partir de los primeros primordios hasta que madura plenamente.

Entre los elementos nutritivos necesarios para su crecimiento los ms importantes son el nitrgeno y el carbono. En condiciones de laboratorio el crecimiento del micelio es ptimo con una fuente nitrogenada proveniente de aminocidos a pH 5,5 y mnima con una fuente en forma de nitrato y a pH 7 no se observa ningn crecimiento. Estos resultados parecen sorprendentes sabiendo que la trufa se desarrolla en medios calcreos, con pH superior a 7, y que en estos medios el nitrgeno se haya generalmente en forma de nitrato. Esto demuestra que los hongos que se desarrollan en medios alcalinos poseen enzimas capaces de reducir el anin nitrato. Adems se ha demostrado la presencia de cuatro aniones orgnicos: en baja cantidad oxalato y malato y en mayor cantidad succinato y por sobre todo citrato (Callot, 1999).

El micelio de la trufa es capaz de utilizar numerosas fuentes de carbono. En cultivo in vitro, la manosa y la sacarosa parecen ser las mejores fuentes de carbono con una fuente de

nitrgeno amoniacal, a pH 6. La manosa es una azcar que se encuentra en las paredes de las clulas vegetales, lo que explica la colonizacin del micelio de trufa en las clulas de las races. La fuerte capacidad de utilizacin de sacarosa, azcar muy presente en la savia elaborada de los vegetales, es tambin compatible con la existencia de la fase micorrtica. El micelio de trufa utiliza entonces fuentes de carbono de compuestos simples, lo que indica una capacidad saproftica de tipo primario. Ciertos compuestos aromticos (cido qunico) en la base de polmeros como la lignina y los taninos, son tambin favorables al micelio de la trufa, que presenta igualmente una capacidad saproftica secundaria permitindole degradar molculas carbonatadas ms complejas, polimerizadas. Por medio de compuestos testeados, la quitina y los taninos son los sustratos ms favorables para el crecimiento del micelio de T. melanosporum. El desarrollo de los micelios presenta siempre un aspecto difuso, salvo en presencia de quitina y de cidos hmicos. Esta capacidad saporoftica secundaria del micelio esta ligada a la secrecin de enzimas de degradacin del almidn, de la celulosa, de las ligninas y de la quitina (Callot, 1999).

4.2.6. Resumen del ciclo biolgico

A continuacin se presenta un resumen del ciclo biolgico de Tuber melanosporum. En la Figura 13, se aprecia que un filamento miceliar (A) en contacto con una raz larga se transforma en un primordio apotecioide (B a F), que crece y se vuelve autnomo. Enseguida, el primordio se cierra y adquiere una forma globulosa (G) presentando la estructura caracterstica de la trufa, con una gleba envuelta por un peridio escamoso negruzco (H). A partir de este estado, el ascocarpo juvenil crece enormemente, las escamas del peridio y las venas de la gleba de multiplican activamente al mismo tiempo que las ascas y las ascosporas llenan completamente la gleba. En la madurez (H), las ascas comprimen y fermentan las venas estriles.

Fuente: Callot (1999). Figura 13. Desarrollo del ascocarpo de T. melanosporum desde un filamento miceliar (A), pasando por un primordio apotesioide (B) que se expande (C-G) hasta llegar a transformarse en una trufa madura (H).

4.3. Fijacin de CO2 por el ascocarpo A pesar de su carcter heterotrfico, ciertos hongos son capaces de fijar y metabolizar el CO2 atmosfrico. Recientemente se ha puesto en evidencia que el fenmeno de fijacin de CO2 ocurre en especies de hongos micorrticos como Pisolithus tinctorius (Pers.) Cooker et Couch., Paxillus involutus (Batsch : Fr.), y en los cuerpos fructferos enteros de Agaricus campestris L. (Callot, 1999).

El ambiente en el que se desarrollan las trufas es muy rico en carbonato y oxalato de calcio y la atmsfera del suelo, bajo ciertos casos, puede encerrar importantes cantidades de CO2, superiores a 2-5 %. En experimentos con 14CO2 para demostrar la fijacin de CO2 por parte de T. aestivum y T. melanosporum, se concluy que en el caso de T. melanosporum, la fijacin puede alcanzar valores iguales a 10 g de carbono por gramo de trufa (peso seco) por hora. Esto representa el equivalente a un 8 a 10 % del CO2 respirado por estas mismas trufas. El carbono fijado es incorporado en diferentes estructuras orgnicas, particularmente en: 20 % en azucares neutras, 45 % en aminocidos (principalmente cido asprtico y glutamina) y 33 % en cidos orgnicos (cido mlico). Las cantidades de CO2 fijadas varan segn el estado fisiolgico del ascocarpo, obteniendo los valores ms elevados los ms jvenes. Al parecer la va ms importante de fijacin de gas CO2 sera por intermedio de la enzima piruvato carboxilasa, que transforma el piruvato en oxalacetato al adquirir una molcula de CO2 (Callot, 1999).

5. Ecologa

5.1. Distribucin mundial

La trufa negra silvestre se encuentra exclusivamente en Europa en reas de rgimen estrictamente mediterrneo, concentrndose en stas zonas casi la totalidad de su produccin, y tambin las encontramos en reas de rgimen atlntico con sequa estival poco pronunciada como es el caso de Perigod, en Francia, o el Pas Vasco, en Espaa. Y en climas temperados hmedos y calurosos, encontrndose trufas en el norte y sur de China y en Amrica del norte (California y Texas) (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Naturalmente la trufa negra se recolecta entre los paralelos 37 y 47 LN, concretamente en los siguientes pases: Alemania, Bulgaria, Espaa, Francia, Grecia, Hungra, Italia, Portugal, Yugoslavia y probablemente Checoslovaquia. La trufa es realmente importante en Francia, Italia y Espaa que son los pases que concentran el 90% de la produccin mundial (Pacioni, 1987; Reyna, 2000).

Fuente: Plantin, truffles and mushrooms (2006). Figura 14. Distribucin natural de las trufas negra y blanca (T. melanosporum y T. magnatum).

La trufa tambin puede ser cultivada inoculando rboles forestales en la etapa de vivero. La tcnica se desarroll en Francia e Italia y luego fue aplicada en Espaa, Nueva Zelanda, Estados Unidos y Australia (Tasmania), donde ya existen cultivos en produccin. Adems se conocen trabajos al respecto en Israel, Sudfrica y Argentina. Todos pases poseedores de clima templado y mediterrneo (Callot, 1999; Reina, 2000; Ramirez, 2003).

Actualmente en Chile se desarrollan proyectos para evaluar el establecimiento de T. melanosporum en el pas. Uno es ejecutado por la Universidad Catlica del Maule y el otro por el Instituto Forestal. Ambos proyectos estn orientados a experimentar el resultado de la inoculacin en diferentes especies leosas como hospederos y a evaluar su prendimiento en terreno (lvarez, 2004).

5.2. Simbiontes de T. melanosporum

Antiguamente la relacin entre la produccin de trufas y las especies arbreas a las que se asocia T. melanosporum era desconocida. Sin embargo, a mediados del siglo XIX, el

agricultor francs Joseph Talon desarroll el concepto de establecer bosques de encinos para obtener trufas, siendo el principio de la denominada poca dorada de la trufa en Francia, al ser una alternativa viable al cultivo de la vid que estaba siendo arrasado por la filoxera (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Distintos autores, de entre los cuales Etayo y De Miguel (1998) y Reyna (2000), citan las siguientes especies (Cuadro 5), reportadas como simbiontes naturales de T. melanosporum, las cuales seran susceptibles tambin de ser micorrizadas artificialmente para su cultivo, segn la regin climtica:

Otros autores citados por Bonet (2006) incluyen en la lista de huspedes de T. melanosporum a especies arbreas del gnero Cistus, includos: C. albidus, C. incanus, C. laurifolius y C. salvifolius y tambin a algunas especies de los gneros Larix, Cedrus, Betula, Carpinus y Salix.

Cuadro 5: Especies vegetales leosas que forman asociacin simbitica naturalmente con el hongo Tuber melanosporum. La mayor parte de stas corresponde a especies de importancia forestal. Castanea sativa Quercus coccifera Cistus spp. Corylus avellana Fagus sylvatica Fumana spp. Ostrya carpinifolia Pinus nigra Populus spp. Quercus cerris Fuente: Reyna (2000). Quercus faginea Quercus ilex Quercus petrae Quercus pubescens Quercus robur Quercus suber Tilia platiphyllos

Adems de estas especies, se ha logrado la micorrizacin artificial de otras especies forestales como Pinus halepensis y Quercus macrocarpa (Reyna, 2000).

5.3. Suelos truferos

5.3.1. Condiciones geolgicas

Los suelos ms extensamente representados en el rea trufera son los que se desarrollan sobre roca madre caliza, dolomas o margas calizas del Jursico medio y superior (etapa ooltica), Cretcico superior e inferior, Mioceno y Plioceno (Callot, 1999; Reyna, 2000).

Segn Bonet (2006), seran preferibles los terrenos del Secundario-Mesozoico: Trisico, Jursico o Cretcico, con preferencia del Jursico superior, aunque tambin los sustratos aluviales de la poca cuaternaria. Se debe tomar en cuenta que la trufa se desarrolla sobre suelos calcreos de 10-40 cm de profundidad del tipo rendzina, calcosoles y calcisoles.

Por otra parte, las tipologas pedolgicas donde se han encontrado quemados o brl (zona alrededor del rbol productor de trufas en la que no crece vegetacin, por efecto de alelopatas generadas por la micorriza) pertenecen a los rdenes de los Entisoles, Inceptisoles, y de los Mollisoles. Las litologas pertenecen esencialmente a tres grupos principales: margas calcreas, conglomerados y escombros (desprendimientos de roca) calcreos, estratificados diferentemente y ms o menos compactos (Raglione, 1997).

5.3.2. Caractersticas fsicas:

En la gran mayora de las zonas truferas, los horizontes del suelo donde se desarrolla el cuerpo fructfero, suelen ser siempre bien estructurados; dominando los agregados finos y medios de tipo granado y grumoso, pero son bastante frecuentes los de tipo polidrico sub-

angular fino.

Estos ltimos, si estn poco desarrollados, se disgregan fcilmente en

agregados granulados y grumosos o en poliedros muy finos si el grado de estructuracin est an ms expresado. Constantemente, el conjunto de estas configuraciones, le da al suelo una gran friabilidad y gran liviandad, a pesar del elevado contenido de fragmentos rocosos. La estructura de los horizontes siempre se expresa bien, con ndice elevado de estabilidad, y todo el suelo presenta caractersticas de buen drenaje y aireacin; no se encuentran figuras pedolgicas que indiquen saturacin hdrica, ni siquiera temporal (Raglione, 1997).

En general la trufa se desarrolla en suelos de texturas equilibradas, descartndose su presencia en suelos arcillosos por su excesiva compactacin, y en suelos limosos, limoarcillosos o limo-arenosos, por su carcter muy desfavorable a formar terrones duros; y los suelos excesivamente arenosos debido a la incapacidad de retener agua. La estructura debe favorecer la aireacin y facilitar el paso de las races del rbol y al micelio de la trufa, presentndose como el suelo ideal el que posea una estructura granulosa que resulte del equilibrio entre una textura media, materia orgnica y caliza (Sez y De Miguel, 1995).

La textura de los suelos truferos es franca, no adaptndose a texturas arcillosas ni arenosas. Se podran sealar los siguientes valores: 10-40% de arcillas, 10-70% de limos y 10-80% de arenas. Lo ideal es que el suelo tenga un buen drenaje, por eso no son buenos los suelos arcillosos, pero tampoco los muy arenosos porque no retienen el agua. Es importante que sean suelos pedregosos (Etayo y De Miguel, 1998).

Los suelos buenos productores son suelos que drenan, profundos, con subsuelo permeable, pero que a menudo presentan un nivel de acumulacin de carbonato de calcio con una profundidad superior a 50-60 centmetros. Dichos suelos aparecen como muy productivos, mientras que los suelos de substrato calcreo poco profundo son poco productivos. En prospecciones geofsicas, en las que se utiliz tcnicas de resistividad elctrica, se

evidenci que las unidades de suelos productivos de trufas, presentan siempre un subsuelo fracturado. Se constat una fuerte correlacin entre las direcciones de fracturas y los alineamientos de ciertos rboles productores y a menudo los rboles buenos productores se situaban cerca de los ejes de fractura, que constituyen ejes de drenaje preferencial donde penetran las races. Este arraigamiento profundo asegura la alimentacin en agua del rbol durante el verano, perodo en el que se desarrolla la trufa (Callot, 1999).

En general son siempre preferibles los suelos profundos a los delgados, puesto que este parmetro influye enormemente en la capacidad para retener agua y ponerla a disposicin de la vegetacin y en consecuencia de la trufa. En las zonas ms secas y clidas donde existe trufa los suelos suelen ser ms profundos que en aquellas otras en que las precipitaciones son ms abundantes. Por otro lado, la profundidad del suelo determinar en algunos casos la especie simbionte a utilizar (Reyna, 2000).

A pesar de que la presencia de gravas en los suelos truferos suele ser muy variable, oscilando entre el 0,2 y el 90%, la pedregosidad superficial suele ser un elemento muy positivo ya que contribuye a un buen drenaje y aireacin del suelo, captacin de calor en invierno, disminucin de la evaporacin en verano, provisin permanente de carbonato clcico, proteccin contra la compactacin y erosin producida por la lluvia dificultando tambin la predacin de trufas por parte la fauna silvestre (Reyna, 2000).

5.3.3. Caractersticas qumicas

La presencia de carbonato de calcio es un requerimiento indispensable para la presencia de T. melanosporum. Absolutamente todos los autores citan su existencia cuanto menos en la roca madre o en los materiales gruesos del suelo. En consecuencia el pH es uno de los parmetros que se mantiene ms estable en las truferas. En diversos anlisis llevados a cabo en la Comunidad Valenciana (Espaa) la variacin fue muy escasa, no superando el 2% sobre una media de pH 7,88 (Reyna, 2000).

El pH del suelo parece ser un buen indicador del medio en que se desarrolla la trufa, con valores medidos en H2O y KCI nunca inferiores a 7,5 y 7,1 respectivamente. Bajo esos valores pareciera no haber posibilidad de desarrollo de Tuber melanosporum. Otro elemento significativo parece ser el contenido de Mn; se han observado valores sustancialmente ms bajos en los suelos de Tuber melanosporum con respecto a los que caracterizan los suelos de otras trufas (Raglione, 1997; Callot, 1999). Idealmente el pH del suelo debiera ser mayor que 7,5 con un ptimo de 7,9 (Sez y De Miguel, 1995; Reyna, 2000; Hall et al., 2001). Sin embargo, de las ocho plantaciones que actualmente producen trufa, fuera de Europa, siete han sido plantadas sobre suelos cidos, con fuertes enmiendas calcreas para ajustar su pH (Hall et al., 2001).

Los valores adecuados de materia orgnica que debiera poseer un suelo para la produccin de trufas son bastante variables y adems dependen del tipo de suelo. Se recogen de los diversos autores valores que fluctan desde un mximo de 17% y mnimos de 0,5%. Sin embargo, los valores recomendados de materia orgnica varan desde un 1% a un 10% con un ptimo de 4% (Reyna, 2000).

Por otra parte, el desarrollo de la trufa se presenta muy ligado a las condiciones del medio y particularmente a la actividad de la fauna del suelo, indispensable para la aireacin el suelo y el microentorno del ascocarpo. Los suelos con potencialidad trufera fuerte, son siempre suelos bien drenados, con fuerte actividad microfunica y con dbil actividad enzimtica microbiana. En ensayos se han obtenido datos ms precisos con las biomasas microbianas y pruebas de actividad enzimtica. El medio pasa a ser favorable a Tuber melanosporum cuando el nivel de biomasa microbiana es inferior a 1,7% del carbono orgnico total, con actividades enzimticas (actividades FD hidrolasa) inferiores o iguales a 0,2. Estas

caractersticas microbiolgicas muestran que T. melanosporum se desarrolla en suelos con actividad microbiana dbil. El mantenimiento y la gestin de una plantacin deben esforzarse en desarrollar la actividad de la microfauna del suelo que regula principalmente la calidad de la materia orgnica y los equilibrios microbianos (Callot, 1999).

En el caso de los macronutrientes, la inmensa mayora de los suelos posee las cantidades suficientes de stos para hacer viable la plantacin. Por lo tanto, salvo casos excepcionales de grandes desequilibrios, se har necesario el abonado para suplir la deficiencia puntual. Al contrario, un alto nivel de estos elementos podra ser perjudicial para la futura produccin, ya que la planta se apoya en las micorrizas para suplir deficiencias o mejorar su nutricin, entonces el abonado podra inducir un efecto de independencia del rbol respecto de la micorriza (Reyna, 2000).

Diversos anlisis realizados en suelos truferos de la comunidad valenciana otorgan datos de los valores para los diferentes macronutrientes. El nitrgeno vara desde valores de 0,1 a 1 %, con un ptimo de 0,5%; el fsforo oscila entre valores de 6,66 ppm hasta 29,5 ppm, siendo los valores recomendados los que fluctan entre 5 ppm y 150 ppm con un ptimo de 25 ppm. El rango del potasio en los suelos de Valencia se mueve entre los 77 ppm y los 280 ppm con una media de 150,8 ppm y la variacin sobre la media corresponde a un 28,6%. Respecto de la presencia o ausencia de sulfatos, en suelos valencianos se detect una escasa presencia observndose mximos de hasta 169 ppm (Reyna, 2000).

La relacin C/N, que indica el estado de evolucin de la materia orgnica, entrega una indicacin de la actividad biolgica. En general, vara entre 8 y 12 en los suelos truferos (Sourzat, 1994). Sin embargo los niveles extremos absolutos para el mximo y el mnimo son 6,72 y 20 respectivamente, observndose una media en los suelos truferos de la regin de Valencia en Espaa de 7,92 1,98 lo que supone una variacin sobre la media del 25% (Reyna, 2000).

La caliza total en materiales finos de suelos truferos de la Comunidad Valenciana en Espaa, presenta valores entre 0,95% y 34,8% y con una media de 16,8% y un porcentaje de variacin sobre la media del 46,5%. Por su parte la caliza activa arroj valores de entre 0,22% y 6,9%, con media en 3,5% y variacin sobre la media de 46,5% (Reyna, 2000).

Respecto de la conductividad elctrica, no se han establecido aun parmetros que tiendan a sealar un ptimo para el cultivo de la trufa, sino que solamente se hace referencia a lo inadecuado de los suelos con problemas de salinidad. En los anlisis a los suelos truferos de la Comunidad Valenciana (Espaa), se comprueba que la conductividad es siempre baja con un mximo de 189 mhos/cm y media de 166,44 mhos/cm con una variacin sobre la media de solo 5,45%. Desde un punto de vista agronmico se tratara siempre de suelos aptos para cualquier tipo de cultivo y se recomienda el uso de suelos con un mximo de hasta 250 mhos/cm (Reyna, 2000).

Segn Olivier (1997), no se puede definir con precisin un suelo trufero tpico, pero en general, se trata de suelos calcreos, relativamente pobres en materia orgnica, con una buena aireacin, bien drenados, con una buena estructura y de textura media, asociado a un substrato fracturado que evita cualquier tipo de asfixia y permite una fuerte actividad de la micro-fauna y de la micro-flora.

En el Cuadro 6 se presenta un resumen de las principales caractersticas qumicas que debe poseer un suelo para ser apto al cultivo de la trufa.

Cuadro 6. Resumen de las principales caractersticas qumicas de un suelo trufero.Elemento del suelo pH (H2O) Materia orgnica C/N cido fosfrico total K intercambiable Mg intercambiable Ca intercambiable Caliza total Mnimo 7,5 1,5% Aprox. 10 0,1% 0,01% 0,01% 5% 10% 0,3% 0,3% 0,03% Mximo 8,5 8,0%

Fuente: (Etayo y De Miguel, 1998) 5.4. Clima Trufero

La zona trufera natural est enmarcada dentro de la llamada zona templada lluviosa, segn la clasificacin climtica de Keppen, que abarca la pennsula Ibrica, Italia, Francia, Croacia, y Bulgaria. Los climas templado lluviosos presentan una estacin fresca y abundante precipitacin, la estacin fresca no es muy fra, teniendo el mes ms fro una temperatura media entre 18 C a -3 C. Dentro de este grupo de climas se encuentra el clima templado hmedo seco en verano, conocido como clima Mediterrneo, que ocurre entre los 33 y 45 de latitud aproximadamente y sus caractersticas se repiten solo en cinco regiones representativas: costas del mar Mediterrneo, las llanuras del centro sur de California, punta occidental sur de Sudfrica, dos regiones del sudeste de Australia meridional y zona centro de Chile (Rodrguez, 1975).

Segn Reyna (2000), el rgimen de precipitaciones del rea trufera es el tpico mediterrneo con sequa estival y mximo de precipitaciones en otoo, y en buena parte de este territorio se observa un amento de la precipitacin estival, lluvias que coinciden con los fenmenos tormentosos de tipo convectivo que induce la cercana a sistemas montaosos. Factor favorable desde el punto de vista que los buenos aos de produccin de trufa siempre se han asociado a abundantes lluvias de verano que favoreceran el mantenimiento de los primordios. Por otro lado tampoco es buena la sequedad excesiva en invierno (Pacioni, 1987; Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

5.4.1. Temperaturas

En cuanto a la temperatura se sealan varios valores que guardan relacin con el rea geogrfica donde es posible el desarrollo de la trufa (Sez y De Miguel, 1995; Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

En el Cuadro 7 se presentan los rangos de temperatura observados en distintas zonas truferas naturales, valores que sirven de referencia para el establecimiento cultivos artificiales de Trufa.

Cuadro 7. Rangos de temperaturas observados en distintas zonas truferas Temperatura media anual Temperatura mxima del mes ms clido Temperatura media del mes ms clido Temperatura mnima del mes ms fro Temperatura media del mes ms fro Temperatura mxima absoluta Temperatura mnima absoluta Fuente: (Etayo y De Miguel, 1998) 11 14 C 23 32 C < 20 22 C -2 a -6 C > 2 C 35 42 C -9 a -25 C

5.4.2. Precipitaciones

La cantidad de agua requerida para la produccin de trufa en cierto grado depende de la especie hospedera, desde el punto de vista de los requerimientos de esta. En el caso de Quercus robur las precipitaciones deben superar los 600 mm al ao, de los que al menos 200 deben ser en verano y sobre 200 mm al ao para el caso de Q. coccifera, que es la especie hospedera con menores requerimientos hdricos y que adems se desarrolla fcilmente en suelos poco profundos incluso llega a tolerar veranos sin lluvias. Se trata en definitiva de dos especies de ecologa muy diferente con las que la trufa naturalmente forma simbiosis y produce carpforos (Reyna, 2000).

Sin embargo, para obtener una buena produccin, la precipitacin anual debe ser de entre 600 y 900 mm al ao, adems no se debe dejar de lado lo que se mencion anteriormente, que es fundamental un aporte hdrico en la poca de primavera y verano para el desarrollo y mantenimiento de los primordios (Etayo y De Miguel, 1998; Reyna, 2000).

La Figura 14 muestra la distribucin de la precipitacin durante el ao y las temperaturas medias alcanzadas en cada mes, en distintas estaciones meteorolgicas representantes de las zonas de produccin trufera en Espaa.

Fuente: (lvarez, 2004). Figura 14. Grfico ombrotrmico de la zona trufera de Espaa (base estaciones de Valencia, Barcelona, Cuenca, Huesca, Soria, Guadalajara, Teruel, Zaragoza y Castelln, periodo 1971 2000).

Todas las estaciones analizadas muestran la caracterstica comn de concentrar las lluvias en los meses de otoo y primavera destacndose el hecho de presentar precipitaciones todo el ao, registrndose en verano las menores pluviometrias lo que a su vez coincide con las mayores temperaturas.

5.5. Condiciones geogrficas

El rango de altitudes en los que se desarrolla la trufa es bastante amplio, siendo su cota mnima los 100 msnm en Francia e Italia y su mxima cercana a los 1.800 msnm en Granada, Espaa. Y para tener una idea ms exacta, el 90% de las truferas de la zona de

Valencia (Espaa) se encuentran entre los 800 y los 1200 msnm (Reyna, 2000; Bonet, 2006).

En general, en las zonas naturales las truferas tienden a orientarse hacia la mejor iluminacin, o sea, se ubican en laderas de exposicin sur (HN), en la cual aprovechan mejor la luz solar, y en el caso de zonas de menor pluviometria se suelen encontrar tambin en laderas de exposicin contraria (Reyna, 2000; Bonet, 2006).

La orientacin de una plantacin obedecera al mismo principio que la mayora de las plantaciones frutales, el mximo aprovechamiento de la luz solar, que en este caso no solo se enfoca al aprovechamiento de la luz por parte de la planta sino que tambin a la insolacin del suelo, para aumentar la temperatura de ste en invierno, fecha de recoleccin de las trufas, puesto que stas necesitan una cierta temperatura para emitir su aroma caracterstico y as ser encontradas. Es por esto que la orientacin debiera ser norte-sur o con una leve inclinacin norponiente-suroriente para aprovechar al mximo la entrada de luz al huerto y as asegurar una buena cosecha.

6. Cultivo de la trufa

6.1. Produccin de plantas micorrizadas

El cultivo de la trufa implica el desarrollo paralelo de una especie arbrea (tpicamente se utilizan encinas y avellanos) sobre los cuales se desarrolla la micorriza que origina la trufa, que es el producto objetivo de este cultivo dual. En consecuencia, algunos manejos difieren sustancialmente de los utilizados en fruticultura, pudiendo parecer un tanto extraos (Reyna, 2000; Sourzat, 2006).

Uno de los temas centrales respecto de la produccin de plantas es la certificacin de calidad de la planta inoculada, ya que para producirlas en primer lugar se debe tener certeza de la identidad gentica de la trufa a inocular. Luego surgen otras incgnitas a resolver como la adquisicin de las plantas, el mtodo adecuado de inoculacin, la eficiencia del mtodo, los tipos de sustratos, entre otros, que son temas aun en desarrollo a nivel mundial y no existe una norma nica de calidad, menos en Chile. En nuestro pas solamente hay un productor de plantas micorrizadas (Agrobiotruf Ltda.), que se certifican a travs de terceros. En cualquier caso, en la planta debiera ir numerada indicando especie (planta y hongo), fecha de inoculacin, lote, sello de quin controla y nombre del vivero.

6.1.1. Tcnicas de inoculacin

El proceso mas adecuado es el que permita el mayor contacto entre la raz del rbol y el hongo de la trufa. Para evitar cualquier tipo de contaminacin por algn hongo de otro tipo, se debe utilizar un sustrato previamente desinfectado. Las semillas de la especie arbrea, como por ejemplo el encino, se lavan en agua corriente desechando las que flotan y se desinfectan con hipoclorito sdico o dicromato potsico. Luego se estratifican en una cajonera sobre substrato de perlita (mayo/junio), se mantienen en invernadero hasta que alcancen entre 5 y 15 cm y se transplantan a contenedores de entre 650 y 1000 cc, con un substrato que idealmente contenga un 40-60% de suelo franco de origen calizo con al menos un 5% de arena gruesa caliza, un 10% de materia orgnica (ojal no basada en turba), de 10-20% de algn material inerte como perlita o vermiculita. El pH debe ser ajustado entre 7 y 8, ya sea con hidrxido de potasio o carbonato de calcio. Los contenedores deben ser con estras para evitar el espiralamiento de la raz. Para las distintas tcnicas de inoculacin los procedimientos hasta aqu descritos son los mismos. Este proceso completo dura alrededor de un ao hasta obtener una planta terminada (Reyna, 2000; FIA, 2001).

Callot (1999), seala la importancia del tipo de ramificacin que deben generar las races para una adecuada asociacin con la micorriza. La presencia de un sistema radicular superficial es favorable al desarrollo de la micorriza por lo tanto de la trufa, por lo que es importante inducir a la planta a generar un sistema radicular superficial desde el vivero. Para esto, luego de varios ensayos con distintas especies de Quercus, llegaron a la conclusin que lo mejor no es decapitar la raz pivotante ya que la planta pierde energa en tratar de formar una nueva raz pivotante. La solucin sera bloquear sta raz u obstaculizar su crecimiento en profundidad estimulando as el crecimiento axial y radial de las races laterales. Un esquema de dicho ensayo se puede apreciar en la Figura 15.

Fuente: Callot (1999). Figura 15. Morfologa del sistema radicular de encino comn de un ao, germinadas sobre turba, despus de modificaciones efectuadas a la raz pivotante. A: testigo. B: pivote decapitado a 6 cm del cuello cuando tena 10 cm de largo. C: pivote bloqueado a 6 cm del cuello. a) Inmersin de races:

En septiembre-octubre se prepara la solucin esporfera triturando finamente las trufas que deben estar en un estado de sobre madurez (casi podrido). Se tritura en agua con alginato de sodio como aditivo para mejorar su adhesin a la raz; en algunos casos se podra utilizar promotores de la germinacin de las esporas. Al momento del transplante se sumergen las races en la solucin y luego se ponen en el contenedor y se rellena con el sustrato previamente mencionado. Cada cierto tiempo se agita la solucin para evitar la decantacin de las esporas a inocular. Se debe realizar en invernadero con ambiente controlado entre 18 y 25 C. Con este mtodo se necesitan entre 1-3 g de trufa por planta (Reyna, 2000; FIA, 2001).

b) Inyeccin de solucin esporfera:

En esta tcnica las plantas se cultivan directamente en contenedor y se les inyecta o riega la solucin esporfera similar a la anterior pero ms concentrada, requirindose entre 6 y 7 g de trufa por planta por lo que suele ser ms cara. Por otra parte, este mtodo no es ms efectivo que el anterior, sin embargo es muy til para reforzar inoculaciones hechas con el primer procedimiento (Reyna, 2000).

c) Inoculacin en masa:

Aqu la inoculacin se realiza en la propia cajonera de estratificado. Se mantienen ah las plantas unos cuatro a cinco meses antes de ser transplantadas al contenedor. Como punto a favor, esta tcnica es ms econmica ya que se utiliza menos de 1 g por planta. Sin embargo, la micorrizacin suele ser menor en comparacin con el mtodo de inmersin y en el transplante se pierden muchas micorrizas (Reyna, 2000).

d) Inoculacin en seco:

El procedimiento inicial descrito anteriormente es el mismo, la diferencia es que en este mtodo en vez de la solucin esporfera se utilizan trufas previamente deshidratadas. Y se corta en finas lminas de entre 1-2 mm. Se seca en un ambiente seco y ventilado, luego se muele hasta que se haga polvo, y se espolvorea el sistema radical antes de ser transplantada al contenedor. El polvo de trufa puede mezclarse con alguna sustancia inerte, como talco, para conseguir una mejor distribucin (Reyna, 2000).

e) Inoculacin del substrato:

El substrato a utilizar en los contenedores se mezcla ya sea con solucin o polvo esporfero y se procede a rellenar con dicha mezcla en el proceso de transplante o tambin se puede preparar igualmente el sustrato de la cajonera de estratificacin (Reyna, 2000). Este mtodo se puede usar para complementar alguno de los otros pudiendo asegurar una mejor infeccin.

6.1.2. Control del mtodo y proceso de inoculacin

a) Material inoculante:

Los carpforos deben ser lavados y cepillados rigurosamente, uno por uno se debe comprobar su identidad gentica, siendo inmediatamente rechazados aquellos dudosos de ser Tuber melanosporum (Reyna, 2000; FIA, 2001; Fischer y Colinas, 2006). Para comprobar con mayor precisin, se pueden observar las esporas al microscopio, esto es de especial importancia ya que existen especies de trufa como T. indicum y T. hymalayensis muy parecidas morfolgicamente a la trufa negra pero sin valor econmico (SjalonDelmas et al., 2000; FIA, 2001). Por esto conviene que las trufas utilizadas sean de gran tamao para evitar esfuerzos intiles y deben ser recolectadas a partir del 15 de enero (HN) para que la madurez sea adecuada (Reyna, 2000).

b) Substratos de cultivo:

Estos deben ser desinfectados para evitar la presencia de propgulos de otros hongos de micorriza que puedan competir o desplazar a T. melanosporum. Lo ms comn es utilizar el mtodo de esterilizacin con vapor de agua a 120 C durante 3 horas desde que el suelo alcanza los 90 C de temperatura. Otra opcin sera la desinfeccin con Bromuro de metilo (FIA, 2001; Reyna, 2000). Tambin se puede realizar un proceso de pasteurizacin mediante calor solar captado dentro de un invernadero, para ello se extiende el sustrato separado del suelo y se cubre con un film de polietileno transparente. En verano el sustrato

alcanza los 60-70 C lo cual es suficiente para eliminar la mayor parte de los hongos de micorriza (Reyna, 2000).

Luego, para controlar la calidad de la desinfeccin realizada se deja un porcentaje de plantas sin inocular (mnimo 50 y hasta un 0,5% del total de las plantas), comprobndose posteriormente la ausencia de micorrizas. Esta reserva a futuro nos podr indicar en que momento del cultivo comienzan las contaminaciones con otros hongos de micorriza (Reyna, 2000; FIA, 2001).

c) Semillas:

Deben ser lavadas con agua corriente clorada y desinfectadas con hipoclorito sdico o dicromto potsico antes de estratificarlas sobre perlita. Las semillas a utilizar, ya sean importadas o locales deben ser identificadas con sus procedencias de manera de poder ajustarlas a las reas de establecimiento definitivo (Reyna, 2000; FIA, 2001).

d) Mtodo de cultivo:

El cultivo se debe realizar en invernadero, con maya antifidos para disminuir la presencia de esporas. Las plantas se desarrollan en contenedores, levantados del suelo a ms de 20 cm. El suelo se debe cubrir con una lmina de plstico que favorece el aislamiento de las races de las plantas, evitando la entrada de otros hongos desde el suelo (Reyna, 2000; FIA, 2001). En un mejor caso el piso puede ser de cemento y siempre el invernadero debe poseer pediluvio para la desinfeccin de los pies al entrar.

Las condiciones de invernadero sern las adecuadas para el desarrollo normal de plantas y de las micorrizas asociadas a ellas. Durante los primeros meses despus de la germinacin, la temperatura se debe mantener entre los 18 y 25 C para favorecer el desarrollo inicial de

las plntulas. La humedad del sustrato deber ser tal que aun estando hmedo no gotee, buscndose la capacidad de campo (FIA, 2001).

e) Agua de riego:

El agua debe ser de pozo profundo o clorada, en este ltimo caso se debe almacenar en un depsito por al menos 48 horas para que se evapore el cloro. Se debe evitar el uso de agua que circule por canales abiertos. El riego ideal es por microaspersin (Reyna, 2000; FIA, 2001).

f) Contenedores:

Sistemticamente se deben utilizar contenedores nuevos, para evitar contaminaciones por esta va (Reyna, 2000; FIA, 2001). En caso contrario deben ser muy bien desinfectados remojndolos por varios minutos en agua clorada. Los contenedores deben poseer un volumen de al menos 650 cc.

6.1.3. Control de calidad de la planta micorrizada

No existe en Chile o en Espaa (Reyna, 2000), una regulacin en cuanto al proceso de produccin y control de calidad que certifique que las plantas han sido debidamente inoculadas, y por tanto aseguren un porcentaje mnimo de micorrizas en ella. Certificacin que si existe en Francia, que posee dos viveros especializados (Agri-truffe y Viveros Robin) que poseen la licencia INRA, y en Italia que aunque no existe un organismo oficial, una comisin de expertos ha puesto a punto una metodologa de anlisis con bases morfolgicas que establece los parmetros para el control de calidad (Hall, 2001; FIA, 2003; Di Massimo, 2006; Robin, 2006). La certificacin representa un verdadero desafo ya

que el reconocimiento de micorrizas en la planta es muy difcil y adems se hacen indispensables el uso de la lupa binocular y de microscopio, herramientas que aun pudiendo poseerse se hace necesario un conocimiento previo para reconocer la micorriza deseada.

Si bien existen diversas metodologas propuestas para evaluar la calidad de la planta micorrizada (Reyna, 1997; Palazn, 1997 (citado por Reyna, 2000); Fischer y Colinas, 2006) no se ha llegado a acuerdo aun de cual de estas es la ms adecuada, y as poder defenderse comercialmente los viveristas frente a la competencia de otros pases como Francia e Italia que si poseen controles de calidad estandarizados en sus pases (Reyna, 2000). Debido a la dificultad de identificacin de las micorrizas, se facilitan las posibilidades de fraude y, por otra parte, el elevado costo de implantacin de un huerto trufero hace buscar una planta de calidad certificada incurrindose en altsimos costos.

Para que un programa de certificacin o control de calidad fuese posible deberan tenerse en cuanta tres aspectos fundamentales que partiran por controlar el mtodo y proceso de inoculacin, luego un control cualitativo de las micorrizas formadas y por ltimo un control de los niveles de micorrizacin o cantidad de estas que se hallan presentes (Reyna, 2000; Fischer y Colinas, 2006).

Para evitar los fraudes respecto de la autenticidad de las cepas a inocular, y tambin por el creciente problema que es la importacin de trufas chinas y comercializacin de stas como trufa negra, se desarroll un mtodo de identificacin de las distintas especies de trufas a travs de herramientas moleculares, que son capaces de identificar las distintas especies de Tuber ya sea obteniendo ADN de ascocarpos frescos como enlatados y tambin de races micorrizadas. Luego de comparar las secuencias ITS (internal transcribed spaces) de ADN recombinante, de varias especies de Tuber, se disearon primers especficos para T. melanosporum para poder detectarla a travs de PCR, para lo cual se desarroll un protocolo especial para la reaccin PCR que tiene la potencialidad de identificar en un solo paso de PCR la presencia de trufas chinas o de cualquier otra especie fngica. Este

protocolo puede ser usado entonces en el control de calidad en la industria trufera desde la etapa de produccin hasta los productos comerciales finales (Sjalon-Delmas et al., 2000).

6.1.3.1. Control cualitativo

Durante el proceso produccin de plantas de vivero, la planta inoculada con la trufa puede ser infectada por otros hongos micorrizgenos competitivos. Por eso es de vital importancia comprobar la presencia de la micorriza inoculada como de otros hongos oportunistas que puedan interferir en la produccin de micorrizas (FIA, 2001).

El control cualitativo o control de calidad de la planta micorrizada se basa en confirmar la presencia de micorrizas de T. melanosporum. En este nivel no es necesario hacer conteos, tan solo cerciorarse de la presencia de la micorriza. Los primeros reconocimientos se llevan a cabo luego de cuatro a cinco meses de la inoculacin (Reyna, 2000; Fischer y Colinas, 2006). En esta etapa es imprescindible el uso de equipos de microscopia y sistemas de registro de las imgenes obtenidas (FIA, 2001), como tambin el uso de claves taxonmicas de la bibliografa especializada (Zambonelli et al., 1993; Meotto et al., 1995; Sez y De Miguel, 1995; De Miguel y Sez, 1997; Etayo y De Miguel, 1998).

La determinacin cualitativa presenta una fase de observacin global seguida por otra observacin en detalle, que se explican a continuacin comenzando por la toma de muestras.

a) Toma de muestras y preparacin

Se toman cinco o ms muestras de cada especie arbrea, elegidas aleatoriamente. Se extraen muestras de sustrato mas races con un sacabocado diseado especialmente, tomando una muestra cilndrica de 1,4 cm de dimetro y una longitud del ancho del

contenedor en la zona media de ste, lo que supone un volumen muestreado de unos 7 a 10 cc, equivalente a un 2-3% del volumen total del contenedor. La muestra se extrae en sentido horizontal, para ello se saca la planta del envase y se coloca en otro previamente perforado a media altura. Se introduce el sacabocados con una rotacin constante que asegure un corte adecuado de las races, la muestra se introduce en un envase plstico y se pesa en una balanza de precisin. Las muestras se remojan en agua con una mnima cantidad de detergente o con algn surfactante como polisorbato 80 (Tween 80) para desprender el mximo de partculas de tierra, durante 24 horas, luego se enjuagan sobre un tamiz con agua destilada y con gran cuidado de no daar las micorrizas. Se colocan en placa Petri con agua para su observacin en lupa binocular. Si aun quedara tierra adherida, sta se remueve suavemente con un pincel fino, siempre con la delicadeza de no desprender hifas que sern determinantes para la identificacin (FIA, 2001).

b) Observacin global

Las races preparadas como se describe en el punto anterior, se observan con una lupa binocular. Las micorrizas se caracterizan por su forma, (ramificadas, dicotmicas, coraloides, tuberculoides, etc.), disposicin y ramificacin del sistema radical, color de las micorrizas (variable segn especies), y por la presencia de rizomorfos (cordones miceliares) que indican la presencia de micorrizas en dichas races. El color como el aspecto morfolgico de las micorrizas de una determinada especie de hongo pueden variar segn la estacin y el grado de desarrollo, como por ejemplo el cambio de color de caf pardo en primavera a marfil en otoo y a caf oscuro en invierno o las espnulas hifales claras en primavera a oscuras en otoo (FIA, 2001).

c) Observacin en detalle

En esta etapa, se debe utilizar un microscopio ptico y las muestras se preparan colocndolas sobre un portaobjeto. Se les agrega unas gotas de cido lctico y se tapan con el cubreobjetos para proceder a su observacin. Se analizan tres caractersticas fundamentales (FIA, 2001):

Manto fngico: Se consideran principalmente dos tipos principales de manto, el manto plectenquimatoso, con clulas alargadas que parecen hifas y el manto

pseudoparenquimatoso, con clulas no alargadas, de forma poligonal o redondeada, semejando piezas de puzzle (T. melanosporum) (Figura 6).

Hifas salientes del manto fngico: Llamadas espnulas, de las cuales se estudian aspectos tales como: color, grosor, forma de colocacin respecto al manto, forma de los tabiques con presencia de uniones en fbula o hebilla (caracterstica de hongos Basidiomicetes) o ausencia de stas (Ascomicetes) (Figura 5).

Rizomorfos: Se determina la presencia o ausencia de hifas sueltas, parecidas a las del manto, hifas apretadas y finalmente formas y colores.

Todas las caractersticas analizadas deben ser contrastadas con claves morfolgicas para la determinacin de especies que han sido desarrolladas por diversos autores (Zambonelli et al., 1993; Meotto et al., 1995; Sez y De Miguel, 1995; De Miguel y Sez, 1997 y Etayo y De Miguel, 1998). Algunas micorrizas se reconocen con facilid