Quimica La Hematología, serologia y especial

UNIVERSIDAD ESPECIALIZADA DE LAS AMERICAS

(Extensión Chiriquí)

Manual de las Pruebas de Hematología, Prueba de Serología y Pruebas de Química Especial

Técnico Asistente Laboratorio Clínico Sanitario

Presentado por:

Ana Castillo 4-773-765

Yoswal Gantes 4-775-1626

Anginy Concepción 4-762-242

Eneida Lezcano 4-770-718

Evelyn Lezcano 4-770-719

Profesor:

Luis Ayarza

2013

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DEDICATORIA

Este trabajo que con muchos esfuerzos hemos realizados se lo dedicamos a nuestro profesor LUIS AYARZA.

También ha requerido de mucha dedicación, no hubiese sido posible su finalización sin la cooperación interesada de todos y cada una de las personas y muchas las que han sido un soporte muy fuerte en momento de angustia y desesperación

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AGRADECIMIENTO

Agradecemos principalmente a Dios, que nos ha guiado y dado la fortaleza de seguir adelante, a nuestras familias por su comprensión, además de sus apoyos incondicional a lo largo de nuestros estudios.

Y a todas las personas que en una u otra forma nos apoyaron en la realización de este trabajo.

Y por último le agradecemos a nuestros compañeros, amistades y apoyo moral han aportado en un alto porcentaje y a nuestras ganas de seguir adelante en nuestra carrera profesional.

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INDICE

Introducción

Capítulo I

1. Manual de Hematología.

1.1 La Hematología.

1.1.2 Enfermedades hematológicas.

1.1.3 Pruebas que se realizan en un laboratorio de hematológica

1.2 Como interpretar los hemogramas.

1.3 Pruebas hematológicas habituales.

1.4 Área de hematología y coagulación.

1.5 Los 5 tipos de exámenes de sangre más frecuentes

1.5.1 Exámenes hematológicos

1.5.2 Valores hematológicos normales

1.6 Hematología

1.6.1 Coagulación

1.6.2 Drogas

1.7 Biometría hemática

1.8 Prueba de coagulación

1.8.1 Punción capilar

1.8.2 Punción venosa

1.8.3 Determinación de hemoglobina (hb)

1.8.4 Determinación de hematocrito

1.8.5. Cuenta de eritrocitria

1.8.6. Cuenta leucocitaria

1.9 Anticoagulante

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1.9.1 Tipo de tubos con anticoagulante

Capítulo II

2. La Serología

2.1 Las enfermedades detectables con la serología

2.1.2 Las técnicas de serología

2.1.3 Técnicas rápidas y automatización

2.1.4 Método cuantitativo: concepto de “titulo de un suero”

2. 2 Realización de examen

2.2.1 Indicaciones

2.2.2 Valores normales

2.2.3 Valores anormales

2.3 Riesgo

2.4 Tubos que se utilizan para serología

2.5 Pruebas de serología o de laboratorio

2.5.1 Utilidad de los estudios serológicos

2.6 Elección de un prueba serológica, sensibilidad y especialidad

2.7 Valores predictivos

2.8 Perfiles serológicos

2.8.1 Utilidad clínica del perfil serológico

2.8.2 Algunos ejemplos de la utilidad de los perfiles serológicos

2.9 Principalmente hay dos posibles campos de utilidad para la serología

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Capitulo III

3. Química especial

3.1 Pruebas Especiales que se realizan en el laboratorio Clínico

Capítulo IV

4. La tinción de gran

4.1 La Metodología

4.1.1 Explicación

4.2 Teoría

4.3 Técnicas de coloración de gram

4.3.1 Tinción

4.3.2 Enjuague

4.4 Bacteria resistente a la tinción de gran

4.5 Utilidad

4.6 Fundamentos de la diferenciación de gram positivo y gram negativo.

4.7 Causa que altera la tinción Gram

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INTRODUCCIÓN

La hematología es la ciencia que estudia los componentes sanguíneos, tales como: las células (hematíes o eritrocitos o glóbulos rojos, leucocitos o glóbulos blancos y plaquetas), plasma y de los tejidos formadores de esas células (órganos hematopoyéticos: médula ósea, sistema linfático, bazo,…). Y en el laboratorio de hematología se llevan a cabo estos estudios.

Las pruebas que se realizan en el laboratorio son para observar el desarrollo y las alteraciones de los componentes de la sangre o tejidos hematopoyéticos. Cuando se produce dichas alteraciones en el organismo o se modifican los parámetros de los componentes, que en condiciones normales son constantes, nos indica que hay una enfermedad o infección en el organismo.

La serología aprovecha la habilidad de los organismos de defenderse ante una infección por un patógeno. Esta defensa incluye diferentes mecanismos específicos e inespecíficos, de los cuales los inespecíficos son innatos e incluyen mucosas, sistemas mecánicos, macrófagos etc. Algunos componentes de este sistema constituyen la base sobre la que funciona el sistema específico dado que es un sistema que adquiere inmunidad tras la fagocitosis y exposición de un antígeno por los macrófagos, su posterior reconocimiento e interacción con los linfocitos que estimula la formación de anticuerpos.Tras una infección la presencia de anticuerpos se puede detectar en general en un plazo de entre 10 y 15 días dependiendo del tipo, cantidad, virulencia y patogénicas del antígeno y del estado, la vía de infección y la capacidad inmune del animal infectado.La química Especial se realiza en el suero que es la parte amarillenta de la sangre que queda después de que la sangre se ha coagulado y las células sanguíneas se han removido.

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana,

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considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.

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CAPITULO IPruebas de Hematología

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MANUAL DE HEMATOLOGÍA

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Objetivo: Repasar y conocer mejor las técnicas más importantes del laboratorio de hematología, así como sus beneficios y la importancia de éstas a la hora de detectar enfermedades

LA HEMATOLOGIA

La Hematología (de gr.hema: sangre, logo: estudio hematología: estudio de la sangre αἷμα, -ατος-, "sangre" y -λογία, "estudio") es la especialidad médica que se dedica al tratamiento de los pacientes con enfermedades hematológicas, para ello se encarga del estudio e investigación de la sangre y los órganos hematopoyéticos (médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, etc) tanto sanos como enfermos.[1]

HEMO-significado de sangre, griego ejemplos de palabras: hematocrito, hematoma.

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OBJETIVO DE LA HEMATOLOGIA

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http://es.wikipedia.org/wiki/Hematolog%C3%ADa#cite_note-1

http://es.wikipedia.org/wiki/Enfermedad

http://es.wikipedia.org/wiki/Bazo

http://es.wikipedia.org/wiki/Ganglio_linf%C3%A1tico

http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9dula_%C3%B3sea

http://es.wikipedia.org/wiki/M%C3%A9dula_%C3%B3sea

http://es.wikipedia.org/wiki/Hematopoy%C3%A9tico

http://es.wikipedia.org/wiki/Sangre

http://es.wikipedia.org/wiki/Especialidad_m%C3%A9dica

http://es.wikipedia.org/wiki/Idioma_griego

La hematología es la rama de la ciencia médica que se encarga del estudio de los elementos formes de la sangre y sus precursores, así como de los trastornos estructurales y bioquímicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad.

La hematología es una ciencia que comprende el estudio de la etiología, diagnóstico, tratamiento, pronóstico y prevención de las enfermedades de la sangre y órganos hemolinfa productores. Los especialistas en este dominio son llamados hematólogos.

La hematología comprende el estudio del paquete celular, el perfil o el estado sanguíneo, los cuales son:

Recuento de eritrocitos (y valor hematocrito)

Recuento de leucocitos

Determinación de hemoglobina

Velocidad de sedimentación globular (VSG)

Fórmula leucocitaria (recuento diferencial de leucocitos).

ENFERMEDADES HEMATOLOGICA

Las enfermedades hematológicas afectan la producción de sangre y sus componentes, como los glóbulos rojos, glóbulos blancos, la hemoglobina, las proteínas plasmáticas, el mecanismo de coagulación (hemostasia), etc. -línea elitroide, línea granulo citarías, megacarociaticas.

PRUEBAS QUE SE REALIZAN EN UN LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA:

1. Pruebas hematocito métricas: En ellas se observan y valoran la morfología y fisiología de los componentes sanguíneos. Como por ejemplo: Hemograma, recuento de hematíes (RBC), hematocrito (HTO, %HTO), concentración de hemoglobina ([Hb]), índices eritrocitarios (VCM, CHCM, HCM), recuento de leucocitos (WBC), recuento de plaquetas (PLT), VSG,…

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2. Pruebas de Hemostasia: En ellas se valora la coagulación sanguínea. Como por ejemplo: Tiempo de protrombina (TP), tiempo de tromboplatina parcial activada (TTPA), tiempo de trombina (TT),…

3. Pruebas de Banco de Sangre y Hemoterapia: Se realizan para la captación de donantes (se determina su grupo sanguíneo y se realizan pruebas de compatibilidad), recepción, procesamiento y fraccionamiento de la sangre donada, almacenaje de la misma y el control de los hemoderivados. En los hospitales hay una sección que funciona como un banco de sangre, donde se encuentran las bolsas de sangre y se realizan las pruebas de compatibilidad entre las bolsas y los receptores.

4. Pruebas de Inmunología y Serología: La inmuno hematología se encarga de estudiar la presencia de antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac), normalmente para los trasplantes y al determinar el grupo sanguíneo. La serología estudia el suero, en el se buscan anticuerpos (Ac) que normalmente provocan infecciones en el organismo.

COMO INTERPRETAR LOS HEMOGRAMO

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El hemograma puede contener también otros recuentos de células sanguíneas. Pídale a su

Hematólogo u oncólogo que le explique lo que son las pruebas y lo que significan.

Además, en un análisis de células sanguíneas se puede ver si tiene en la sangre células inmaduras, denominadas pro mielocitos, mielocitos o ameloblastos (las células más inmaduras). Estas células suelen estar solamente en lamédula ósea, pero en la LMC estas células inmaduras migran de la médula ósea a la sangre.

PRUEBAS HEMATOLÓGICAS HABITUALES

Perfil hematológico básico

•Hematíes

◦Varón 4,5-5,5 3 10 12 /l

◦Mujer 3,8-4,8 3 10 12 /l

•Hemoglobina

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◦Varón 130-170 g/l

◦Mujer 120-150 g/l

•Hematocrito

◦Varón 0,40-0,50 l/l

◦Mujer 0,36-0,46 l/l

•Volumen corpuscular medio (VCM) 80-100 fl

•Hemoglobina corpuscular media (HCM) 27-32 pg

•Concentración corpuscular media de hemoglobina (CCMH) 315-345 g/l

•Leucocitos 7,0-10,0 3 10 9 /l

◦Recuento diferencial leucocitario

Neutrófilos 40-80 % (2,0-7,0 3 10 9 /l)

Bandas 0-6 % (0,0-0,5 3 10 9 /l)

Linfocitos 17-45 % (1,0-3,0 3 10 9 /l)

Monocitos 2-10 % (0,2-1,0 3 10 9 /l)

Eosinófilos 0-5 % (0,0-0,5 3 10 9 /l)

Basófilos 0-2 % (0,0-0,1 3 10 9 /l)

•Plaquetas 150-400 3 10 9 /l

◦Velocidad de sedimentación globular (VSG) primera hora

Varón (mm) Mujer (mm)

17-50 años 10 19

51-60 años 12 19

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61-70 años 14 20

> 70 años 30 35

•Viscosidad plasmática 25 ºC: 1,4-1,7 mP

Mielograma: recuento porcentual

Serie paquetearía 0,0-0,4

Serie roja 18,4-33,

Proeritroblastos 0,2-1,3

Eritroblastos basófilos 0,5-2,4

Eritroblastos policromatófilos 17,9-29,2

Eritroblastos ortocromáticos 0,4-4,6

Serie blanca 50,4-70,3

Blastos 0,2-1,5

Pro mielocitos 2,1-4,1

Mielocitos 8,4-17,0

Metamielocitos 10,0-26,8

No segmentados + segmentados 15,7-31,0

Otras células 11,5-27,9

Linfocitos 11,1-23,2

Plasmocitos 0,4-3,9

Monocitos + macrófagos 0,0-0,8

Relación mieloeritroide 1,5-3,3

Poblaciones linfocitarias

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Linfocitos T

CD2 80 71-90

CD3 72 60-83

CD5 70 56-83

Subpoblaciones de linfocitos T

CD4 44 30-60

CD8 29 17-42

CD3+ CD56+ 3,5 0-18

CD57+ CD8+ 6 0-14

CD4/CD8 1,6 0,5-2,9

Linfocitos NK

CD3- CD56+ 10 1- 19

CD16 13 5-48

Linfocitos B

CD19 14 5-22

CD19+ CD5+ 3 0,1-12

Interpretación de las pruebas sistemáticas de la coagulación

•Prolongación aislada del TTPA

◦Antecedentes personales o familiares hemorrágicos

Hemofilia A

Hemofilia B

Déficit de FXI

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Inhibidor adquirido anti-FVIII

◦Sin antecedentes personales y familiares hemorrágicos

Déficit de FXII

Déficit de precalicreína

Déficit de cininógeno

Inhibidor lúpico

•Prolongación del TTPA y del tiempo de sangría

◦Enfermedad o síndrome de von Willebrand

◦Prolongaciones del TTPA y del tiempo de protrombina

◦Deficiencia de uno o más de los siguientes factores: FII, FV, FX y FI

◦Insuficiencia hepática

◦Ingestión de anti vitaminas K

◦Tratamiento fibrinolítico

◦Coagulación intravascular diseminada

◦Heparina

•Prolongación aislada de tiempo de protrombina

◦Deficiencia de FVII

•Prolongación del tiempo de trombina

◦Heparina

◦Hipofibrinogenemia/disfibrinogenemia

◦Coagulación intravascular diseminada

◦Hepatopatía

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◦Tratamiento fibrinolítico

•Pruebas sistemáticas normales con antecedentes hemorrágicos

•Sospecha de deficiencia de FXIII

•Sospecha de deficiencia de a 2 –antiplasmina.

ÁREA DE HEMATOLOGIA Y COAGULACION

En el área de hematología se realizan estudios hematológicos cualitativos, cuantitativos y morfológicos. En esta área, el hemograma o cuadro hemático es una de las pruebas más solicitadas y realizadas. Con el fin de brindar este servicio nuestro Laboratorio Clínico cuenta con auto analizadores de última generación que le permiten al médico contar con nuevos parámetros, convirtiéndose en una herramienta de rutina que permite una mayor utilidad clínica, con mayor exactitud, precisión y costo razonable. Se procesan cuadros hemáticos en equipos de avanzada tecnología, reportando de 18 a 21 parámetros acompañados de sus histogramas y disperso gramas.

Por otro lado, en el área de coagulación se procesan pruebas rutinarias como tiempo de protrombina (PT), tiempo parcial de tromboplastinas (PTT). También se realizan estudios más especializados para el diagnóstico de los trastornos hemorrágicos y trombocitos. Contamos con los siguientes equipos para la realización de las pruebas que hacen parte de esta área:

HEMATOLOGIA TIEMPO MUESTRA

BIOMETRIA HEMATICA COMPLETA CON PLAQUETAS

1 DIA SANGRE TOTAL

COOMBS DIRECTO 1 DIA SANGRE TOTAL

COOMBS INDIRECTO 1 DIA SUERO

FIBRINOGENO 2 DIAS PLASMA

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GRUPO SANGUINEO Y FACTOR RH 1 DIA SANGRE TOTAL

PLAQUETAS 1 DIA SANGRE TOTAL

RETICULOCITOS 1 DIA SANGRE TOTAL

RETRACCION DEL COAGULO 1 DIA SANGRE TOTAL

TIEMPO DE SANGRADO 1 DIA SANGRE TOTAL

TIEMPO DE COAGULACION 1 DIA SANGRE TOTAL

TIEMPO DE PROTROMBINA (T.P) 1 DIA PLASMA

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (T.P.T)

1 DIA PLASMA

TIEMPO DE TROMBINA ( T.T ) 2 DIAS PLASMA

VEL.DE SED.GLOBULAR 1 DIA SANGRE TOTAL

LOS 5 TIPOS DE EXAMENES DE SANGRE MÁS FRECUENTES

1. Hematología completa o conteo sanguíneo completo (CBC): Una de las pruebas de sangre más frecuentes, como parte de un chequeo de rutina. Determina la cantidad y forma de los glóbulos rojos, los glóbulos blancos, las plaquetas, la hemoglobina, el volumen corpuscular media, ayudando a detectar enfermedades de la sangre, como la anemia, infecciones, problemas de coagulación, cáncer de la sangre y trastornos del sistema inmunológico.

2. Química sanguínea o panel metabólico básico (BMP): Mide diferentes sustancias químicas en la sangre, en esta prueba se utiliza el plasma sanguíneo y brinda información sobre los músculos (incluyendo el corazón), los huesos, los riñones y el hígado, ya que incluye las pruebas que miden la glucosa en la sangre, el calcio, los electrolitos y además de las pruebas de función renal.

3. Análisis de enzimas sanguíneas: Estas ayudan a controlar las reacciones químicas en el cuerpo y se centra en las pruebas de

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enzimas sanguíneas que se utilizan para ayudar al diagnostico de un ataque al corazón. Estas pruebas incluyen la troponina y la creatin -quinasa CK-MB

4. Examen de sangre para el riesgo de las enfermedades cardiacas: Para analizar las sustancias en la sangre que transportan el colesterol. El panel de lipoproteína mide los niveles de colesterol total de colesterol LDL, el colesterol HDL y triglicéridos en su sangre. Los niveles anormales de colesterol o triglicéridos pueden ser signos de un mayor riesgo de cardiopatía coronaria.

5. Pruebas de coagulación de la sangre: Los resultados anormales pueden sugerir un riesgo de sangrado o de formación de coágulos en los vasos sanguíneos. Son utilizadas para diagnosticar los trastornos en la coagulación o para controlar a las personas que están tomando medicamentos para disminuir el riesgo de coágulos de sangre (Warfarina y la Heparina).

EXAMENES HEMATOLOGICOS

I - Sangre, Hematología

Células del lupus, cada muestra de coagulación, tiempo del coagulo, tiempo de retracción del coagulo

Tiempo de lisis del coombs directo, test de coombs indirecto

Prueba de cuerpos de Heinz

Deshidrogenasa Glucosa -6- fosfato en eritrocitos

Deshidrogenasa -6- fosfogluconato en eritrocitos

Ferritina

Fibrinógeno, productos de degradación del fierro sérico fierro, capacidad de fijación (incluye fierro sérico fierro), cinética del (cada

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determinación fierro, prueba de sobrecarga grupos sanguíneos ABO y RHO (incluye estudio de factor du en RH negativos)

Hematocrito

Hemoglobina en sangre total

Hemoglobina Glicosilada

Hemoglobina, electroforesis de (incluye HB. total)

Hemograma (incluye recuentos de leucocitos y eritrocitos, hemoglobina, hematocrito, formula leucocitaria, características de los elementos figurados y velocidad de eritrosedimentación)

Protrombina, tiempo de o consumo de (incluye INR, relación internacional normalizada)

Recuentos de eosinofilos (absoluto)

Recuentos de eritrocitos, absoluto (Proc. Aut.)

Recuentos de leucocitos, absoluto (Proc. Aut.)

Recuentos de linfocitos (absoluto)

Recuentos de plaquetas (absoluto)

Recuento de reticulocitos

Recuento diferencial o formula leucocitaria

Sangría, tiempo de (IVY)

Sobrevida del eritrocito

Subgrupo ABO y RH fenotipo - genotipo RH c/u

Transferrina

Tromboplastina, tiempo de generación de (TGT)

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Velocidad de eritrosedimentación

Vitamina B12, Absorción.

VALORES HEMATOLOGICOS NORMALES

Hemostasia:

Plaquetas: 150 - 450

Tiempo sangría: 3 - 9min

Tiempo protrombina: 13 - 14 seg (vía extrínseca)

Tiempo tromboplastina: 35 - 45 seg (vía intrínseca)

Tiempo trombina: 10 - 12 seg (vía común)

Test reptil asé: 17 - 19 seg.

Fibrinógeno: 2 - 4 g/l

PDF< 10 mg/l

Hematimetría:

Hematíes: 4.5 - 6.5 millones (hombre), 3.9 - 4.6 (mujer)

Hto: 40 - 54% (hombre), 35 - 47 (mujer)

Hb: 13 -18 g/l (hombre), 11.4 - 16.5 (mujer)

HCM: 27 - 32 pg.

VCM: 76 - 96

CHCM: 31 - 35

Reticulocitos: 0.5 - 2 %

Leucocitos: 4.000 - 8.000, Neutrofilos: 40 - 75 %, Linfocitos: 20 - 45 %, Monocitos: 2 - 10 %, Eosinófilos: 1 - 6 %, Basófilos: 0 - 1 %

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HbA2: 1.5 - 3.5 %

HbF: <2 %

Plaquetas: 150 - 400 mil.

Plasma:

Na+ .......................................136 - 148 mol/l ...............,.........70 - 105 mg/dl

K+....................................... 3.6 - 5 ""

Cl+ ........................................95 - 105 ""

CO3H- ..................................24 - 32 ""

PO4H- .................................0.8 - 1.1 ""

Ca++. ...................................2.12 - 2.61 "" ................................4.2 - 5.3 mEq/l..............8.8 - 10.5 mg/dl

Mg++...................................0.7 - 1.0 "" ....................................1.6 - 2.6 mg/dl

Zn++....................................8 - 20 mcmol/l

Fe++,+++................................85-170 gr/dl (hombre), 65-155 gr/dl (mujer)

Ferritina...............................15-200 ngr/dl

Glucosa................................2.5 - 4.7 mol/l ...........................70 - 105 mg/dl

Creatinina ...........................62 - 124 mol/l ...............................0.7 - 1.3 mg/dl

Albúmina ............................3.5 - 5 g/dl

Colesterol (HDL)...................35 - 65 mg/dl, LDL........................100 - 180 mg/dl

Amilasa ................................70 - 300 UI/l

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CPK......................................25 - 145 mUI/ml, MB (normal < 6 %), MM (normal 94 -100 % %)

Fosfatasa alcalina .............10 - 95 UI/l

Osmolalidad........................285 - 295 mosm/kg de agua

Osmolaridad........................278 - 298 mOsm/kg.

HEMATOLOGÍA

Coagulación

Hemodilución Hipervolémica

Hemodilución Normovolémica

Sustitución Componentes Sanguíneos

Valores Hematológicos normales.

COAGULACION

Factores de la Coagulación:

Factores de la Coagulación

Factor Nombre Factor Duración de la Vida Media

I Fibrinógeno 4 a 5 días

II Protrombina 3 días

III Tromboplastina Tisular

IV Calcio

V Proacelerina, F. Labil 1 día

VII Proconvertina, F. Estable 4 a 6 horas

VIII F. Antihemofílico A 12 a 18 horas

vW Factor von Willebrand 12 a 18 horas

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IX F. Antihemofílico B, F. Christmas 18 a 24 horas

X Factor Stuart 1 a 2 horas

XI Precursor de la tromboplastina plasmática 2 a 3 horas

XII Factor Hagemann, F. de contacto 2 horas

XIII F. Estabilizante de la fibrina días

Fisiología de la Coagulación:

Laboratorio:

APTT (Tiempo Parcial de Tromboplastina activada) (Vía Intrínseca):

Normal 25-34 seg.

F II, V, VIII, IX, X, XI, XII C(excepto F VII) (Vía extrínseca).

en déficit o inhibición de factores (II, V, VIII, IX, X, XI, XII), déficit vit K, anticumarínicos, heparina, hemofilia A y B.

Quick / TP (Tiempo Protrombina ó Tiempo de Tromboplastina) (Vía extrínseca)

Normal: 11.5-13.5 seg (70-100 %)

F II, V, VII, IX, X

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Para prueba del sistema extrínseco y del tratamiento anticoagulante.

en déficit de factores (II, V, VII, IX, X), déficit vit K, anticoagulantes dicumarínicos, hepatopatías, CID.

ACT (Tiempo Coagulación Activado):

Normal 120-150 Seg, rango terapéutico: 350 seg.

Para chequeo de la terapia con heparina.

Tiempo de Hemorragia (tiempo de sangría):

IVY (1 - 9 min), DUKE (1 - 4 min).

Normal 2-6 ' (Chequeo de la función paquetearía)

Patológico > 10 minutos.

trombocito peña, CID, púrpura, enf. de von Willebrand, trat. con aspirina.

TT (Tiempo trombina):

Normal 13-18'',

Para chequeo de la terapia con heparina.

heparinización. CID, afibrinogemia.

Fibrinógeno:

Normal 1.5 - 4.5 g/l, 150 - 450 mg %

afibrinogenemia, CID, infecciones.

Productos de degradación del Fibrinógeno (PDF)

Normal < 10 mg/l

Tiempo de Reptilase(vía común)

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Normal < 22 seg. ;

en la CIDen la heparinización.

Plaquetas

150.000 - 400.000/mm3

Diagnóstico de la coagulopatía:

1. Anamnesis

2. Pruebas de Laboratorio si la Anamnesis es positiva:

PTTQ (TP)

PlaquetasTiempo de Hemorragia

T. Reptilase

T. Cefalina

Fibrinógeno

Enfermedad Hepática

+/= + -/= = + ++ -

Warfarina =/+ ++ = + = ++ =

Trombocito peña

= = - +++ = = =

Aspirina = = = + = = =

Heparina + +/= = = = ++ =

Hemofilia + = = = = ++ =

von Willebrand + = = +++ = + =

CID. Enfermedad Hepática Severa

+/= ++ -- ++ ++ ++ --

Transfusión Masiva

+ - - + = ++

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Drogas:

Heparina

Dosis: bolus 5'000 UI, mujer 300 (hombre 400) UI/kg /24 hrs.

En cirugía vascular, en el postoperatorio dependiendo el tipo de cirugía: 10'000 UI/24 h.

Antídoto: Portaminas UI = 1.5 x dosis UI de Heparina, en infusión lenta.

Efectos:

1. Alergia Tipo I

2. Caída presión sanguínea (Depresión miocárdica)

3. Hipertonía arterial pulmonar

Warfarina

Antagonista de la vitamina K

Bloquea la formación de los Factores II, VII, IX, X

Antídoto: Vit

Ácido Acetilsalicílico

Inhibidor irreversible de la ciclo-oxigenas; vida del trombocito 7 días

Monitorización

Tiempo de sangría:

2 días después de la retirada, significante mejora.

4 días después de la retirada, alcanzada la línea basal.

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Capacidad de agregación:

4 días después de la retirada, normal a 100 mg/día.

7 días después de la retirada, normal a 300 mg/día.

Ácido Tranexámico

Inhibidor de la actividad del plasminógeno (antifibrinolítico)

Son necesarios niveles de actividad de 5 - 10 g/ml

Dosis: 10gr (= 20 Amp de 0.5 gr) ácido tranexámico en 250 ml NaCl en 30 min. (Inerve. Cardiacas).

Momento: 20 min antes del comienzo de la intervención.

No se han observado interferencias con los test de ACT.

Aprotinina (Trasylol)

Formando parte de mecanismos todavía desconocidos (inhibición de la trombina y plasmina), la Aprotinina con su conexión a los desórdenes del coágulo puede reducir la pérdida de sangre, y respectivamente, la necesidad de una transfusión sanguínea.

Dosis: (Intervenciones cardiacas)

Inicial: (= 280 mg) durante la apertura del tórax en 20 min.

Después: hasta el final de la operación 500 000 E/h Aprotinina

El control de de la acción de la heparina por medio del ACT con la aprotinina no es fiable. La Aprotinina trabaja sinérgicamente con la heparina pero puede causar resistencia a la heparina. Durante el bypass, la ACT el valor debe estar por lo menos en 750 seg.

Antitrombina III

De acuerdo con las pruebas de coagulación (Disponible 24 h/d)

Adultos: Comenzar con 2'500 UI

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Plasma Fresco Congelado

Una bolsa aumenta el T. de Quick en un 5 % (1 UI/kg KG aumenta el T de Quick en un 2% y los factores en un 1%)

Incremento factores de la coagulación 2-3 %

Volumen: 250 +/- 50 ml. Atención: No calentarlo por encima de los 38º C

Fibrinógeno

Pool de concentrado de fibrinógeno, 1 Botella = 1g ( en 50 ml: 20 mg/ml)

HBs-Ag y Anti-HIV negativo

Para aumentar el nivel a 1 g/l: 3 - 4 g Fibrinógeno

Factor VII

Dosis (de acuerdo con las pruebas), comenzar con 600 UI

Factor VIII

Frascos con 200 o 500 UI

Dosificación para la hemofilia A (iv, máximo 4 ml/min):

Dosis en UI = kg KG x incremento factor requerido % x 0.5 o:

Sangrado Intervención Dosis Duración

Bajo

Hemorragia espontanea de articulaciones

Sangrado de nariz bajo

Sangrado suave de otras partes

10 -15 UI/kg

A menudo basta con una dosis

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Medio

Hemartrosis completa

Sangrado en antebrazo/pantorrilla

Sangrado del psoas

Extracción dentaria

15 - 35 UI/kg

Repetir la mitad de la dosis inicial cada 8 - 12 h en 3 - 4 días

Severo

Sangrado por una lesión

Preparación para operaciones

Sangrado intracraneal

Sangrado gastrointestinal (incluyendo faringe y lengua)

35 - 50 UI/kg

Repetir la mitad de la dosis inicial cada 8 - 12 horas

Factor IX

Factor IX (Complejo SRK):

Incluyendo: F. II, VII, IX, X. 200/500/1000 IU por frasco

Dosificación para la hemofilia B:

Dosis en UI = kg KG x incremento factor requerido % o:

Sangrado Intervención Dosis Duración

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Bajo

Hemorragia espontanea de articulaciones

Sangrado de nariz bajo

Sangrado suave de otras partes

10 -25 UI/kg

A menudo basta con una dosis

Medio

Hemartrosis completa Sangrado en antebrazo/pantorrilla.

Sangrado del psoas Extracción dentaria

15 - 35 UI/kg

Repetir la mitad de la dosis inicial cada 8 - 12 h asta la curación

Severo

Sangrado por una lesión

Preparación para operaciones

Sangrado intracraneal Sangrado gastrointestinal (incluyendo faringe y lengua)

Consultar Consultar

Hemodilución Hipervolémica

Utilizar:

Dextrano 40 7.5 ml/kg y Ringer L 7.5 ml/kg en 30 min. Como alternativa Dextrano 70 8 - 12 ml/kg o Expafusin 10 - 15

ml/kg en 30 a 60 min.

Hemodilución Normovolémica

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1º) Volumen extraíble:

(Fórmula de Dubousset) VE = Peso/13 x [Hto inicial-Hto final/(Hto inicial + Hto final)/2]

(Fórmula de Bourke simplificada) (MS) (Hto inicial - Hto final) [3 - (Hto inicial - Hto final)/2], donde:

MS = masa sanguínea en litros, Hti y Htf expresados en decimales (para un 45 % es 0.45)

La MS se determina por la fórmula de Allen:

MS = (0.417 x T3+ 0.045 x P) - 0.03 para el hombre

MS = (0.414 x T3+ 0.0328 x P) - 0.03 para la mujer. P = peso en Kg, T = talla en m

Al volumen extraíble restar un 25 % y un 20 % más para seguridad

Extraer 450 ml de sangre en 10 - 15 min

Añadir a la bolsa de sangre (de 400 a 500 cc) 63 cc de CPD.

2º) Relleno o reemplazamiento:

a) Si se utilizan cristaloides reemplazar del 300 al 400 % del volumen extraído.

b) Si se utilizan coloides pasar de un 20 a un 50 % más del volumen extraído (normalmente de un 20 a 25 %):

-- Gelatinas y dextranos 40, pasar el mismo volumen que en la hemodilución durante las siguientes 24 horas.

-- Hidroxietilalmidón de bajo PM, limitado a 1.5 - 2 gr/kg-1/día-1mas lejos de esta cantidad utilizar gelatinas.

Etiquetar las bolsas con todos los datos.

Almacenarlas a 4º C. Es preferible utilizarlas antes de 4 horas.

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BIOMETRIA HEMATICA.

La biometría hemática es un estudio de los elementos que conforman la sangre, tanto los celulares como los sólidos presentes en el plasma, este ensayo sirve para determinar las alteraciones tanto cuantitativas (anemias, policitemias, leucocitosis, leucopenias), como cualitativas de los elementos formes de la sangre.

En DiagSA las muestras sanguíneas son procesadas utilizando un contador automatizado CoulterAcT-Diff, del que se obtiene el hemograma, para posteriormente ser teñidas con una tinción de MayGrunwald-Giemsa, para su análisis microscópico. Esto junto con algunos otros procedimientos, nos permite reportarle hasta 20 parámetros que le ayudaran a usted en su diagnóstico.

Los analitos que reportamos en la biometría hemática son:

Hematocrito Plaquetas Neutrófilos en Banda

Hemoglobina Fibrinógeno Eosinófilos

Velocidad de Sedimentación Relación Proteínas: Fibrinógeno Basófilos

Eritrocitos Leucocitos Mielocitos

Volumen globular Linfocitos Meta mielocitos y

C.M.H.C. Monocitos Células indiferenciadas

Sólidos totales Neutrófilos Segmentados

Al final del informe en la sección Comentarios, le reportaremos en su caso las características observadas en los eritrocitos, como por ejemplo: tamaño, forma, color., así como de la línea leucocitaria le reportaremos las anormalidades presentes en la muestra.

Los valores de referencia que se reportan corresponden a la especie en cuestión (caninos, felinos, equinos), y sirven de base para que con los valores obtenidos y la Historia Clínica del paciente, el Médico

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Veterinario concrete un Diagnóstico Diferencial a fin dar el tratamiento más adecuado o sugerir se realicen estudios complementarios.

Para el envío de este tipo de muestras se requiere sangre en un tubo adicionado con EDTA (tubo de tapón lila), el volumen mínimo necesario es de 2mL, debe evitarse el que la sangre forme coágulos. Para su correcta preservación la muestra debe ser refrigerada (entre 2 ºC y 8ºC) durante su almacenamiento y transporte.

Este tipo de muestra también es útil para otros estudios como: Búsqueda de Hemoparásitos Celulares, Conteo de Reticulocitos, Determinación de Fibrinógeno, Cuenta celular.

PRUEBAS DE COAGULACION

Estas pruebas junto con la determinación del número de plaquetas son de gran ayuda en los cuadros hemorrágicos de los animales.

En las intoxicaciones con cumarínicos (relentecidas), la valoración del tiempo de protrombina, y del tiempo parcial de protrombina, es mandataria para determinar tanto la presencia de estos tóxicos, como la efectividad del tratamiento administrado.

Las muestras de sangre para estos estudios deben remitirse ya sea en un tubo de plástico usando EDTA como anticoagulante si se trata de muestras para conteo plaquetario, o bien usando ACD (Ácido Citrato Dextrosa) como anticoagulante (tubos de tapón azul), cuando se trata de determinar los tiempos de coagulación.

El ACD debe ser usado en una relación 1:9 con el volumen de sangre tomado.

Por ejemplo 0.2mL de ACD para 1.8mL de sangre completa.

Para estas pruebas se requiere un volumen mínimo de 2mL, debe evitarse el que la sangre forme coágulos. La muestra debe ser mantenida en refrigeración (entre 2 ºC y 8ºC), durante su almacenamiento y transporte.

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Estas muestras deben procesarse en las siguientes 4 horas a su toma.

Fundamentación Teórica:

Es una prueba de detección básica y constituye la técnica de laboratorio que se pide con más frecuencia.

Los datos que proporciona constituyen información diagnóstica muy valiosa sobre el sistema hematológico y otros aparatos del cuerpo, pronóstico, respuesta al tratamiento y recuperación.

Consta de una serie de pruebas que determinan el número, variedad, porcentaje, concentración y calidad de las células sanguíneas.

Preparación del paciente:

1.- Evitar la tensión todo lo posible debido a que las alteraciones fisiológicas cambian los valores.

2.- Tanto la deshidratación como la sobre hidratación alteran en forma considerable los valores.

3.- No es necesario el ayuno, sin embargo los alimentos con un alto contenido en grasas alteran los resultados.

PUNCIÓN CAPILAR

Fundamento teórico:

Para tomar una muestra en forma adecuada se necesita la técnica correcta y el momento preciso en caso necesario.

Cuando se necesita un frotis de sangre periférica, se prefiere la sangre capilar.

Metodología:

1.- Tome la muestra de las yemas de los dedos o lóbulo de la oreja (adultos); del dedo pulgar del pie o del tobillo (en lactantes).

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2.- Desinfecte el sitio de la punción, séquelo y puncione la piel con una lanceta estéril que no debe penetrar más de 2 mm; si se utiliza isodine. Permita que se seque completamente.

3.- Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un micro tubo y prepare las laminillas con esa muestra.

Recomendaciones:

No oprima el sitio de la punción para obtener sangre porque se altera la composición hepática o invalida los resultados.

Muchas veces se facilita la toma e muestra si se calienta la extremidad o se coloca en postura colgante.

Preparación del cliente:

Instruya al paciente sobre el propósito y la técnica de su prueba.

Cuidado del paciente después de la prueba:

Aplique una pequeña curación o cinta adhesiva sobre el sitio de la punción, si bien hay que verificar presencia de hemorragia. De haberla, presione; en caso de que persista el sangrado, busque en los antecedentes del paciente si ha sido sometido a un tratamiento con anticoagulantes (aspirina).

PUNCION VENOSA


La punción venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas necesarias. Las venas de elección suelen ser las de la cara anterior del antebrazo porque resulta fácil acceder a ellas. Las cifras hepáticas permanecen constantes no obstante el sitio seleccionado para obtener la punción venosa.

Metodología:

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1.- Coloque un torniquete en la parte superior del brazo para producir congestión venosa.

2.- Pida al paciente que abra y cierre el brazo y cierre el puño varias veces. Escoja una vena accesible.

3.- Limpie el sitio de punción y séquelo con una gasa estéril. El isodine debe secarse.

4.- Puncione la vena según la técnica explicada por la maestra. En el adulto, las agujas de calibre 21 más o menos dificultan la extracción de sangre.

5.- Una vez que penetra en la vena, la sangre llena los tubos aspiradores automáticamente por la presión negativa dentro del tubo.

6.- Retire el torniquete antes de extraer la aguja o se producirá una hemorragia.

7.- Extraiga la aguja y aplique presión y una cinta adhesiva estéril en el sitio de la punción.

8.- El conservador o anticoagulante que se añade al tubo depende de la prueba.

Importante:

Para la mayoría de las pruebas hematológicas se utiliza como anticoagulante el ácido etilendiaminotetracético (EDTA) o edético. Es necesario colocar la cantidad adecuada del anticoagulante, ya que la mayoría de las pruebas se invalidan con sangre muy poco coagulada.

Preparación del paciente:

1.- Instruya al paciente sobre la técnica para tomar la muestra. Valore la existencia de problemas hemorrágicos o de circulación o alergias en látex.

2.- Avisar al paciente que al introducir la aguja sentirá dolor.

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3.- Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba.

4.- Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con toallas húmedas y calientes o con cobijas, además se debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios minutos antes de realizar la punción.

Cuidados después de la prueba:

No extraiga sangre de la misma extremidad utilizada para la administración intravenosa de medicamentos, líquidos o transfusiones.

La punción venosa causa infección, alteraciones, o retraso en la cicatrización.

El torniquete prolongado provoca éxtasis y hemoconcentración.

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA (HB)

Fundamento:

Es una proteína conjugada de color rojo integrantes de los eritrocitos entre un 31-34%.

Existen varios métodos para determinación como hematina ácida, hematina alcalina, oxihemoglobina, car oxihemoglobina y cian metahemoglobina; éste último es el de elección por que es estable en soluciones diluidas, porque existen en el mercado estándares de cian metahemoglobina y porque las lecturas se pueden hacer en espectrofotómetro de uso común y corriente.

La sangre se hemoliza por agregado de un agente desactivo, con el ferrocianuro de potasio se oxidan el átomo de fierro de ferroso a férrico para producir metahemoglobina. El cianuro de potasio estabiliza la metahemoglobina pasando de cian metahemoglobina. La cloración producida es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina presente.

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Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100 ml

Pipetas de 1ml

Pipetas de Salí

Boquillas

Gradillas

Gasa

Celdas para espectrofotómetro

Sangre capilar o venosa con anticoagulante.

Reactivos:

EDTA al 10 % (.07 ml por .5 ml de sangre)

Reactivo DE Drabkin:

-ferrocianuro de potasio

-cianuro de potasio

-bicarbonato de potasio

Solución estándar de cian metahemoglobina.

Procedimiento:

1.- Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de reactivo de Drabkin

2.- Homogeneizar bien la sangre

3.- Llenar en sangre hasta la marca de la pipeta de Sahli

4.-Mezclar la sangre con el disolvente

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5.- Dejar Reposar 10 min. Para la formación de cian metahemoglobina

6.- leer a 540 nanómetros en el espectrofotómetro contra un blanco de reactivo.

7.- comparar con la curva calibrada de estándares.

Valores de referencia:

Mujeres: 12 -14 gr/dl

Mujeres embarazadas: 11-14 gr/dl

Hombres: 13-19gr/dl

Recién nacidos: 13.19gr/d

DETERMINACIÓN DEL HEMATOCRITO

Es sencillo y exacto y es importante para determinar los índices eritrocitarios

Fundamento:

El hematocrito mide el porcentaje del volumen de sangre total pero ocupada solamente por los eritrocitos

Material (macro hematocrito)

Tubo de Wintrobe que tiene 11.5 cm de largo x 3 mm de luz (hueco). Para el micro se usa el tubo capilar)

Pipeta Pasteur larga o pipeta para llenado de hematocrito

Centrífuga

Sangre capilar (micro) o venosa (macro) con anticoagulante

Reactivos.

Procedimiento:

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1.- Homogeneizar perfectamente la sangre haciendo girar el tubo

2.- Utilizando la pipeta Pasteur se llena de sangre el tubo de Wintrobe exactamente hasta 10, no deben quedar burbujas de aire en el tubo

3.-Centrífuga a 3600 rev x min. Durante 30 min.

4.- Leer en la línea de separación de la columna de glóbulos rojos sabiendo que cada raya tiene 1%


H= 47 +- 2.5

M= 42+- 2.5

CUENTA ERITROCITARIA

Introducción:

Cuando la eritropoyesis tiene lugar normalmente, su resultado final es la producción de una célula-eritrocito perfectamente diferenciada y apta para su función principal que es la de transportar oxígeno y CO2 . La falta de núcleo le confiere la virtud de acarrear el oxígeno sin consumir prácticamente nada de él; su forma bicóncava es la que mejor se presta para afrontar la hemólisis; su membrana no admite la salida de hemoglobina.


Consiste en diluir la sangre con el líquido de Hayem en una proporción exacta y luego examinar al microscopio una pequeña cantidad de la muestra colocada en la cámara de Neubauer, contando el número de elementos que se encuentran en el retículo de la cámara y mediante una operación matemática se obtiene la cifra total.

Material:

Tubos de ensayo de 13x100mm

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Pipetas de Thomas para glóbulos rojos

Cámara de Neubauer

Boquillas

Microscopio

Gasa

Gradilla

Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Cámara de Neubauer

La que más se utiliza es la de Neubauer que presenta un retículo con una superficie total de 9mm2 dividida en 9 cuadros de 1mm2 los cuatro cuadros grandes de los extremos son los que usualmente se emplean para contar leucocitos. De los 9 cuadros centrales grandes el central es el único dividido en 25 cuadros.

Reactivos:

EDTA (sal di sódica) al 10%

Líquido de Hayem:

Cloruro de mercurio 0.5 g

Cloruro de sodio 1.0g

Sulfato de sodio 5.0g

Agua destilada 100ml

Procedimiento:

Las pipetas están constituidas por dos porciones capilares y un bulbo central. El tubo capilar inferior está dividido en 10 partes iguales con marcos de0.5 y 1.0.

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En el interior del bulbo existe una perlita de plástico (roja), para favorecer la mezcla de la sangre con el líquido y en el capilar superior hay una marca 101.

1.- llenar con sangre bien mezclada la pipeta de Thoma, hasta la marca 0.5.

2.- se limpia cuidadosamente con gasa la parte externa de la pipeta.

3.- completar con líquido de Hayem hasta la marca 101.

4.- agitar durante 3 minutos para mezclar perfectamente.

5.- colocar el cubre hematímetro sobre la cámara.

6.- desechar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y llenar la cámara por uno de los bordes del cubre hematímetro.

7.- se deja que el líquidos penetre lentamente entre la cuadrícula y el cubre hematímetro hasta que la plataforma de recuento este completamente cubierto.

8.- dejar reposar de 3.5 minutos sobre la platina del microscopio.

9.- con objetivo de 40x se encuentra los eritrocitos contenidos en 80 cuadros pequeños; uno central y cuatro de los extremos.

Cálculos:

Si se considera que el retículo central tiene 400 cuadritos se realizará el siguiente cálculo.

N x 200 x 10 x 400 = N x 10,000

80

N= número de eritrocitos contados

200= factor de dilución

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10= corrección x altura de la cámara


Hombres 4.5 x 106 - 5.5 x 106 mm3

Mujeres 4.3 x 106 - 5.0 x 106 mm3

Índices eritrocitarios

Sirven para clasificar a los eritrocitos de acuerdo a su tamaño y contenido de hemoglobina

Se utiliza el hematocrito y la cuenta de eritrocitos para calcular los índices:

-VCM (Volumen Corpuscular Medio)

-CMHC (Concentración Media de la Hemoglobina Corpuscular)

-HCM (Hemoglobina Corpuscular Media)

Es posible medir de manera directa los índices eritrocitarios en contadores celulares automáticos. Por ejemplo: el coulter; al pasar los eritrocitos a través de un orificio en el cual fluye una corriente eléctrica.

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CUENTA LEUCOCITARIA

Introducción:

La leucopoyesis es un proceso que se lleva a cabo con gran actividad, ya que si el número de granulocitos circulantes de ninguna manera es comparable al de los eritrocitos, en cambio se estima que la sobrevida de los neutrófilos no excede de 5 días, de las cuales solo pasan 10 hrs. en la sangre circulante.

Fundamento:

La sangre se diluye 1:2 con una solución hipotónica de ácido acético que destruye a los eritrocitos.

El azul de metileno permite reconocer fácilmente el líquido y observar mejor los glóbulos blancos, a los que tiñe ligeramente

Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para corregir los resultados

Material:

Tubos de ensayo de 13 x 100mm

Pipeta de Thoma para glóbulos blancos

Cámara de Neubauer

Microscopio

Boquillas

Gasa

Sangre capilar o venosa con anticoagulante

Reactivos:

EDTA (sal disódica) al 10 %

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Liquido de Turk:

Ácido acético glacial 3.0 ml

Agua destilada c.b.p. 100 ml

Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno

Procedimiento

1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5

2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera

3.- Aforar con solución de Turk hasta la marca de II

4.- Agitar la pipeta durante 3 min.

5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la cámara de Neubauer

6.-Dejar reposar la cámara durante 3 min.

7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos presentes en los cuatro cuadros grandes de los extremos

8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente fórmula

Células contadas x 20 (dilución) x 10 (corrección de altura) /

4 (núm. De cuadro de 1mm contados)

Este factor varía si se cambia la dilución y o el número de cuadros contados

*En caso de existir normo lastos (eritrocitos nucleados) deberá hacer la cuenta diferencial leucocitaria


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Leucocitos:

-Adultos: 5000 - 10 000 / mm3

- Recién nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3

-Niños: 8000 - 15 000

*Cuenta diferencial leucocitaria

Fundamento:

Se realizará este proceso en caso de existir normo lastos (eritrocitos nucleados) en la cuenta leucocitaria

Por este proceso se podrá decir cuántosnormo lastos hay por cada 100 leucocitos. Ejemplo:

Si hay 28 normo lastos por cada 100 leucocitos se aplica la siguiente relación:

128 - 100

12000 -- x

x = 9375 leucocitos

La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del número de los distintos tipos de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la infección

Técnica:

La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos:

-neutrófilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene múltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro lóbulos nucleares.

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-eosinófilos: es redondo u ovalado, el núcleo posee no más de tres lóbulos y en el citoplasma se observa no más de 20 granos color naranja.

-basófilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro. Estos gránulos son hidrosolubles.

-linfocitos: Su citoplasma es azul pálido y la cromatina nuclear color púrpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma.

-monocitos: su núcleo suele ser arriñonado. Contiene una red de cromatina. El citoplasma se tiñe de un color azul grisáceo y contiene finas granulaciones color rosa.


Neutrófilos:

-en banda 0-11%

-segmentados 25-62%

Eosinófilos: 0-2%

Basófilos: 0-1%

Linfocitos: 25-40%

Monocitos: 3-12%

*Tinción de Wright

Fundamento:

La tinción de Wright es una tinción de tipo Romanowsky.

Es extremadamente importante en el laboratorio de hematología este tipo de tinción, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de información a partir del examen de un frotis de sangre periférica bien teñido

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Una tinción de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y o eosina B

La acción combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a los gránulos neutrofílicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y

Las propiedades de tinción de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras químicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de ácidos nucleídos, las proteínas de los núcleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante básico

La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.

Material:

Frotis sanguíneo

Agua destilada

Eosina B

Eosina Y

Azul de metileno

Alcohol metílico

Procedimiento:

1.- Hacer un frotis sanguíneo, ni demasiado delgado, ni que llegue al extremo del portaobjetos

2.- Fijar el frotis con alcohol metílico y dejar secar

3.- Sumergir el portaobjetos en el hemoclorante 1, durante 5 o 6 segundos

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4.- Lavar con Buffer 7.2 y sacudir para eliminar exceso

5.- Sumergir por 6-8 segundos en el hemoclorante 2

6.- Lavar con buffer 7.2 y dejar secar

7.- Observar al microscopio

CUENTA PAQUETARIA

Fundamento:

Las plaquetas son fragmentos de una célula llamada megacariocito, se encuentran unas 250 mil x mm3, su vida media es de 9.5 días, sus funciones principales son: coagulación y mantener la integridad de las paredes de los vasos.

Miden de 3-4 micras de diámetro, son redondeadas, se pueden observar con una tinción azul de crisil brillante, no tienen núcleo; el número de plaquetas es el resultado el equilibrio entre el numero de plaquetas producidas en la médula ósea y las utilizadas, también de la pérdida o destrucción de la sangre periférica.

Material:

Sangre venosa con EDTA al 10%

Tubo de ensayo de 13 x 100ml

Pipeta de Thomas para glóbulos rojos

Cámara de Neubauer

Caja de petri

Gradilla

Reactivos:

Colorante de azul de cresil brillante

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EDTA al 10 %

Procedimiento:

1.- Asepsia y obtención de la muestra Adultos o niños:

La sangre se extrae de una vena (punción venosa), usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico y luego se coloca un torniquete.

-Bebés o niños pequeños:

En los bebés o niños pequeños, el área se limpia con un antiséptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta.

2.-Descargar la pipeta en el líquido diluyente

3.-Enjuagar y llenar hasta la marca 1 y con la , muestra de sangre hasta 1.1

4.-Mezclar de 3-5 minutos

5.-Tirar las primeras 3-5 gotas

6.-cargar la cámara cuenta glóbulos

7.- dejar reposar 5 minutos, en una caja petri con un papel filtro húmedo

8.- Dejar reposar la cámara

9.- observar por le objetivo 10x

10.- las plaquetas aparecen como cuerpos coloreados en todo el cuadro central.

Cálculo:

Numero de plaquetas contadas x 1000

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150 mil- 450 mil /mm3

Cuidados durante el examen:

Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras sólo sienten un pinchazo o sensación de picadura. Después, puede haber una sensación pulsátil.

El conteo plaquetario se puede ver afectado por muchos estados patológicos. Igualmente, se puede medir para evaluar la causa de un sangrado excesivo.

Entre los medicamentos que pueden disminuir el conteo de plaquetas están: agentes quimioterapéuticos, cloranfenicol, colchicina, agentes bloqueadores H2, heparina, hidralacina, indometacina, isoniacida, quinolina, estreptomicina, sulfonamida, diuréticos tiazídicos y tolbutamina.

ANTICOAGULANTE


Los anticoagulantes son medios que actúan como bloqueantes de la coagulación o bien de la agregación de plaquetas.

Se utilizan para romper el trombo o bien para prevenir que los trombos se repitan. La heparina alarga el tiempo de coagulación. S e administra mediante inyección subcutánea, pero también hay otros grupos que se toman por vía oral.

En éstos grupos de medicamentos debe hacerse un control de tiempo de coagulación para evitar un exceso de actividad y como consecuencia la aparición de hemorragias.

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Hay dos sales: cálcica y sódica. La cálcica se usan vía subcutánea, pero los dos se pueden usas endovenosas. La heparina se utiliza cuando es preciso. La acción de anticoagulantes es rápida y de poco tiempo. En el manejo de la acción anticoagulante prolongada se utiliza acecumorol.

Se han utilizado diversas medicaciones como anticoagulantes paqueterías, la aspirina y medicamentos vasodilatadores, como el dipridamol, ambos tienen un mecanismo diferente de acción y pueden asociarse para obtener una sinergia de acción.

TIPOS DE TUBOS CON ANTICOAGULANTES

EDTA (C10H6N2O8):Etilendiaminotetraacético o sal disódica, di potásica. Actúa mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++) impidiendo la coagulación de la sangre. Se utiliza para: recuentos celulares (hematíes, leucocitos y plaquetas), hematocrito, concentración de hemoglobina ([Hb]), frotis sanguíneos (utilizados para la determinación de la formula leucocitaria u observación de la morfología de hematíes, leucocito,…).

CITRATO TRISÓDICO (C6H5O7Na3): Se une al calcio (Ca++) evitando así la coagulación sanguínea, provoca que desaparezcan los iones de calcio del plasma. Se utiliza para: la velocidad de sedimentación globular (VSG) en proporción 1/4, las pruebas de coagulación en proporción 1/9.

OXALATOS: Son menos comunes, se usan para la determinación de la glucosa. La sangre debe mezclar inmediatamente con el anticoagulante, para ello se invierte suavemente el tubo varias veces hasta obtener

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una mezcla homogénea, también podemos utilizar rotores especiales.

HEPARINA SÓDICA/ HEPARINA LITIO: Impide que la protrombina se transforme en trombina. Se utiliza para: estudios de bioquímicas en urgencias (heparina con litio), estudios de linfocitos (heparina sódica). No se recomienda utilizar muestras con heparina para realizar frotis para la tinción de panóptico. La sangre total heparinizada se utiliza para transfusiones de gran volumen en cirugía cardiaca. La heparina no tiene efecto conservador por ello la sangre tratada con este anticoagulante de ser usada antes de 48h desde su extracción.

ACD: El anticoagulante es el citrato, la dextrosa y la adenia ayudan a mantener los procesos metabólicos de los eritrocitos (formación de ATP). Se usa en proporción 1/4, para estudios metabólicos.

CPD-A: El anticoagulante es el citrato, el fosfato retrasa la disminución de los niveles de 2,3 DPG de los hematíes, la dextrosa y la adenina ayudan a mantener los procesos metabólicos de los eritrocitos (formación de ATP). Se utiliza en el banco de sangre para conservar las unidades de sangre.

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CAPITULO IIPruebas de Serologia

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LA SEROLOGIA

Es el estudio que permite comprobar la presencia de anticuerpos en sangre. Es una prueba fundamental a la hora de realizar donaciones de sangre y transfusiones. Este se basa en un examen serológico, que tiene como fin el conocer la exposición o presencia previa de un microorganismo patógeno en particular y a partir de ella la capacidad de respuesta del individuo a tal infección. Para ello se debe tomar una muestra de sangre en volumen apropiado según la técnica que se emplee (ELISA, IFI, Western blot, IHA, etc.). Se puede usar la sangre total o tomar solo el suero, el cual se obtiene luego de centrifugar la sangre previamente coagulada, para eliminar las células sanguíneas de la reacción.

Este examen se realiza también para descartar sospechas sobre alguna infección, si se encuentran razones para pronosticar una enfermedad existente, el examen se puede repetir a las dos semanas de la primera toma de muestra sanguínea. La serología permite detectar infecciones o qué tanto el individuo es inmune a una infección o enfermedad específica.

OBJETIVO:

Identificación de problemas de salud. Determinación de la distribución de una enfermedad. Conocer los diferentes procedimientos que se llevan a

cabo en el área de serología.

LAS ENFERMEDADES DETECTABLES CON LA SEROLOGIA SON LAS SIGUIENTES

Sarampión, rubéola, carbunco, SIDA, hepatitis viral, brucelosis, amebiasis, infección nicótica, VSR, tularemia, sífilis, toxoplasmosis y una variedad de enfermedades más.

LAS TÉCNICAS DE SEROLOGÍA

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Los diferentes test serológicos aprovechan una serie de fenómenos fisiológicos como son el sistema de complemento, las reacciones entre anticuerpo y antígeno, la precipitación y la aglutinación.

Los sistemas más importantes aprovechados para estas pruebas son:

a) El sistema de complemento

El sistema o la cascada de complemento consiste en veinte proteínas séricas algunas de ellas termolábiles. La formación de un complejo de antígeno y anticuerpo activa este sistema de proteínas que interacciona de forma secuencial. Su activación resulta en una reacción con las membranas de células que puede causar bien su activación, la alteración de su estructura o su destrucción. Eritrocitos sobre la superficie de los cuales se han fijado anticuerpos son destruidos mediante lisis por el sistema de complemento.

Una de las pruebas conocidas de serología aprovecha esta acción lítica del complemento. La técnica utiliza cantidades conocidas de complemento para medir la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra. Para no medir concentraciones erróneas los factores de complemento propios de la muestra, todos ellos termolábiles, se desactivan mediante calentamiento a 56ºC durante 30 minutos previamente a la realización de la prueba.

b) La reacción de anticuerpos con el antígeno

La reacción entre anticuerpos y antígeno es muy específica, y por esta razón constituye un instrumento muy valioso para mediante un componente conocido (antígeno) identificar la presencia de un desconocido con un alto nivel de seguridad.

La aplicación de estos recursos es muy amplia, sobre todo en el diagnóstico y en la monitorización de enfermedades infectocontagiosas. La reacción de un antígeno con anticuerpos resulta en la formación de complejos inmunes de diferentes tipos (precipitantes, etc.). Dependiendo del antígeno y el sistema de prueba utilizada se pueden obtener y medir diferentes tipos de estos

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complejos. En general, en las pruebas de serología se emplea una cantidad conocida de antígeno y se diluye el suero que se investiga de forma seriada. Se mide la concentración del suero que aún inhibe (mediante complejos anticuerpo antígeno) una acción concreta del antígeno, o la que aún forma complejos que provocan una reacción demostrable. Esta concentración del suero es expresado como el título de anticuerpos del suero.

TECNICAS RAPIDAS Y AUTOMATIZACION

El laboratorio de serología, encuadrado en el Servicio de Microbiología Clínica, es el encargado de realizar el diagnóstico indirecto a través de una tecnología que ha evolucionado en el estudio y diagnóstico de las enfermedades infecciosas muy rápidamente; la aparición de los anticuerpos monoclonales fue el eje sobre el que este cambio comenzó a producirse. La producción controlada de anticuerpos más específicos y de mayor afinidad hizo posible, por una parte la mejoría de las técnicas ya existentes (IFI, Látex, Hemaglutinación etc.) y por otra la aparición de micro técnicas, (RIA, ELISA, etc.), que utilizan pequeños volúmenes de muestra para su realización. La unidad de volumen pasó de ser el mililitro (ml) al micro litro (&micro), La disminución de los tamaños de todos los utensilios de trabajo del laboratorio, ( pipetas, baños, aparición de placas de micro técnica, etc., etc.) ha precipitado igualmente un cambio radical en las formas de trabajar en los mismos de tal manera que las técnicas de realización manual han sido sustituidas, en su mayoría, por aparatos automáticos que permiten en primer lugar el manejo de gran cantidad de muestras y en segundo lugar la realización simultánea de gran número de pruebas y técnicas quedando los procedimientos manuales relegados para realizar o pruebas individualizadas muy rápidas o aquellas de las que existe poca demanda.

Desde siempre el inconveniente más importante que ha tenido el diagnóstico indirecto ha sido su falta de rapidez. Al tiempo que tarda el organismo en formar los anticuerpos se le sumaba la tediosidad en tiempo de la realización técnica. La llegada de la biología molecular ha

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puesto a nuestra disposición la posibilidad de producir antígenos nativos lo que ha permitido una gran expansión del catálogo de pruebas diagnósticas disponibles en los últimos años y por otro se ha mejorado mucho las pruebas permitiendo acortar sustancialmente los tiempos de realización de las mismas. En la actualidad es muy rara la metodología que no pueda realizarse a lo largo de unas pocas horas o incluso minutos y todas ellas con una calidad excelente. Todas pueden por tanto considerarse como técnicas cortas y aunque es muy difícil de precisar en cuánto disminuye el coste de la enfermedad la celeridad y el significado diagnóstico de un resultado serológico, sí es cierto que en muchas ocasiones elimina la práctica de otras exploraciones complementarias y la aplicación más dirigida de los tratamientos. Esto hace del mismo un método nada despreciable, y a veces único, a la hora de plantearse en clínica el diagnóstico etiológico de algunas enfermedades infecciosas.

METODOS CUANTITATIVOS: CONCEPTO DE “TITULO DE UN SUERO”

En muchas ocasiones interesa conocer no sólo si el paciente tiene o no anticuerpos frente a un/unos patógenos determinados sino qué concentración otasa de ellos tiene. Esto es útil ya que para muchas infecciones es posible correlacionar la concentración con la situación clínica o decidir si aquella ha sido una respuesta eficiente como resultado de una vacunación.

Para ello, realizamos diluciones seriadas del suero que irán sucesivamente disminuyendo la concentración de anticuerpos; el título del suero será la última dilución del suero que da una reacción positiva. Según esto, un suero con un título 1/32 tendrá menos anticuerpos que un suero con un título 1/256.

Se dice que un título es significativo cuando estadísticamente esa concentración, o una superior, se asocia con el estado de enfermedad.

Este método de expresión del resultado serológico ha sido empleado durante muchos años y es el método más inteligible ya que la cifra se

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correlaciona rápidamente con su significado. Existe además mucha experiencia clínica acumulada y definidos bastantes títulos significativos para muchas infecciones. En nuestra opinión, y siempre que se pueda, los resultados de una prueba serológica deben ser expresados así ya que es, probablemente, la valoración mejor interpretada en la clínica.

Aún hoy se realizan pruebas cuantitativas cuyo sistema de medida es el título del suero. En general todas son técnicas que se emplean en el diagnóstico desde hace mucho tiempo y que tienen ya una solvencia clínica más que comprobada (fijación de complemento, aglutinación en tubo y porta, inmunofluorescencia, etc.). En otras ocasiones el resultado se expresa en función de una curva que se construye cada vez y que tiene unos valores conocidos por nosotros. Los resultados de cada muestra son obtenidos por comparación con los valores de la curva

Los laboratorios actuales orientan las técnicas manuales a la realización de pruebas con poca demanda y por tanto no rentables para la automatización o aquellas que son de muy corta realización. Entre estas encontramos las comúnmente conocidas como pruebas de Látex, aglutinación en tubo o porta, inmunofluorescencia y algunas pruebas enzimáticas con soporte de macropartículas en las que el resultado de la reacción adopta formas significativas cuando la reacción es positiva. En general estas pruebas tienen una sensibilidad excelente cuando las comparamos con las de referencia lo que ha permitido incorporarlas a las pequeñas unidades de Diagnóstico Rápido de los Servicios de Microbiología. Las pruebas que pueden automatizarse se realizan mediante máquinas robots. El ideal de estas máquinas es el evitar cualquier trabajo manual, ganar en seguridad y disminuir la penosidad en el trabajo. La seguridad se obtiene al evitar en lo posible los errores humanos ya que por lo general estas máquinas identifican las muestras mediante códigos de barras, la diluyen si es necesario, la dispensan y realizan la incubación y lectura con interpretación de los resultados si han sido programadas por el facultativo. Pueden trabajar con un número ilimitado de sueros si el

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diseño es de carga continua. La mayoría de ellas están programadas para realizar simultáneamente diferentes determinaciones a una sola muestra. Esta capacidad multiparamétrica capacita a los laboratorios para la realización diaria de una gran cantidad de determinaciones en corto intervalo de tiempo, con el inconveniente de que en muchos casos las pruebas no pueden personalizarse.

REALIZACION DEL EXAMEN

La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de punción se limpia con un antiséptico. El médico coloca una banda elástica alrededor de la parte superior del brazo con el fin de aplicar presión en el área y hacer que la vena se llene de sangre.

Luego, el médico introduce suavemente una aguja en la vena y recoge la sangre en un frasco hermético o en un tubo adherido a la aguja. La banda elástica se retira del brazo.

Una vez que se ha recogido la muestra de sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de punción para detener cualquier sangrado.

En bebés o en niños pequeños, se puede utilizar un instrumento puntiagudo llamado lanceta para punzar la piel y hacerla sangrar. La sangre se recoge en un tubo pequeño de vidrio llamado pipeta, en un portaobjetos o en una tira reactiva. Finalmente, se puede colocar un vendaje sobre el área si hay algún sangrado.

La sangre se analiza luego en un laboratorio para determinar la forma como ciertos anticuerpos reaccionan con antígenos específicos. El examen se puede utilizar para confirmar la identidad de microorganismos específicos.

Existen varias técnicas serológicas que se utilizan dependiendo de los anticuerpos de los cuales se sospecha entre las que se pueden mencionar aglutinación, precipitación, fijación del complemento, anticuerpos fluorescentes y otras.

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INDICACIONES

Un examen serológico puede determinar si la persona alguna vez ha estado expuesta a un microorganismo particular (antígeno), pero esto no necesariamente es indicio de una infección actual.

Este examen se realiza también para descartar sospechas sobre alguna infección, si se encuentran razones para pronosticar una enfermedad existente, el examen se puede repetir a las dos semanas de la primera toma de muestra sanguínea.

La serología permite detectar infecciones y / o que tanto el individuo es inmune a una infección o enfermedad específica.

VALORES NORMALES

Normalmente, no se encuentran anticuerpos en la muestra de sangre.

Nota: Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. La persona debe hablar con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.

VALORES ANORMALES

Si se encuentran anticuerpos, la persona puede haber estado expuesta a algún tipo de antígeno. A medida que la enfermedad empeora, se presentarán más anticuerpos. Si se sospecha una enfermedad, es posible que sea necesario repetir el examen de 10 días a 2 semanas después del primero.

La detección de anticuerpos se puede utilizar ya sea para diagnosticar una infección previa o activa, o para determinar si el individuo es inmune a una re infección por parte de un organismo. Algunas de las diferentes enfermedades que se pueden detectar son:

Amebiasis. Carbunco. Brucelosis. Virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Infección nicótica.

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Sarampión. Rubéola. Virus sindical respiratorio (VSR). Sífilis. Tularemia. Hepatitis viral (diversos tipos).

Las afecciones adicionales bajo las cuales se puede realizar el examen son:

Absceso hepático amebiano. Eritema infeccioso. Artritis nicótica. Meningitis criptocócica. Meningitis por H. influenza. Meningitis meningocócica. Artritis viral.

RIESGOS

Las venas y arterias varían de tamaño de un paciente otro y de un lado del cuerpo a otro, razón por la cual obtener una muestra de sangre de algunas personas puede resultar más difícil que de otras.

Otros riesgos asociados con la extracción de sangre son leves, pero pueden ser:

Sangrado excesivo. Desmayo o sensación de mareo. Hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel). Infección (un riesgo leve cada vez que se presenta ruptura de

la piel).

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TUBOS QUE SE UTILIZAN PARA SEROLOGIA

TUBO CON TAPA ROJA:Tubo para serología, sin anticoagulante, en plástico, transparencia cristal, con el interiorrecubierto de silicona y activador de coágulo, con un volumen aproximado de aspiración de 4.0 ml, de 13 x 75 mm, con tapa de seguridad HEMOGARD y tapón siliconado hemorrepelente.

TUBO CON TAPA AMARILLA: Tubo para serología, sin anticoagulante, con gel separador, en vidrio con fondo de doble espesor, con el interior recubierto de silicona y activador de coágulo, con un volumen aproximado de aspiración de 6.0 ml, de 13 x 100 mm, con tapa de seguridad HEMOGARD y tapón siliconado hemorrepelente.

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PRUEBAS SEROLOGICAS O DE LABORATORIO

Las pruebas biológicas o in vitro (en laboratorio, no en el animal) son formas de evaluación relativas, que detectan concentraciones comparativas de ciertas clases de inmunoglobulinas (Ig) que podrían estar presentes en algunas alergias. El nivel de desarrollo y avance en veterinaria no es aún comparable al alcanzado en medicina humana, por lo que su efectividad y sensibilidad están aún en estudio. En muchos países, ésta tecnología ha avanzado mucho, y las pruebas son más depuradas y sensibles, pero en otras regiones las pruebas disponibles resultan anticuadas, y por ende la fiabilidad puede ser discutible. Aún así pueden resultar efectivas en la determinación de causas de alergia, pero teniendo en cuenta sus limitaciones, a fin de sacarles provecho frente a su alto costo.

Las pruebas deberían ser evaluadas por un alergista que pueda interpretar la relación de los hallazgos del análisis frente a la historia del animal y teniendo en cuenta su medio ambiente. Debería solicitarse la medición de alérgenos individuales y evitar el uso de grupos de alérgenos que pueden dar resultados desconcertantes. Evitar las pruebas que miden alérgenos alimentarios o de contacto, ya que su efectividad no está comprobado y pueden causar desazón en el propietario. Para éste tipo de alérgenos existen otras pruebas mucho más efectivas y seguras.

En definitiva, ciertas pruebas biológicas pueden servir solamente para que el propietario tome conciencia de que su animal es alérgico, lo cual ya se sospechaba antes. Los animales que no presentan alergias también pueden dar resultados positivos en éstas pruebas, lo que complica la evaluación.

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UTILIDAD DE LOS ESTUDIOS SEROLOGICOS

Los estudios serológicos pueden emplearse fundamentalmente para:

1.- Estudios de diagnóstico

Aunque el diagnóstico directo tiene muchas ventajas, existen situaciones en las cuales éste no es posible o es muy caro. En general se trata de infecciones víricas de aislamiento difícil o no víricas pero de patógeno difícilmente cultivable o no cultivable. En estos casos, el diagnóstico indirecto puede darnos a conocer la etiología de la infección.

2.- Estudios epidemiológicos

La demostración del estado inmunitario de una población con respecto a uno o varios patógenos puede hacerse fácilmente mediante este tipo de diagnóstico. El estudio retrospectivo de los anticuerpos presentes nos indicará la prevalencia de este microorganismo/s en dicha población y dependiendo de su distribución etaria la conveniencia o no de establecer campañas de vacunación

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ELECCION DE UNA PRUEBA SEROLOGICA. SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD

La incorporación de una técnica nueva a un laboratorio clínico debe de estar precedida de estudios de evaluación. Una prueba serológica se evalúa, fundamentalmente, por los parámetros de sensibilidad, especificidad y valor predictivo. Del conocimiento de estos tres valores intrínsecos de la misma se deducirá su aplicación o no en determinadas circunstancias y como deberá interpretarse su resultado ya sea positivo o negativo.

La medida de la sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que están en la situación que queremos diagnosticar. Cuantos más resultados positivos produzca en este grupo de enfermos más sensibilidad tendrá la prueba y menos resultados falsos negativos (FN) obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos positivos (VP) que son detectados en individuos con esa enfermedad y esa técnica. En serología es difícil tener pruebas con el 100% de sensibilidad y casi todas producen algún resultado negativo falso.

La especificidad se mide, por el contrario, realizando la prueba en colectivos de personas que no padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La especificidad por tanto se define como el porcentaje de verdaderos negativos que serán detectados en pacientes sanos con esa prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de resultados negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serológicas con especificidades casi del 100%. Estos dos parámetros son propiedades intrínsecas del test y no varían nunca con relación a la población estudiada.

VALOR PREDICTIVO

La utilidad de una prueba es la resultante de los valores predictivos (VP), positivo (VPP) o negativo (VPN), obtenidos al emplearla sobre una población general en la que existen individuos sanos e infectados por el agente frente al que queremos investigar los anticuerpos.

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Conocer estos valores es muy importante ya que ellos serán los que nos indiquen la conveniencia de emplearlo para confirmar una enfermedad o para descartarla. El VPP de una prueba es el porcentaje de resultados verdaderamente positivos (VP) obtenidos con ella cuando la aplicamos a una población general. Igualmente el VPN es el porcentaje de pruebas verdaderamente negativas (VN) aplicadas a la misma población. VPP y VPN se calculan mediante las siguientes relaciones:

VPP = (VP/ (VP+FP)) x100 y VPN=(VN/(VN+FN))x100

El VPP y VPN se encuentran enormemente influidos por la prevalencia de la patología que queramos estudiar de tal manera que en ocasiones y tendrá un mayor valor predictivo el resultado negativo que el positivo. (Una prueba de rosa de bengala negativa, con cualquier prevalencia, descarta casi con seguridad la infección por Brúcela mientras que un resultado positivo no asegura de la enfermedad y menos en una zona endémica con elevada prevalencia). Así pues el empleo de una prueba de sensibilidad alta en una población determinada nos asegura que casi todos los pacientes con anticuerpos específicos, se clasificarán como positivos pero no nos asegura que todos ellos sean VP; su VPP está influido por la prevalencia. En la tabla 1 se exponen los VPP y VPN de una prueba serológica con una sensibilidad y especificidad del 98 % en relación con la prevalencia de la enfermedad por 100.000 habitantes. En estas condiciones sólo con prevalencias superiores a un 10 % obtenemos VPP significativos.

Esto supone que el resultado de una misma prueba serológica pueda tener diferente valor predictivo: Si empleamos una prueba para rastreo del virus de hepatitis B con una sensibilidad y especificidad del 99% en un banco de sangre (prevalencia en donantes de 0,8 %) el VPP será de 47 %. Esa misma prueba empleada en una población de pacientes con síntomas compatibles de enfermedad (Laboratorio de microbiología, con prevalencias de 10%) presenta un VPP de 91%. El empleo de técnicas con elevada especificidad nos garantizará que las muestras positivas lo son de verdad pero no que todas las negativas lo sean. Al igual que en el caso anterior el VPP y VPN se ven muy influidos por la prevalencia.

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Valores predictivos positivo y negativo de una prueba con 98 % de sensibilidad y 98 % de especificidad según la prevalencia

Prevalencia por 100.000 VPP VPN

1.000 33 % 100 %

3.000 60 % 100 %

10.000 84 % 100 %

20.000 92 % 99 %

30.000 95 % 99%

PERFILES SEROLOGICOS

En la práctica diaria el diagnóstico indirecto se ha decantado, en los últimos años, por el estudio de las muestras mediante perfiles serológicos. La lógica de estas agrupaciones, similar a lo que realiza en el diagnóstico directo, descansa en que generalmente el problema clínico requiere investigar varios patógenos como posibles agentes etiológicos, como responsables de la patología del paciente. Las alternativas son pues explorarlos uno a uno o simultáneamente. Obviamente la primera fórmula es más lenta y, probablemente, más económica. La segunda es lo contrario y probablemente más eficaz desde el punto de vista clínico. En ocasiones el perfil se divide en dos o tres niveles que se ejecutan progresivamente según los resultados obtenidos en el nivel anterior. Este método de perfiles no es nuevo, pero en la actualidad la disponibilidad comercial de muchos antígenos y la automatización ha impulsado su utilización y a nosotros nos parece un sistema bueno y eficaz para el diagnóstico dada la excelente relación entre coste, eficacia y tiempo de respuesta diagnóstica. Esta filosofía de trabajo supone una organización especial del laboratorio de tal suerte que la mayoría de las técnicas se realicen con una frecuencia mayor a la requerida si se buscan patógenos de manera independiente.

UTILIZACION CLINICA DE LOS PERFILES SEROLOGICOS

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Dependiendo de la clase de anticuerpos que ponga en evidencia la técnica empleada (IgG, IgM o ambos) será necesario, como ya se citó en otra parte, el estudio de una o dos muestras de suero realizadas, en este último supuesto, simultáneamente. En el caso de detección de IgM una muestra extraída en la fase aguda será suficiente. En el supuesto de que midan IgG o ambas clases es mandatorio el estudio seriado.

ALGUNOS EJEMPLOS DE LA UTILIDAD DE LOS PERFILES SEROLOGICO:

Perfil respiratorio

Perfil para el estudio de las Hepatitis Virales Perfil serológico para Virus de la inmunodeficiencia adquirida Perfil para gestantes e infecciones congénitas

PRINCIPALMENTE HAY DOS POSIBLES CAMPOS DE UTILIDAD PARA LA SEROLOGIA

a) El diagnóstico de un proceso infeccioso en curso

Si se utiliza con este fin hay que observar una serie de requerimientos muy concretos:

La detección de anticuerpos (inmunoglobulinas G) frente a un antígeno específico significa que el animal ha sido recientemente expuesto a este antígeno y que se ha producido una infección. Para poder determinar que hay una infección en curso e incluso que una enfermedad clínica esté relacionado con el patógeno en cuestión hace falta el examen de muestras seriadas es decir al mínimo dos muestras en una distancia de 10 días en las que se demostrara un aumento del título de anticuerpos cuatro veces la primera cifra.

En algunas infecciones, que producen inmunidad persistente la detección de anticuerpos en una sola muestra si puede ser diagnóstica (Herpes virus, HIV).

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Las técnicas existentes de detección de anticuerpos generalmente no pueden distinguir entre anticuerpos procedentes de una infección o de una vacunación

Para la detección de anticuerpos es necesario que el animal infectado tenga un sistema inmune funcional que produce anticuerpos.

Los anticuerpos producidos con respuesta a una infección desaparecen con el tiempo de la circulación sanguínea, y en algunos individuos o especies la respuesta a un infección determinada es muy débil. Por estas dos razones la ausencia de anticuerpos no necesariamente significa la ausencia de una infección.

Algunos anticuerpos producidos contra un antígeno pueden tener reacciones cruzadas con otro antígeno y producir resultados falsos positivos (APMV-1 y aPMV-3)

En el caso del diagnóstico clínico en general es mejor la detección del patógeno o de su ADN que la presencia de anticuerpos frente a él.

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CAPITULO IIIPruebas Química Especial

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Química Especial

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La química Especial se realiza en el suero que es la parte amarillenta de la sangre que queda después de que la sangre se ha coagulado y las células sanguíneas se han removido.

La mayoría de los exámenes que pertenecen a este departamento determinan principalmente hormonas secretadas por el cuerpo humano.

También una parte muy importante de la química especial es la determinación de los marcadores tumorales.

Resultados anormales conllevan a diagnósticos de enfermedades como desordenes de la tiroides, enfermedades de los ovarios y testículos, desordenes de crecimiento y diversos tipos de cáncer.

PRUEBAS ESPECIALES QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO CLINICO

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Proteinuría Proteínas de Bence Jones Microalbuminuría Cálculo Urinario Creatinia en Orina Depuración de Creatinina Nitrógeno Ureico en Orina Calcio en Orina Potasio en Orina Magnesio en Orina Cocaina Marihuana Opiaceos Escopolamina Extasis 17 Cetoesteroides 17 Hidroxicorticoesteroides Ácido Vanilmandélico Catecolaminas Electrólitos en Orina Cortisol Hormona de Crecimiento Somatomedina C Ácido Valproico Carbamazepina Fenitoina Litio

CAPITULO IV Tinción de Gram

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Tinción

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Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para resaltar organelos dentro de células individuales.

En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propósitos.

Diferentes tipos de tinciones biológicas son utilizadas también para marcar células en citometría de flujo y para marcar proteínas o ácidos nucleicos en electroforesis en gel.

Las tinciones no están limitadas a su uso en materiales biológicos, también pueden ser utilizadas para estudiar la morfología de otros materiales (por ejemplo, las estructuras la melares de polímeros semicristalinos de las estructuras de dominio de bloques de copolímeros.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Copol%C3%ADmero

http://es.wikipedia.org/wiki/Morfolog%C3%ADa_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gel

http://es.wikipedia.org/wiki/Citometr%C3%ADa_de_flujo

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Marca_fluorescente&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Carbohidrato

http://es.wikipedia.org/wiki/L%C3%ADpido

http://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://es.wikipedia.org/wiki/ADN

http://es.wikipedia.org/wiki/Bioqu%C3%ADmica

http://es.wikipedia.org/wiki/Organela

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_sangu%C3%ADnea

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_sangu%C3%ADnea

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

http://es.wikipedia.org/wiki/Tejido_conectivo

http://es.wikipedia.org/wiki/Fibra_muscular

http://es.wikipedia.org/wiki/Medicina

http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscop%C3%ADa

Un espécimen histológico teñido, colocado entre portaobjetos y cubreobjetos, montado sobre la platina de un microscopio óptico.

Tinción in vivo e in vitro

Una tinción in vivo (tinción supravital) es el proceso de teñir tejidos vivos. Al provocar que determinadas células o estructuras adquieran los colores de contraste, se puede estudiar su ubicación y morfología mientras están desempeñando su función. El propósito más común es revelar detalles de la cito estructura que de otra manera no resultarían evidentes, sin embargo, la tinción supravital puede revelar además donde aparece un determinado producto químico o donde se lleva a cabo una determinada reacción química dentro de las células o tejidos.

A menudo estas tinciones son llamadas tinciones vitales o supravitales. Se introducen en el organismo mientras las células aún se encuentran vivas. Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5.000 a 1:50.000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente tóxicas para los organismos, algunas más que otras.

Una tinción in vitro involucra el coloreo de células o estructuras que han sido removidas de su contexto biológico. Se utiliza a menudo una combinación de varios colorantes para revelar más detalles y características de las que se obtendrían con la utilización de uno solo. Combinados con protocolos específicos de fijación y de preparación de muestras, los científicos y profesionales de la salud pueden utilizar estas técnicas estandarizadas como una herramienta diagnóstica repetible y consistente. Una contratinción es una tinción que consigue que las células o estructuras sean más visibles, cuando no se consigue que sean totalmente visibles con la tinción principal.

Por ejemplo, el cristal violeta tiñe únicamente a las bacterias Gram positivas en la tinción de Gram. Se utiliza una contratinción de safranina (que colorea todas las células), para permitir también la identificación de bacterias Gram negativas.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Gram_negativas

http://es.wikipedia.org/wiki/Safranina

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram

http://es.wikipedia.org/wiki/Gram_positivas

http://es.wikipedia.org/wiki/Gram_positivas

http://es.wikipedia.org/wiki/Cristal_violeta

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Contratinci%C3%B3n&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fijaci%C3%B3n_(histolog%C3%ADa)&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/In_vitro

http://es.wikipedia.org/wiki/In_vivo

http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_%C3%B3ptico

http://es.wikipedia.org/wiki/Platina

http://es.wikipedia.org/wiki/Cubreobjetos

http://es.wikipedia.org/wiki/Portaobjetos

Es de notar que muchas tinciones pueden ser utilizadas tanto en células vivas como en células fijadas.

Métodos de tinción in vitro

Preparación

Las etapas preparatorias involucradas en una tinción van a depender del tipo de análisis planeado; bajo estas premisas se puede considerar que algunos o todos de los siguientes pasos podrían requerirse.

Fijación: de por sí, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijación es una modificación de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas que forman una célula o tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de las células o tejidos tanto como sea posible. A veces se puede utilizar una fijación por calor para matar, adherir y alterar un espécimen de modo que acepte la tinción. La mayor parte de las veces se utiliza un fijador químico. Los fijadores químicos en general causan la formación de enlaces cruzados entre proteínas, o entre proteínas y otras sustancias presentes en la muestra, incrementando su resistencia mecánica. Entre los fiadores químicos más comunes se encuentran el formaldehído, etanol, metanol, y/o el ácido pícrico. Pequeños bloques de tejido pueden ser embebidos en parafina o algún polímero, proceso conocido como inclusión, para incrementar su resistencia y estabilidad, y para hacer más fácil cortarlos en rodajas extremadamente delgadas, ya que cuanto más delgado es un corte histológico, más definición se obtiene en las imágenes microscópicas.

Permeabilización este paso implica el tratamiento de las células con un surfactante suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver la membrana celular para permitir que las grandes moléculas de colorante puedan acceder a las estructuras del interior de las células.

Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histológicos a un portaobjetos de vidrio para su observación al microscopio o análisis. En algunos casos, se puede cultivar a las células

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http://es.wikipedia.org/wiki/Portaobjetos

http://es.wikipedia.org/wiki/Surfactante

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Inclusi%C3%B3n_(histolog%C3%ADa)&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_p%C3%ADcrico

http://es.wikipedia.org/wiki/Metanol

http://es.wikipedia.org/wiki/Etanol

http://es.wikipedia.org/wiki/Formaldeh%C3%ADdo

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Fijaci%C3%B3n_(histolog%C3%ADa)&action=edit&redlink=1

directamente sobre le portaobjetos. En muestras de células sueltas, como las que se presentan en un extendido de sangre o de fluidos biológicos, la muestra puede ser aplicada directamente sobre el portaobjetos. Para piezas de tejido de mayor tamaño, se utiliza un micrótomo que corta la muestra en rodajas sumamente delgadas. Estas rodajas son luego adheridas al portaobjetos por medio de una substancia que funciona como pegamento, ya sea una resina transparente, gelatina o clara de huevo. El montaje tiene por finalidad aumentar la resistencia mecánica de una muestra que de otra manera sería extremadamente frágil, para que soporte el proceso de teñido conservando lo más posible su estructura original.

Tinción adecuada

En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra (antes o después de la fijación y el montaje) en la solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente, esto es, un compuesto químico que reacciona con el colorante para formar un precipitado coloreado insoluble. Cuando la solución de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.

La mayoría de los colorantes utilizados en microscopía se encuentran disponibles como colorantes certificados. Esto significa que los colorantes ofrecidos por el fabricante han sido evaluados por un organismo independiente, la Biological Stain Commission, y que este organismo ha determinado que el producto ofrecido cumple o excede ciertos estándares de pureza, concentración de sustancia colorante y desempeño en las técnicas de tinción empleadas. Estos estándares son publicados detalladamente en la revista Biotechnic & Histochemistry.1 Muchos colorantes presentan una composición diferente entre diferentes fabricantes. La utilización de colorantes certificados elimina una fuente de resultados inesperados.

83

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n#cite_note-Bio.26Histo-1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Biotechnic_%26_Histochemistry&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Biotechnic_%26_Histochemistry&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Biological_Stain_Commission&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Precipitado

http://es.wikipedia.org/wiki/Mordiente

http://es.wikipedia.org/wiki/Micr%C3%B3tomo

Tinción directa

Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo.

Tinción indirecta

Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es el ácido tánico.

Afinidad de diferentes tejidos por diferentes colorantes

Cuando un tejido u estructura subcelular presenta una afinidad por un determinado colorante se suele designar por los sufijos -filo o -fílico. Por ejemplo, los tejidos que se tiñen con azure suelen ser nombrados como azurófilos o azurofílicos. También puede ser utilizado para designar propiedades tintoriales más generalizadas, por ejemplo los tejidos que se tiñen con colorantes de naturaleza ácida (por ejemplo la eosina) suelen ser denominados como acidofílicos, basofílicos cuando se tiñen con colorantes de naturaleza básica (tales como por ejemplo el azul de metileno o la hematoxilina), y anfifílicos cuando aceptan ambos colorantes. Por el contrario, los tejidos cromófobos no toman colorante con facilidad.

Tinción negativa

Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea. Adicionalmente, la tinción negativa es una técnica suave que no destruye a los microorganismos, permitiendo por lo tanto un recultivo posterior para el estudio de patógenos.

Colorantes

84

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinta_china

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Nigrosina&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_negativa

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Crom%C3%B3fobo&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Anfif%C3%ADlico&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Basof%C3%ADlico&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Acidof%C3%ADlico&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Azur%C3%B3filo&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Azure&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_t%C3%A1nico

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

Colorantes histológicos más comunes

Los diferentes colorantes reaccionan o se concentran en diferentes partes de las células o tejidos, y estas propiedades son utilizadas como una ventaja para revelar partes o áreas específicas. Algunos de los colorantes biológicos más comunes se listan más abajo. A menos que se indique lo contrario la mayoría de estos colorantes se utilizan con células y tejidos fijados. Las tinciones vitales (que pueden ser utilizadas con organismos vivos) se encuentran destacadas.

Azul brillante de Coomassie

Coomassie blue (también conocido como azul brillante) es un colorante que tiñe en forma no específica a todas las proteínas con un fuerte color azul. Se utiliza frecuentemente para teñir las corridas de proteínas en las electroforesis en gel.

85


http://es.wikipedia.org/wiki/Coomassie_Brilliant_Blue

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Negro_Sud%C3%A1n&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Rojo_Congo

http://es.wikipedia.org/wiki/Fucsina_%C3%A1cida

http://es.wikipedia.org/wiki/Eosina

http://es.wikipedia.org/wiki/Safranina


http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_metileno

http://es.wikipedia.org/wiki/Colorante

Azul de metileno

Azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.

Azul Nilo

El Nile blue (o Nile blue A), es decir azul Nilo, tiñe a los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.

Bismarck brown

Bismarck brown, Marrón Bismarck, (también conocido como Bismarck brown Y o Manchester brown) le imparte un color amarillo a las mucinas ácidas. Se puede utilizar con células vivas.

Bromuro de etidio

El bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teñir células vivas ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para identificar células que se encuentran en las etapas finales de la apoptosis, ya que tales células poseen unas membranas mucho más permeables. Por el mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar las bandas de ADN en una corrida en electroforesis en gel. Este colorante puede ser utilizado en combinación con naranja de acridina (NA) en el conteo de células viables. Esta tinción combinada BE/NA le otorga a las células vivas un color verde fluorescente mientras que las células apoptóticas aparecen con la distintiva fluorescencia rojo-naranja.

Carmín

El carmín es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teñir glicógeno, mientras que las sales de alumbre-carmín son colorantes que se adhieren al núcleo. Las tinciones con carmín requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre.

Cristal violeta

86

http://es.wikipedia.org/wiki/Alumbre

http://es.wikipedia.org/wiki/Aluminio

http://es.wikipedia.org/wiki/Litio

http://es.wikipedia.org/wiki/Carm%C3%ADn

http://es.wikipedia.org/wiki/Naranja_de_acridina




http://es.wikipedia.org/wiki/Apoptosis

http://es.wikipedia.org/wiki/Fluorescencia


http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Intercalaci%C3%B3n_(qu%C3%ADmica)&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Bromuro_de_etidio

http://es.wikipedia.org/wiki/Mucina

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Bismarck_brown&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Nile_blue&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Reticulocito

http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_metileno

El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram.

DAPI

El DAPI es un colorante nuclear (tiñe el núcleo) fosforescente, se excita con luz ultravioleta para producir una fuerte fluorescencia azul cuando se encuentra unido al ADN. El DAPI se une a las regiones de alta repetición A=T en los cromosomas. Además no es visible cuando se utiliza con un microscopio de transmisión corriente. Puede ser utilizado en células vivas o fijadas. La técnica de tinción con DAPI es especialmente adecuada para el recuento celular.

Eosina

La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción. De hecho existen dos compuestos muy estrechamente relacionados (aunque no iguales) conocidos como eosina. El más frecuentemente utilizado es la eosina Y (también conocida como eosina amarillenta) ya que posee una tonalidad amarillenta muy suave. El otro compuesto conocido como eosina es la eosina B, también conocida como eosina azulada o rojo imperial, la cual posee una suave tonalidad azul. Los dos colorantes son intercambiables, y la utilización de uno u otro es más una cuestión de preferencia y tradición.

87

http://es.wikipedia.org/wiki/Eritrocito

http://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_celular

http://es.wikipedia.org/wiki/Citoplasma



http://es.wikipedia.org/wiki/Fosforescente

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=DAPI&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Coloraci%C3%B3n_de_Gram

http://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular


Lista de algunas de las tinciones más comunes

Nota: Esta lista incluye sólo algunas de las tinciones más comunes, y no es ni con mucho completa.

Tinción Tipo Características Uso Ejemplo

HematoxilinaBásica /

Acidofílica

Tiñe núcleos, ácidos nucleicos y estructuras basofílicas (mitocondrias y ribosomas) en azul.

Tinción histológica general

EosinaÁcida /

Basofílica

Tiñe proteínas y estructuras con afinidad por los ácidos en diferentes tonos de rojo


Tinción hematoxilina-eosina

BicomponenteAnfifílica

Los núcleos

aparecen en

azul

(hematoxilina)

Los ácidos

nucleicos

asociados a

proteína (ej.

ribosomas) en

violeta

Fibra

muscular en

rojo

Tejido

conectivo en

rosado


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http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_hematoxilina-eosina




http://es.wikipedia.org/wiki/Hematoxilina

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ependyma.png

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Skeletal_muscle_-_longitudinal_section.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Angiokeratoma_-_intermed_mag.jpg

Tinción hemalumbre-eosina

Similar a la tinción H&E con colores más marcados y definidos


Tinción HOPS

Policromática Los núcleos

aparecen en

azul

(hematoxilina)

La elastina

aparece en

negro

(orceína)

Fibra

muscular en

rojo (filoxina)

Tejido

conectivo

(colágeno) en

amarillo

(safranina)

Tinción HPS Los núcleos

aparecen en

azul

(hematoxilina)

Fibra

muscular en

rojo (filoxina)

Tejido

conectivo

(colágeno) en

amarillo

(safranina)

89

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_HPS&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_HOPS&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_hemalumbre-eosina&action=edit&redlink=1



http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gallenblase_-_Schnitt.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Deroceras_laeve_epithelium_400_saturn.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Chordoma_-_intermed_mag.jpg

Tinción de Papanicolau

Permite ver la cromatina con mucha claridad

Núcleos

aparecen

entre azul y

negro

Células con

alto contenido

de queratina

en amarillo

Glucógeno en

amarillo

Células

superficiales

de naranja a

rosado.

Células

intermedias y

parabasales

entre turquesa

y azul.

Células

metaplásicas

muestran

coloraciones

mezcladas (P.

Ej. verde y

rosa)

Se utiliza para diferenciar células en muestras de secreciones biológicas (esputo, LCR, orina, etc.) y en raspados y biopsias. Permite distinguir con relativa facilidad células con transformaciones neoplásicas, levaduras y bacterias.

Tinción de Romanowsky

Pancromáticade

Romanowsky

Extendidos sanguíneos

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http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Romanowsky

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Romanowsky

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Papanicolau&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Papanicolau&action=edit&redlink=1

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Low_grade_squamous_intraepithelial_lesion.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:High-grade_squamous_intraepithelial_lesion.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Candida_pap_1.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:PBStabkerniger.jpg

Tinción de Wright

Tinción de Giemsa

Tinción de Jenner

Tinción de Leishman

Tinción de Field

Tinción de May Grünwald

Tinción de May Grünwald-Giemsa

Tinción con azul de metileno

Supravital

metacromátic

a

Tiñe de azul oscuro restos de ácidos nucleicos, y los proteoglicanos ácidos en varios tonos de violeta.

Diagnóstico de anemias regenerativas

Demostración de

estructuras

metacromáticas

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http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_supravital&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_con_azul_de_metileno&action=edit&redlink=1



http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_May_Gr%C3%BCnwald-Giemsa



http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_May_Gr%C3%BCnwald&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_May_Gr%C3%BCnwald&action=edit&redlink=1

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http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Jenner&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Jenner&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Giemsa

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Giemsa

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Wright

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Wright

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Acute_leukemia-ALL.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Plasmodium.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Lymphocyte2.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:P_vivax_gametocyte4.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Melanoma_-_cytology_field_stain.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:%E6%85%A2%E6%80%A7%E7%99%BD%E8%A1%80%E7%97%85.png

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:LMC-1.JPG

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reticulocytes_Human_Blood_Supravital_Stain.jpg

Tinción con azul de prusia

Tiñe los depósitos de hemosiderina y hierro de color azul-celeste

Diagnóstico de hemopoyesis ineficaz, y hemocromatosis

Tinción tricrómica de Masson

Tricrómica Los núcleos

aparecen en

marrón o

negro

Queratina y

músculo en

rojo

Los

citoplasmas

en tonos de

rosa

El colágeno y

hueso en azul

o verde

Tinción tricrómica de Lillie

Símil tricrómica de Masson

Tinción tricrómica AZAN de Heidenhan

Símil tricrómica de Masson, los citoplasmas aparecen en tonos de rojo más profundos y el conectivo en tonos más intensos de azul

Tinción tricrómica de Mallory

Símil tricrómica de Masson

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http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_tricr%C3%B3mica_de_Mallory&action=edit&redlink=1



http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_tricr%C3%B3mica_AZAN_de_Heidenhan&action=edit&redlink=1



http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_tricr%C3%B3mica_de_Lillie&action=edit&redlink=1



http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_tricr%C3%B3mica&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_tricr%C3%B3mica_de_Masson



http://es.wikipedia.org/wiki/Hemocromatosis

http://es.wikipedia.org/wiki/Hemocromatosis

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_con_azul_de_prusia&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_con_azul_de_prusia&action=edit&redlink=1

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ring_Sideroblast_smear_2010-01-13.JPG

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Masson's_Trichrome_Stain_(Rat_Airway_Section).jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bile_duct_hamartoma_high_mag.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ileon-Payer-AZAN.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cirrhosis_high_mag.jpg

Tinción de Van Gieson

Núcleos

celulares color

marrón a

negro.

Colágeno

(tejido

conectivo

fibroso): Color

rosa o rojo.

Músculo y

Citoplasma:

Color amarillo.

Tinción de Movat

Negro =

núcleos, fibras

elásticas

Amarillo =

colágeno,

fibras

reticulares

Azul =

sustancia

basal, mucina

Rojo brillante

= fibrina

Rojo =

músculo

Tinción tricrómica de Gömöri

TricrómicaArgéntica

Tinción de Warthin-Starry

Argéntica

Tinción de Von Kossa

Tiñe de tonos de marrón y negro los depósitos de

93

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http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_arg%C3%A9ntica

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Warthin-Starry&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Warthin-Starry&action=edit&redlink=1


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http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Van_Gieson

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Van_Gieson

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bronquio_secundario_de_avestruz.JPG

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cardiac_amyloidosis_very_high_mag_movat.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pylorigastritis.jpg

fosfato inorgánico en hueso.

Tinción de Golgi

Tinción de Bielchowsky

Tinción de Jones

Tinciones para Microbiología

Tinción de Gram

Tinción de Ziehl-Neelsen

Tinción de Schaeffer-Fulton

Tiñe endosporas de verde y bacterias en rojo

Sirve para diferenciar endosporas y bacterias

Tinción de Conklin

Tiñe endosporas de verde, similar a Schaeffer-Fulton

Tinción de Grocott

Detección de microorganismos, en especial fúngicos.

94

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http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen



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http://commons.wikimedia.org/wiki/File:GolgiStainedPyramidalCell.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cerebellum_-_biel_-_very_high_mag.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Membranous_nephropathy_-_alt_-_mpas_-_very_high_mag.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:20101017_175758_Bacilli.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Mycobacterium_tuberculosis_Ziehl-Neelsen_stain_640.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Bacillus_subtilis_Spore.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cryptococcosis_of_lung_in_patient_with_AIDS_Methenamine_silver_stain_963_lores.jpg

Tinción de Dieterle

Búsqueda de microorganismos, ej., Treponema pallidum

Tinción negativa

Tiñe el exterior, pero no el interior de células y estructuras

Es muy utilizada en microscopía electrónica. En microscopía óptica para identificar microorganismos encapsulados.

Tinción con mucicarmina

Tiñe las paredes celulares de polisacáridos de un intenso color rojo

Sirve para diferenciar bacterias con pared de polisacáridos de otras que no. (Ej Cryptococcus son mucicarmina +)

Tinciones para Organelos

Tinción metacromática

Produce colores púrpuras y violetas en presencia de mucopolisacáridos ácidos sulfatados

Tinciones para Fibras

Tinción de Weigert

Tiñe fibras elásticas en tonos de azul y violeta

Tinción con orceína

Tiñe fibras elásticas en tonos de marrón y negro

Tinciones para Carbohidratos

95

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http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Weigert

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Weigert






http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_con_mucicarmina&action=edit&redlink=1

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http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Dieterle&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tinci%C3%B3n_de_Dieterle&action=edit&redlink=1

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Treponema_pallidum_-_very_high_mag_-_extreme_crop.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cryptococcus_neoformans_using_a_light_India_ink_staining_preparation_PHIL_3771_lores.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cryptococcosis_of_lung_in_patient_with_AIDS._Mucicarmine_stain_962_lores.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Compact_bone_-_ground_cross_section.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Nichtlaktierende_Mama_Elastika-Faerbung.gif

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Deroceras_laeve_muscle_400_orcein.jpg

Tinción PAS

Tiñe carbohidratos y proteínas glicosiladas de color rojo magenta

Tinción con Lugol

Tiñe el almidón de azul, el glucógeno de amarillo y el resto en tonos de ocre

Tinción con Carmín

Tiñe el glicógeno de intenso color rojo.

Tinciones para Proteínas

Tinción argéntica

Dependiendo del fijado tiñe proteínas y ácidos nucleicos en tonos de negro y marrón

Tinción con Rojo Congo

Tiñe el amiloide de un intenso color rojo

Se utiliza con hematoxilina eosina en patología cuando se busca amiloide

Tinción con Alcian Blue

Tiñe mucopolisacáridos ácidos de color azul

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http://es.wikipedia.org/wiki/Amiloide

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http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Cerebral_amyloid_angiopathy_-_very_high_mag.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Barretts_alcian_blue.jpg

Tinción con Coomassie Brilliant Blue

Tiñe inespecíficamente proteínas de color azul

Tinciones para Ácidos Nucleicos

Tinción de Feulgen

Tiñe el ADN y cromosomas de color rojo-violeta

Naranja de acridina

Tiñe ADN y cromosomas de color verde fluorescente, ARN y ribosomas en color rojo fluorescente

DAPITiñe ADN de color azul-celeste fluorescente

Bromuro de etidio

Tinciones para Lípidos

Tinción con Luxol Fast Blue

Tiñe la mielina de azul-celeste

Técnica de la Hematina ácida de Baker

Tiñe fosfolípidos y nucleoproteínas de color azul negro

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http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gel_electrophoresis_2.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Pons_-_very_high_mag.jpg

Tinción con Oil Red O

Sudánlipofílica

Tiñe lípidos neutros de color rojo intenso

Tinción con Sudan Black B

Tiñe gotas de lípidos neutros de color negro azulado

Tinción con Sudan II

Tinción con Sudan III

Tiñe lípidos neutros de color rojo

Tinción con Sudan IV

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http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Differentiated_3T3-L1_Cell_line_stained_with_Oil_O_Red.jpg

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:AML-M7,_bone_marrow_section.jpg

TINCION DE GRAM

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

METODOLOGIA

• Recoger muestras.

• Hacer el extendido en espiral.

• Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.

• Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)

• Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las células gram positivas se tiñen de color azul-púrpura.

• Enjuagar con agua.

• Agregar Lugol y esperar entre 1 minuto.


• Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos (parte crítica de la coloración).


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• Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

EXPLICACION

El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana. El Lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta..

La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como lasafranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).

Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior;

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después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.

Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram. Los representantes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.

El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el número de grupos metilo en la molécula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono más oscuro es la hexametil-p-rosanilina(violeta cristal), y el tinte más ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenido. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram.

La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden retener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.

TEORIA

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u

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otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidratan las paredes de los microorganismos gran positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gran positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

TECNICAS DE COLORACION GRAM

Fijar un frotis

• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.

• Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra.

• Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.

• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lámina.

• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

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TINCION

Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 °C.

ENJUAGUE

Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia abajo... La solución de cristal violeta, se recomienda sea al 1%.

Mordiente

Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto más. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijación en las bacterias.

Decoloración (paso crítico)

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra más líquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra más líquido azul.

Lavado y secado

Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

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Tinción de contraste

Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

Nuevo enjuague

Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.

De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación microscópica.

BACTERIAS RESISTENTES A LA TINCION GRAM

Las siguientes bacterias de naturaleza gran positiva, tiñen como gramnegativas:

• Mycobacterias (están encapsuladas).

• Mycoplasmas (no tienen pared).

• Formas L (pérdida ocasional de la pared).

• Protoplastos y esferoplastos (eliminación total y parcial de la pared, respectivamente).

UTILIDAD

En el análisis de muestras clínicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:

• Identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.

• Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tinción de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor número de formas bacterianas que las aisladas

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hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados así como la atmósfera de incubación.

A partir de la tinción de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esférica. Pueden aparecer aislados después de la división celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).

Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada.

También pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rígida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.

FUNDAMENTOS DE LA DIFERENCIACION DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglicano (también conocido como mureína)

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared

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celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.

CAUSA QUE ALTERE LA TINCION DE GRAM

• I: Edad de la bacteria.

• II: Errores del operador.

• III: Uso de antibióticos

A pesar de la gran utilidad del la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como gram negativos) y la técnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tiñan como gram negativas),Es por esta situación que junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).

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CONCLUSION

Pudimos repasar y conocer mejor estas técnicas y sobre todo la importancia de conocer bien los procedimientos y de estudiarlos y comprenderlos correctamente, no solo a la hora de calificar la materia, sino para poder ponerlos en práctica y tener un conocimiento general acerca de la sangre, lo cual es la finalidad de la capacitación de laboratorito clínico-hematología, formar íntegramente alumnos capaces de realizar este tipo de análisis.

La serología es un instrumento versátil y de gran interés para el trabajo de conservación y de los centros de recuperación. Como prueba diagnóstica, método de monitorización e instrumento para la evaluación de riesgos su validez depende de la correcta selección, aplicación e interpretación de la prueba a utilizar.

Una parte muy importante de la química especial es la determinación de los marcadores tumorales.

Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren mucho químicamente esta diferencia química es los que permite distinguir las bacterias por Tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.

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ANEXOS

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Quimica La Hematología, serologia y especial

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