QUE PARA OBTENER EL PRESENTA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE

BIOTECNOLOGÍA

" PIGMENTOS FÚNGICOS EN EL CONTROL DE

HONGOS POSTCOSECHA Y BACTERIAS DE

INTERÉS CLÍNICO”

ESTANCIA DE TITULACIÓN

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:

"INGENIERO EN BIOTECNOLOGIA”

PRESENTA:

AGUILAR POMPA CARLOS ARTURO

DIRECTOR

DR. RAMÓN VILLANUEVA ARCE

MEXICO D. F. 2010

ii

A mi madre por que me dio la visión y fortalezas necesarias cada día,

Mi familia y mis amigos, que con su amor, apoyo y sabia guía, me han enseñado que la perseverancia,

la valentía, el no mirar atrás y el esfuerzo son baluartes de una vida en vía a la excelencia.

iii

AGRADECIMIENTOS

El autor manifiesta su gratitud a:

Dr. Ramón Villanueva Arce por su enseñanza y la oportunidad de formar el habito

investigativo.

Dr. Yolanda Gómez, por su ayuda, colaboración, enseñanza y discusiones.

Los estudiantes, profesores y auxiliares de los laboratorios de Alimentos y Farmacología.

Mis padres por su confianza y sabios consejos.

A todos aquellos que me acompañaron en esta carrera y me comunicaron sus conocimientos y

enseñanzas, su apoyo ha sido clave a lo largo de esta etapa de mi vida.

iv

CONTENIDO

Página

LISTA DE CUADROS

LISTA DE FIGURAS

RESUMEN 1

I. INTRODUCCIÓN 2

REVISIÓN DE LITERATURA 2

1.1 Los microorganismos como fuentes de metabolitos de interés

1.2 Los hongos como agentes productores de pigmentos

1.3 Metabolitos fúngicos en el control de hongos fitopatógenos

2

5

7

II. JUSTIFICACIÓN 14

III. OBJETIVOS 14

IV. MATERIALES Y MÉTODOS 15

4.1 Zonas de muestreo

4.2 Aislamiento y purificación de hongos

4.3 Identificación de hongos productores de pigmentos

4.4 Caracterización cultural del hongo y producción de colorante

4.5 Extracción, purificación e identificación del colorante

15

15

16

17

18

4.6 Pruebas de control contra hongos fitopatógenos 21

4.7 Pruebas de control contra bacterias de interés clínico 22

V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 23

VI. CONCLUSIONES 47

ANEXO 48

LITERATURA CITADA 50

v

LISTA DE CUADROS

Página

1 Características morfológicas del hongo productor de pigmento bajo el efecto de la Temperatura, pH y medio de cultivo.

27

2 Efecto de la Temperatura, pH y medio de cultivo en el crecimiento fúngico, y

producción de biomasa en medio solido y líquido. 34

3 Comparación de medias del efecto de la temperatura, pH y medio de cultivo

en el Crecimiento, Biomasa Medio Solido y Medio Liquido. 35

4 Factores de retención del pigmento y los colores estándar después de una

cromatografía en capa fina. 36

5 Medidas del Halo de inhibición de un extracto fúngico en dos

especies bacterianas. 43

vi

LISTA DE FIGURAS Página 1 Estructura de la gliotoxina producida por Trichoderma viride. 8 2 (A) Glisoprenina C, la más activa de las 4 glisopreninas de C. rosea, (B)

Neobulgarona D, (C) Scytalol D. 9

3 Colonia de Fusarium graminearum en PDA (a, b) y EMA (c, d) de 10 días de edad.

21

4 Producción de pigmento en micelio de Fusarium graminearum, cultivado en EMA, 10 días de edad.

22

5 Características de Fusarium graminearum a 20°C, 28°C y 32, a los diez días de incubación,desarrollado en tres medios de cultivo solido (PDA, EMA, Czapeck) y tres pH (4,6,8).

23

6 Efecto de la temperatura ambiente en el diámetro de la colonia a 3 pH (4, 6,8) en 3 medios de cultivo (PDA, EMA, Czapeck) durante 10 días de incubación.

24

7 Efecto de la temperatura de 28°C en el diámetro de crecimiento de la colonia en distintos pH (4, 6,8) en 3 medios de cultivo (PDA, EMA, Czapeck)

26

8 Peso Seco del hongo productor de pigmento en medios sólidos en distintos pH (4, 6,8) en 3 medios de cultivo (PDA, EMA, Czapeck), a temperatura ambiente y 28°C. Valores obtenidos a los 15 días de incubación.

30

9 Peso Seco del hongo en medio liquido en distintos pH (4, 6,8) en 3 medios de cultivo (PDC, EMC, Caldo Czapeck), a temperatura ambiente, 28°C y 32°C.

31

10 Características de Fusarium graminearum a 20°C, 28°C y 32, a los diez días de incubación, desarrollado en tres medios de cultivo liquido (PDC, EMC, Czapeck) y tres pH (4,6,8)

32

11 Cromatografía en capa fina del pigmento extraído contra estándares de colores químicos. 1-Safranina, 2-Rojo de metilo, 3-Rojo Neutro, 4-Fuchsina Básica, 5- Naranja de Xileno. Metanol- Hexano (8:2).

36

vii

12 Valores máximos de absorbancia del barrido espectrofotométrico (200 – 600 nm) de los siete extractos obtenidos de la cromatografía de columna.

38

13 Pruebas in vitro del pigmento extraído contra dos especies fitopatógenas. 1- Colletotrichum acutatum, 2- Colletotrichum fragarie.

40

14 Pruebas in vitro del pigmento extraído contra Salmonella typhi. N: Extracto diluido, E: Extracto esterilizado, A: Solvente (Etanol).

42

15 Pruebas in vitro del pigmento extraído contra Staphylococcus aureus. Extracto diluido, E: Extracto esterilizado, A: Solvente (Etanol).

42

1

RESUMEN

Los metabolitos fúngicos tienen un gran auge de interés hoy en día sobre la industria

biotecnológica, farmacéutica y la industria de los alimentos, su maquinaria enzimática,

composición genética y fisiológica diversa los convierte en potenciales herramientas para el

biocontrol de enfermedades en postcosecha y la generación de nuevas tecnologías. Se

realizaron muestreos y colectas de material vegetal, con síntomas de ataque por hongos en

los estados de Guerrero, México, Michoacán y Morelos. Se caracterizaron y purificaron los

hongos presentes, se aislaron de manera individual las esporas germinadas y se sembraron

en cajas con PDA e incubaron a 25 ± 2°C durante 5 días. Las esporas purificadas se

conservaron en glicerol al 20% a -80°C. Se identifico la especie por medio de guías

taxonómicas e identificación a nivel molecular. Se realizó un diseño completamente al azar

en arreglo factorial 33 (temperatura: Ambiente, 28°C y 32°C; pH: 4, 6 y 8; Medio de cultivo:

PDA, EMA y Czapeck), para identificar las mejores condiciones de crecimiento y producción

de pigmento. Se realizó la extracción del pigmento. Se realizaron pruebas de cromatografía

en capa fina y en columna silica –gel para caracterización química del pigmento. Se

realizaron pruebas de control biologico con el extracto obtenido contra hongos

fitopatógenos (Colletotrichum fragarie, C. gloeosporoides) y bacterias de interés clínico

(Bacillus subtillis, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, y Candida albicans). El hongo que

presentó una potencial producción de un pigmento de color fue identificado a nivel

molecular como Giberella zaes (Fusarium graminearum).Las mejores condiciones de

producción de color fueron en EMA a pH de 4 a 8 a temperatura ambiente. La mayor

producción de biomasa fue en PDA y EMA a pH 6 a 28°C. El pigmento extraído presento

similitud con colores químicos rojos a una absorbancia de 360 nm. Las pruebas in vitro fueron

negativas contra las especies fitopatógenas de Colletotrichum spp., al menos a la

concentración y dosis utilizadas. Por otra parte se observó inhibición en el crecimiento en las

pruebas realizadas contra S. tiphy y S. aureus, esto debido a las compuestos policetidos

(Naftoquinonas) presentes en el pigmento. El pigmento extraído del hongo F. graminearum

2

presentó inhibición en el crecimiento contra dos bacterias de interés clínico debido a la

presencia de micotoxinas del grupo de las naftoquinonas.

PIGMENTOS FÚNGICOS EN EL CONTROL DE HONGOS POSTCOSECHA Y BACTERIAS DE INTERÉS

CLÍNICO

I. INTRODUCCIÓN

1.1. Los microorganismos como fuente de metabolitos de interés

Los microorganismos son una gran fuente de recursos biotecnológicos porque tanto

bacterias como hongos poseen, una maquinaria enzimática, composición genética y

fisiológica diversa, haciéndolos atractivos para la investigación mediante programas de

búsqueda y exploración. Procesos que han permitido descubrir un amplio número de

especies, distribuidas en la mayoría de ecosistemas terrestres acuáticos, así como una

potencial cantidad de compuestos microbianos.

En la década de 1990 se estimó que existían al menos 1,5 millones de hongos en nuestro

planeta, donde apenas el 10% de la microbiota estaba descrita (Hawksworth et al, 1987).

Según datos de Selitrennikoff (2001), el número se incrementó a 250 000 especies

identificadas, un 25% de la población, lo que significa que aún quedan 75% de nuevos

géneros y biotipos por caracterizar; reflejando la diversidad de este grupo de organismos

asombrosos y extremadamente versátiles. Además del incremento en su número, se

presume que con cada nueva especie se pueden encontrar nuevos productos naturales y

biomoléculas asociadas (Strobel y Daisy, 2003), de las cuales también es necesaria su

identificación.

3

Demain (1999) reportó que existían 100 000 productos naturales, alrededor del 50%

corresponde a los producidos por microorganismos. De este porcentaje, existen 12 000

antibióticos conocidos y en donde el 22% pertenece a los derivados de los hongos

filamentosos, lo que significa aproximadamente 2 640 sustancias con propiedades

antimicrobianas. El 78% restante, se divide entre los producidos por bacterias filamentosas

(66%) y no filamentosas (12%), confirmando al grupo de los actinomycetes, especialmente al

género Streptomyces, como la principal fuente de antibióticos a nivel mundial (Strobel y

Daisy, 2003). El número de antibióticos derivados de fuentes fúngicas, pertenece a los más

de 3 000 metabolitos producidos por esta microbiota, con diferencias tanto en sus

estructuras químicas y moleculares, como las funciones que realizan, las cuales no siempre

son conocidas (Calvo et al., 2002).

Como se mencionó anteriormente, muchos de los metabolitos descritos se derivan de

bacterias y hongos filamentosos que son habitantes comúnes del suelo (Fravel, 1988).

Encontrándose una marcada influencia del ecosistema, de donde se aísla el microorganismo,

sobre la tasa de producción de sustancias fúngicas, porque en su micro hábitat, el

microorganismo desarrolla interacciones benéficas o negativas (Atlas y Bartha, 2002) que

posiblemente pueden resultar en un efecto inductor o supresor de la producción de

sustancias antibióticas (Fravel, 1988). Investigaciones basadas en el supuesto que los hongos

nunca viven solos, y por tanto se ven influenciados por las relaciones con otros organismos,

demuestran que existe una mutua inducción entre ellos para la producción de metabolitos

secundarios, especialmente entre hongos que presentan el mismo hábitat, porque cepas de

Penicillium sp. inducen la producción de strobilurina en Oudemansiella mucida, que a su vez

incrementa la síntesis de crisogina en P. notatum, en comparación a la inoculación de la

misma cepa en un medio de cultivo diseñado para su fermentación. Evidenciándose una

diferencia de rendimiento para aquellas cepas que se cultivan en medios de producción

frente a las mismas pero en condiciones naturales.

4

Este fenómeno también se ha observado para algunos basidiomycetos, que produjeron

compuestos bioactivos, cuando se cultivaron en medios enriquecidos, bajo condiciones de

laboratorio, pero donde el porcentaje de cepas productoras (50%) no fue comparable a los

obtenidos al propiciar el crecimiento en el sustrato natural (12 de 17 cepas, 70%), debido a

que también se producen antibióticos para suprimir el crecimiento de hongos que compiten

por sustrato o espacio (IBWF, 2005). Este tipo de diferencias observadas al cultivar un

microorganismo a escala de laboratorio frente a las condiciones nativas, comprueba la

influencia de los factores abióticos y bióticos en la gran biodiversidad microbiana, que se ha

desarrollado como respuesta a las características que le proporciona el medio ambiente,

conllevando a la expresión y desarrollo de un sinnúmero de estrategias para poder conservar

su hábitat y nicho, dentro de un determinado ecosistema (Atlas y Bartha, 2002; Fravel, 1988;

IBWF, 2005). Motivo por el cual se observan microorganismos (bacterias y hongos) que

pueden vivir en condiciones adversas o extremas, bien sea de temperatura (-12°C a >110°C),

radiación (ionizante, UV, luz visible), presión (atmosférica, hidrostática, osmótica), salinidad,

actividad de agua (0,60-1,00), pH (0, ácidos y 13, básicos) y potencial redox, entre otros (Atlas

y Bartha, 2002).

Todas estas características, revelan el potencial biotecnológico de la microbiota en general,

porque todos los factores moleculares, enzimáticos, metabólicos y estructurales, que le

confieren resistencia y que suceden en respuesta al escenario, son deseables para su

aprovechamiento en diversos procesos de interés industrial y económico, por la producción

de pigmentos, enzimas, polímeros, lípidos, ácidos, sales y demás derivados del reservorio

metabólico y bioquímico de los microorganismos.

1.2 . Los hongos como agentes productores de pigmentos

5

Los pigmentos son sustancias químicas que imparten color a otros materiales por el efecto

óptico de la refracción de la luz del sol. Igualmente, puede ser definido como una sustancia

en polvo que cuando se mezcla con un líquido vehículo imparte color a una superficie (Wani

et al., 2004). Debido a estas características, son muy importantes para diversas industrias,

como la alimentaria (aditivos, intensificadores de color), farmacéutica (coloración de

vehículos, cosméticos), textil (coloración de prendas), etc.

Desde hace mucho tiempo se ha investigado la producción de pigmentos de origen natural,

asilando, caracterizando y purificando muchos compuestos de este tipo

(Durán, et al., 2002); los cuales se han obtenido a partir de plantas y microorganismos,

principalmente. Sin embargo, los procesos biotecnológicos parecen ser una mejor alternativa

para la obtención de estos compuestos. El empleo de microorganismos, especialmente los

hongos filamentosos, ha traído consigo la generación de nuevas tecnologías, y nuevos

pigmentos; así mismo, la obtención de estos productos, puede reemplazar en gran parte el

uso de colorantes químicos ó sintéticos.

Los hongos han sido estudiados por su actividad metabólica, en la generación de una

cantidad de metabolitos, tanto primarios como secundarios (pigmentos), además de su

capacidad de producción extracelular, facilitar procesos fermentativos y por los altos

rendimientos obtenidos (Carvalho et al., 2003). Los hongos pertenecientes al género

Monascus han sido estudiados por muchos años y diversos autores, refieren a éstos como un

potencial productor de pigmentos naturales (Blanc et al., 1994) los cuales se han utilizado

como ingredientes alimenticios desde hace muchos años, produciéndose en granos de arroz

(Ahmed et al., 2001). Algunas especies de Monascus producen pigmentos hidrosolubles y

que difunden por todo el medio de cultivo con tonalidades rojas a amarillas; los cuales son

aplicados a la industria de los alimentos como ingredientes (Blanc et al., 2001). Monascus no

es el único microorganismo que puede producir pigmentos, otros microorganismos como los

pertenecientes al género Paecilomyces también producen pigmentos en tonalidades rojas,

6

amarillas y violetas; en cantidades de hasta 4.73 gL-1 (Cho et al., 2002). Los hongos

pertenecientes a los géneros Aspergillus y Penicillium, también han sido estudiados, como

potenciales productores de pigmentos naturales (Engstrom et al., 1982; Larsen y Breinholt,

1999; Suhr et al., 2002).

De igual manera se han logrado identificar una gran diversidad de organismos como posibles

agentes productores de colorantes a los cuales se les atribuye bioactividad y diversas

aplicaciones en la industria alimenticia y farmacéutica. En el caso de las levaduras, producen

en su gran mayoría -caroteno. La distribución de los carotenoides en hongos es amplia y se

consideran las siguientes generalidades: no todos los organismos sintetizan carotenoides; los

hongos que producen principalmente carotenoides son los Phycomycetes. Se ha comprobado

que hay colorantes en algas y también se han encontrado en hongos de diversos géneros

(García et al., 2002).

Se ha reportado el uso de microorganismos, tales como bacterias, levaduras y actinomicetos,

en la producción de pigmentos; como ha sido el caso de Phaffia rhodozyma (Fontana et al.,

1996; Lim et al., 2002). Esta levadura se ha utilizado para la producción de un pigmento rojo

con mucho uso en la industria de los alimentos, la astaxantina, con nombre comercial

“AstaXin” (Igene Biotechnology Inc., Columbia, Maryland); astaxanthin (Mera

Pharmaceuticals Inc. )(Wani et al., 2004). Existen diferentes métodos de obtención de

pigmentos metabólicos; es importante mencionar esto, ya que por medio de la obtención de

colorantes naturales pueden sustituirse en la industria alimenticia y farmacéutica a los

productos químicos utilizados actualmente; lo que minimizaría los costos y por tanto

produciría más ganancias

Otros microorganismos han sido modificados genéticamente para poder producir pigmentos,

tal es el caso de Escherichia coli, trasformada para la síntesis de carotenoides (Yokohama et

al., 1998). Los microorganismos endémicos de las regiones semidesérticas del Norte de

México, no han sido estudiados en detalle, algunos de ellos presentan mucho potencial

7

industrial (debido al metabolismo muy eficiente que presentan como resultado de las

condiciones extremas en las que se llegan a desarrollar).

Por otra parte, también se pueden identificar pigmentos con potencial uso como,

saborizantes y aromatizantes, pero es necesario identificar el grupo funcional del compuesto

o metabolito de interés, ya sea primario ó secundario. Los grupos funcionales de importancia

son: alcoholes y esteres que producen alcoholes; lactonas que aportan principalmente

aromas de durazno, coco, nuez y miel; los compuestos bencénicos son capaces de degradar

lignina además de producir compuestos aromáticos; por ultimo los terpenos son productores

de ciertos aceites esenciales (García et al., 2002).

1.3 . Metabolitos fúngicos en el control de hongos fitopatógenos

Se define como control biológico a "la utilización de organismos vivos, o de sus productos,

para evitar o reducir las pérdidas o daños causados por los organismos nocivos". Desde este

punto de vista se incluyen en este concepto no solo los organismos fitopatógenos y

patógenos sino también parásitos, depredadores e insectos, ácaros, malezas así como

feromonas, hormonas y técnicas de manipulación genética y desarrollo de métodos de

control biológico como son los biofungicidas, micoherbicidas, miconematocidas, etc., ya que

estos métodos pueden reemplazar el uso de fungicidas químicos tóxicos y propiciar un

equilibrio en el agro-ecosistema así como generar cosechas más sanas para el consumo. La

utilización de cepas biológicas con características biocidas en el control de enfermedades de

plantas producidas por hongos es una de las nuevas alternativas y más prometedoras en

contraste con el empleo de fungicidas químicos.

El desarrollo y aplicación de agentes de control biológico adquiere una importancia relevante

como una alternativa en el desarrollo de una agricultura sustentable que preserve los

recursos naturales y el medio ambiente para las futuras generaciones. La aplicación

controlada en agroecosistemas de organismos vivos o sus metabolitos para el control de

8

plagas y enfermedades, implica el mejoramiento de los cultivos, al proteger las plantas del

deterioro producido por agentes fitopatógenos (Gómez et al., 2002).

Los mecanismos por los cuales los hongos pueden desplazar agentes fitopatógenos es

principalmente de tres tipos: competencia directa por espacio y nutrientes, producción de

metabolitos con efecto antibiótico y parasitismo directo sobre el hongo fitopatógeno

(micoparasitismo). Para poder utilizar hongos fitopatógenos como medios de control

biológico deben producirse cantidades masivas del hongo, el cual debe mantener su

capacidad infectiva por un período de tiempo considerable. Los hongos se han reproducido

para su uso como agentes biológicos de plagas desde hace 100 años, para lo cual se ha

utilizado diferentes métodos de reproducción. Entre ellos, el uso de sustratos como arroz,

trigo y medios líquidos mediante técnicas más sofisticadas (Vélez et al., 1997).

La explotación de los hongos para el control de plagas implica una amplia investigación y en

donde se involucran disciplinas como la patología, ecología, genética, fisiología, producción

masiva, formulación y estrategias de aplicación (Butt et al., 2001). Por esta razón una de las

rutas más eficientes es la búsqueda de sistemas de control preventivos, curativos,

erradicantes es por medio de microorganismos antagonistas de agentes infecciosos y

metabólitos de los mismos.

El desarrollo alcanzado en las técnicas de aislamiento e identificación de metabolitos y

compuestos de origen natural (vegetal o fúngico), permiten su potencial aplicación en la

industria alimentaria con la producción de aromas, colorantes y sabores; además de la

biotecnológica y farmacéutica, lo cual hacen que el área de productos naturales sea de

mayor crecimiento.

Muchos de los metabolitos fúngicos utilizados como agentes de biocontrol de

microorganismos fitopatógenos, presentan diferentes modos de acción específicos o no

específicos, y comprenden tanto agentes líticos, enzimas, compuestos volátiles y otras

sustancias tóxicas, siendo considerados como mecanismos de antibiosis (Fravel, 1988). A

continuación, se enumeran algunos de los metabolitos fúngicos utilizados en fitoprotección,

9

que han sido agrupados dentro de estos fenómenos de antagonismo como antibióticos,

sustancias volátiles y enzimas.

Antibióticos: Desde los años 50´s, existen varios reportes que mencionan la producción de

metabolitos fúngicos para el control de ciertas enfermedades ocasionadas por fitopatògenos

(Fravel, 1988). Como la gliotoxina (Figura 1) producida por Trichoderma viride (G. virens),

para el control de Pythium, patógeno que induce volcamiento en plantas (Fravel, 1988). En

1962 Barnett et al., referido por Fravel, 1988; citan la producción in vitro de un antibiótico

que explica el antagonismo de G. roseum, frente a varios hongos, relacionándolo como uno

de los posibles mecanismos responsables, además del hiperparasitimo. Otra correlación,

pero entre la actividad in vitro y en invernadero, fue realizada para la quetomina producida

por Chaetomium globosum, viéndose una inhibición del patógeno Venturia inequalis, en

ambos modelos de estudio (Cullen y Andrews, 1984; citado por Fravel, 1988).

Figura 1. Estructura de la Gliotoxina

Fravel (1988), consideró algunas investigaciones realizadas durante la década de los 80´s,

donde mencionan varios estudios que relacionan el empleo de diferentes extractos de

fermentación fúngica con la inhibición de algunos fitopatógenos. En 1982 Papavizas et al.,

reportaron que el extracto del medio de cultivo de Trichoderma harzianum inhibe la

pudrición blanca ocasionada por S. cepivorum. En 1986, Ricard y Bollen, encontraron una

sustancia producida por Scytalidium sp. que inhibía a Poria carbonica. El año siguiente,

Fravel et al., aislaron un metabolito del medio de cultivo de Talaromyces flavus, que

destruía los esclerocios de Verticillium dahliae.

10

Wilson y Wisniewski (1994), también exponen una revisión de diversas investigaciones, de

donde se aislaron algunos metabolitos bioactivos de cultivos líquidos, principalmente de

especies de Trichoderma sp., varios compuestos de estructura 6-pentil-α-pirona, siendo de

este grupo, el 6-amil- α-pirona el más común y potente in vitro e in vivo. Otras especies

como T. lignorum y T. viride producen trichodermina, que inhibe no solo a hongos

filamentosos sino también a Candida albicans. Otros metabolitos fúngicos derivados de este

género, son las koninginas, aisladas de T. koningi que produce Koningina A, y de T.

harizianum que sintetiza tanto la Koninginas A y B, así como dos nuevas estructuras

butenolidas, estas últimas con actividad frente a Gaeumannomyces graminis, un patógeno de

cereales (Wilson y Wisniewski, 1994).

Para favorecer el ingreso a la planta, después de la germinación del conidio, muchos

fitopatógenos desarrollan una estructura conocida como apresorio, la cual se ha visto que es

afectada por numerosos metabolitos orgánicos, con diferentes estructuras químicas y modos

de acción, dentro de las que se cuentan 4 glisopreninas de carácter lipofílico (Figura 2A) de

Clonostachys rosea, 6 dímeros derivados de la antraquinona, las Neobulgaronas A-F, con

mayor actividad de la Neobulgarona D (Figura 2B), purificadas del micelio de Neobulgaria

pura (asomycete) (Eilbert et al., 2000). Así como, varios ácidos grasos de longitud de cadena

de 16,18 ó 20 átomos de C, hallados en extractos de micelio de hongos (Thines et al., 2004)

una mejor actividad inhibitoria frente a M. grisea, para aquellos que presentaban

configuración –cis en su instauración, como el ácido palmitoléico, el octadecenico y el

petroselínico (C18, cis-6) principalmente.

Otros compuestos con la misma afinidad por el sitio de acción son Scytalol D (Figura 2C),

producido por el hongo anamórfico Scytalidium sp. (Thines et al., 1998) y una cerulenina

obtenida de un aislamiento originalmente llamado Cephalosporium caerulens (Matsumae et

al., 1963 y Sano et al., 1967 en Thines et al., 2004).

11

Figura 2. (A) Glisoprenina C, la más activa de las 4 glisopreninas de C. rosea,

(B) Neobulgarona D, (C) Scytalol D (Thines et al., 2004).

Algunos metabolitos también han sido aislados de hongos basidiomycetos, puesto que según

el IBWF (2005) la mitad de ellos producen antibióticos, como los encontrados en el extracto

de Resupinatos leightonii, dos sesquiterpenos, el 4-germacradieno-2,6,12-triol y 1,6-

farnesadieno-3,10,11-triol, asimismo inhibidores de M. grisea (Eilbert et al., 2000; Thines et

al., 2004).

Strobilurina A, ha sido un ejemplo destacado de metabolitos empleados como moléculas

modelo para el desarrollo de nuevos productos originalmente aislados de fuentes fúngicas,

en este caso de basidiomycetes. Según la Universidad de Kaiserslautern de Alemania, ésta es

la clase más importante de fungicidas utilizados en agricultura (Anke et al., 1977) de cultivos

líquidos de Strobilurus tenacellus un basidiomycete que crece en los conos de los pinos.

En 1986 se produjeron los primeros derivados sintéticos que tenían estabilidad frente a la

radiación UV, porque aplicaciones del compuesto natural en campo demostraron una

relativa volatilidad e inestabilidad fotoquímica (Gullino et al., 2000), además que existían

dificultades para producir el compuesto a gran escala. De la optimización química han

12

resultado varios análogos, especialmente kresoxin-metil, desarrollada por BASF y

comercializada como Stroby®, Brio®, Discus® y Juwel®.

Las strobilurinas en el presente, están dentro de los fungicidas más vendidos alrededor del

mundo, siendo usados como protectantes de plantas frente a los más importantes hongos

fitopatógenos. Porque análogos químicos como kresoxin-metil, azoxystrobina,

metominostrobina y trifloxystrobina, tienen un amplio espectro de actividad ya que, son

inhibidores de la respiración fúngica controlando ascomycetes y basidiomycetes, mildeos

(polvoso y velloso) y royas (Gullino et al., 2000), presentes en hojas, tallos, frutos y espigas

principalmente de cebada, trigo, arroz. Además de su uso para cultivos de cereales, estos

fungicidas se emplean para en otros cultivos para el control de Alternaria, Rhizoctonia solani,

Pythium spp., Venturia, Botrytis cinerea y Sclerotinia, entre otras enfermedades (Gullino et

al., 2000).

Estos fungicidas del tipo strobilurina son un ejemplo del éxito en la aplicación comercial de

un producto a base de hongos ó de sus metabolitos, evidenciando que las sustancias

naturales pueden ser una importante fuente de agentes antifúngos, que luego pueden ser

desarrollados como productos o bien como moléculas modelo para la síntesis de nuevos

fungicidas selectivos (Gullino et al., 2000; Thines et al., 2004). Este último autor, además

menciona su importancia para el ambiente, porque se asume que los compuestos naturales,

siendo parte del ecosistema, pueden ser biodegradables, compatibles y menos tóxicos.

Enzimas: Las enzimas son otro tipo de metabolitos fúngicos que median el antagonismo

ejercido por agentes de biocontrol, lo que significa su uso potencial sobre poblaciones de

fitopatógenos y de insectos plaga. Debido a que, las enzimas pueden degradar las paredes

celulares y otros compuestos estructurales, o bien actuar frente a algunos eventos

relacionados con la patogénesis de organismo.

13

Fravel (1988) menciona dos investigaciones realizadas en 1982 y 1987, por Marois y

colaboradores y Lewis y Papavizas respectivamente, donde encontraron compuestos que

tenían una acción enzimática en hongos fitopatógenos como Sclerotinia y R. solani, derivados

de Talaromyces flavus, Gliocladium virens y especies de Trichoderma sp. Cabe resaltar, que

la mayoría de enzimas de importancia agroecológica, son las que producen varias especies de

este género, como las chitinasas y B-1,3-glucanasas reportadas por Elad y Kapat (1999) para

Trichoderma harzianum cepa T39.

Además de estas enzimas, De la Cruz y Llobell (1999) y Ait-Lahsen et al., (2001), indican la

producción de B-1,6-glucanasas y proteasas corroborando la producción de una gran

variedad de estos metabolitos que lisan la pared celular, de micelios y conidios en hongos

fitopatógenos, por diferentes aislamientos de Trichoderma.

Volátiles: Como se mencionó anteriormente, T. harzianum es una fuente de antifúngicos con

diferentes modos de acción, como los metabolitos volátiles reportados por Claydon et al.

(1987), citado por Fravel (1988) identificados como alquilpironas con acción fungicida y

mayoritariamente fungistática sobre patógenos como R. solani.

Otro microorganismo que produce sustancias volátiles protectoras, es Boletus varigatus

(Krupa y Nyland; 1972; citado por Fravel, 1988) dentro de las que se incluyen alcoholes como

etanol e isobutanol y ácido isobutírico.

Por lo general los principales compuestos volátiles, pertenecen al grupo de los alcoholes y de

los ácidos, como los compuestos reportados para el hongo endofítico Muscodor albus,

denominado “biofumigante” según Mercier y Jiménez en el 2004, porque este micelio estéril

aislado de una árbol de canela (Cinnnamomum zeylanicum) en Centro América (Strobel et

al., 2001) produce 28 compuestos que inhiben y destruyen varias especies de hongos,

oomycetes y bacterias (Mercier y Jiménez, 2004).

Este tipo de metabolitos principalmente 2-metil-1-butanol y el ácido isobutírico, pueden ser

empleados para controlar algunas de la enfermedades que se presentan en postcosecha

14

durante el almacenamiento de los frutos, ocasionadas por Botrytis, Colletotrichum,

Geotrichum, Monilinia, Penicillium y Rhizopus, ya que no se requiere el contacto del hongo

con el fruto o el fitopatógenos para ver un efecto inhibitorio, fungicida o fungistático de los

volátiles (Mercier y jiménez, 2004).

II. JUSTIFICACIÓN

Los productos vegetales utilizados para el consumo humano tienen enemigos naturales

(hongos, bacterias, nematodos, etc.) los cuales causan un impacto social, ambiental y

económico en la producción de los cultivos por las pérdidas que ocasionan. Aunado a esto, el

uso y abuso de productos químicos tales como fungicidas, bactericidas y otras sustancias

químicas para su control, ha traído como consecuencia la resistencia de enfermedades lo que

ocasiona problemas de contaminación al ambiente (aire, agua, suelo) y representan un serio

peligro para el ser humano. Un enfoque más ecologista es ver a los microorganismos no

como enemigos sino como agentes útiles en el control de otros o como productores de

sustancias capaces de controlarlos. Algunos de estos productos pueden ser útiles, además de

su papel en el control biológico, en la industria de los alimentos por la producción de

colorantes y en la farmacéutica o biotecnológica en la producción de toxinas, antibióticos u

otros metabolitos de interés. De esta manera, los microorganismos pueden ayudar a un

desarrollo sustentable de las sociedades ya que busca el equilibrio perfecto entre los

sectores ambiental, social y económico.

II. OBJETIVOS

Aislar, identificar, cultivar y preservar algunos hongos productores de

pigmentos con uso con uso potencial en el control de hongos postcosecha y

de bacterias de interés clínico.

15

Aislar, identificar y producir masivamente los pigmentos producidos por

hongos con uso potencial en el control de hongos postcosecha y de bacterias

patógenas de interés clínico.

Realizar pruebas de control de hongos postcosecha y de bacterias patógenas

de interés clínico con los pigmentos producidos por hongos.

MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Zonas de muestreo

Se realizaron muestreos y colectas de material vegetal, vivo o muerto, con síntomas de

ataque por hongos durante los meses de enero a septiembre del 2009 en los estados de

Guerrero, México, Michoacán y Morelos. Algunas de las muestras (material vivo) se

colocaron en cámaras húmedas (25°C, 90-95% HR) hechas con bolsas de polipapel y otras en

bolsas de papel (material muerto). El material recolectado se trasladó al laboratorio de

Inocuidad Alimentaria de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI) del

Instituto Politécnico Nacional (IPN).

4.2. Aislamiento y purificación de hongos

Se caracterizaron los síntomas de las muestras colectadas. Se realizaron preparaciones

temporales (glicerol al 20%) en el caso de las muestras con presencia evidente de hongos y se

observaron en un microscopio óptico para detectar la presencia de cualquier tipo de signos

(esporas, micelio, cuerpos fructíferos, etc.). En los casos donde se detectó la presencia de

esporas, se procedió a purificar los hongos presentes por medio de cultivos monospóricos. En

caso contrario, se cortaron secciones de tejido (vivo o muerto) y se sembraron en cajas Petri

16

con medios de cultivos papa dextrosa agar (PDA) y extracto de malta agar (EMA). Las cajas

sembradas se incubaron a 25 ± 2°C durante 3 días. Una vez que fueron producidas esporas, se

purificaron por cultivos monosporicos o punta de hifa, para ello se tomó una asada de

micelio y se diluyeron en tubos con agua destilada estéril, el líquido se vació en cajas Petri

con agar-agar e incubaron a 25 ± 2°C durante 24 h. Posteriormente, se observó la caja en un

microscopio estereoscópico y se identificó la germinación y/o crecimiento de micelio. Se

aislaron de manera individual las esporas germinadas y se sembraron en cajas con PDA e

incubarón a 25 ± 2°C durante 5 días. Las esporas de los hongos purificados se conservaron en

una solución de glicerol al 20% en viales de 3 mL a -80°C.

En los casos donde el material vegetal no presento algún tipo de signo, la muestra se colocó

en cámaras húmedas (25°C, 90-95% HR) para favorecer la esporulación y también se

sembraron pedazos de tejido, previamente lavados y desinfestados, en cajas Petri con PDA y

se incubarón a 25 ± 2°C durante 3 días. Posteriormente, las muestras que presentaron algún

tipo de crecimiento de hongos, se aislaron individualmente en cajas con PDA y se incubaron a

25 ± 2°C durante 5 días. Una vez desarrollada la colonia y producido algún tipo de espora, se

realizó la purificación por cultivo monospórico y se conservaron en solución las esporas a -

84°C.

Durante el aislamiento y crecimiento de los hongos, se identificaron las colonias que

produjeron algún metabolito (pigmento) y/o causaron inhibición o muerte de colonias

fungosas o bacterianas.

4.3. Identificación de hongos productores de pigmentos

17

La identificación a nivel género de los hongos de interés se realizo por comparación de las

características morfológicas de la colonia y del tipo de estructuras (esporas) presentes con

claves taxonómicas de identificación para hongos anamórficos y ascomycetos. En caso de los

basidiomicetos, la identificación y caracterización fue a nivel molecular por lo que se realizó

la extracción de ADN genómico, amplificación, secuenciación y su posterior comparación con

las bases de datos del banco de genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica

(NCBI, por sus siglas en inglés).

Para realizar la extracción de ADN genómico se tomó el micelio crecido previamente (0,5-

1,00 g) en PDA en un microtubo de 2 mL al cual se le adicionó 500 mL de solución buffer de

extracción (50mM Tris-HCl pH= 7,5; 50 mM EDTA; 2% de SDS y 1% de Na2SO3). La muestra se

maceró con el buffer de extracción; se agitó en Vortex por un minuto y posteriormente se

centrifugó a 6 000 rpm, por 10 min; el sobrenadante se incubó a 70°C durante 15 min.

Después, se adicionó un volumen de fenol/cloroformo (1:1) a cada muestra y se centrifugó a

10 000 rpm, por 10 min. Se transfirió la fase acuosa a otro microtubo y se le agregó un

volumen de isopropanol. Se dejó en frío (congelación) durante 10 min y nuevamente se

centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min; el precipitado se secó a 37°C y se suspendió en 50

mL de TE 1X. Posterior a la extracción, se visualizó la integridad del ADN en un gel de

electroforesis (Agarosa 1%, 100 V, 45 min). Se realizó la amplificación de la región ITS del

rDNA. Se realizó el análisis de los polimorfismos de restricción de la región ITS, y se realizó la

secuenciación. La identificación de la especie se hizo por comparación con la base de datos

del NCBI.

4.4. Caracterización cultural del hongo y producción de colorante

18

Se realizó la caracterización cultural en medio sólido y líquido del hongo seleccionado con el

fin de encontrar las mejores condiciones de crecimiento así como la producción del

pigmento. Para esto, se estableció un diseño experimental completamente al azar en arreglo

factorial 33 en donde los factores y niveles evaluados fueron: temperatura de crecimiento

(20, 28, 34°C), pH (4, 6 y 8) y medio de cultivo (PDA, EMA, Czapeck). Las variables de

respuesta evaluadas fueron: tipo y hábito de crecimiento del micelio, color de la colonia,

velocidad de crecimiento (mm), aparición del pigmento, y producción de biomasa (mg). Se

realizaron tres repeticiones por cada tratamiento.

En el caso del medio sólido, se depositó un disco (5 mm) de PDA con micelio en el centro de

cada una de las cajas Petri y se incubaron a las condiciones antes señaladas durante 10 días.

Se hicieron evaluaciones diarias en todos los casos, excepto en la producción de biomasa que

se hizo al final (10 días). Para esto último, se colocaron las cajas Petri en baño María hasta

licuar el medio, y con ayuda de unas pinzas se tomo el micelio y se coloco en charolas de

aluminio a peso constante. Las muestras se secaron (60°C, 2 días) en una estufa. Por

diferencia de peso, se calculó la producción de biomasa. Por otra parte, en los medios de

cultivo líquidos, se depositó un disco (5 mm) de PDA con micelio en tubos de ensaye de 50

mL con 30 mL de medio de cultivo líquido. Los tubos se incubaron a las temperaturas

indicadas en agitación (100 rpm) durante 10 días. Las variables de respuesta fueron las

mismas que en caso anterior. La producción de biomasa se evaluó a los 10 días por el método

de peso seco. Para esto último, se extrajo el micelio de cada tubo por filtración bajo una

campana de flujo laminar.

4.5. Extracción, purificación e identificación del colorante

El pigmento se extrajo del medio en donde se observó la mayor producción en menor tiempo

(EMA). Se probaron como solventes cloroformo, éter de petróleo, acetona, y etanol (96°).

19

Para realizar la extracción se utilizaron cajas petri con colonias desarrolladas del hongo en

EMA de 20 días de incubación a temperatura ambiente

La extracción del pigmento se realizó removiendo el micelio con un asa bacteriológica y agua

destilada, el agar se partió y se colocó en morteros donde se maceró con los diferentes

solventes por separado. Las muestras maceradas se colocaron en matraces de 500 mL y se

les agregó más solvente hasta alcanzar un volumen de 200 mL o lo equivalente para una

relación 2:1:. se agitaron vigorosamente de forma manual durante 10 minutos.

Posteriormente se colocaron en un Sonicador AS3120B durante 10 minutos para promover la

solubilidad y se agitó nuevamente durante 10 minutos.

Visualmente se observó la solubilidad en los tratamientos con los diferentes solventes y se

eligió el solvente que presentó mayor solubilidad. La concentración del pigmente se realizó

por destilación simple hasta la evaporación de la mayor cantidad del solvente; para ello se

filtró la muestra para remover los trozos de agar y conservar solamente el pigmento

solubilizado, se destiló utilizando un sistema implementado de laboratorio, utilizando un

parrilla a 300ºC durante aproximadamente 30 minutos ò el tiempo requerido para la máxima

evaporación del solvente alcanzada Se agrego sulfato ferroso anhidro para absorber restos

de agua, posteriormente se filtro para remover restos de sulfato hidratado. El extracto

obtenido se depositó en viales de vidrio de 20 mL y fueron cubiertos con papel aluminio para

protegerlos de la luz.

Para la separación y purificación del pigmento se realizaron pruebas de cromatografía de

capa fina (TLC, por sus siglas en inglés) en una placa de 20x10cm. Se realizaron pruebas con

distintos solventes para evaluar cual sistema presentaba una mejor migración y visualización

del pigmento extraído. Como fase móvil se utilizaron 25 mL de diferentes solventes [metanol:

hexano (8:2), hexano: acetato de etilo (8:2) y dicloro metano: acetato de etilo (8:2).

El extracto se colocó en la parte inferior de la placa sembrando 5 aplicaciones con un capilar;

se agregó el sistema de solventes en cada caso en una cámara de cromatografía, se colocó la

placa y se cerró la cámara. La placa cromatográfica se retiró de la cámara cuando el nivel de

20

diluyente llegó a la línea superior de la placa, se secó y se reveló con ácido sulfúrico al 10%

colocándola sobre una parilla a 40ºC hasta la visualización de la muestra. Con el solvente que

presentó la mejor visibilidad y revelado con metanol:hexano (8:2) se realizó una

cromatografía de capa fina en la cual se comparó el pigmento obtenido y concentrado con

estándares de colorantes químicos como testigos: safranina, rojo de metilo, rojo neutro,

fuchsina básica y naranja de xileno.

La concentración utilizada en testigo fue de 0.1 mg /mL. Se identificó la similaridad del

pigmento obtenido con los colorantes químicos. Se reportó el factor de retención de la

muestra con respecto a los testigos.

Además de lo anterior, se realizó una cromatografía de columna-silica gel (25 mL) con el

solvente que mejor resultado presentó la cromatografía de capa fina (metanol: hexano, 8:2)

para la fase móvil por lo que se hidrataron 5 g de sílica-gel. Se sembró 300 µL del pigmento

concentrado en la parte superior de la columna y se fue agregando la mezcla de solventes

según se requirió. Se recolectó una muestra del extracto cada 5 minutos o cada vez que se

observó el descenso de la separación de una banda del pigmento a través de la columna.

Las muestras obtenidas se leyeron en un espectrofotómetro Cintra 10e y se realizó un

barrido en el espectro de luz visible (200 nm – 800 nm). Se utilizó como blanco la mezcla

empleada en la columna. Se identificaron los puntos máximos de absorbancia y longitud de

onda que existieron en cada una de las muestras y la relación de éstos entre cada muestra.

Se identificó el color correspondiente entre la relación absorbancia–longitud de onda del

espectro de luz visible.

El extracto liquido se sometió a un tratamiento en un Rotavapor a 70° aplicando vacio

durante aproximadamente 30 minutos, para la evaporación total del solvente de la muestra y

poder conservarlo de manera solida. El extracto resultante se depositó en un vial de vidrio de

2 mL y se mantuvo con una tapa con perforaciones para la evaporación en su totalidad del

solvente. Se determinó el rendimiento del extracto solido obtenido. Posteriormente se

almacenó para uso futuro.

21

4.6. Pruebas de control contra hongos fitopatógenos

Se realizaron pruebas de control in vitro con el pigmento concentrado contra hongos

fitopatógenos conocidos (Colletotrichum fragarie, C. gloeosporoides, y C. acutatum)

obtenidos de frutos de chirimoya, mango, fresa y aguacate. Los hongos se identificaron,

aislaron, purificaron, y se mantuvieron conservados en ultra congelación, tal como se

describió en párrafos anteriores. Se reactivaron los hongos sembrando una asada de esporas

en medio de cultivo PDA y se incubaron a 24 ± 2 °C durante 5 días.

Para la prueba de control se solubilizó 1.6 mg de extracto con 100µL de solvente (Alcohol 96°

y se colocó sobre un disco de papel filtro estéril de 0.6 cm de diámetro colocado en la parte

central de cajas Petri con PDA. En sentidos opuestos, se colocó un disco de 0.5 cm de PDA

con micelio del hongo fitopatógeno.

Las cruzas se realizaron por triplicado y por cada especie. La incubación se realizó a 25°C, luz

blanca y 10 días. Se observó y midió el crecimiento del hongo así como la presencia de halos

de inhibición, velocidad de crecimiento, muerte ó inhibición del hongo.

22

4.7. Pruebas de control contra hongos bacterias de interés clínico

Se realizaron pruebas de control con el pigmento concentrado contra cepas bacterianas de

interés clínico (Bacillus subtillis, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, y Candida albicans)

proporcionadas por el Laboratorio de Farmacología de la UPIBI-IPN. Se utilizo el método de

vaciado en placa ya que con esta técnica se tiene un crecimiento bacteriano homogéneo en

el área interna de la caja Petri. Para ello se preparó el medio de cultivo de siembra (agar

nutritivo). Se vaciaron 10 mL del medio por cada caja Petri y se y se inocularon las diferentes

cepas bacterianas (0.1 mL de inoculo por cada 100 mL de medio de cultivo).

Posterior a la gelificación del medio base se depositó sobre el mismo, el medio de siembra y

se esperó hasta que gelificara. Posteriormente se solubilizó 1.6 mg de extracto con 100µL de

solvente (Alcohol 96°) y se colocó sobre un disco esteril de papel filtro de 0.6 cm, los cuales

se colocaron sobre la superficie del medio de cultivo de siembra por duplicado y de manera

opuesta en la parte media de las cajas Petri.

Las pruebas se realizaron por duplicado para cada bacteria. Las cajas inoculadas se incubaron

a 37°C durante 5 días. Se observó y midió el crecimiento las colonias bacterianas observando

cualquier signo de inhibición o disminución en la velocidad de crecimiento de las colonias y

diámetro del halo de inhibición.

23

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.8. Aislamiento y purificación de hongos

De los hongos aislados y purificados en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) y

extracto-malta-agar (EMA), se seleccionó una colonia en la que se observó la producción de

un pigmento amarillo-rosáceo en el micelio (en PDA) y un tono rojo-violeta (en EMA) (Figura

3). En este último caso, el color de la colonia se intensificó con la edad.

Figura 3. Colonia de Fusarium graminearum (Gibberella zeae) en PDA (a, b) y EMA (c, d) de 10 días de edad.

24

Morfológicamente, la colonia fue blanca, de crecimiento raso en colonias jóvenes y

progresivamente aéreo en cultivos de mayor edad. La producción de color se observó

aproximadamente 5 días después de la siembra en EMA. Por observaciones al microscopio

compuesto (40x) se pudo determinar que el pigmento se encontró principalmente dentro del

micelio inmerso en el medio de cultivo y su intensidad fue mayor a medida que la colonia

envejecía (Figura 4). No se observó la presencia esporas ni de cuerpos fructíferos.

Figura 4. Producción de pigmento en micelio de Fusarium graminearum cultivado en EMA de 10 días

de edad (40x).

4.2. Identificación de hongos productores de pigmentos

Debido a la ausencia de cuerpos fructíferos y esporas no fue posible identificar

morfológicamente a esta especie productora del pigmento púrpura por lo que se recurrió a

su caracterización molecular por secuenciación de la región ITS1 del ADN ribosomal y su

posterior alineamiento con las bases de datos del Banco de Genes del National Center for

Biotechnology Information (NCBI, por sus siglas en inglés) para la identificación de la especie.

La comparación de la secuencia de ADN revelo, la similitud genética con Fusarium

graminearum (teleomorfo: Gibberella zeae). La secuencia de pares de bases encontrada para

esta especie se presenta en el siguiente cuadro (Cuadro 1).

Cuadro 1 Secuencia de pares de bases de la región ITS1 del ADNr de Fusarium graminearum.

25

CTTNATNCTTTTNTTCANCTGNTCCGAGGTCACATTCAGAAGTTGGGGTTTANCGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGATGTGTAAATTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATGTATTTGGGGAGTGCAGCAGGACTGCAGCTCCCAACACCAAGCTGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTGTTTTTTATACTCAGAAGTTCCACTAAAAACAGAGTTTAGGGTTCCTGCGGCGGGCCGTCCCTTTTTACGGGNCGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACATANGGTATGTTCACAGGGGTTTGGGAGTTGTAAACT CTTNNTNACTTTTCTTCANCTGATCCGAGGTCAACATTCAGANGTTGGGGTTTANCGGCGTGGCCGCGACGATTACCAGTAACGATGTGTAAATTACTACGCTATGGAAGCTCGACGTGACCGCCAATGTATTTGGGGAGTGCAGCAGGACTGCAGCTCCCAACACCAAGCTGGGCTTGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTTGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTTATTTGTTTTTTATACTCAGAAGTTCCACTAAAAACAGAGTTTAGGGTTCCTGCGGCGGGCCGTCCCTTTTTACNGGGCGCGGGCTGATCCGCCGAGGCAACATANGGTATGTTCACAGGNGTTTGNGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTG

Muestra por duplicado, alineamiento en la base de datos de la ENCBI

4.3. Caracterización cultural del hongo y producción de colorante

En la Figura 5 se presentan las características de los cultivos en medio sólido de Fusarium

graminearum (teleomorfo: Gibberella zeae) expuestos a las diversas condiciones de

crecimiento con el fin de obtener las mejores condiciones para la obtención del pigmento.

Cabe aclarar que en estos tipos de medios, a pH 4 no se formó el gel por lo que no hubo

crecimiento. No hubo crecimiento en los cultivos mantenidos a 34°C por lo que sólo se

presenta el inóculo inicial.

26

Figura 5. Colonias de Fusarium graminearum a 20°C, 28°C y 32, de 10 días de edad cultivado en papa

dextrosa agar (PDA), extracto demalta agar (EMA) y czapeck a pH 4, 6 y 8.

No hubo crecimiento del hongo a 34°C. Por el contrario, se observó que las características de

crecimiento (tipo y hábito de crecimiento del micelio, color de la colonia, etc.) así como la

producción del colorante de las colonias a temperatura ambiente resultaron afectadas por el

medio de cultivo solido. Así, en los tratamientos con PDA, el micelio fue raso durante los

primeros días y aéreo en la periferia de la caja con excepción de las cajas a pH 8 las cuales

tuvieron un crecimiento compacto y el micelio creció en pliegues concéntricos (Figura 5).

El color inicial de las colonias en PDA fue amarillo el cual cambió a ligeramente rojo a los

cinco y seis días; a pH 8 predominó un color rojo rosáceo desde los primeros días de

incubación (Cuadro 2). Las colonias en EMA presentaron con un crecimiento compacto en el

centro con micelio raso y aéreo algodonoso en los márgenes y mayor intensidad de pigmento

rojo. En cultivos de mayor edad (viejos), con excepción de los cultivos a pH 8, se presentó el

menor crecimiento y predominaba un color rojo con manchas blancas algodonosas en el

margen de la colonia. La intensidad del color se incremento con respecto a la edad del cultivo

(Figura 5) ya que cambio de rojo a guinda intenso a los diez días de incubación.

El cultivo en medio Czapeck a pH 4 no se presento crecimiento, en el pH 6, hubo crecimiento

micelial compacto en forma de anillos concéntricos, el color del micelio tuvo un color café y

en pH 8 presentó áreas con tonos rosáceas entre los siete y ocho días de incubación (Cuadro

2). El mayor crecimiento radial se presentó en el medio de cultivo PDA a pH 6 con diámetros

de la colonia de 66 mm mientras que en medio EMA el máximo diámetro alcanzado fue de 60

mm a pH 6 (Figura 6).

27

Fig

ura 6. Efecto de la temperatura ambiente en el diámetro de la colonia a 3

pH (4, 6,8) en 3 medios de cultivo (PDA, EMA, Czapeck) durante 10 días de incubación.

Las en PDA a 28°C presentaron un rápido crecimiento raso, el micelio en pH 4 y 6 fue corto y

tuvo un aspecto raso y una textura aterciopelada de color amarillo (Figura 5) y ligeramente

rojo con manchas blancas al margen entre el quinto y sexto día de incubación; el cultivo a pH

8 tuvo un desarrollo lento con pliegues en forma de estrella y micelio compacto de color rojo

desde los primeros días de crecimiento.

Los cultivos en EMA presentaron un crecimiento uniforme en forma de anillos, el micelio fue

rojo desde los primeros días, con tonos blancos algodonosos en los extremos

(Cuadro 2), la similitud entre estas características la compartieron los cultivos entre los tres

pH a excepción del pH 8 el cual solo presento una velocidad de crecimiento menor que los

otros dos.

La colonia en medio Czapeck a pH 4 no presento crecimiento después de los diez días de

incubación, a pH 6 presentó micelio compacto y polvoriento, el crecimiento tuvo un aspecto

28

de anillos concéntricos, y el micelio fue de color café claro con tonos rosas en la periferia. La

colonia a pH 8 al igual que la anterior presentó micelio compacto y crecimiento en forma de

anillos concéntricos, pero predominaron las aéreas de color rosáceo y el micelio en estas

áreas era más denso y algodonoso (Figura 5).

El mayor diámetro de crecimiento a 28°C fue en las colonias a pH 6 en PDA con 53 mm de

diámetro, seguido de la colonia a pH 4 en medio EMA con 40 mm de diámetro (Figura 7). La

mayor aparición de pigmento se observo en las colonias en EMA donde se observó un color

rojo y guinda desde los primeros días, así como el aumento de la intensidad y concentración

tanto en el agar como en el micelio después de los diez días de incubación.

Figura 7. Efecto de la temperatura de 28°C en el diámetro de crecimiento de la colonia en distintos pH (4, 6,8)

en 3 medios de cultivo (PDA, EMA, Czapeck)

29

Cuadro 2. Características morfológicas del hongo productor de pigmento bajo el efecto de la Temperatura, pH y

medio de cultivo

Temp. pH Medio de

Cultivo Tipo de

crecimiento Cuerpos

Fructíferos Color de colonia

Velocidad de crecimiento

(mm/día)

Aparición

pigmento (días)

20

°C

pH 4

PDA - N - - -

EMA ☼▲ N R, B 6,8 9

CZA - N - - -

pH 6

PDA ☼▲ N A, R 6,7 6

EMA ▲ N R, C 6,0 6

CZA ▲ N C 3,6 7

pH 8

PDA ▲ N R 6,2 6

EMA ▲ N R, B 3,2 9

CZA ☼▲ N Rs 5,1 8

28

°C

pH 4

PDA - N - - -

EMA ☼▲ N R, B 3,9 7

CZA - N - - -

pH 6

PDA ☼▲ N A 6,5 5

EMA ☼▲ N R, B 3,3 4

CZA ▲ N C, Rs 3,4 4

pH 8

PDA ▲ N R 2,9 6

EMA ▲ N R, B 2,2 9

CZA ▲ N Rs 3,7 8

▲: Crecimiento raso, ☼: crecimiento aéreo, N: No, A: Amarillo, R: Rojo, B: Blanco, C: Café, Rs: Rosa

Bajo las condiciones de crecimiento establecidas no se observó la presencia de esporas y

cuerpos fructíferos; ni visual ni microscópicamente en colonias de variada edad. No se

presentó crecimiento en ninguno de los tratamientos a 34°C bajo ningún pH por lo que esta

temperatura no es significativa para el crecimiento y desarrollo de la colonia productora de

pigmento.

30

El crecimiento y apariencia de las colonias fueron diferentes en todos los medios de cultivo

solido, lo cual esta relacionado con las fuentes de carbono y la composición nutritiva de cada

uno de ellos (Orozco et. al, 2004). La mayoría de especies de hongos de suelo, troncos,

ectomicorrizógenos y saprofitos han registrado datos experimentales que indican un

crecimiento optimo que oscila entre un pH de 6.8 a 8.3. No obstante los experimentos in

vitro que miden el efecto del pH sobre el crecimiento fúngico deben ser interpretados con

precaución ya que los resultados pueden ser afectados por la duración del ensayo, la fuente

de nitrógeno o la adición de sales de hierro u otros aditivos nutricionales antes o después de

la esterilización del medio (Hung & Trappe, 1983).

La máxima producción de biomasa en los tratamientos a temperatura ambiente en PDA a pH

6 fue de 0.15 gr., los menores valores de biomasa fueron en medio Czapeck A 28°C,

la mayor producción de biomasa se observó en PDA a pH 6 con 0.14 gr.; el resto de las

evaluaciones no sobrepaso los 0.1gr. (Figura 8).Los valores entre los tratamientos en EMA y

Czapeck presentaron valores similares, con excepción de la colonia en medio Czapeck a pH 4

donde no hubo crecimiento bajo ambas temperaturas. La mayor producción de biomasa en

ambas temperaturas fue en PDA seguido de EMA.

El agar de papa y dextrosa es un medio de cultivo universal recomendado para el aislamiento

y crecimiento de hongos en general (Agrios, 1988).

La dextrosa que contiene este medio es una fuente importante de carbono que promueve un

buen crecimiento micelial (Madan 1994). Al igual que la dextrosa, la glucosa y sacarosa

representa las fuentes principales en los medios de cultivo empleados que al permitir un

desarrollo favorable de la especie propician las condiciones para que se presente tanto el

metabolismo primario como secundario; como lo es el caso del medio Czapeck que contiene

nitrato como fuente de carbono y en estudios se han observado frecuentemente la

producción de sustancias con actividad biológica. (Turner, 1971). La producción de pigmentos

en muchas especies está influenciada por la presencia de sustratos complejos de menor

31

asimilación por el hongo como los presentes en los medios en donde se obtuvo la mayor

coloración (EMA y PDA), que aquellos compuestos de más fácil asimilación.

Figura 8. Peso Seco del hongo productor de pigmento en medios sólidos en distintos pH (4, 6,8) en 3 medios de

cultivo (PDA, EMA, Czapeck), a temperatura ambiente y 28°C. Valores obtenidos a los 15 días de incubación.

En PDA y EMA se evidenció la presencia de compuestos tales como Dextrosa y Extracto de

Malta; la presencia de almidón, y extracto de malta, marcaron la alta pigmentación

encontrada en los respectivos medios; datos similares fueron encontrados por otros autores

en donde la presencia de componentes de alto peso molecular o de polisacáridos, tales

como el almidón incrementan la producción de pigmentos, así como la presencia de sacarosa

ha tenido efectos positivos sobre la producción de pigmentos, en cantidades menores que en

el caso de almidón, más sin embargo teniendo resultados positivos a menor costo (Cho et al,

2002).

En el PDA la presencia de dextrosa favorece el crecimiento más que la producción de

pigmentos (Su, 1983) y tomando en cuenta que las fuentes de nitrógeno, aún siendo

orgánicas no favorecieron una adecuada pigmentación en el medio, pero sí en el micelio en

el margen de la colonia, pues la baja concentración de estos y la presencia de glucosa,

32

favoreció el crecimiento en mayor medida que la producción de pigmentos, por esto que los

tratamientos en este medio de cultivo obtuvieron la mayor producción de biomasa.

Su, en 1983, utilizando una cepa de Monascus sp., encontró que el uso de arroz en polvo,

favorece la producción de pigmentos tanto intra como extracelularmente, a comparación de

fuentes de carbono como la glucosa. De igual manera la fuente de nitrógeno marca un efecto

muy significativo sobre la expresión de estos compuestos, encontrándose que con el uso de

fuentes orgánicas de nitrógeno, el incrementó en la producción de pigmentos a comparación

de las fuentes inorgánicas (Cho et al. 2002) como lo fue en el caso del medio Czapeck. Su

(1983), encontró que las fuentes de nitrógeno orgánicas tales como el monoglutamato de

sodio (MSG), el ácido casamino, incrementan la producción de pigmentos, y la presencia de

nitrato de potasio también influye de manera positiva en la producción de pigmentos.

Cultivos de Fusarium graminearum en PDA son predominantemente rosa-rojizos con micelio

de 3.5 x 10-14 µm y conidios en forma de hoz, de 2.5 x 35-63 µm

(Melo & Carmona, 2002)

En las colonias desarrolladas en Caldo de Papa y Dextrosa (PDC) a temperatura ambiente 20

+/- 2°C se observo micelio abundante y aglomerado de tamaño grande de un color

blanquecino; en pH 6 fue la única colonia donde se observó la presencia de pigmento rojo

intenso en el micelio y sobre las paredes del tubo de ensaye. Por otra parte en caldo de

Malta (EMC) el micelio tuvo un color café rojizo, la biomasa fue abundante en forma de

aglomerados grandes y grumos de menor tamaño. En el caldo Czapeck el crecimiento micelial

fue escaso en forma de aglomerados compactos pequeños de un tono blanquecino

translucido (Figura 10).

La producción de biomasa fue escasa en los tratamientos a temperatura ambiente, los

valores mas altos se presentaron en Caldo de Malta con 0.11, 0.10 y 0.09 gr. respetivos a

cada pH (4, 6 y 8). El resto de los tratamientos a temperatura ambiente no rebasaron

estos valores (Figura 9).

33

Figura 9. Peso Seco del hongo en medio liquido en distintos pH (4, 6,8) en 3 medios de cultivo (PDC, EMC,

Caldo Czapeck), a temperatura ambiente, 28°C y 32°C.

34

Figura 10. Características de Fusarium graminearum a 20°C, 28°C y 32, a los diez días de incubación,

desarrollado en tres medios de cultivo liquido (PDC, EMC, Czapeck) y tres pH (4, 6,8).

35

Los cultivos líquidos en caldo de papa a pH 6 a 28°C desarrollaron micelio rojo intenso, el

tamaño de las colonias en PDC fue más grande que las desarrolladas a temperatura

ambiente, presentaron micelio grande y aglomerado de tono blanquecino. La presencia de

pigmento rojo se observo con mayor intensidad en Caldo de Malta en los tres distintos pH;

micelio de color café rojizo formando aglomerados grandes (Figura 10). El crecimiento en

Caldo Czapeck fue muy escaso y el crecimiento micelial en forma de aglomerados pequeños

de tono traslucido y presencia de pigmento nula.

Las colonias a 32°C presentaron las mismas características morfológicas, aglomerados de

mayor tamaño se observaron en Caldo de Malta y Caldo de Papa, la presencia de pigmento

se observo en Caldo de Malta, con un micelio café rojizo en las paredes y superficie del tubo.

Las colonias en caldo Czapeck fueron las de menor tamaño con respecto al resto de los

tratamientos.

La mayor producción de biomasa fue en caldo de Malta a 28°C en pH 4, seguido de las

colonias en Caldo de Malta a 32°C a pH 6, presentaron una producción de: 0.32 y 0.24 gr.

respectivamente. Las colonias en Caldo de papa no sobrepasaron los 0.13 gr en ningún

tratamiento; por lo tanto las variables eficientes para una alta producción de biomasa así

como producción de pigmento fueron en Caldo de extracto de malta a 28°C a un pH básico.

El análisis de varianza de los datos obtenidos del diseño completamente al azar en arreglo

factorial se pueden observar en el siguiente cuadro (Cuadro 3). De esta forma se evaluó las

comparaciones entre tratamientos y las condiciones a las que se llevaron a cabo, ya que los

ensayos del experimento se realizaron con todas las combinaciones de los niveles de los

factores de temperatura, pH y medio de cultivo.

36

Cuadro 3. Efecto de la Temperatura, pH y medio de cultivo en el crecimiento fúngico, y producción de

biomasa en medio solido y líquido

Factor y nivel Crecimiento

radial

Biomasa

Medio Solido

Biomasa

Medio Liquido

Temperatura (A) ** ** **

pH (B) ** ** **

Medio de cultivo (C) ** ** **

AB ** ** **

AC ** ** **

BC ** ** **

ABC ** ** **

*significativo (5%), **altamente significativo (1%)

De acuerdo al análisis de varianza entre los niveles de cada factor, la relación directa entre

los tres determinó que cada factor y la combinación entre estos es altamente significativo

dentro de las variables evaluadas: Crecimiento de la colonia y producción de Biomasa en

cultivo en medio solido como en medio líquido.

El echo de alojar los tratamientos en bloques al azar puede disminuir la eficiencia de las

estimaciones al incluir en el experimento mayor heterogeneidad en el material experimental;

sin embargo la utilización de este sistema resulta de mucha eficiencia en la evaluación de los

factores relacionados en el optimo desarrollo de sistemas biológicos.

La comparación de medias por medio del método de Tukey para evaluar la relación directa y

la significación entre los niveles de cada factor se observa en el siguiente cuadro (Cuadro 4).

37

Cuadro 4. Efecto de la temperatura, pH y medio de cultivo en el Crecimiento, Biomasa Medio Solido y

Medio Liquido

Factor Nivel n Crecimiento

(mm)

Biomasa

Medio Solido

(g)

Biomasa

medio

Líquido (g)

Temperatura

(A)

Ambiente 9 43.04 a 0.1179 a 0.1167 a

28°C 9 30.41 b 0.0947 a 0.0967 a

32°C 9 6.00 c 0.0050 b 0.0606 a

pH(B)

pH 4 9 34.852a 0.092a 0.11185 a

pH 6 9 27.889a 0.068a 0.08326 a

pH 8 9 16.704 b 0.056a 0.07904 a

Medio de

cultivo

(C)

PDA 9 30.296a 0.115a 0.15953 a

EMA 9 28.037a 0.071b 0.06310 b

Czapeck 9 21.11b 0.031b 0.05152 b

Nota: n, numero de observaciones, Comparación de medias según la prueba de Tukey (p<0.05). Valores con

diferente letra son estadísticamente diferentes La comparación se realizó entre niveles de cada factor. Los

niveles en cada factor están en orden descendente.

De acuerdo a los valores obtenidos del análisis de medias, los niveles del factor A con

respecto al crecimiento de la colonia en medio solido fueron diferentes marcando diferencia

significativa entre los tres niveles. En cuanto a la producción de biomasa tanto en cultivo

solido como liquido existió similitud entre datos obtenidos a temperatura ambiente y 28°C y

diferencia con respecto a estos en el nivel a 32°C. En el factor B no existió diferencia

significativa más que en el crecimiento de la especie a pH 4 y 6 con respecto al nivel pH 8.

Con respecto al factor C, en el desarrollo de la colonia existió igualdad estadística entre los

medios PDA y EMA, por otro lado en la producción de biomasa tanto en medio solido como

liquido la igualdad se presento entre el medio EMA y Czapeck con respecto al PDA.

38

4.4 Extracción, purificación e identificación del colorante

Los solventes empleados para las pruebas de dilución fueron: Cloroformo, Éter de Petróleo,

Acetona, Etanol; de los cuales la mayor solubilidad se presentó con el uso de acetona y

mayormente con alcohol etílico (96°). Después de una destilación para evaporar el solvente y

concentrar el pigmento se realizó una cromatografía de capa en la cual se eligió el sistema

Metanol-Hexano (8:2) ya que fue el que presentó mejores resultados como diluyente del

pigmento y mejor visualización en el revelado con acido sulfúrico al 10% en pruebas de

cromatografía de capa fina. Las muestras se sembraron en el borde inferior de la placa

cromatografíca colocando 5 aplicaciones de cada muestra (Figura 11).

Figura 11. Cromatografía en capa fina del pigmento extraído contra estándares de colores químicos.

1-Safranina, 2-Rojo de metilo, 3-Rojo Neutro, 4-Fuchsina Básica, 5-Naranja de Xileno. Metanol- Hexano (8:2)

Muestra 1 2 3 4 5

39

Las distancias recorridas por la muestra de pigmento así como cada uno de los estándares

aplicados, la distancia recorrida del diluyente y el Factor de retención (Rf) de cada muestra se

observan en el siguiente cuadro (Cuadro 5.)

Cuadro 5. Factores de retención del pigmento y los colores estándar después de una cromatografía en

capa fina

Sustancia Distancia Recorrida (cm) Rf=distancia recorrida por compuesto/ distancia

recorrida por el eluyente

Mancha 1 pigmento 3.7 0.34




Safranina 1 0.09

Rojo de Metilo 5 0.45

Rojo neutro 7 0.64

Fuchsina básica 0.5 0.05

Naranja de Xileno 7.5 0.68 Concentración de los estándares: 1mg/mL. Sistema Metanol-Hexano (8:2), Revelador: H2SO4 (10%). Distancia recorrida

desde el origen por el frente del eluyente: 11 cm.

El revelado de la placa indicó la presencia de 4 manchas correspondientes al pigmento

extraído, tres de las cuatro bandas de la muestra presentaron valores ideales de Rf (0.6 y

0.75) de 0.59, 0.70 y 0.8 respectivamente, lo que evidencia la buena elección del sistema de

solventes empleado.

La mayor similitud del pigmento extraído con respecto a los estándares se observó en la

mancha 1 del pigmento (Rf 0.34) con Rojo de metilo (0.45); y la mancha 2 del pigmento (Rf:

0.59) presento gran similitud con Rojo neutro (Rf: 0.64).

Por lo tanto se reafirmó cualitativamente que el pigmento extraído corresponde a la gamma

de colores rojos.

40

La cromatografía en columna (Silica-gel) utilizando el mismo sistema de solventes (Metanol-

Hexano, 8:2) permitió recolectar 7 extractos en un periodo de 60 minutos. El barrido

espectrofotométrico (200nm – 600nm) indicó los máximos valores de absorbancia

(Figura 12).

Figura 12. Valores máximos de absorbancia del barrido espectrofotométrico (200 – 600 nm) de los siete

extractos obtenidos de la cromatografía de columna.

El primer extracto recolectado tuvo un color amarillo claro, el cual presentó la mayor

absorbancia a una longitud de onda de 250 nm. El segundo y tercer extracto recolectado de

igual forma que el primero presentaron color amarillo y las máximas absorbancias se

presentaron a 245 nm y 240 nm respectivamente. El cuarto extracto tenia un aspecto

aceitoso con una tonalidad de amarillenta blanquecina, el máximo valor se presento a 250

nm de longitud de onda. El quinto extracto tuvo un color guinda con aspecto acuoso, su pico

máximo de absorbancia fue a 245 nm aproximadamente. El extracto seis y siete tuvieron un

tono rosáceo translucido con un máximo en 280 y 340 nm.

41

Los barridos de todos los extractos presentaron gran cantidad de lecturas desde los 200 nm

hasta la máxima longitud donde se presento lectura la cual fue de 340 nm; el color del

extracto que presento esta lectura tenia un color rosáceo claro y acuoso; sin embargo la

máxima absorción de pigmentos rojos producidos por hongos se da en el rango de los 500

nm, no concordando con los valores obtenidos en esta investigación.

Se puede considerar que las lecturas a las longitudes de onda observadas pueden ser una

mezcla de pigmentos en donde uno de ellos se enmascare por otro al estar uno en mayores

cantidades, o bien estos picos de absorbancia máxima pueden deberse a que existan

isómeros de una misma molécula de pigmento ya sea con diferentes

sustituyentes o protonados.

De acuerdo con otros autores la presencia de mas de dos picos pueden deberse a la mezcla

de 2 o más pigmentos, para pigmentos amarillos-naranjas longitudes de onda de 405 nm y

rojos de 495 nm en pigmentos de Monascus sp. y longitudes de onda de 400 nm para

pigmentos amarillos, 470 para naranjas y 500 para pigmentos rojos

(Cho et al. 2002), en pigmentos de Paecilomyces sp..

La muestra concentrada resultante se mantuvo en un vial durante dos días para la

evaporación total del solvente y poder conservarlo de manera solida. Posteriormente por

diferencia de peso se obtuvo el peso del extracto solido con respecto al vial de almacenaje. El

peso del extracto solido fue de 0.2821 gr., la cantidad de muestra diluida en solvente inicial

fue de 17 mL, por lo que el rendimiento obtenido fue de 0.01659 gr/mL ó 16.6 mg/mL.

42

4.5 Pruebas de control contra hongos fitopatógenos

Las especies caracterizadas de Colletotrichum acutatum y Colletotrichum fragarie se

probaron in vitro contra discos impregnado con el extracto bajo una concentración de 1.6 mg

(diluido en 100 µL de solvente) utilizando 2 discos testigos; un disco impregnado solamente

con el solvente empleado, para descartar inhibición debido al diluyente, y otro disco

impregnado con la misma concentración de extracto diluido pero sometido a esterilización,

para evitar contaminación bacteriana y descartar posible inhibición debido a este factor

(Figura 13).

Figura 13. Pruebas in vitro del pigmento extraído contra dos especies fitopatógenas.

1- Colletotrichum acutatum, 2- Colletotrichum fragarie.

43

El desarrollo de las colonias fungosas después de los 5 días de incubación fue característico

de cada especie. En los ensayos con C. acutatum el crecimiento radial fue uniforme hasta el

contacto del micelio con el disco donde se observó una ligera disminución del crecimiento al

margen de la colonia con respecto a la cercanía del disco. De igual forma ocurrió en el

crecimiento contra los dos discos testigos, pero no se visualizó una inhibición clara después

de los diez días de incubación.

En el caso de la especie de C. fragarie la velocidad de crecimiento fue más rápida que la

anterior especie, el crecimiento radial fue uniforme en toda la caja y hubo crecimiento

incluso sobre los discos con extracto y los discos de control. No se observó la presencia de

halos de inhibición ni disminución de la velocidad de crecimiento del hongo por lo que el

extracto no presento actividad eficiente sobre esta especie bajo la concentración empleada.

4.6 Pruebas de control contra hongos fitopatógenos

Las especies empleadas contra el extracto (1.6 mg por cada 100 µL de solvente) fueron:

Bacilllus subtilis, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus y Candida albicans. La presencia de

halos de inhibición después de 24 hrs de incubación se observó solamente en dos de las

cuatro especies. Tanto B. subtillis como C. albicans no hubo presencia de inhibición, el

crecimiento de las colonias bacterianas fue uniforme y abundante en ambas especies.

En el crecimiento de la cepa de S. typhi fue evidente la presencia de halos de inhibición

(Figura 13). El disco impregnado con solvente no presento ningún signo de disminución de

crecimiento bacteriano, lo que indica que la inhibición no se relaciona con este factor. El

disco con extracto que se sometió a esterilización tuvo un diámetro menor de inhibición, por

lo que la esterilización y/o el cambio a altas temperaturas y condiciones extremas

disminuyeron la actividad bactericida. (Cuadro 6).

44

Figura 13. Pruebas in vitro del pigmento extraído contra Salmonella typhi.

N: Extracto diluido, E: Extracto esterilizado, A: Solvente (Etanol)

En la cepa de S. aureus también se presencio inhibición del crecimiento bacteriano (Figura

14) Los halos tuvieron un tamaño considerablemente mayor que con la especie anterior,

estos tomaron un aspecto de pliegues en forma de estrella debido a que la concentración

utilizada en los discos fue muy alta por lo que los halos tuvieron un tamaño mayor. De igual

manera no hubo crecimiento en el disco testigo impregnado con el diluyente, al contrario de

los discos testigos donde si hubo inhibición. El extracto esterilizado presento menor diámetro

de inhibición con respecto al no esterilizado.

Figura 14. Pruebas in vitro del pigmento extraído contra Staphylococcus aureus.

N: Extracto diluido, E: Extracto esterilizado, A: Solvente (Etanol)

45

El diámetro mayor de inhibición en ambas especies donde se observo actividad fue de

13 mm en S. typhi y 18 mm para S. aureus (Cuadro 6), tomando en cuenta que el diámetro

del disco fue de 6 mm. Los valores del tamaño del halo en las dos especies demuestran una

eficiente actividad biológica en la inhibición del crecimiento bacteriano, en mayor medida

contra S. aureus ya que las concentraciones fueron las mismas en todos los ensayos.

Cuadro 6. Medidas del Halo de inhibición de un extracto fúngico en dos

especies bacterianas

Microorganismo Halo de inhibición (mm)

Salmonella typhi

EN 10

EE 8

EC 13

Staphylococcus aureus

EN 17

EE 14

EC 18 EN: Disco con Extracto diluido, EE: Extracto diluido y esterilizado, EC: Extracto diluido, disco por caja.

Diámetro del disco: 6 mm

La especie Fusarium graminearum es un fitopatógeno conocido por su potencial actividad

micotoxica la cual afecta causando severas enfermedades a los animales que consumen

granos contaminados. Esta especie presenta una amplia gama de hospedantes, las

principales especies de interés económico susceptibles son: trigo, cebada, avena, centeno,

maíz, trébol, alfalfa y arroz. Las principales toxinas estudiadas que afectan a los animales y al

ser humano son la zearalenona, deoxinivalenol, T2 y tricotecenos. Otras micotoxinas tales

como: fumonisina, fusarin y moniliformin, entre otras se ha investigado que producen un

pigmento rojo.

46

Se ha identificado que la especie en particular Fusarium graminearum produce un policetido

dimerico conocido como Aurofusarin, perteneciente al grupo de policetidos aromaticos:

Naftoquinonas; las cuales han presentado actividad antimicobacteriana (Barrero et al, 1991).

Las propiedades tóxicas de las naftoquinonas se han atribuido a su capacidad de inhibir el

transporte de electrones y al desacoplamiento de la fosforilación, (Medentsev y Akimenko de

1998). Estudios sobre Aurofusarin han informado que se presenta en granos del trigo en

concentraciones hasta de 4.2mg/kg (Kotik y Trufanova, 1998) y es agente causal de

enfermedades en aves de corral (Dvorska et al., 2002).

Aurofusarin fue aislado por primera vez de F. culmorum y su estructura se caracterizó por

Ashley et al. (1937). Este pigmento rojo tiene propiedades antibióticas contra tanto hongos

filamentosos, levaduras y algunas bacterias (Medentsev et al., 1993).

Además se ha demostrado que altera la vitamina A y la vitamina E, modificando la

composición de ácidos grasos en las yemas de huevo de la codorniz japonesa

(Dvorska et al. 2001). La función del compuesto en el hongo no se ha encontrado en cepas

mutantes blancas, pero cepas silvestres tienen una alta tasa de crecimiento y son las cepas

mayormente patógenas en trigo y cebada (Malz et al., 2005).

Los resultados de esta investigación arrojan la posibilidad de la presencia de Aurofusarin en

el extracto obtenido debido a la inhibición que se observo contra bacterias de interés clínico.

La identificación cualitativa de los compuestos que componen el extracto nos proporcionaría

un mayor numero de herramientas y bases de comparación con respecto a las micotoxinas

ya estudiadas sobre esta especie F. graminearum.

47

CONCLUSIONES

Se aisló, purifico y conservo un hongo filamentoso el cual presentó una potencial producción

de un pigmento de color rojo tanto intra como extracelularmente. No se observó

microscópicamente la presencia de cuerpos fructíferos ni esporas por lo que no fue posible la

identificación con guías de identificación taxonómica; por otra parte en la identificación

molecular, la comparación de la secuencia de ADN del hongo demostró la similitud genética

con el hongo Giberella zaes (Fusarium graminearum), por lo cual se confirma que el hongo

aislado es la fase imperfecta F. graminearum.

Las mejores condiciones para la producción del pigmento rojo de F. graminerum en medios

sólidos fueron en EMA a pH 6 a 28°C; y en medios líquidos en Caldo EM, pH 6 a 28°C. Los

mayores valores de producción de biomasa del hongo se reportaron en EMA pH 4 y PDA pH 6

a temperatura ambiente; en medios líquidos fue mayor en caldo EM

a pH 8 a 28°C.

El análisis de varianza reveló que los tres factores empleados en el diseño de los tratamientos

del hongo son altamente significativos entre los 3 niveles de temperaturas, pH y medios de

cultivo utilizados.

En las pruebas cromatograficas con el pigmento extraído se observó similitud colorimétrica

con respecto a rojo neutro y rojo de metilo, de acuerdo a la cercanía de valores de Rf

obtenidos. Las mayores absorbancias de los extractos del pigmento recolectados de la

cromatografía en columna se mostraron entre los 300 y 340 nm, cercanos a la gamma

espectral de tonos rosáceos y lilas.

No se observo resultados positivos en las pruebas de control realizadas con el pigmento

extraído contra las especies fúngicas fitopatógenas de Colletotrichum spp., al menos a la

concentración y dosis utilizadas. Por otra parte se observó inhibición en el crecimiento en las

pruebas realizadas contra S. tiphy y S. aureus, esto debido a las compuestos policetidos

(Naftoquinonas) presentes en el pigmento.

48

LITERATURA CITADA

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50

ANEXO I

Medios de Cultivo:

Czapeck g/L

Sacarosa 30,0

NaNO3 2,0

MgSO4 0,244

KCl 0,5

FeSO4 0,01

K2HPO4 1,0

Agar Papa Dextrosa (PDA) g/L

Papa 200,0

Dextrosa 10,0

Agar 20,0

Extracto de Malta Agar (EMA) g/L

Papa 200,0

Dextrosa 10,0

Agar 20,0

QUE PARA OBTENER EL PRESENTA

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