REACCIONES DE PARDEAMIENTO ENZIMATICO

I. OBJETIVOS

Observar el pardeamiento enzimático que ocurre en la manzana

II. MARCO TEORICO

PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO

El pardeamiento enzimático aparece fundamentalmente en los tejidos vegetales

cuando se daña por ejemplo por un corte, siendo el color parduzco que aparece al

estar al contacto con el aire un pardeamiento enzimático. El tejido produce esta

coloración como defensa contra el crecimiento de mohos, pero sin embargo

afectará al aspecto visual del alimento.

Este fenómeno se debe a la acción de unas enzimas, las FENOLASAS. Como

sustrato de estas enzimas están los compuestos fenólicos por lo que afectan a los

pigmentos con estructura fenólica. La acción de las fenolasas se divide en dos

actividades.

 

Actividad cresolasa, que provoca la oxidación de los fenoles dando orto-difenoles.

Actividad catenolasa, que forma ortoquinonas que reaccionan entre ellas

produciendo compuestos que dan color parduzco.

El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de

polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando

se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato.

También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales.

Se descubrió primero en los champiñones, en los que el efecto de pardeamiento

tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente.

En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimático puede ser un problema

muy serio en frutas, patatas y otros vegetales, e incluso en la industria del vino, al

producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o

incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas pérdidas son muy

importantes en el caso de las frutas tropicales, productos trascendentales para la

economía de muchos países poco desarrollados.

A pesar del nombre genérico de “pardeamiento” (“browning” en inglés), los colores

formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del

alimento y de las condiciones del proceso. En algún caso, como en las pasas,

otras frutas secas, la sidra, el té o el cacao, el pardeamiento enzimático contribuye

al desarrollo de los colores característicos de estos productos, aunque como se ha

indicado, en otros muchos constituye un problema grave. Además de la alteración

del color, los productos formados pueden reaccionar con las proteínas,

insolubilizándolas. Por otra parte, puede producirse también una pérdida

nutricional, ya que aunque la polifenoloxidasa no oxida directamente al ácido

ascórbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la

reacción.

La reacción de pardeamiento enzimático

El pardeamiento enzimático es un conjunto complejo de reacciones, que se inicia

por la o las reacciones catalizadas de forma enzimática. La primera de ellas,

cuando el sutrato presente es un monofenol, es su transformación en difenol. La

segunda, la transformación del difenol en quinona. En el caso de la tirosina

(monofenol) se forma primeramente la dopa (difenol) y luego la dopaquinona

(quinona).

A partir de la formación de la quinona, la reacción progresa de forma espontánea.

Las quinonas se pueden convertir en trifenoles por reacción con el agua, y

posteriormente oxidarse a hidroxiquinonas. Todas estas sustancias son muy

reactivas, dando lugar a polímeros y reaccionando con otras sustancias presentes

en el alimento, especialmente proteínas. Los productos finales, llamados

melaninas, son de color muy oscuro, o negro, e insolubles en agua. Estos

polímeros tienen propiedades antimicrobianas, y podrían ser un mecanismo de

defensa de los vegetales contra infecciones.

Substratos

Los sustratos de la reacción pueden ser monofenoles o difenoles. En los

vegetales, el sustrato más extendido es probablemente el ácido clorogénico, en el

que el grupo fenólico se encuentra unido a un resto de azúcar, que se encuentra,

entre otros, en manzanas, peras, melocotones, ciruelas, uvas, aguacates y

patatas. En algunos vegetales se encuentran además DOPA, dopamina, p-cresol,

ácido cafeico y otros fenoles.

Las polifenoloxidasas son también en muchos casos capaces de oxidar aminas

aromáticas para formar o-aminofenoles.

Control de la reacción de pardeamiento

El control natural de la actividad de la polifenoloxidasa se produce

fundamentalmente mediante la compartimentalización de los sustratos. El enzima

se encuentra en los plástidos y cloroplastos (en los vegetales superiores), y

también en el citoplasma celular, mientras que los compuestos fenólicos que

pueden servir de sustratos se acumulan en vesículas. Cuando se rompe la

compartimentalización por un daño mecánico, como el triturado, corte o

congelación y descongelación, la reacción de pardeamiento se puede producir.

También se produce la inhibición del enzima por los productos de la reacción.

Además de manteniendo la compartimentalización, la reacción de pardeamiento

se puede frenar actuando sobre diferentes factores:

Evitando el contacto del oxígeno con la superficie de corte

Bajando al temperatura

Reduciendo el pH

Desnaturalizando el enzima

Generalmente estos factores actúan de forma combinada. Así, el descenso de pH

puede actuar inicialmente reduciendo la actividad del enzima, (su pH óptimo está

entre 5 y 7), pero también, si es suficientemente bajo, desnaturalizándola de forma

irreversible.

Los reductores pueden actuar de varias formas, entre ellas revertiendo la reacción

de quinonas a fenoles. También pueden actuar directamente sobre el centro activo

del enzima, transformando el cobre 2 en cobre 1, que se disocia más fácilmente.

El sulfito y la cisteína, además de reaccionar con las quinonas reduciéndolas a

difenoles, inactivan el enzima. Los sulfitos presentan el problema de su toxicidad

diferenciada para algunas personas, un pequeño porcentaje de los asmáticos, que

pueden sufrir crisis severas con cantidades incluso inferiores a los límites legales.

Consecuentemente, existe una tendencia a reducir la utilización de sulfitos,

aunque no siempre es posible.

Un inhibidor muy eficiente la actividad de la polifenoloxidasa de los crustáceos es

el ácido bórico, aunque actualmente está prohibido su uso, dados los riesgos de

toxicidad.

Para que se produzca este pardeamiento es necesario, por lo tanto, la presencia

de los tres componentes: enzima, substrato más el oxígeno. Como nada se puede

hacer o muy poco con el substrato oxidable, los métodos hoy en uso tienden a

inhibir la enzima o a eliminar el oxígeno y algunas veces se combinan ambos

métodos.

a) Inactivación de la enzima mediante calor. Tiene la ventaja de que no se

aplica aditivo alguno, pero presenta el inconveniente de que la aplicación de calor

en frutas frescas produce cambios en la textura, dando sabor y aspecto a cocido.

Para evitar estos inconvenientes se regula el tiempo de calentamiento,

acortándolo justo al mínimo capaz de inactivar la enzima por un escaldado

inmediato. Se puede controlar la inhibición enzimática por la prueba del catecol. La

inhibición es lenta a 75°, pero se hace rápida a 85°C.

b) Inactivación de la enzima mediante inhibidores químicos:

Anhídrido sulfuroso: Es uno de los más efectivos y económicos inhibidores

químicos hoy usados en la industria alimentaría, aunque su olor y sabor

desagradables pueden comunicarse al alimento cuando se emplea en grandes

cantidades. Su uso no es aconsejable en alimentos ricos en tiamina y vitamina C,

pues las destruye. En el caso de la tiamina, el SO2 es capaz de romper el anillo

tiazólico de la vitamina, separando el anillo de pirimidina, con lo que pierde su

carácter vitamínico.

La polifenoloxidasa es muy sensible al SO2, pero la reacción debe realizarse antes

que se formen las quinonas por oxidación del substrato, pues éstas oxidan al SO2,

por lo que pierde entonces su propiedad de inhibir la enzima.

Acidos: Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimática, que es óptima entre 5 y 7.

Aunque luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera,

impidiéndose así el pardeamiento. Entre los ácidos más usados está el málico,

que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la cual es uno de sus

componentes naturales; también se usa, pero en menor proporción, el ácido

cítrico.

Acido ascórbico: Este ácido es el más recomendado para evitar o minimizar el

pardeamiento enzimático, por su carácter vitamínico inofensivo. El ácido ascórbico

por sí mismo no es un inhibidor de la enzima: actúa sobre el substrato, de modo

que puede adicionarse después de haberse formado las quinonas; Tiene la

propiedad de oxidarse a ácido dehi-hidroascórbico, reduciendo la quinona a fenol.

Esto lo hace el ácido ascórbico hasta que se haya transformado totalmente en

dehidroascórbico que ya no puede reducir las quinonas, de manera que éstas

continúan, entonces, su oxidación hasta la formación de melanoides. El ácido

dehidroascórbico aún puede ser perjudicial al formar, en la esterilización posterior,

melanoides con los aminoácidos presentes; por » eso la adición de ácido

ascórbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a

otras frutas exceso de ácido ascórbico para inactivas totalmente la enzima, se

logra prevenir el pardeamiento en forma efectiva y permanente.

Productos especialmente propensos a empardecer por oxidación química, cómo

manzanas, peras, duraznos, damascos, ciruelas y plátanos entre las frutas, y

papas, espárragos, zanahorias entre las hortalizas, deben mantenerse,

inmediatamente después de cortadas o peladas, en agua adicionada de 0,1-0,2 %

de ácido ascórbico y de 0,2% de ácido cítrico.

Además, para evitar alteraciones de color por oxidación química en las conservas

enlatadas, es conveniente agregar por cada litro de líquido de relleno 0,5-1 g de

ácido ascórbico (y 0,25-0,50 g de ácido cítrico, según lo admita el producto en

cuanto al sabor). Para mantener el color de conservas de champiñones y otros

hongos es conveniente una adición de 0,15-0,20 g por litro y para el choucroute se

agrega a la salmuera 1-2 g/kg de ácido ascórbico, poco antes del envase.

Otros inhibidores químicos: Entre las sales propuestas para controlar el

pardeamiento la más usada es NaCl, cuya acción impide la actividad de la

polifenol-oxidasa frente al ácido clorogénico. Una sumersión en solución acuosa

diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar por corto tiempo el

obscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser

sometidas al procesamiento; Su contenido en ácido ascórbico sé mantiene,

entonces, constante durante varias horas.

Se aplica el bloqueo de los hidróxilos fenólicos por adición de complejantes con el

cobre de la enzima, como el ácido cítrico (0,2%) y boratos

(0,2% + 0,01% SO2). También la cisteína y otros dadores de SH se unen a los

fenoles, dando complejos incoloros, previa reducción de las quinonas.

El uso de jugos de piña o de limón para evitar el pardeamiento en preparaciones

caseras, se basa en el contenido de compuestos sulfhidrílicos del primero y en

ácidos cítrico y ascórbico del segundo.

c) Eliminación del oxígeno: La exclusión o limitación de la influencia del O2 del

aire al trabajar y envasar rápidamente el material y en caso necesario con ayuda

del vacio o en atmósfera inerte representan medidas satisfactorias para mantener

ciertas frutas al estado lo más natural posible, especialmente en lo que se refiere a

textura y sabor. Para frutas destinadas a la congelación, se usa también azúcar y

jarabe para cubrir la superficie, retardando así la entrada del oxigeno atmosférico.

Los agentes quelantes, capaces de eliminar los átomos de cobre del centro activo

del enzima, y consecuentemente inactivarla, son inhibidores muy eficientes.

Pueden utilizarse el EDTA, pirofosfato, y especialmente el ácido cítrico, que

combina el efecto de la acidez con la capacidad secuestrante de metales.

Algunas otras sustancias, como el ácido benzoico y otros compuestos aromáticos,

actúan reduciendo la actividad del enzima al competir con los sustratos. Y, por

supuesto, la desnaturalización térmica, por ejemplo mediante escaldado con

vapor, es un sistema muy eficaz, cuando puede utilizarse.

III. PARTE EXPERIMENTAL

Tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en reacción de

pardeamiento

1) Utilizar cuarta parte de una manzana y cortarla en dos trozos. Desmenuza

uno de los trozos y ponerlo en un vidrio de reloj junto al trozo entero.

Comparar el pardeamiento que se produce en las dos muestras.

2) Cuando el trozo entero esté marrón, dividirlo en tres partes mediante rotura

y por corte. Observar el color del interior del trozo de manzana y hallar cual

pardea más rápidamente, sí la superficie rota o cortada.

3) Utilizando zumo de manzana: Poner 10mL en un tubo de ensayo y otros

10mL en una placa petri.

¿En cuál de las dos muestras se encontrará mayor grado de pardeamiento?

La alteración de la estructura celular de la manzana no alcanza más allá del

substrato, la reacción de los compuestos fenólicos se activa por contacto con

oxigeno atmosférico.

El efecto del calor en la reacción

Obtener zumo de manzana de la manera que se ha descrito. Poner

aproximadamente 10mL de zumo en cada uno de los tubos de ensayo A, B, C y D.

Tubo A.- Calentarlo a la llama del mechero y dejar que su contenido hierva

durante un minuto.

Tubo B.- Ponerlo en un baño de agua a 50ºC.

Tubo C.- Ponerlo en un baño de agua a 100ºC.

Tubo D.- Mantenerlo a la temperatura de la habitación.

Dar las razones por las que afirma que pardeamiento del zumo de manzana es

una reacción enzimático.

Poner a hervir un trozo de manzana durante un minuto, dejándolo después

expuesto al aire.

¿Cuál es la diferencia si se compara con una muestra que no ha sufrido la acción

del calor?

El efecto del pH

Utilizando trozos de manzana. Poner 5 trozos de manzana sobre vidrio de reloj y

empaparlos de una de las siguientes disoluciones:

A ácido cítrico al 1%

B ácido cítrico al 0.5%

C zumo de limón

D agua

E solución de carbonato de ácido de sodio al 1%

Dejarlos varias horas y comparar el pardeamiento que haya tenido lugar.

(El grado de reaccion alcanza su maximo con valores de pH entre 6 y 8. Con pH

menor que 3 se inhibe casi completamente la reacción)

El efecto de ácido ascórbico

El ácido ascórbico es antioxidante natural, razón por lo cual inhibe el

pardeamiento, pero llega un momento en que el mismo llega a oxidarse y de esta

manera se inutiliza su acción. Por esto, si se añade ácido ascórbico hay un retraso

en la aparición del pardeamiento. El retraso es aún mayor, consiguiendo una

concentración alta de ácido ascórbico en la tecnología de alimentos.

Poner 5 trozos de manzana sobre vidrios de reloj y tratar cada uno, con una de las

cinco soluciones siguientes:

A ácido ascórbico al 5%

B ácido ascórbico al 2.5%

C ácido ascórbico al 1%

D agua

E ácido clorhídrico 2M

Anotar el tiempo en que cualquier trozo llega a ponerse marrón que el trozo E.

Este actúa como testigo cuyo pardeamiento es imposible por la adición de ácido

clorhídrico 2M.

¿Por qué no se puede utilizar el ácido clorhídrico 2M para inhibir el pardeamiento

de las frutas?

IV. RESULTADOS Y OBSERVACIONES

Tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en reacción de

pardeamiento

¿En cuál de las dos muestras se encontrará mayor grado de pardeamiento?

Al romper parte de la manzana y cortar la otra parte con un cuchillo, se pudo

observar que la primera de estas comenzó a cambiar a un color marrón mas

rápido q la segunda.

El efecto del calor en la reacción

¿Cuál es la diferencia si se compara con una muestra que no ha sufrido la acción

del calor?

A medida que vamos incrementando la temperatura el pardeamiento es mas lento

con respecto a un trozo de manzana dejado a temperatura ambiente.

El efecto de ácido ascórbico

A medida que incrementamos la concentración de ácido ascórbico el

pardeamiento disminuye con respecto al tiempo.

¿Por qué no se puede utilizar el ácido clorhídrico 2M para inhibir el pardeamiento

de las frutas?

Porque el ácido clorhídrico degrada la materia orgánica y también es perjudicial

para el consumo humano.

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

El pardeamiento enzimático se puede evitar impidiendo el contacto con el

oxígeno. Esto se hace sumergiendo en el agua y escaldando los productos

para inactivar las fenolasas. La adición de ácidos (cítricos o málicos por

ejemplo) hará que la encima no se encuentre en su pH óptimo de actuación.

Se pueden usar agentes secuestrantes ya que la enzimas tiene cobre en su

estructura por lo que sí lo queremos evitamos la acción de la fenolasa

aunque esta medida no la podemos utilizar en muchos casos.

El ácido ascórbico actúa de varias formas; por un lado gasta el oxígeno

porque se oxida la vitamina C al ser reductor, eliminando el oxígeno del

medio. Por otro lado reacciona con las ortoquinonas y desplaza la reacción

hacia la formación de orto-difenoles.

Procurar que las muestras de manzana no se oxiden rápidamente antes de

haber efectuado la experiencia ya que si esto sucede no podremos observar

los resultados.

VI. BIBLIOGRAFÍA

Dona B. Ott. Manual de laboratorio d los Alimentos.

http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/enzimas/tirosinasa.html

www.arrakis.es/~lluengo/pproteinas.html