¿QUE ES LA CITO / METRIA Inmunofenotipificación … · CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones...
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Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo
T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.
www.oncoinmun.co.cl
¿QUE ES LA QUE ES LA CITO / METRIACITO / METRIADE FLUJODE FLUJO??
La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición
simultánea de múltiples características físicas y químicas de
células en suspensión”
0 13 24 71 113223
481 611811 940
10771234
15051861
22722413
27462919
35753518
357636273899
4261
48555034
5384
5818
6243
2901
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
5500
6000
6500
7000
1976
1977
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1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Papers
Datos Tomados de PubMed usando las palabras: “flow Cytometry”
AÑOS
Citometría de Flujo: Publicaciones / año(09/07/2005 : 09:20 hrs)
¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA
CELULA?
1.- Su tamaño.2.- Su granularidad o complejidad
interna.3.- Evaluación de características químicas:
• Fluorocromos
• Anticuerpos conjugados con fluorocromos
FACS: Fluorescence activated cell sorter
¿¿COMO SON DETECTADAS COMO SON DETECTADAS ESTAS CARACTERISTICAS?ESTAS CARACTERISTICAS?
• Usando un sistema óptico-electrónico, se registra como la célula interactúa con un rayo láser.• Se detecta la capacidad de la célula para:
– Desviar la luz incidente (Láser).– Emitir fluorescencia.
•Detección de moléculas específicas (Acs. Conjugados)
Flow Cell
InjectorTip
FluorescenceFluorescencesignalssignals
FocusedFocused laserlaserbeambeam
Sheathfluid
Componentes• Sistema de Fluidos
• Sistema Optico:
• Fuente de luz
• Separación espectral
• Sistema Electrónico:
• Control mecánico, de luz y detectores
• Colección y análisis de pulsos
• Sistema Informático:
• Análisis y presentación de datos
FLUORESCENCIAFLUORESCENCIA
1.- El fluorocromo absorveenergía del láser incidente.
2.- El fluorocromo libera energía absorvida :
– Vibrando y emitiendo color
– emitiendo fotones deuna longitud de onda mayor (Fluorescencia)
O
CCOH
= 488 nmOH
= 530 nm
Fluoresceína
FLUOROCROMOSFLUOROCROMOS FluoresceinFluorescein (FITC)(FITC)
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relativ
e Intens
ity
Wavelength
ProteinProtein
ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
PropidiumPropidium IodideIodide
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relativ
e Intens
ity
DNADNA
Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
ExcitationExcitation EmissonEmisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
PhycoerytherinPhycoerytherin (PE)(PE)
Protein
PMT
PMT
PMT
PMT
DichroicFilters
BandpassFilters
FlowFlow CytometryCytometry OpticsOptics
Laser
1
2
3
4
Flow cell
ANTICUERPOSANTICUERPOSMONOCLONALESMONOCLONALES
•Grandisponibilidadcomercial•Gran variedad de fluorocromos•Preciosaccesibles•Pedidos vía Internet•Gran Calidad
FORMA DE PRESENTACION DE DATOS
• Histograma• Gráfico de Puntos (Dot Plot)• Gráfico de Contorno (Countour Plot)• Gráfico Isométrico (3D)• Gráfico de Densidad (Density Plot)
Citometría de flujo: mediciones
L
M
G
SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN
“GATE”
Density Dot Plot Contour Plot
Color of dots can give indication Identify subpopulationsof frequency of events with proper contour lines
HISTOGRAMA(Un Parámetro)
0
coun
ts
FL1
Autofluorescenciay/o
control isotipo
M1
ESTADISTICA DE CUADRANTES
(Dos Parámetros)
Autofluorescenciay/o
control isotipo
0FL
2FL1
ESTADISTICA DE CUADRANTES
(Dos Parámetros)
-,+
-,- +,-
+,+
0
FL2
FL1
1 2
3 4
PREPARACIONPREPARACIONDE LA MUESTRADE LA MUESTRA
CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJO
OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR
Procedimiento St.:• 100 L de sangre total • 10 L del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT• Añade el lisador• Leer en un citómetro de flujo
CITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOCITOMETRIA DE FLUJOPREPARACION DE LA MUESTRAPREPARACION DE LA MUESTRA
PROCESO DE ANALISIS DE PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRAUNA MUESTRA
• CALIBRACION•ADQUISICION•ANALISIS
CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES
• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología
• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . . . .
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Cuantificación de moléculas• Estudio de HLA-B27• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Función Neutrofílica• Estudio de Citokinas Intracelulares
Cytoplasmic Parameters
Nuclear Parameters
Cell Surface Parameters
Extracellular Parameters
Enzymes
EnzymesEnzymes
Proteins
Proteins
Cell Wall
Secreted Proteins
WhatWhat can be can be analyzedanalyzed byby FlowFlow Cytometry?Cytometry?
Cell Surface Molecules
DNA
INMUNOFENOTIPIFICACIONDE LEUCEMIAS
“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una
proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea
como sangre periférica”
Hematopoiesis
PLURIPOTENTSTEM CELL
COMMITTEDPROGENITOR
CELL
RECOGNIZABLE BONE MARROW
PRECURSOR CELL
MATUREBLOODCELL
myeloblastmonoblast
pronormoblast red cellneutrophilmonocyte
basophil
platelet
CFU-Baso
CFU-Eos
CFU-GM
BFU-E/CFU-E
eosinophil
pre-T
pre-B
myeloidprogenitor
cell
lymphoidprogenitor
cell
lymphoblast
lymphoblast
T-cell
B-cell& plasma cell
MIXEDPROGENITOR
CELL
CFU-Meg megakaryocytepluripotentstem cell
Hematopoiesis
PLURIPOTENTSTEM CELL
COMMITTEDPROGENITOR
CELL
RECOGNIZABLE BONE MARROW
PRECURSOR CELL
MATUREBLOODCELL
myeloblastmonoblast
pronormoblast red cellneutrophilmonocyte
basophil
platelet
CFU-Baso
CFU-Eos
CFU-GM
BFU-E/CFU-E
eosinophil
pre-T
pre-B
myeloidprogenitor
cell
lymphoidprogenitor
cell
lymphoblast
lymphoblast
T-cell
B-cell& plasma cell
MIXEDPROGENITOR
CELL
CFU-Meg megakaryocytepluripotentstem cell
HEMATOPOYESISSTEM CELL
CFU-MLCFU-GEMMCFU-L
LINFOCITO B LINFOCITO TCFU
ERITROIDEMEGACARIOCITO
CFUBASOFILO
CFUEOSINOFILO
CFU-GM
ERITROCITO PLAQUETAS BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO MONOCITO
RETENCION DE ANTIGENOS• Células malignas frecuentemente conservan
antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados
CD19 CD19
CELULAPRE-B NORMAL
CELULALEUCEMICA
Transformación
Maligna
INMUNOFENOTIPIFICACIONDE LEUCEMIAS
• Evaluación de linfocitosis de etiología no determinada.
• Identificar desordenes linfoproliferativos crónicos de células T y B.
• Diferenciar entre leucemia linfoblástica y leucemia mieloide.
• Subtipificar inmunológicamente leucemias agudas.
Aplicaciones :
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
• No establece diagnóstico de Leucemia aguda, pero es fundamental para definir línea celular.
• Útil en monitorizar Leucemias Linfoblástica Aguda (LLA) y Leucemia MielobásticaAguda.
• Subclasificación Inmunológica de LLA e Identificación de fenotipos Mieloides (valor pronóstico).
Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)
INMUNOFENOTIPO DE LEUCEMIAS
• Modalidad Diagnóstica Primaria en sindromes Linfoproliferativos crónicos (Subclasificación clínica y Pronóstico).
• Valor diagnóstico en Gammapatiasmonoclonales (Enf. Residual).
Cytometry (CCC)34:39-42 (1998)
CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg
•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
•LMA :-LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)
• Paciente sexo femenino• 45 años• Sangre periférica• Compromiso general severo• Falla hepática
• Inmunofenotipo normal• Paciente fallece
Características normales
• Paciente sexo masculino• 43 años• Dgto. Leucemia Aguda
Leucemia LinfoblásticaDe Línea B (B-II: Común)
CD10CD19CD34HLA-DR
CD5CD33CD13CD3CD16+56MPOCD14
CD20
Positivo Negativo Positivo Débil
• Paciente sexo femenino• 80 años• Diagnóstico: Proceso
linfoproliferativo crónico
Leucemia Linfoblática de Línea B (B-III - pre B)
CD10CD19CD20CD34CD33HLA-DR
CD5CD13CD3CD16+56MPO
Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 6 años 5 meses• Medula ósea
Leucemia Linfoblástica de tipo B-II (Común), con expresión mieloide aberrante
CD10CD19CD34CD33CD13HLA-DRTdT
CD20CD5CD3CD8CD16+56MPOCD14
Positivo Negativo Positivo Débil • Paciente sexo masculino• 21 años• Sangre periférica
Leucemia Linfoblástica de Línea T (Pre T)
CD5CD4CD8CD2CD7CD3cTdT
CD3CD10CD19CD20CD34CD33CD13CD16+56HLA-DRMPOCD14
Positivo Negativo Positivo Débil• Paciente sexo masculino• 5 años 8 meses• Medula ósea
LeucemiaAgudaLínea T (T-IV madura)
CD10CD5CD2CD3CD7CD8CD4
CD19CD20CD33CD13CD16+56MPOCD34HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil • Paciente sexo femenino• 78 años• Sangre periférica • WBC:169.000.
Sugerente de una Leucemia PromielocíticaHipogranular M3 HLA-DR (-)
CD33CD13CD56MPO
CD10CD19CD20CD5CD3CD34
CD14HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.
CD19CD20kappaHLA-DR
CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda
Positivo Negativo Positivo Débil
• Sexo masculino• 57 años• Sangre periférica• 13 Febrero 2004
Trastorno linfoproliferativo crónico de línea B, con expresión clonal de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa.
Linfoma del Manto
Leucemizadoetapa IV-B
• Mismo paciente• 59 años• Sangre periférica• 08 de junio 2005
Dgto. y TTO
CD19CD20kappaHLA-DR
CD10CD3CD4CD7CD16+56CD34TdTCD13CD33CD14MPOlambda
Positivo Negativo Positivo Débil
sugerentes de una leucemia mieloide aguda HLA-DR negativo, con expresión de CD7. ¿Promielociítica hipogranular?.
CD33CD34CD7
CD10CD19CD20CD4CD3CD14TdTHLA-DRMPO
CD56CD13
Positivo Negativo Positivo Débil
• Sexo masculino• 30 años• Abril 2005:
Adenopatía cervical sugerente de Linfoma No Hodkin Difuso Mixto.
• 07 de julio 2005• Medula ósea
SSC Bajo
Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)
• Sexo femenino• 42 años• Julio 2001• Medula ósea
37 % células
CD19CD20kappa
lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
Linfoma de células linfociticas pequeñas de bajo grado de malignidad (línea B con expresión clonal de cadenas livianas del tipo kappa)
CD19CD20kappa
lambdaCD10CD3CD4CD7CD33CD34CD13CD14HLA-DR
Positivo Negativo Positivo Débil
• Misma paciente• 44 años• Octubre 2002• Medula ósea
9.6 % células
• Misma paciente• 45 años• Agosto 2003• Medula ósea
Medula ósea normal
• Misma paciente• 46 años• Abril 2004• Medula ósea
Medula ósea normal
• Citometría de flujo:
• Principios básicos.
• Instrumentación y fluorocromos.
• Presentación de datos.
• Inmunofenotipificación de leucemias y linfomas:
• Utilidad y clasificación.
• Inmunofenotipo normal.
• Casos clínicos reales.
Tópicos Revisados
Inmunofenotipificación Celular:Leucemias y Linfomas por Citometría de Flujo
T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.
www.oncoinmun.co.cl