Autor:Byron Rafael Larios Alemán

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

ObjetivosDescribir el proceso de la reacción en

cadena de la polimerasa o PCR.Detallar los componentes necesarios para

llevar a cabo una PCR.Explicar las aplicaciones de este proceso en

el campo clínico

DefiniciónLa reacción en cadena

de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite replicar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN.

DesarrolloLa reacción en cadena de la polimerasa fue

desarrollada en 1983 por el Doctor Kary Mullis. El Dr. Mullis recibió en 1993 el Premio Nobel de Química por este descubrimiento. Al recibir el premio dijo esto: “Antes del la PCR, el DNA era largo y fibroso, en absoluto molecular… Yo había resuelto uno de los principales problemas de la química del DNA en un solo paso: abundancia y distinción”

Cabe destacar que, antes de la PCR existían métodos para aislar fragmentos de DNA basados en la clonación, pero estos métodos resultaban mucho más costosos en tiempo y en dinero.

¿Qué componentes son necesarios para la PCR?

Proceso de la PCREl proceso que tiene lugar durante la PCR

se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un ADN molde, una enzima, la ADN Polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde. El proceso se da en tres fases: Desnaturalización, hibridación y elongación.

DesnaturalizaciónOcurre cuando las dos cadenas de ADN se

separen. Se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC. La re naturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

HibridaciónLos cebadores se unen a las zonas 3´

complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (35-65º C) Esto permite que los cebadores se unan por complementariedad al ADN molde.

Especificidad de la reacción de la PCRLa especificidad de la PCR depende,

fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se incorporan a la reacción (además de depender de la secuencia de los cebadores).

Por una parte, cuanto mayor sea la temperatura utilizada en la fase de hibridación, más específica es la reacción. Por otra parte, en un determinado rango, incrementos en la concentración de MgCl2 hacen disminuir la especificidad de la reacción.

Elongación o ExtensiónSe produce la síntesis de una cadena sencilla en la

dirección 5´-> 3´ mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los desoxinucleotidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC.

¿Qué se ha obtenido tras un ciclo dePCR?

Únicamente una copia de un pequeño fragmento del ADN molde.

El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo.

¿Cómo se limita el tamaño de los fragmentos generados?Sabemos que en el primer ciclo, los

fragmentos generados no tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el cebador hibrida con el ADN molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más nucleótidos. Entonces, ¿Cómo se limita? La PCR se completa repitiendo entre 25 y 35 veces las tres fases descritas previamente, es decir, realizando entre 25 y 35 ciclos.

El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

¿Cuántos fragmentos se generan durante la reacción de PCR?

¿Cuántos fragmentos se generan durante la reacción de PCR?

Al final del proceso se obtiene aproximadamente una cantidad de fragmento igual al producto de la cantidad inicial de ADN molde por 2n, siendo n el número de ciclos. Como dato para apreciar la cantidad de copias que se generan, en el ciclo 20 se ha multiplicado por más de un millón la cantidad inicial de ADN molde.

¿Cómo se prepara?

1. Primero se prepara la mezcla de reacción (en cantidad suficiente para todas las muestras) que contenga todos los componentes de la PCR, a excepción del ADN molde.

2. Una vez preparados los tubos de reacción se introducen en el termociclador.

Aplicaciones médicasEn Oncología, la detección de

translocaciones, mutaciones, deleciones, etc., aporta un método más objetivo y sensible al establecer un diagnóstico, dado que el estudio «clásico» de las neoplasias se fundamenta en la identificación histopatológicade células malignas las cuales, sin embargo, sereconocen sólo si al menos 1%-10% de las células son neoplásicas.

También, es la identificación de ciertos genes asociados a diferentes enfermedades familiares como la fibrosis quística, la distrofia muscular de Duchenne y otras muchas.

En la serología o el estudio histopatológico de las muestras, la amplificación de ácidos nucleicos por medio de la PCR aporta grandes ventajas, como son una gran sensibilidad diagnóstica, así como una elevada especificidad. Uno de los ejemplos paradigmáticos de la utilidad clínica de la PCR es el diagnóstico de la encefalitis por el virus herpes simplex.

La PCR ha ayudado a establecer el pronóstico de distintas infecciones por medio de la determinación cuali/cuantitativa del virus de la hepatitis C o por medio de la determinación de la viremia plasmática en la infección por el VIH, en la que está reconocida la importancia de la determinación de la carga vírica en sangre en el pronóstico de la infección y también en la evaluación del tratamiento.

Otros usosOtros usosBiotecnología y Ciencias agropecuariasSecuenciación de ADNEstudios de evolución molecular

ConclusiónDescribimos que la PCR, es el proceso el

cual permite replicar muchas veces el ADN in vitro.

Las fases de la PCR son: Desnaturalización, Hibridación y elongación.

Explicamos que la PCR es muy útil tanto para enfermedades genéticas, prenatales y oncológicas. Además se aplica en las ciencias agropecuarias y por supuesto, en la Biología molecular.

BibliografíaBibliografíaSantambrosio, Eduardo “PCR (Polymerase

chain reaction) Reacción en cadena de la polimerasa” Universidad Tecnológica Nacional,

Pérez de Castro, Ana María “Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR)” Universidad Politécnica de Valencia.

Diazaraque, R; Pacheco, R; Roiz, J.C “Reacción en cadena de la polimerasa. Fundamentos y aplicación en Medicina Interna” Comentarios Clínicos, Hospital Universitario de La Paz, Madrid.

Muchas Gracias…