Receptores y señalización: receptores de célula B y de...

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Todos los eventos de señalización empie zan con una interacción complementaria entre un ligando y un receptor. En esta figura se des cribe la interacción molecular entre las regiones variables de una molécula de anticuerpo (las cadenas ligera y pesada se muestran en azul y rojo, respectivamente) y el extremo de la molécula de hemaglutinina del virus de la influenza, que se muestra en amarillo. [Ilustración basada en datos de cristalografía de rayos X recabados por P.M. Colman y W.R. Tulip de GJVH Nossal, 1993, Scientific American 269(3):22.]

■ Interacciones receptor-ligando

■ Estrategias comunes usadas en muchas vías de señalización

■ Vías de señalización que se encuentran con frecuencia

■ La estructura de los anticuerpos

■ Transducción de señal en células B

■ Receptores de células T y señalización

La coordinación de las funciones fisiológicas en todo el organismo depende de la capacidad de células individuales para detectar cambios en su ambiente y para mostrar respuesta de manera apropiada. Una de

las principales rutas mediante las cuales una célula interpreta su entorno es por medio de la unión de moléculas de señales a proteínas receptoras asociadas a la célula. Una molécula que se une a un receptor es un ligando. La unión no covalente de un ligando a su receptor puede inducir alteraciones en el receptor mismo, en su estado de polimerización, o en el ambiente de ese receptor, o en varios de estos factores a la vez; estos cambios actúan para transmitir o transducir la señal de unión a ligando hacia el interior de la célula, lo que lleva a alteraciones de las funciones celulares. En el sistema nervioso las moléculas transmisoras de señales se llamarían neurotransmisores, y en el sistema endocrino, hormonas. En el sistema inmunitario, las moléculas extrañas que indican la presencia de entidades no propias son antígenos y las moléculas pequeñas que se comunican entre las diversas poblaciones de células inmunitarias son las citocinas. Las citocinas especializadas que inducen quimioatracción o quimiorrepulsión se denominan quimiocinas.

En este capítulo se proporciona una introducción general a la unión de receptor-ligando, y a los conceptos y estrategias a los que están por debajo de la transducción de señal. A continuación la exposición se enfoca de manera específica en los antígenos y receptores del sistema inmunitario adaptativo; se introducen los receptores de célula B y de célula T y los eventos de emisión de señales intracelulares que se producen en el momento de unión al antígeno.

Dado que las células del sistema inmunitario están distribuidas en todo el cuerpo —algunas residen en tejidos fijos y otras circulan por los diversos tejidos linfoides, la sangre y los linfáticos—, la capacidad de estas células para comunicarse con otra y para emitir señales hacia otra por medio de mensajeros moleculares citocinas y quimiocinas solubles, es esencial para su función. En el capítulo 4 se describen los eventos de transmisión de señales que se producen cuando las citocinas y quimiocinas se unen a sus receptores cognados (que coinciden con ellas). En el capítulo 5 se incluye una descripción de los receptores de reconocimiento de patrones (prr) del sistema inmunitario innato, y de los eventos de emisión de señales iniciados por su unión a antígeno.

Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T

Los conceptos esenciales que son la base de la señalización celulares en el sistema inmunitario pueden resumirse como sigue:• Una señal celular es cualquier evento que da instrucciones

a una célula para que cambie su estado metabólico o proli-ferativo.

• Las señales suelen ser generadas por la unión de un ligando a un receptor unido a la célula complementaria.

• Una célula puede hacerse más o menos susceptible a las acciones de un ligando al incrementar (regular en dirección ascendente) o disminuir (regular en dirección descendente) la expresión del receptor para este ligando.

s e c c i ó n i | Introducción66

para formar una conexión receptor-ligando biológicamente significativa. Además, puesto que cada una de estas in teracciones no covalentes sólo opera en una distancia muy corta —por lo general alrededor de 1 Angstrom (1 Å = 10–10 m)—, una inte-racción de alta afinidad entre receptor y ligando depende de un “ajuste”, o grado de complementariedad, muy cercano, entre el receptor y el ligando (figura 3-1).

¿Cómo se cuantifica la fuerza de interacciones receptor-ligando?

Considérese un receptor, R, que se une a un ligando, L. Es posi-ble describir su reacción de unión de acuerdo con la ecuación que sigue:

R + L RLk1

k–1

(Ec. 3-1)

en la cual RL representa el complejo de receptor-ligando unido, k1 es la constante de tasa hacia adelante o de asociación, y k–1 es la constante de tasa de reversa o de disociación.

La proporción de k1/k–1 es igual a Ka, la constante de aso-ciación de la reacción, y es una medida de la afinidad del par de receptor-ligando. La constante de asociación se define como la relación entre la concentración del producto de la reacción,

• El ligando puede ser una molécula soluble, o puede ser un péptido, carbohidrato o lípido presentado sobre la superfi-cie de una célula.

• Desde su punto de entrada, el ligando puede viajar largas distancias por el cuerpo en el torrente sanguíneo o los lin-fáticos antes de que llegue a una célula que porta el recep-tor adecuado.

• La unión de ligando-receptor es no covalente, aunque puede ser de afinidad bastante alta.

• La unión de ligando al receptor induce un cambio molecu-lar en el receptor. Este cambio puede ser en la forma de una alteración conformacional en el receptor, dimerización o agrupación de receptor, un cambio de la ubicación del receptor en la membrana, o una modificación covalente.

• Esas alteraciones de receptor ponen en marcha cascadas de eventos intracelulares que incluyen la activación de enzi-mas, y cambios de las ubicaciones intracelulares de molécu-las importantes.

• El resultado final de la transmisión de señales celulares a menudo, mas no siempre, es un cambio del programa de transcripción de la célula blanco.

• A veces una célula debe recibir más de una señal por medio de más de un receptor para que se llegue a un resultado particular.

• La integración de las señales recibidas por una célula ocurre en el ámbito molecular dentro de la célula receptora.

Interacciones receptor-ligando

Los receptores de antígeno del sistema inmunitario adaptativo son proteínas transmembrana situadas en la membrana plasmá-tica. La unión del ligando a su receptor cognado normalmente se produce por medio de interacciones no covalentes específicas entre el ligando y la porción extracelular del receptor de mem-brana. Aunque un linfocito individual sólo expresa un tipo de receptor de antígeno, también puede expresar muchas molécu-las receptoras diferentes para señales como citocinas y quimio-cinas y, por ende, una célula sana debe integrar las señales que provienen de todos los receptores que están ocupados en un momento dado.

La unión de receptor-ligando ocurre por medio de múltiples enlaces no covalentes

La superficie de una molécula de receptor se une a la superficie de su ligando complementario por medio de los mismos tipos de enlaces químicos no covalentes que usan las enzimas para unirse a sus sustratos, los cuales comprenden enlaces de hidró-geno y enlaces iónicos, e interacciones hidrofóbicas y Van der Waals. La clave para que la interacción receptor-ligando sea significativa es que la suma total de estas interacciones de unión se mantengan juntas, con suficiente energía de unión y durante suficiente tiempo, las dos superficies que están interactuando, a fin de permitir que una señal pase del ligando a la célula que porta el receptor. Dado que estas interacciones no covalentes son indivi-dualmente débiles, se requieren muchas interacciones de ese tipo

FigurA 3-1 La unión de receptor-ligando obedece las reglas de la química. Los receptores se unen a ligandos usando toda la gama de interacciones de enlace no covalente, incluso enlaces iónicos y de hidrógeno, e interacciones de Van der Waals e hidrofóbicas. Para que se emitan señales, los enlaces deben ser suficientemente fuertes como para mantener el ligando y el receptor en estrecha proximidad durante suficiente tiempo como para que se inicien eventos torrente abajo. En la señalización de células B y T, las interacciones activadoras también requieren agrupación de receptor. En un ambiente acuoso, las interaccio-nes no covalentes son débiles y dependen de la complementariedad estrecha de las formas del receptor y el ligando.

Ligando

CH2

Receptor

OH ••• O C CH2 CH2

NH2Enlace dehidrógeno

CH2 CH2 NH3+ –O

CH2 CH2C EnlaceiónicoO

CH2

CH3

CH

CH3 CH3

+H3N

CH2CHCH3Interaccionesde Van der WaalsCH CHCH3

CH CH3

O

O–CH2 C CH2 Enlace iónico

CH3 Interaccioneshidrofóbicas

Receptores y señalización: receptores de célula B y de célula T | c a p í t u l o 3 67

rentemente reversibles; el ligando pasa parte del tiempo unido al receptor, y parte del tiempo en un estado no unido, o “inac-tivo” (figura 3-2a). Cuando está involucrado más de un sitio de unión, es menos probable que todos los sitios receptores estén simultáneamente en el estado “inactivo” y, por ende, que el receptor libere el ligando (figuras 3-2b y 3-2c).

El término avidez se usa para describir la fuerza general de las interacciones de unión colectivas que ocurren durante unión multivalente. Durante las fases tempranas de la respuesta inmu-nitaria adaptativa a antígenos multivalentes, las células B secre-tan anticuerpo IgM, que tiene 10 sitios de unión a antígeno disponibles por cada molécula. Por ende, la IgM tiene capaci-dad de unión a antígenos a una magnitud importante desde el punto de vista biológico, incluso si la afinidad de cada sitio de unión individual por su antígeno es baja, debido a la avidez de la interacción antígeno-anticuerpo entera. De igual modo, cuando un receptor unido a célula se une a un ligando unido a célula, su interacción puede ser funcionalmente multivalente, incluso si las moléculas receptoras individuales son monovalentes, porque múltiples moléculas receptoras pueden agruparse en la mem-brana celular y participar en la interacción receptor-ligando. Además, otras interacciones con correceptor también pueden contribuir a la avidez general de la unión entre una célula y su antígeno (véase más adelante).

La afinidad de las interacciones receptor-ligando puede medirse mediante técnicas como diálisis de equilibrio o reso-nancia de plasmón de superficie (spr). Estos dos métodos se describen en el capítulo 20.

[RL], y el producto de las concentraciones de reactantes [R], multiplicado por [L]. Por consiguiente, las unidades de afinidad son M–1. Mientras más alta es la Ka, más alta es la afinidad de la interacción.

Ka [RL][R][L]

= (Ec. 3-2)

El recíproco de la constante de asociación, la constante de diso-ciación, Kd, a menudo se usa para describir las interacciones entre receptores y ligandos. Se define como:

Kd [R][L][RL]

= (Ec. 3-3)

Las unidades de la constante de disociación están en molaridad (M). La inspección de esta ecuación revela que cuando la mitad de los sitios receptores están ocupados con ligando —es decir, [R] = [RL]—, la Kd es igual a la concentración de ligando libre [L]. Mientras más baja es la Kd, más alta es la afinidad de la interacción.

Para propósitos de comparación, es útil considerar que los valores de Kd de muchas interacciones enzima-sustrato se ubi-can en el rango de 10–3 a 10–5 M. Los valores de Kd de interac-ciones antígeno-anticuerpo al principio de una respuesta inmunitaria normalmente son del orden de 10–4 a 10–5 M; sin embargo, puesto que los anticuerpos generados en el momento de la estimulación con antígeno son mutados y seleccionados en el transcurso de una respuesta inmunitaria, las interacciones antígeno-anticuerpo en etapas tardías de una respuesta inmuni-taria pueden alcanzar una Kd tan baja como de 10–12 M. En estas condiciones, si un antígeno está presente en solución a una concentración tan baja como de 10–12 M, la mitad de los sitios de unión a anticuerpo disponibles estará ocupada. Ésta es una interacción extraordinariamente fuerte entre receptor y ligando.

Las interacciones entre receptores y ligandos pueden ser multivalentes

Muchos receptores biológicos, incluso receptores de célula B, son multivalentes —es decir, tienen más de un sitio de unión a ligando por cada molécula—. Cuando tanto los receptores como los ligandos son multivalentes —como ocurre, por ejem-plo, cuando un receptor de inmunoglobulina bivalente sobre la superficie de una célula B se une a dos antígenos repetidos idén-ticos sobre una superficie bacteriana—, la interacción de unión general entre la célula bacteriana y el receptor de célula B está notoriamente aumentada en comparación con una interacción similar, pero univalente. De esta manera, múltiples interaccio-nes receptor-ligando concurrentes aumentan la fuerza de unión entre dos superficies celulares. Note que la unión por medio de dos sitios receptores idénticos a dos ligandos idénticos sobre la misma célula puede ser un poco menos de dos veces tan firme como la unión por medio de un sitio receptor único. Esto se debe a que la unión de ambos sitios receptores a dos ligandos sobre un antígeno único puede tensar un poco las característi-cas geométricas de la unión en uno de los sitios o en ambos y, por ende, interferir un poco con el “ajuste” de las interacciones individuales.

Gran parte del beneficio de la multivalencia depende del hecho de que las interacciones de unión no covalente son inhe-

FigurA 3-2 Unión monovalente y bivalente. a) Unión monovalente. El receptor existe en equilibrio con su ligando, represen-tado aquí como un círculo. Parte del tiempo está unido (la unión se encuentra en el estado “activo”), y parte del tiempo está no unido (la unión se encuentra en el estado “inactivo”). La proporción del tiempo que se pasa en el estado “activo” en contraposición con “inactivo” determina la afinidad de la interacción de receptor-ligando, y se relaciona con la fuerza de la suma de las interacciones de unión no covalente entre el receptor y el ligando. (Continúa)

a)

“Activo”

“Inactivo”


La expresión de receptor y ligando puede variar en el transcurso de una respuesta inmunitaria

Una de las características más notorias de la lógica molecular de las respuestas inmunitarias es que los receptores para algunos factores de crecimiento y citocinas sólo se expresan según se re quiere. Por ejemplo, casi todos los linfocitos expresan una forma de baja afinidad, heterodimérica (de dos cadenas), del receptor para la citocina interleucina-2 (IL-2), que inicia una señal que promueve la proliferación de linfocitos (esta citocina y su receptor se cubren con mayor detalle en el capítulo 4). Esa forma de baja afinidad del receptor es incapaz de unirse a la IL-2 a concentración fisiológica de citocina. Con todo, cuando un linfocito es activado por unión a antígeno, la señal que proviene del receptor unido a antígeno causa un incremento de la expre-sión de una tercera cadena del receptor de IL-2 en la superficie celular (figura 3-3). La adición de esta tercera cadena convierte la forma de baja afinidad del receptor de IL-2 en una forma de alta afinidad, capaz de responder a la concentración de citocina que se encuentra en los órganos linfoides. El corolario funcional de esto es que sólo los linfocitos que ya se han unido a antígeno y han sido estimulados por esa unión, tienen receptores de citocina de afinidad suficientemente alta para responder a la concentración fisiológica de citocina. Al esperar hasta que ha interactuado con su antígeno específico antes de expresar el re -ceptor de citocina de alta afinidad, el linfocito conserva energía y evita el inicio accidental de una respuesta inmunitaria contra un antígeno irrelevante.

Las concentraciones locales de citocinas y otros ligandos pueden ser en extremo altas

Al considerar las interacciones entre receptores y sus ligandos, es importante considerar el ambiente anatómico en el cual están ocurriendo estas interacciones. Los linfocitos y las células presen-tadoras de antígeno que participan en una respuesta inmunita-

ria pasan cantidades importantes de tiempo juntos por medio de múltiples interacciones receptor-ligando. Las señales de cito-cina liberadas por una célula T, por ejemplo, son recibidas por una célula presentadora de antígeno unida en la interfaz entre las células, antes de que la citocina haya tenido tiempo para difundirse hacia los líquidos tisulares. La secreción de citocinas hacia exactamente el sitio donde se necesitan es facilitada por la capacidad de la señalización de receptor de antígeno para indu-cir redistribución del centro organizador de microtúbulos (mtoc) dentro de la célula T activada. A su vez, la reorienta-ción del mtoc causa la redistribución de los orgánulos secre-tores (el cuerpo de Golgi y vesículas secretoras) dentro del citoplasma de la célula T, de modo que las citocinas sintetizadas por la célula T son secretadas en la dirección del receptor de célula T que, a su vez, está unido a la célula presentadora de antí-geno. El término técnico para este fenómeno es la redistribución vectorial (direccional) del aparato secretor. De este modo, las cito-cinas son secretadas de manera directa hacia el espacio entre la célula T activada y la célula presentadora de antígeno.

La redistribución vectorial del aparato secretor en células dendríticas presentadoras de antígeno también ocurre en el momento de interacción con células T específicas para antí-geno. Esto asegura que las citocinas, como la IL-12, que son secretadas por células dendríticas, sean suministradas con efi-ciencia a las células T que reconocen antígeno. La figura 3-4 muestra la secreción direccional de la citocina IL-12 por una célula dendrítica presentadora de antígeno que participa en la activación de una célula T.

Las células efectoras del sistema inmunitario, como las célu-las B, también son capaces de presentar antígenos sobre su superficie celular para reconocimiento por células T auxiliares. Una célula B que ha reconocido de manera específica un antí-geno por medio de su propio receptor procesará el antígeno y expresará una concentración en particular alta de los péptidos antigénicos unidos a moléculas del complejo mayor de histo-compatibilidad (mhc) sobre su superficie. Por ende, una célula T

FigurA 3-2 (continuación) b) Unión bivalente. Aquí se visua-liza un receptor bivalente, que se une a dos sitios en un ligando multi-valente único. Esto podría representar, por ejemplo, una molécula de anticuerpo bivalente que se une a una bacteria que tiene antígenos repetidos sobre su superficie. En esta representación, ambos sitios están ocupados. c) En esta representación, el receptor bivalente se ha separado

momentáneamente de uno de sus sitios, pero aún está fijo al ligando con el otro. Las proteínas grandes, como los anticuerpos, vibran y “res-piran” continuamente, lo que da lugar a esa cinética de activo-inactivo. La unión bivalente o multivalente ayuda a asegurar que cuando un sitio libera momentáneamente el ligando, la interacción no se pierde por completo, como se pierde en la parte a).

b) c)


lugar a una interacción de unión de fuerza y duración suficien-tes para desencadenar un cambio bioquímico en el receptor, o en sus moléculas asociadas, o en ambos. A su vez, este cambio bioquímico puede causar una diversa gama de consecuencias bio-químicas en la célula (figura 3-5, Perspectiva general). Los términos torrente arriba y torrente abajo a menudo se usan para describir elementos de vías de señalización. Los componentes torrente arriba de una vía de emisión de señales son los que están más cerca del receptor; los componentes torrente abajo son los que están más cerca de las moléculas efectoras que determinan el resultado de la vía; por ejemplo, los factores de transcripción o enzimas cuyas actividades son modificadas en el momento en que se recibe la señal.

Pese a lo discrepantes y complejas que algunas de estas vías de señalización pueden ser, muchas comparten caracte-rísticas. En esta sección, para proporcionar un marco para analizar las vías individuales empleadas por las células del sis-

auxiliar, unida a un antígeno presentado sobre la superficie de una célula B, suministrará una concentración alta de citocinas directamente a una célula B activada, específica para antígeno. Por consiguiente, la concentración local de citocinas en las inter-fases celulares puede ser en extremo alta, mucho más alta que en los líquidos tisulares en general.

Estrategias comunes usadas en muchas vías de señalización

Una vía de transducción de señal es la ruta molecular mediante la cual una interacción ligando-receptor se traduce en un cam-bio bioquímico dentro de la célula afectada. La comunicación del mensaje del ligando a la célula es iniciada por la comple-mentariedad de estructura entre el ligando y su receptor, que da

FigurA 3-4 Secreción polarizada de IL-12 (rosado) por células dendríticas (azul) en la dirección de una célula T unida (verde). La micrografía con aumento más alto muestra la secre-ción de paquetes de IL-12 a través de la membrana de la célula dendrí-tica. [J. Pulecio et al., 2010, Journal of Experimental Medicine 207:2,719.]

momento de la estimulación, la cadena alfa del receptor de IL-2 (IL-2Rα) (amarillo) está regulada en dirección ascendente, lo que aumenta la afinidad del receptor de IL-2 por la IL-2. En el momento de estimulación con antígeno se observa una regulación ascendente similar del IL-2Rα. [Cortesía de R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA.]

FigurA 3-3 La expresión de algunos receptores de cito-cina está regulada en dirección ascendente después de estimulación celular. Leucocitos teñidos con dapi, un colorante que detecta dna (azul), no se trataron (izquierda) o se estimularon con el mitógeno de células T humanas fitohemaglutinina (derecha). En el


La unión de ligando a receptores sobre una célula induce diversos efectos torrente abajo, muchos de los cuales culminan en activación de factor de transcripción. Aquí se ilustran algunas de las vías que se abor-dan en este capítulo. La unión del receptor a ligando induce agrupa-ción de receptores y moléculas emisoras de señales hacia regiones de la membrana denominadas balsas de lípidos (rojo). La unión de recep-tor a ligando puede acompañarse de unión de correceptores asociados a sus propios ligandos, y causa la activación de tirosina cinasas asocia-das con receptor, que fosforilan proteínas asociadas con receptor. La unión de moléculas adaptadoras torrente abajo a los grupos fosfato sobre proteínas adaptadoras crea un andamio en la membrana que permite entonces la activación de diversas enzimas, entre ellas fosfatasa Cγ (PLCγ), PI3 cinasa, y otras tirosina cinasas. PLCγ divide el fosfatidil inositol bifosfato (PIP2) para dar trifosfato de inositol (IP3), que interactúa con receptores sobre vesículas del retículo endoplasmático para causar

la liberación de iones calcio; éstos a su vez activan la calcineurina, que desfosforila el factor de transcripción nfat, lo que le permite entrar al núcleo. El diacilglicerol (dag), que permanece en la membrana des-pués de división de PIP2 por PLCγ, se une a, y activa, la proteína cinasa C (pkc), que fosforila y activa enzimas que llevan a la destrucción del inhibidor del factor de transcripción NF-κB. Con la liberación del inhibi-dor, NF-κB entra al núcleo y activa una serie de genes importantes para el sistema inmunitario. La unión de la proteína adaptadora Ras-GRP al complejo de emisión de señales permite la unión y la activación del factor de intercambio de nucleótido guanina (gef ), Son of Sevenless (sos) que, a su vez, inicia la cascada de fosforilación de las vías de la MAP cinasa. Esto da pie a la entrada de un tercer grupo de factores de transcripción al núcleo, y activación del factor de transcripción AP-1. (Muchos detalles que se explican en el texto se han omitido de esta figura en aras de la claridad.)

Ligando

Receptor

Correceptor

Tirosina cinasaasociada a receptor

Moléculas asociadasa receptor

PI3cinasa IP3

Liberación de Ca2+

desde el retículoendoplasmático

Activación de calmodulinay calcineurina

Adaptador Adaptador

Cascada de laMAP cinasa

AP-1

Activación de gen

Citoplasma

Núcleo

Intercambiode GDP/GTP

Ubiquitinacióny destrucción

Ras-GRP

Ras

PKC

DAG

NF-κB IκB

DAGPIP3

PIP2

DAG

NFAT

NFAT

PIP3PIP2

P P

P

P

P P

P

P P

P

P

P

Fosforilación

NF-κB

SOSPLCγ

Conceptos en la señalización de linfocitos

3-5PeRSPecTIva geneRaL


tema inmunitario, se describen algunas de las estrategias com-partidas por muchas vías de emisión de señales. En la sección que sigue se proporcionan tres ejemplos de vías de emisión de señales usadas por el sistema inmunitario, así como por otros sistemas.

La unión a ligando puede inducir cambios conformacionales en el receptor, o agrupación del receptor, o ambos

El primer paso necesario para la activación de una vía de seña-lización es que el sitio de unión del ligando a sus receptores de alguna manera induce un cambio físico o químico en el recep-tor mismo, o en moléculas asociadas a él. En el caso de muchos receptores de factor de crecimiento, la unión a ligando induce un cambio conformacional en el receptor que da lugar a dime-rización de receptor (figura 3-6). Puesto que las regiones cito-plasmáticas de muchos receptores de factor de crecimiento tienen actividad de tirosina cinasa, esto da lugar a la fosforila-ción recíproca de las regiones citoplasmáticas de cada una de las moléculas receptoras por su pareja de dimerización.

Otros receptores pasan por cambios conformacionales en el momento de unión a ligando, que dan lugar a órdenes más altos de polimerización de receptor. Los receptores sobre células B son formas unidas a membrana de las moléculas de anticuerpo que la célula B finalmente secretará. En la superficie de células B vírgenes hay dos tipos de receptores de antígeno, que se deno-minan inmunoglobulinas M y D (IgM e IgD). Estudios estruc-turales de la forma IgM del receptor han revelado que la unión a ligando induce un cambio conformacional en una parte no de unión a antígeno del receptor, cerca de la membrana, que faci-lita la agregación de receptores hacia complejos multiméricos, y su movimiento subsiguiente hacia regiones de la membrana especializadas. De modo similar, los receptores de célula T se

agrupan en el momento de unión a antígeno. Persisten las con-troversias respecto a si pasan o no por un cambio conformacio-nal en el momento de unión a antígeno.

Algunos receptores requieren moléculas asociadas a receptor para emitir una señal de activación celular

En contraste con los receptores de factor de crecimiento, que tienen actividades enzimáticas inducibles integradas en la molécula de receptor misma, los receptores de célula T y B tie-nen componentes citoplasmáticos muy cortos y, por ende, nece-sitan ayuda de moléculas asociadas a receptor intracelulares para desencadenar transducción de señal. El heterodímero Igα/Igβ (CD79α/β) en células B, y el complejo CD3 hexamérico en células T, están estrechamente asociados con sus receptores de antígeno respectivos, y se encargan de transmitir al interior de la célula las señales iniciadas por unión a ligando (figura 3-7). Estos dos complejos tienen un par de colas citoplasmáticas largas que contienen múltiples copias del motivo de activación de inmu-norreceptor basado en tirosina (Immuno-receptor Tyrosine Activation Motif [itam]). Los itam son motivos de secuen-cia recurrentes que se encuentran en muchas proteínas emiso-ras de señales dentro del sistema inmunitario, que contienen tirosinas que quedan fosforiladas después de transducción de señal por medio del receptor asociado. La fosforilación de resi-duos de itam-tirosina a continuación permite el acoplamiento de moléculas adaptadoras, lo que facilita el inicio de la cascada de señalización.

Otras moléculas asociadas con los receptores de antígeno de célula B o T también pueden interactuar con el antígeno o con otras moléculas sobre la superficie del agente patógeno. Por ejemplo, en el caso de las células B, el complejo de CD19/CD21 se une a moléculas de complemento fijas de manera covalente al antígeno (figura 3-7a). De modo similar, moléculas de CD4 y CD8 sobre células T se unen a regiones no polimórficas de la molécula de mhc que presenta antígenos, y ayudan en la trans-ducción de señal (figura 3-7b). Por último, el correceptor CD28 sobre células T vírgenes debe interactuar con sus ligandos CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) para que ocurra activación completa de célula T.

La agrupación de receptor inducida por ligando puede alterar la ubicación de receptor

La agrupación inducida por ligando de receptores de célula B y T lentifica las tasas de su difusión dentro de los planos de sus respectivas membranas celulares, y facilita su movimiento hacia regiones especializadas de la membrana del linfocito conocidas como balsas de lípidos. Estas balsas son regiones de la mem-brana ricas en colesterol y en esfingolípidos, insolubles en deter-gente, muy ordenadas, pobladas por muchas moléculas cruciales para la emisión de señales de receptor. El movimiento de recep-tores y correceptores hacia las balsas de lípidos las hace suscepti-bles a la acción de enzimas asociadas con esas balsas. En la figura 3-8 se muestra cómo la tirosina cinasa asociada a balsa Lyn inicia la cascada de emisión de señales de célula B al fosfo-rilar las moléculas asociadas con receptor Igα e Igβ. La tirosina cinasa Lck desempeña una función similar en la cascada de señalización de tcr.

FigurA 3-6 algunos factores de crecimiento inducen dimerización de sus receptores, seguida por fosforilación de tirosina recíproca de las moléculas de receptor. Muchos recep-tores de factor de crecimiento poseen actividad de tirosina cinasa en sus regiones citoplasmáticas. La dimerización del receptor ocurre en el momento de unión del ligando relevante y permite fosforilación recí-proca en múltiples sitios de las cadenas de receptor dimerizadas, lo que inicia la cascada de señalización. Como un ejemplo, el factor de células madre se une a su receptor, c-kit (CD117), sobre la superficie de células del estroma de la médula ósea.

Tirosina cinasasreceptoras inactivas

Actividad de cinasa estimuladapor fosforilación cruzada

Factor decrecimiento

Dominiode tirosinacinasa

Citosol

PP

P

P

P

P

P

P


FigurA 3-7 Los receptores de células tanto B como T requieren moléculas asociadas a receptor y correceptores para la transducción de señal. a) Los receptores de célula B requieren Igα/Igβ para transmitir su señal. El correceptor CD21, que está asociado con CD19, se une a la molécula de complemento C3d, que se une de manera covalente al antígeno. La interacción entre CD21 sobre la célula B, y C3d asociada con el antígeno, mantiene el antígeno en contacto con el receptor de célula B, incluso cuando la unión de antí-geno-BCR es relativamente débil. Las bandas de color amarillo sobre las re giones citoplasmáticas de las moléculas asociadas a receptor indican motivos de activación de inmunorreceptor basados en tirosina (Immuno-receptor Tyrosine Activation Motifs [itam]). La fosforilación de residuos tirosina en estos motivos permite la unión de moléculas adaptadoras

torrente abajo, y facilita la transducción de señal desde los receptores. Tanto CD19 como Igα/Igβ portan itam intracitoplasmáticos y, junto con CD81 (TAPA-1), participan en eventos de señalización torrente abajo. b) Los receptores de célula T usan CD3, un complejo de cadenas δε, γε, y un par de moléculas de cadena ζ o un par de ζν. Los correcep-tores CD4 y CD8 se unen a la región no polimórfica de las moléculas del mhc clase II o clase I, respectivamente; esta figura ilustra la unión de CD4 a mhc clase II. Dicha unión asegura la conexión entre la célula T y la célula presentadora de antígeno, e inicia también una señal por medio de CD4/8. El correceptor CD28 proporciona otra señal en el momento de unión a CD80 o CD86. La unión de CD28 a moléculas coestimuladoras sobre células presentadoras de antígeno se requiere para estimulación de células T vírgenes, pero no de memoria.

s s

MHCclase II

Péptido

ITAM

CD4

CD28

CD3

CD80 oCD86

TCR

ζ ζ γε εδ

Antígeno

mIgM

C3d

CD21

CD81(TAPA-1)

CD19

lgα/lgβ(CD79α,β)

FigurA 3-8 Regiones balsa de lípidos dentro de membra-nas. En células B en reposo, el receptor de célula B (bcr) es excluido de las balsas de lípidos, que son regiones de la membrana altas en coles-terol y ricas en glicoesfingolípidos. La balsa está poblada por moléculas emisoras de señales de tirosina cinasa, como Lyn. En el momento de unión a antígeno, el bcr se multimeriza (forma agrupaciones), y los cambios en la conformación del bcr desencadenados por su multime-

rización aumentan la afinidad del bcr por los lípidos de la balsa. El movimiento del bcr hacia la balsa lo pone en contacto con la tirosina cinasa Lyn, que fosforila las proteínas asociadas a receptor Igα/Igβ lo que, así, inicia la cascada de activación. Un movimiento similar de tcr hacia balsas de lípidos ocurre en el momento de activación de célula T. [Adaptado de S. K. Pierce, 2002, Nature Reviews Immunology 2:96.]

Lyn

Syk

lgα/lgβ

PP

P

Syk

BLNK BLNK

LynLyn

+ Antígeno

Antígeno

Traducciónde señal

Internalizaciónde receptor

Balsa

BCR

– Antígeno

P


La fosforilación de tirosina es un paso temprano en muchas vías de señalizaciónMuchas vías de emisión de señales, en particular las que emiten señales para el crecimiento de células o la proliferación de estas últimas, se inician con un evento de fosforilación de tirosina. Muchas de las tirosina cinasas que inician la activación de bcr y tcr pertenecen a la familia de enzimas conocida como cinasas de la familia Src. Las cinasas de la familia Src (que en idioma inglés se pronuncia “sark”) tienen homología con un gen, c-src, que se identificó por vez primera en aves. Se mostró que un virus del sarcoma Rous homólogo de estos genes, activo de manera

constitutiva, v-src, induce una forma de cáncer, el fibrosarcoma, en aves. El hecho de que una mutación sencilla en esta forma viral de un gen que codifica para tirosina cinasa podría dar lugar a la aparición de un tumor fue el primer indicio de que los genes que codifican para tirosina cinasa pueden ser importantes en la regu-lación de la proliferación celular y, de hecho, en muchos aspectos de la señalización celular.

Las cinasas de la familia Src son importantes en las etapas más tempranas de activación de células tanto T como B. Lck y Fyn son cruciales para la activación de células T, y Lyn, Fyn y Blk desempeñan los papeles iniciadores correspondientes en células B. Puesto que la activación inadvertida de estas enzimas puede llevar a proliferación incontrolada —un precursor para la forma-ción de tumor—, no sorprende que su actividad esté estrecha-mente regulada de dos maneras distintas pero interconectadas.

Las enzimas tirosina cinasa de la familia Src inactivas existen en una conformación cerrada, en la cual una tirosina fosforilada está estrechamente unida a un dominio SH2 (dominio de homo-logía de SH2 [Src homology 2]) interno (figura 3-9, cuadro 3-1). (Los dominios SH2 en proteínas se unen a residuos de tirosina fosforilados.) Mientras la tirosina inhibitoria esté fosforilada, la cinasa de la familia Src permanece plegada sobre sí misma e inac-tiva. En linfocitos, la enzima tirosina cinasa Csk se encarga de mantener la fosforilación de la tirosina inhibitoria. Aun así, en el momento de la activación celular, una tirosina fosfatasa elimina el fosfato inhibidor, y la cinasa de la familia Src se abre hacia una conformación parcialmente activa. Así, el evento iniciador en la transducción de señal a menudo es el movimiento de la tirosina cinasa hacia una región de la célula o la membrana poblada por una fosfatasa activadora, apropiada, y distante de la cinasa inhibi-dora Csk. A continuación se logra actividad completa cuando la cinasa de la familia Src se fosforila a sí misma en un segundo resi-duo de tirosina activador.

FigurA 3-9 activación de cinasas de la familia Src. Las cinasas de la familia Src son mantenidas en una configuración cerrada, inactiva, por la unión de un residuo de tirosina inhibidor fosforilado (pY508 en este ejemplo) con un dominio SH2 en la misma proteína. La desfosforilación de esta tirosina abre la molécula, lo que permite que el sustrato tenga acceso al sitio enzimático. La abertura de la cinasa también permite la fosforilación de una tirosina interna diferente (pY397), que estimula más la actividad de la cinasa Src.

Inactiva

SH2

Cinasa

pY508

Y508Y397

pY397

P

Activa

SH2

CinasaP

Dominio de proteína adaptadora especificidad de unión de dominio adaptador

Homología de Src 2 (SH2) Fosfotirosina específica (pY) —que contiene motivos en el contexto de tres a seis aminoácidos ubicados en posición carboxilo terminal a la pY (se requiere una arginina invariable en el dominio SH2 para unión a pY)

Homología de Src 3 (SH3) Secuencias ricas en prolina en una hélice de poliprolina zurda (los residuos de prolina por lo general van precedidos por un residuo alifático)

Unión a fosfotirosina (PTB) Motivos peptídicos que contienen pY (DPXpY, donde X es cualquier aminoácido) en el contexto de secuencias amino terminal

Homología de pleckstrina (PH) Fosfoinositidas específicas, que permiten que proteínas que contienen PH respondan a la generación de segundos mensajeros lípidos generados por enzimas como la PI3 cinasa

WW Se une a secuencias ricas en prolina (su nombre se deriva de dos residuos de triptófano [W] conservados, con 20 a 22 aminoácidos de separación)

Secuencias ricas en cisteína (C1) Diacilglicerol (DAG) (en asociación con DAG, el dominio C1 muestra afinidad aumentada por la mem-brana lipídica, lo que promueve el reclutamiento de proteínas que contienen C1 hacia la membrana)

Unión a tirosina cinasa (TKB) Dominio de unión a fosfotirosina divergente de los dominios SH2 y PTB típicos (consta de tres motivos estructurales [un fascículo de cuatro hélices, una mano EF, y un dominio SH2 divergente], que juntos forman un dominio de reconocimiento de fosfoproteína integrado)

Rico en prolina Tramos de secuencia de aminoácidos ricos en residuos de prolina, capaces de unirse a dominios modulares, entre ellos dominios SH3 y WW

Motivos de unión a 14-3-3 Residuos de serina fosforilados en el contexto de uno de los dos motivos RSXpSXP y RXXXpSXp

[Según G.A. Koretsky y P.S. Myung, 2001, Nature Reviews Immunology 1:95]

Dominios seleccionados de proteínas adaptadoras y sus motivos blanco de unióncUaDRo 3-1


particular. En muchas vías de emisión de señales, múltiples pro-teínas adaptadoras pueden participar en la formación de un andamio de proteína que proporciona un marco estructural para la interacción entre miembros de una cascada de emisión de señales. Los dominios en particular comunes en proteínas adaptadoras que funcionan en la señalización del sistema inmu-nitario son el dominio SH2 que se une a residuos de tirosina fosforilados (pY), el dominio SH3 que se une a agrupaciones de residuos de prolina, y el dominio de homología de plecstrina (PH) que se une a fosfatidil inositol trifosfato en la membrana plasmática.

La unión de proteínas adaptadoras puede simplemente poner en contacto moléculas entre sí, de modo que, por ejemplo, una enzima puede actuar sobre su sustrato. De modo alternativo, la unión de una proteína adaptadora puede inducir un cambio conformacional, que a su vez puede estabilizar la pareja de unión, desestabilizarla o activarla.

La transducción de señal puede inducir cambios conforma-cionales en proteínas que a su vez dan lugar a descubrimiento de uno o más dominios de proteína con afinidad específica por otras proteínas. Esas interacciones pueden ser homotípicas (in -teracciones entre dominios idénticos) o heterotípicas (interac-ciones entre dominios diferentes).

La fosforilación sobre residuos de serina y treonina también es un paso común en vías de señalización

En tanto la fosforilación de tirosina suele observarse al inicio de una cascada de emisión de señales, la fosforilación de proteínas en residuos de serina y treonina (figura 3-10) tiende a ocurrir en pasos más avanzados en la activación celular. La fosforilación de serina o treonina puede servir para activar una enzima fos-forilada, para inducir la interacción de una proteína fosforilada con un grupo diferente de proteínas, para alterar la ubicación de la proteína dentro de la célula, para proteger la proteína contra destrucción o, en algunos casos importantes, para con-

La fosforilación de tirosina puede desencadenar cambios en una vía de emisión de señales de más de una manera. A veces, la fosforilación de un residuo de tirosina puede inducir un cam-bio conformacional en la proteína fosforilada misma, que puede echar a andar esta actividad enzimática o desactivarla. De ma -nera alternativa, la fosforilación de tirosina de componentes de un complejo receptor puede permitir que otras proteínas se unan a él por medio de sus dominios SH2 o de unión a fosfotirosina (cuadro 3-1), lo que altera sus ubicaciones dentro de la célula. Note que una tirosina fosforilada a menudo se denomina un residuo “pY”.

Las proteínas adaptadoras recolectan miembros de vías de señalización

Es fácil imaginar el citoplasma como un océano de macromo- léculas, con poca estructura u organización, en el cual las proteí-nas se golpean una a otra a una frecuencia que sólo depende de sus concentraciones citoplasmáticas generales. De cualquier modo, nada podría estar más lejos de la verdad. El citoplasma de hecho es un ambiente intrincadamente organizado, en el cual disposiciones tridimensionales de proteínas se forman y disper-san de una manera dirigida por eventos de emisión de señales celulares. Muchas de estas interacciones reversibles entre pro-teínas están mediadas por proteínas adaptadoras, así como por interacciones entre miembros de vías de señalización con com-ponentes del citoesqueleto.

Las proteínas adaptadoras carecen de función enzimática o de receptor intrínseca; tampoco actúan como factores de trans-cripción. Su función es unirse a motivos o dominios específicos sobre proteínas o lípidos, enlazar uno al otro; poner sustratos al alcance de enzimas, y en general mediar la redistribución de moléculas dentro de la célula. El cuadro 3-1 lista varios domi-nios adaptadores representativos, junto con sus especificidades de unión. Las proteínas adaptadoras se caracterizan por tener múltiples dominios de superficie, cada uno de los cuales posee una especificidad de unión precisa para una estructura molecular

FigurA 3-10 Tirosina, serina y treonina fosforiladas.

Tirosina Treonina

Fosfotirosina

Tirosinacinasa

OH

CH2 CH

CH2 CH

Serina/treoninacinasas

NH3+

NH3+

COO−

OH

H3N

H3C

CH

CH

+COO−

Serina

H3N CH

CH2OH

+COO−

Fosfotreonina3-Fosfoserina

COO−

OPO32−

H3N

H3C

CH

CH

+COO−

OPO32−

H3N CH

CH2O

+COO−

PO32−


sitio de unión en la superficie de la membrana interna. La ubi-cación de proteínas en la membrana las pone en contacto con otros miembros de una cascada de señalización, lo que per-mite que las enzimas tengan acceso a nuevos sustratos, y permite la modificación de proteínas adaptadoras, con el montaje subsi-guiente de complejos de emisión de señales.

La desintegración de PIP2 por plc, inducida por señal, causa un incremento de la concentración citoplasmática de ion calcioAdemás de ser fosforilado por la PI3 cinasa, el PIP2 también es susceptible a un segundo tipo de modificación bioquímica indu-cida por señal. Una segunda enzima (más correctamente, una familia de enzimas), la fosfolipasa C (Phospholipase C [plc]), también es activada en el momento de emisión de señales de antígeno de linfocitos (figura 3-12). La plc hidroliza el PIP2, lo cual separa el azúcar trifosfato de inositol (IP3) desde el esqueleto de diacilglicerol (dag). El dag permanece en la membrana, donde se une a varias enzimas de señalización importantes, y las activa. Se libera IP3 hacia el citoplasma, donde interactúa con receptores de IP3 específicos sobre la superficie de vesículas de retículo endoplasmático, lo que induce la liberación de iones calcio (Ca2+) almacenados hacia el citoplasma. Estos iones calcio a continuación se unen a varias proteínas celulares, y cambian su conformación y alteran su actividad.

La doble carga positiva de los iones calcio, y el tamaño de su radio iónico, los hacen en particular idóneos para unión a muchas proteínas; sin embargo, en el campo de la emisión de señales celulares, la calmodulina (CaM) es indiscutiblemente la proteína de unión a calcio de mayor importancia. La CaM es una proteína en forma de mancuerna, con dos subunidades globulares separadas por un bastón α-helicoidal (figura 3-13a). Cada una de las dos subunidades tiene dos sitios de unión a calcio, de modo que la CaM tiene la capacidad para unirse a cuatro iones Ca2+. En el momento de la unión a calcio, la CaM pasa por un cambio conformacional notorio (figura 3-13b), que le permite unirse a diversas proteínas celulares diferentes, y activarlas.

A medida que se usan iones Ca2+ citoplasmáticos en la unión a proteínas citoplasmáticas, y la concentración de ion Ca2+ cito-plasmática libre disminuye, empiezan a montarse proteínas de canal de Ca2+ en la membrana. Finalmente, los canales se abren para permitir la afluencia de más calcio desde el líquido extra-celular y completar la activación de las proteínas reguladas por calcio. El montaje de estas llamadas proteínas de canales de calcio operados por depósito es imposible en presencia de calcio intracelular alto.

Muchos tipos diferentes de iones se encuentran en una cé -lula, y es razonable preguntar por qué los eucariontes deben haber adquirido por evolución proteínas con actividades que muestran tanta capacidad de respuesta a la concentración de ion Ca2+ intracelular. La respuesta a esta pregunta yace en parte en el hecho de que es relativamente fácil alterar la concentración citoplasmática de iones Ca2+. La concentración de Ca2+ en la sangre y los líquidos tisulares es del orden de 1 mM, mientras que la concentración citosólica en una célula en reposo está más cerca de 100 nM —10 000 veces más baja que la concentración extracelular—. Esta diferencia es mantenida por un sistema de bombas de membrana eficiente (aunque costoso desde el punto de vista energético). Además, hay reservas de Ca2+ en concen-tración más alta dentro de vesículas intracelulares asociadas

vertir la proteína fosforilada en un blanco para la destrucción proteosomal.

La fosforilación de fosfolípidos de membrana recluta proteínas que contienen dominio PH hacia la membrana celular

El fosfolípido fosfatidilinositol bifosfato (Phosphatidyl Inosi-tol bis-Phosphate [PIP2]) es un componente de la cara interna de membranas plasmáticas de eucariontes. No obstante, el PIP2 es mucho más que un fosfolípido estructural; también participa de manera activa en la emisión de señales celulares. La enzima fosfatidil inositol-3-cinasa (Phosphatidyl Inositol-3-kinase [PI3 cinasa]), activada en el transcurso de la señalización por medio de muchos receptores inmunitarios, fosforila el PIP2 para formar fosfatidil inositol trifosfato (Phosphatidyl Inosi-tol tris-Phosphate [PIP3]) (figura 3-11). El PIP3 permanece en la membrana y sirve como un sitio de unión para proteínas que portan dominios de homología a plecstrina (PH) (cuadro 3-1). Así, este evento de fosforilación de lípido sirve para mover pro-teínas desde el citosol hacia la membrana y proporcionarles un

FigurA 3-11 el PIP2 puede ser fosforilado (rojo) por la PI3 cinasa para crear PIP3 durante la activación celular. El PIP3 a continuación crea sitios de unión para proteínas con dominios PH en la cara interna de la membrana plasmática.

O

O

O

O

O

OOH

OH

P OO−

O

O−

P O−O

O−

O−

P OO

O

O−

P O−O


Fosfolipasa C

Fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2)

OPO32−

−

OPO32−

OHHO

OO

P

OO OHO

O H

O

O

Diacilglicerol (DAG)(Permanece asociado con la membrana)

Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3)Entra al citoplasma e induce la liberaciónde ion Ca2+ a partir de vesículas del ER

+

OHO

O H

O

O

OPO32−

OPO32−

2−O3PO

OHHO

OH

FigurA 3-12 el PIP2 puede ser hidrolizado por la PLc para crear Dag e IP3.

con el retículo endoplasmático y las mitocondrias. Así, cual-quier evento de señalización que abre canales en la membrana del retículo endoplasmático, o en la membrana plasmática, y que permite el flujo libre de iones Ca2+ hacia el citoplasma, faci-lita un aumento rápido de la concentración citoplasmática de ion Ca2+.

La ubiquitinación puede inhibir la transducción de señal o aumentarla

La proteína ubiquitina es una proteína monomérica pequeña, de 76 residuos, altamente conservada. La unión del carboxilo terminal de la ubiquitina a residuos de lisina de proteínas blanco

FigurA 3-13 La proteína reguladora de la unión de calcio calmodulina pasa por un cambio conformacional en el momento de unión a calcio, que le permite unirse a otras proteínas y activarlas. [Parte a) PDB ID 3CLN.]

Ca2+

Ca2+

Calmodulina

Complejode calcio-calmodulina

Proteínablanco

Sitio de unióna calmodulina

La calmodulina seune a iones Ca2+.

1

La calmodulina cambiade conformación,y se hace activa.

2

La calmodulina se unea una proteína blanco.

3

b)

Ca2+

Ca2+

COOH+NH3

a)


a menudo va seguida por polimerización de una cadena de ubiquitinas sobre residuos de lisina seleccionados de la ubiqui-tina conjugada; esto da lugar a poliubiquitinación de la proteína blanco. La monoubiquitinación o la poliubiquitinación casi siempre sirve como un mecanismo mediante el cual las proteí-nas marcadas son establecidas como objetivo para destrucción por el proteasoma de la célula. Empero, se sabe que la ubiquiti-nación en ciertos residuos de proteínas también sirve como una señal activadora y esta función alternativa de la ubiquitina se abordará más adelante conforme se describa la activación del factor de transcripción NF-κB, así como en los capítulos 4 y 5.

Vías de señalización que se encuentran con frecuencia

El análisis de las rutas bioquímicas mediante las cuales las seña-les moleculares pasan desde receptores de superficie celular hacia el interior de la célula ha revelado que algunas vías de transducción de señal se utilizan repetidas veces en las respues-tas celulares a diferentes ligandos. Estas vías se utilizan, de maneras un poco diferentes, en múltiples sistemas celulares y de órganos, y en muchas especies. El resultado final de casi todas estas vías es una alteración del programa de transcripción de la célula. Aquí se describen brevemente tres de esas vías de particular importancia para el sistema inmunitario adaptativo (figura 3-5, Perspectiva general). Cada una de estas vías es des-encadenada por unión de antígeno al receptor, y conduce a la activación de una familia de factores de transcripción diferente. La generación de estos factores de transcripción activos a su vez inicia la regulación ascendente de una cascada de genes que tienen importancia para la respuesta inmunitaria, incluso los que codifican para citocinas, anticuerpos, factores de supervi-vencia y señales proliferativas.

Si bien el marco conceptual de estas vías de emisión de seña-les es compartido entre muchos tipos de células, pequeñas modificaciones en los intermediarios moleculares y factores de transcripción involucrados permiten que haya variaciones de las identidades de los genes controlados por señales particulares, y que haya mecanismos de control de la transcripción específicos para tipo de célula. Por ejemplo, la enzima plc existe en dife-rentes formas; la PLCγ1 se usa en células T, y la PLCγ2 en células B. De modo similar, la familia de factores de transcrip-ción factor nuclear de células T activadas (Nuclear Factor of Activated T cells [nfat]) incluye cinco miembros, algunos de los cuales son expresados como variantes empalmadas de manera diferencial y cada uno de los cuales es afectado por disposiciones diferentes de señales moleculares.

Además, la activación de la transcripción desde algunos promotores requiere la unión de múltiples factores de transcrip-ción. Por ejemplo, la expresión completa del gen que codifica para la interleucina-2 (IL-2) requiere la unión de AP-1, NF-κB y nfat, además de varios otros factores de transcripción, al promotor de interleucina. De esta manera, el promotor puede estar parcialmente activado en presencia de algunos de estos factores de transcripción, pero no está por completo activo sino hasta que todos ellos están en su sitio. La sección que sigue se centra en los principios generales que rigen el control de estas tres vías, desde la recepción de una señal de antígeno, hasta la activación de un tipo particular de factor de transcripción.

La vía de la plc induce liberación de calcio y activación de pkc

Los elementos esenciales de esta vía se presentaron en la expo-sición sobre las enzimas que modulan el PIP2 en el momento de la activación celular (figura 3-12), y ahora se sabe que la plc desintegra la PIP2 hacia IP3 y dag; sin embargo, ¿de qué modo la plc queda activada en primer lugar? Aquí se usan células T como ejemplo.

Como se mencionó, las células T usan la forma PLCγ1 de la enzima. En el momento de la estimulación por antígeno, la fos-forilación de tirosina de los residuos de itam del complejo asociado a receptor CD3 da lugar a la localización de la proteína adaptadora lat a la membrana (figura 3-14). La lat a su vez es fosforilada, y la PLCγ1 a continuación se une a lat fosforilada; esta unión asegura que la PLCγ1 se localice a la membrana

FigurA 3-14 La activación de la calcineurina por unión del complejo de calcio-calmodulina induce la desfosfori-lación de nfat y la entrada del mismo al núcleo.

IP3

Citoplasma

NúcleoNFAT

Activación de factorde transcripción

NFAT

PIP2PIP3 DAG

P

P

PLCγ1

PP

Ca2+

Calmodulina(inactiva)

Calmodulina(activa)

Calcineurina

TCR/CD3

Itk

LckLAT

Retículoendoplasmático

CD4

P


cirla a liberar gdp y aceptar gtp; las proteínas activadoras de GTPasa (GTPase Activating Proteins [gap]) inhiben la acti-vidad de proteína al estimular la habilidad intrínseca de Ras para hidrolizar gtp unido.

Al igual que la vía PLCγ, la vía Ras es iniciada durante acti-vación de linfocitos tanto B como T y, de nuevo, se usarán las células T como ejemplo. El dag, liberado después de división de PIP2 mediada por PLCγ1, se une a, y activa, Ras-GRP, una proteína adaptadora que a continuación recluta el gef, Son of Sevenless (sos). sos se une a Ras, y la induce para que se una a gtp, momento en el cual Ras adquiere la capacidad para unirse a, y activar, el primer miembro de una cascada de enzi-mas serina/treonina cinasa que se fosforilan y activan una a la otra. Dado que los miembros de esta cascada se identificaron por vez primera en experimentos en los que se estudió la acti-vación de células por mitógenos (agentes que inducen prolife-ración), se denominan la cascada de proteína cinasa activada por mitógeno (Mitogen Activated Protein Kinase) o de map cinasa. Los miembros de la cascada son mantenidos en estrecha proximidad uno a otro mediante la proteína adaptadora ksr.

En la forma de esta cascada de activación de célula T (figura 3-16), RasGTP se une a la map cinasa cinasa cinasa (mapkkk) Raf. La unión de RasGTP altera la conformación de Raf y estimula su actividad de serina/treonina cinasa. A continuación Raf fosforila y activa la siguiente enzima en el relevo, una map cinasa cinasa (mapkk). En este caso mek. mek activada a con-tinuación fosforila su sustrato, la cinasa relacionada con señal extracelular (Extracellular signal-Related Kinase) o Erk, una map cinasa, que en consecuencia adquiere la capacidad para pasar a través de la membrana nuclear.

Una vez dentro del núcleo, Erk fosforila y activa un factor de transcripción, Elk-1, que coopera con una segunda proteína, el factor de respuesta sérica (srf), para activar la transcripción del gen fos. La proteína Fos también es fosforilada por Erk, y junto con su pareja, Jun, forma el factor de transcripción maes-tro, AP-1. Jun es fosforilada y activada por medio de una forma un poco diferente de la vía de la map cinasa. AP-1 es otro de los factores de transcripción que facilita la transcripción del gen que codifica para IL-2.

celular, el sitio de su sustrato, PIP2. Una vez ubicada en la mem-brana plasmática, la PLCγ1 es más activada por fosforilación de tirosina mediada por la cinasa activada por receptor, Lck, así como por una segunda tirosina cinasa, Itk. La PLCγ1 fosfori-lada y activada a continuación media la división de PIP2 hacia IP3 y dag, como se describió.

¿De qué modo estos mediadores secundarios funcionan a continuación para desencadenar la activación de linfocitos? Los iones calcio, liberados a partir de reservas intracelulares de IP3, se unen al intermediario emisor de señales, calmodulina. Cada mo lécula de calmodulina se une a cuatro iones calcio, unión que da lugar a una profunda alteración de su conformación (figura 3-13). El complejo de calcio-calmodulina a continuación se une a, y activa, la fosfatasa calcineurina, que desfosforila el factor de transcripción nfat (figura 3-14). Esta desfosforilación induce un cambio conformacional en nfat, que revela una secuencia de localización nuclear, que dirige el nfat para que entre al núcleo y active la transcripción de varios genes blanco importantes de célula T. Los genes activados por la unión a nfat comprenden los que codifican para interleucina-2, una citocina que tiene impor-tancia fundamental en el control de la proliferación de células T.

La importancia de la vía de la PLCγ1 para la activación de células T es ilustrada por los profundos efectos inmunosupreso-res del fármaco ciclosporina, que se usa para tratar tanto enfer-medad autoinmunitaria mediada por células T como rechazo de trasplante de órgano. En las células T, la ciclosporina se une a la proteína ciclofilina (inmunofilina), y el complejo de ciclospo-rina/ciclofilina se une a la calcineurina y la inhibe, lo que sus-pende con eficacia la proliferación de células T.

La división de PIP2 por plc es una estrategia de emisión de señales en particular eficiente porque ambos productos de la desintegración del PIP2 son activos en eventos celulares subsi-guientes. El dag, el segundo producto de la desintegración del PIP2 (figura 3-12), permanece en la membrana, donde se une a enzimas de la familia de la proteína cinasa C (pkc) y las activa. Estas cinasas son serina/treonina cinasas activas en diversas vías de señalización. La proteína cinasa Cθ, importante en la señalización de células T, sólo requiere unión de dag, mientras que su pariente, la proteína cinasa C, también debe unirse a iones Ca2+ para quedar activada por completo. El dag también está implicado en la vía Ras (que se describe en la sección siguiente).

La cascada de Ras/Map cinasa activa la transcripción por medio de AP-1

La vía de emisión de señales Ras se descubrió inicialmente des-pués de que se encontró que una forma viral mutada de la pro-teína Ras induce cáncer en un modelo de rata. La Ras es una proteína de unión a gtp, monomérica (que se abrevia proteína G). Cuando Ras se une a gtp, su conformación cambia hacia un estado activo, en el cual es capaz de unirse a varias serina/treonina cinasas, y de activarlas. Empero, la proteína Ras posee una actividad de GTPasa intrínseca que hidroliza gtp hacia gdp, y la forma Ras-gdp de la proteína es incapaz de transmitir una señal positiva a cinasas torrente abajo (figura 3-15); por ende, la activación de la vía Ras depende de la capacidad para mantener Ras en su estado unido a gtp. La modulación entre la forma unida a gtp, activa, y la forma unida a gdp, inactiva, es desencadenada por dos familias de enzimas. Los factores de intercambio de guanina-nucleótido (gef) activan Ras al indu-

FigurA 3-15 Proteínas g monoméricas pequeñas, como Ras, alteran la conformación dependiendo de si están unidas a gtp o gdp. La forma unida a gdp de proteínas G pequeñas, como Ras (verde pálido), es inactiva, y la forma unida a gtp (verde oscuro) es activa. Las proteínas G pequeñas tienen actividad de GTPasa intrínseca, que es aumentada por las Proteínas Activadoras de GTPasa (GTPase activating proteins [gap]). Los factores de intercambio de nucleótido guanina (guanine nucleotide exchange factors [gef ]) actúan de una manera opuesta para liberar gdp y promover la unión de gtp.

Inactiva PiActiva

Factores de intercambiode nucleótido guanina (GEF)

Proteínas activadorasde GTPasa (GAP)

GTP

GTP

GDP

GDP


La vía Ras es un componente de importancia de muchos pro-gramas vinculados con el desarrollo, y de activación celular. Cada vía usa combinaciones un poco diferentes de proteínas ci nasas torrente abajo, pero todas se apegan al mismo modo general de pasar la señal desde la superficie celular hacia el núcleo por medio de una cascada de reacciones de fosforilación, con la activación resultante de un nuevo programa de transcripción.

La pkc activa el factor de transcripción NF-κB

El NF-𝛋B pertenece a una familia de factores de transcripción heterodiméricos, y cada dímero activa su propio repertorio de promotores. En las células en reposo, heterodímeros de NF-κB

son mantenidos en el citoplasma mediante unión a la proteína Inhibidor de NF-𝛋B (I𝛋B). La activación celular induce la fos-forilación de estas proteínas inhibidoras mediante un complejo de IκB cinasa (IKK). La proteína IκB fosforilada a continua-ción es establecida como objetivo para degradación proteoso-mal, lo que libera el NF-κB para que entre al núcleo y se una a los promotores de una amplia gama de genes importantes desde el punto de vista inmunitario.

NF-κB es importante en el control de la transcripción de pro-teínas necesarias para el funcionamiento apropiado de muchos tipos de células de los sistemas inmunitarios innato y adapta-tivo; en general, la transcripción mediada por NF-κB está aso-ciada con eventos proinflamatorios y de activación, más que con procesos reguladores. Diferentes tipos de células y recepto-res usan diversas formas de activación de proteína cinasa, así como diversas combinaciones de moléculas adaptadoras en la vía que llevan a la activación de NF-κB. Con todo, todas estas vías culminan en la fosforilación y la destrucción subsiguiente del inhibidor de NF-κB, IκB. A continuación se describe la vía de activación de NF-κB que es desencadenada por el reconoci-miento de antígeno por tcr.

FigurA 3-16 La vía Ras involucra una cascada de fosfori-laciones de serina/treonina, y culmina en la entrada de la map cinasa, erk, al núcleo, donde fosforila los factores de transcripción elk-1 y Fos.

Citoplasma

Cascadade MAPcinasa

Núcleo

Pi

(inactiva)

(activa)

P

DAG

Señales mediadas por TCR

Raf (MAPKKK)

MEK (MAPKK)

ERK (MAPK)

Elk-1

SRF

Jun

AP-1

Jun

Fos

Fos Fos

GTP

GTP

GDP

GDP

P P

P

P

Ras-GRP

SOS

Activación de gen

Activación de gen

FigurA 3-17 La fosforilación y ubiquitinación activa IKK, que fosforila I𝛋B y lo desactiva, lo que permite la translo-cación de nF-𝛋B hacia el núcleo.

TCR/CD3

Vía deNF-κB

PKC

DAG

Citoplasma

Núcleo

Complejode TAK1

Carma-1P

P

P

P

NF- B

TRAF6

MALT1Bcl10

I BP

NF- B

5´ 3´

NEMO

IKK IKK

Activación de gen

Ub

Ub


anticuerpos secretados y sus formas de receptor unidas a membrana pertenecen a la familia de proteínas inmunoglobu-lina. Esta familia grande de proteínas, que incluye receptores tanto de célula B como de célula T, moléculas de adhesión, algunas tirosina cinasas y otros receptores inmunitarios, se ca -racteriza por la presencia de uno o más dominios de inmuno -globulina.

Los anticuerpos están constituidos de múltiples dominios de inmunoglobulina

El dominio de inmunoglobulina (figura 3-18) se genera cuando una cadena polipeptídica se pliega hacia una serie organizada de cadenas con plegamiento β paralelas. Dentro de cada domi-nio, las cadenas β están dispuestas hacia un par de láminas β que forman un dominio terciario, compacto. El número de cadenas por cada lámina varía entre proteínas individuales. En moléculas de anticuerpo, casi todos los dominios de inmunoglobulina contienen aproximadamente 110 aminoácidos, y cada lámina β contiene de tres a cinco cadenas. El par de láminas β dentro de cada dominio son estabilizadas una respecto a la otra por medio de un enlace disulfuro intracadena. Los dominios vecinos están conectados uno a otro por medio de un tramo de cadena polipeptídica relativamente no estructurada. Dentro de las cadenas β, aminoácidos hidrofóbicos e hidrofílicos alternan, y sus cadenas laterales están orientadas en posición perpen- dicular al plano de la lámina. Los aminoácidos hidrofóbicos sobre una lámina están orientados hacia la lámina opuesta y, por ende, las dos láminas dentro de cada dominio son estabili-zadas por interacciones hidrofóbicas entre las dos láminas, así como por el enlace disulfuro covalente.

El plegamiento de inmunoglobulina proporciona un ejem-plo perfecto de cómo la estructura determina la función, o la facilita, o ambas cosas. En los extremos de cada una de las lámi-nas β, regiones polipeptídicas que muestran plegamiento más laxo enlazan una cadena β a la siguiente, y estas regiones laxa-mente plegadas pueden dar cabida a diversas longitudes y estructuras de cadena lateral de aminoácidos sin causar altera-ción alguna de la estructura general de la molécula. Por ende, en la molécula de anticuerpo, el plegamiento de inmunoglobulina está muy bien adaptado para proporcionar un andamio único en el cual pueden construirse múltiples sitios de unión diferentes, puesto que los sitios de unión a antígeno pueden simplemente integrarse hacia estas regiones laxamente plegadas de los domi-nios de unión a antígeno. Estas propiedades explican por qué el dominio de inmunoglobulina se ha usado en tantas proteínas con funciones de reconocimiento o de adhesión. La estructura del dominio esencial proporciona un esqueleto molecular, mientras que las regiones laxamente plegadas se pueden adaptar para que se unan de manera específica a muchas estructuras adhesivas o antigénicas.

De hecho, la estructura del dominio de inmunoglobulina es usada por muchas proteínas además de las cadenas de bcr. El receptor de célula T también está constituido de unidades repe-titivas del dominio de inmunoglobulina (véase más adelante). Otras proteínas en las que se utilizan dominios de inmunoglo-bulina comprenden receptores Fc; las proteínas accesorias del receptor de célula T CD2, CD4, CD8 y CD28; las proteínas asociadas a receptor tanto del tcr como del bcr; moléculas de adhesión, y otras. En la figura 3-19 se ilustran algunas de estas proteínas que contienen dominio de inmunoglobulina. Cada

En las células T, la activación de NF-κB empieza cuando el dag, generado por PLCγ1, recluta la serina/treonina cinasa PKC a la membrana (figura 3-17). Como se mencionó, PKCθ es la forma de la serina/treonina cinasa que se usa en la vía de emisión de señales de receptor de célula T. Una vez unida a dag, la PKCθ es activada y fosforila proteínas adaptadoras, incluso Carma1, que inician una cascada que finalmente recluta la ubiquitina ligasa TRAF6. TRAF6 ubiquitina y activa parcial-mente el complejo ikk, que está constituido de la proteína reguladora nemo, y dos subunidades ikk catalíticas. El com-plejo ikk sólo es activado por completo cuando está fosforilado y ubiquitinado. (Note que éste es uno de los casos en los cuales la ubiquitinación no da lugar a degradación subsiguiente de proteína, sino más bien a su activación.) Otras señales mediadas por células T activan el complejo TAK1, que fosforila ikk, lo que completa su activación y permite que fosforile IκB. En este paso, la fosforilación de IκB emite señales para su degradación, más que para su activación. NF-κB a continuación está libre para moverse hacia el núcleo y activar la transcripción de sus genes blanco, incluso el gen que codifica para IL-2.

Además de esta vía de activación de NF-κB mediada por receptor de célula T, la señalización por medio de CD28, el correceptor de célula T, también ejerce control positivo de la activación de NF-κB en células T.

Estas tres vías juntas ilustran cómo los conceptos amplios antes introducidos en este capítulo pueden aplicarse a entender los mecanismos que subyacen la activación de células T; estos temas recurren en muchas formas en todo el sistema inmuni-tario.

La estructura de los anticuerpos

Una vez esbozados algunos de los conceptos generales que constituyen la base de muchas diferentes interacciones recep-tor-ligando y vías de señalización, ahora se centrará la atención de manera más específica en los receptores de antígeno del sis-tema inmunitario adaptativo.

En el momento de la estimulación con antígeno, las células B secretan anticuerpos que tienen sitios de unión a antígeno idénticos a los que están en el receptor de antígeno de la mem-brana de célula B. La identidad entre los sitios de unión del anticuerpo secretado y el Receptor de Célula B (BCR) unido a membrana se demostró por vez primera al sintetizar reactivos que se unieron a anticuerpos secretados por una clona de célu-las B particular, y mostrar que esos reactivos también se unie-ron a los receptores sobre las células que habían secretado los anticuerpos. Dado que trabajar con proteínas solubles es signi-ficativamente más fácil que manipular proteínas receptoras de membrana, la presencia de una forma soluble del receptor faci-litó mucho la caracterización de la estructura del receptor de célula B. En consecuencia, los aspectos de bioquímica básica del receptor de célula B se establecieron mucho tiempo antes que los del Receptor de Célula T (TCR) que, a diferencia del bcr, no se libera en una forma secretada. El recuadro 3-1, Experi-mento clásico, detalla los experimentos ganadores del Premio Nobel que establecieron la estructura de cuatro cadenas de la molécula de anticuerpo.

Esta sección empieza con una exposición de la estructura de anticuerpos, y después se describe el receptor de mem-brana de célula B y sus vías de señalización asociadas. Los


una de estas proteínas es clasificada como un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina, un término que se usa para denotar proteínas derivadas de un gen primordial común que codifica para la estructura del dominio básica.

Los anticuerpos comparten una estructura de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas

Todos los anticuerpos comparten una estructura de cuatro cadenas polipeptídicas (figura 3-20), que consta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (heavy [H]) tam-bién idénticas. Cada cadena ligera está unida a su cadena pesada pareja mediante un enlace disulfuro entre residuos de cisteína correspondientes, así como por interacciones no cova-lentes entre los dominios VH y VL y los dominios CH1 y CL.

Estos enlaces permiten la formación de un heterodímero estre-chamente asociado (H-L). Múltiples puentes disulfuro enlazan juntas las dos cadenas pesadas a alrededor de la mitad de su longitud, y las partes C terminal de las dos cadenas pesadas también participan en interacciones de enlace no covalente entre dominios correspondientes.

La molécula de anticuerpo forma una Y, con dos regiones de unión a antígeno en los extremos de la Y (figura 3-21). Cada región de unión a antígeno está constituida de aminoácidos derivados de los dominios amino terminal de las cadenas tanto pesada como ligera. Las cadenas tanto pesada como ligera con-tribuyen con dos dominios a cada extremo de la Y; el dominio no de unión a antígeno de cada cadena sirve para extender el extremo de unión a antígeno. La base de la Y consta de los dominios C terminal de la cadena pesada de anticuerpo.

a)

b)

Dominio CL

Enlace disulfuro

Cadenas β

Ordenamiento de cadena β

Asas

Dominio VL

NH2

NH2

COOH

COOH

COOH

CDR

CDR

NH2

FigurA 3-18 Diagrama de la estructura plegada de inmu-noglobulina de los dominios de región variable (vL) y cons-tante (cL) de la cadena ligera de anticuerpo. a) Las dos láminas con plegamiento β en cada dominio son mantenidas juntas por interac-ciones hidrofóbicas y el enlace disulfuro conservado. Las cadenas β que componen cada lámina se muestran en colores diferentes. Las tres asas de cada dominio variable muestran considerable variación de longitud y secuencia de aminoácidos; estas regiones hipervariables (azul) constitu-yen el sitio de unión a antígeno. Las regiones hipervariables por lo gene-

ral se llaman regiones determinantes de la complementariedad (cdr). Los dominios de cadena pesada tienen la misma estructura característica. b) Las láminas con plegamiento β están abiertas para revelar la relación de las cadenas β individuales y las asas de unión. Note que el dominio variable contiene dos cadenas β más que el dominio constante. [Parte a) adaptada de M. Schiffer et al., 1973, Biochemistry 12:4620; reimpreso con autori-zación; parte b) adaptada de A.F. Williams y A.N. Barclay, 1988, Annual Review of Immunology 6:381.]

82

La elucidación de la estructura de anticuerpo

ron averiguar qué aspecto tenían los anti-cuerpos. El hecho de que podían formar complejos multivalentes precipitables sugi-rió que cada anticuerpo tenía la capacidad de unión a más de un sitio en un antígeno multivalente. Sin embargo, los científicos aún desconocían cómo muchas cadenas polipeptídicas constituyen una molécula de anticuerpo, y cómo muchos sitios de unión a antígeno estuvieron presentes en cada mo lécula.

Dos líneas de experimentación llevadas a cabo en un marco de tiempo similar en ambos lados del Atlántico se combinaron para proporcionar las respuestas a estas dos preguntas. Experimentos de ultracentrifuga-ción habían colocado el peso molecular de las moléculas de anticuerpos IgG en aproxi-madamente 150 000 daltones. La digestión de IgG con la enzima papaína produjo tres fragmentos, dos de los cuales fueron idénti-cos, y un tercero que fue claramente distinto (figura 2). El tercer fragmento, de aproxima-damente 50 000 daltones, formó de manera espontánea cristales y, por ende, se nombró el fragmento cristalizable, o Fc. Al demostrar que podían inhibir de manera competitiva la unión de anticuerpos a su antígeno, se mos-tró que los otros dos fragmentos retienen la capacidad de unión a antígeno del anti-cuerpo original. Por ende, estos fragmentos se nombraron Fab, o fragmento de unión a

en un complejo multivalente, que salió de la solución y se precipitó. A continuación el precipitado se extrajo mediante centrifuga-ción. Ahora que habían logrado eliminar los anticuerpos de un antisuero, la pregunta fue ¿qué pico de proteína quedaría afectado?

El gráfico de color negro en la figura 1 ilustra sus resultados. Se perdió muy poca proteína de los picos de albúmina o de globulina α o β. Aun así, la inmunoprecipita-ción dio lugar a un decremento notorio del tamaño del pico de globulina γ, lo que de -mostró que casi todos sus anticuerpos anti-ovoalbúmina podían clasificarse como glo - bulinas γ.

Ahora se sabe que casi todos los anti-cuerpos de la clase IgG de hecho se encuen-tran en la clase de globulina γ. No obstante, se encuentran anticuerpos de otras clases en los picos de globulina α y β, lo cual puede explicar el decremento leve de la concentra-ción de proteína que se encontró después de inmunoprecipitación en estos otros picos de proteína.

Segundo grupo de experimentoS

Sir Rodney Porter, Gerald Edelman y Alfred NisonoffConocer la clase de proteína sérica en la cual caen los anticuerpos fue un inicio, pero los inmunoquímicos a continuación necesita-

Los experimentos en los que se identificó por vez primera a los anticuerpos como inmunoglobulinas séricas y después se ca -racterizó su estructura de cuatro cadenas familiar, representan algunas de las mejores adaptaciones de la química de proteína al -guna vez usadas para resolver un problema biológico.

primer grupo de experimentoS

Arne Tiselius, Pers Pederson, Michael Heidelberger y Elvin KabatDesde finales del siglo xix se ha sabido que los anticuerpos residen en el suero sanguí-neo, es decir, en el componente de la sangre que queda una vez que se han eliminado células y proteínas de la coagulación. Em -pero, la naturaleza química de esos anticuer-pos permaneció como un misterio hasta que Tiselius y Pederson de Suecia, y Heidel-berger y Kabat, en Estados Unidos, hicieron sus experimentos, publicados en 1939. Hi -cieron uso del hecho de que, cuando los anticuerpos reaccionan con un antígeno proteínico multivalente, forman un comple jo multimolecular con enlaces covalentes que salen de la solución. Este proceso se conoce como inmunoprecipitación (véanse en el capítulo 20 los usos modernos de esta téc-nica). Inmunizaron conejos con la proteína ovoalbúmina (el principal componente de las yemas de huevo), extrajeron sangre de los conejos para obtener un antisuero antio-voalbúmina, y después dividieron su anti-suero en dos alícuotas. Sujetaron la primera alícuota a electroforesis y midieron la canti-dad de proteína que avanzó distancias di -ferentes desde el origen en un campo eléctrico. El gráfico azul en la figura 1 des-cribe las cuatro subpoblaciones de proteínas principales resueltas mediante su técnica. La primera —y la de mayor tamaño— es el pico de albúmina, la proteína más abun-dante en el suero, que se encarga de trans-portar lípidos en la sangre. Nombraron a los otros picos globulinas. Dos picos de menor tamaño están denotados como los picos de globulina α y β, y después un tercer pico de globulina, la globulina gamma, clara-mente representa un grupo de proteínas en concentración alta en el suero.

Con todo, la parte más notable del expe-rimento ocurrió cuando los investigadores mezclaron su segunda alícuota del suero con ovoalbúmina, el antígeno. Los anticuer-pos en el suero se unieron a la ovoalbúmina

exPeRImenTo cLáSIco

Globulinas

Albúmina

Abso

rban

cia

Distancia de migración

α

+

β

−

γ

FIGuRA 1Demostración experimental de que casi todos los anticuerpos están en la frac-ción de globulina γ de las proteínas séricas. Después de que se inmunizó a conejos con ovoalbúmina (ova), sus antisueros se combinaron y se procesaron con electroforesis, que separó las proteínas séricas de acuerdo con su carga eléctrica y masa. La línea azul muestra el patrón electroforé-tico de antisuero no tratado. La línea negra muestra el patrón de antisuero que se incubó primero con ova para eliminar anticuerpos anti-ova, y después quedó sujeto a electroforesis. [Adaptado de A. Tiselius and E. A. Kabat, 1939, Journal of Experimental Medicine 69:119, con permiso de copyright de Rockefeller University Press.]

83

ligera provenientes de los experimentos de reducción y alquilación. La respuesta fue inmediatamente clara.

Los anticuerpos anti-Fab se unieron a cadenas tanto pesadas como ligeras y, por ende, el sitio de unión a antígeno de la IgG original de conejo estuvo formado de com-ponentes de cadenas tanto pesada como ligera. Con todo, los anticuerpos anti-Fc sólo se unieron a las cadenas pesadas, pero no a las cadenas ligeras de la molécula de IgG, lo que demostró que la parte Fc de la molécula sólo estaba constituida de cadenas pesadas. Por último, experimentos de química de proteína cuidadosos demostraron que los aminos terminales de las dos cadenas resi-dían en la porción Fab de la molécula. De esta manera, la estructura de cuatro cadenas familiar, con los sitios de unión en los aminos terminales de los pares de cadenas pesadas y ligeras, se dedujo a partir de algunos expe-rimentos clásicos muy bien realizados.

En 1972 se otorgó el Premio Nobel en Fisiología y Medicina a sir Rodney Porter y

antígeno (Fragment antigen binding). Este experimento indicó que una molécula de an ticuerpo única contenía dos sitios de unión a antígeno y una tercera parte de la mo- lécula que no participaba en la reacción de unión.

El uso de otra enzima proteolítica, la pepsina, dio lugar a la formación de un frag-mento único de 100 000 daltones, que con-tuvo dos sitios de unión a antígeno que aún fueron mantenidos juntos en una molécula bivalente. Puesto que la molécula actuó como si contuviera dos fragmentos Fab, pero claramente tuvo un componente adi-cional que facilitó la combinación de los dos fragmentos hacia una molécula, se nombró F(ab’)2. La digestión con pepsina no da lugar a un fragmento Fc recuperable, puesto que al parecer lo digiere hacia fragmentos más pequeños. Empero, F(ab’)2 derivados de anti-cuerpos se usan a menudo en experimentos en los cuales los científicos desean evitar artefactos originados por la unión de anti-cuerpos a receptores Fc sobre superficies celulares.

En el segundo grupo de experimentos, los investigadores redujeron la molécula de IgG entera usando β-mercaptoetanol, a fin de romper enlaces disulfuro, y produjeron alquilación del producto reducido de modo que los enlaces disulfuro no podían volver a formarse de manera espontánea. A conti-nuación usaron una técnica llamada filtra-ción en gel para separar y medir el tamaño de los fragmentos de proteína generados mediante esta reducción y alquilación. (En la actualidad se usarían geles sds page para hacer este experimento.) De esta manera, se demostró que cada molécula de IgG conte-nía dos cadenas pesadas, con peso molecu-lar (mw) de 50 000 y dos cadenas ligeras, con mw de 22 000.

Ahora el desafío fue combinar los resul-tados de estos experimentos para crear un modelo consistente de la molécula de anti-cuerpo. Para hacer esto, los científicos tuvie-ron que determinar cuál de las cadenas estaba implicada en la unión a antígeno, y cuál cadena contribuía a los fragmentos cristalizables. Los inmunólogos a menudo usan medios inmunológicos para responder sus preguntas y ésta no fue la excepción. Eligieron usar fragmentos Fab y Fc purifica-dos a partir de anticuerpos IgG de conejo para inmunizar dos cabras. A partir de estas cabras, generaron anticuerpos anti-Fab y anti-Fc, que hicieron reaccionar, en experi-mentos separados, con las cadenas pesada y

Gerald Edelman por su trabajo en el descu-brimiento de la estructura de las inmunoglo-bulinas.Edelman, G.M., B.A. Cunningham, W.E. Gall,

P.D. Gottlieb, U. Rutishauser, y M.J. Waxdal. 1969. The covalent structure of an entire gam-maG immunoglobulin molecule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 63:78-85.

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RECUADRO 3-1

FIGuRA 2estructura prototipo de Igg, que muestra la estructura de cadena y los enlaces disulfuro intercadena. Se indican los fragmentos producidos por digestión enzimática con pep-sina o papaína, o mediante división de los enlaces disulfuro con mercaptoetanol. Las cadenas ligeras (L) están en azul claro y las cadenas pesadas (H) están en azul oscuro.

S S

Cadena L

F(ab')2

Fab

Fc

Fab

Digestióncon pepsina

Reducción conmercaptoetanol

Digestión con papaína

Cadena H

S

Enlacesdisulfuro

Cadenas L

SHHS

Fragmentos Fc+

Cadenas H

SS S

S S

S SS S

S S S S

S SS S SH

SH

S S S S SHHS

SHSH

+ + + +


CCV

Moléculas del MHC

Receptor de célula T

Inmunoglobulina (IgM)

Clase I Clase II

S

S

S

S

S

S

S

S S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

β2microglobulina

β α

S

S

S

SS

S

S

S

S

S

S

S

S

SS

S

Proteínas accesorias de célula T

Moléculas de adhesión

LFA–3

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

VCAM-1

S S

CD8

CD3

γ δ ε

S

S

S

S

S

SCD2

CD4

SS S S

S S

Receptorpoli-Ig

CHOHeterodímero

Ig-α/Ig-β

C

C

C

CC C

C

C

CC

C CC C C C

C

C

CC C C

C

C

C

C

C

C

C

C

C

S

S

S

S

S

S

S

S

S

SC

C

C

C

C

C

C

CC

V

VV

V V

V V

V

V

V

V

V

V

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

C

C

ICAM-2

ICAM-1

Fcγ RI

S

S

S

S

S

S

γγ

CD64

FigurA 3-19 algunos ejemplos de proteínas que portan dominios de inmunoglobulina. Cada dominio de inmunoglobulina se representa mediante un asa azul y, cuando es importante, está marcado como variable (V) o constante (C).

La figura 3-21 muestra que la estructura general de la molécula de anticuerpo consta de tres regiones relativamente compactas unidas por una región bisagra más flexible. La re -gión bisagra es en particular susceptible a división proteolítica por la enzima papaína. La división con papaína resuelve la molécu la de anticuerpo hacia dos fragmentos idénticos que retienen la especificidad de unión a antígeno (antigen-bin-ding) del anticuerpo original (que se muestra como las regio-nes Fab en la figura 3-21), y la región restante de la molécula, que consta de la porción no de unión a antígeno. Esta última región, que es idéntica para todos los anticuerpos de una clase

dada, se cristaliza fácilmente y, así, se llama la región Fc (frag-mento cristalizable).

Cada región Fab y región Fc de los anticuerpos media sus pro-pias funciones particulares durante una respuesta de anticuerpos a un antígeno. Las regiones Fab se unen al antígeno, y la región Fc del anticuerpo unido a antígeno se une a los receptores Fc sobre célu-las fagocíticas o citolíticas, o a moléculas efectoras inmunitarias. De esta manera, los anticuerpos sirven como puentes fisiológicos entre un antígeno presente en un agente patógeno, y las células o mo- léculas que finalmente lo destruirán. Hay una familia de receptores Fc; cada receptor Fc se expresa sobre una gama distinta de células, y se une a una clase diferente de anticuerpos.


Hay dos clases principales de cadenas ligeras de anticuerpo

La secuenciación de aminoácidos de cadenas ligeras de anti-cuerpos reveló que la mitad amino terminal (alrededor de 110 aminoácidos) de la cadena ligera era en extremo variable, mien-tras que la secuencia de la mitad carboxilo terminal podía clasificarse en una de dos tipos de secuencias principales. Así, la mitad N terminal de cadenas ligeras se denomina región varia-ble, o VL, de la cadena ligera, y la parte menos variable de la secuencia se llama región constante, o CL. Las dos secuencias principales de región constante de cadena ligera se denominan cadenas κ (kappa) o λ (lambda). Conforme se generaron más secuencias de cadena ligera, quedó de manifiesto que las secuencias de la región constante de la cadena λ podían sub-dividirse en cuatro subtipos —λ1, λ2, λ3 y λ4— con base en sustituciones de aminoácido en algunas posiciones. En seres humanos, las cadenas ligeras están divididas de manera bas-tante uniforme entre las dos clases de cadena ligera; 60% de las cadenas ligeras de ser humano es κ, mientras que sólo 40% es λ. En ratones, la situación es bastante distinta: sólo 5% de las cadenas ligeras de ratón es del tipo de cadena ligera λ. Todas las cadenas ligeras tienen un peso molecular de aproximada-mente 22 kDa.

El análisis adicional de secuencias de cadena ligera demostró que, incluso dentro de las regiones variables de la cadena ligera,

hubo regiones de hipervariabilidad. Dado que pudo mostrarse que estas regiones hipervariables interactúan con el antígeno unido, se renombraron las regiones determinantes de la com-plementariedad o CDR.

Los lectores con conocimiento en genética identificarán de inmediato un problema: ¿cómo es posible codificar una cadena proteínica única con algunas regiones que son en extremo di -versas y otras regiones que son relativamente constantes, mien-tras se mantiene esa distinción a través de millones de años de deriva evolutiva? La solución a este enigma comprende la codi-ficación de una región variable de anticuerpo única en múltiples segmentos genéticos que después se unen entre sí en diferentes combinaciones en cada célula productora de anticuerpos indi-vidual. Este mecanismo singular se describirá a fondo en el ca -pítulo 7.

Hay cinco clases principales de cadenas pesadas de anticuerpoAl usar anticuerpos dirigidos hacia la región constante de inmunoglobulinas, y la secuenciación de aminoácidos de inmu-noglobulinas derivadas de células tumorales de plasmacitoma, ciertos investigadores descubrieron que las secuencias de las regiones constantes de cadena pesada caen dentro de cinco patrones básicos. Estas cinco secuencias básicas se han llamado con las letras griegas: μ (mu), δ (delta), γ (gamma), ϵ (épsilon) y α (alfa). Cada región constante de cadena pesada diferente se denomina isotipo, y el isotipo de las cadenas pesadas de una

S SS S

S S

S S

S S

S S

CHO CHO

COO–

CH 2

CH 3

SSS

S

VH

CH 1

S

S

S

SVL

CL

S

S

S

S

C H1

V H

S

S

S

S

C L

V LS

S

S

S

Bisagra

NH3+ NH

3 +

NH3 +NH3

+

COO–

COO–COO–

Actividadefectora

Cadenaligeraκ o λ

Cadena pesadaμ, γ, α, δ o ϵ

Unión aantígeno

CH2

CH3

446

214

FigurA 3-20 Diagrama de la estructura de inmunoglobu-linas derivado del análisis de la secuencia de aminoácidos. Cada cadena pesada (azul oscuro) y ligera (azul claro) en una molécula de inmunoglobulina contiene una región variable (V) amino terminal que consta de 100 a 110 aminoácidos y difiere de un anticuerpo al siguiente. El resto de cada cadena en la molécula —las regiones cons-tantes (C)— muestra variación limitada que define los dos subtipos de cadena ligera y las cinco subclases de cadena pesada. Algunas cadenas pesadas (γ, δ y α) también contienen una región bisagra rica en prolina. Las porciones amino terminal, que corresponden a las regiones V, se unen a antígeno; las funciones efectoras están mediadas por los domi-nios carboxilo terminal. Las cadenas pesadas μ y ϵ, que carecen de una región bisagra, contienen un dominio adicional en la parte media de la molécula. CHO denota un grupo carbohidrato enlazado a la cadena pesada.

FigurA 3-21 La estructura tridimensional de la Igg. En esta representación son claramente visibles los dominios de inmunoglo-bulina de 110 aminoácidos de los cuales está construida la molécula, junto con la estructura bisagra abierta en el centro de la molécula, que proporciona flexibilidad en la unión a antígenos multivalentes. En la IgG, la cadena ligera contiene dos dominios de inmunoglobulina, y la cadena pesada, cuatro. Fab, porción del anticuerpo de unión a antígeno; con-tiene dominios VL/VH y CL/CH1 pareados. Fc, región del anticuerpo no de unión a antígeno, con dominios CH2/CH2 y CH3/CH3 pareados. [Fuente D. Sadava, H.C. Heller, G.H. Orians, W.K. Purves, y D.M. Hillis. Life: The Science of Biology, 7ed. (© 2004 Sinauer Associates, Inc., y W.H. Freeman & Co.), figura 18-10 con modificaciones.]

Cadenasligeras

Cadenas pesadas

Región bisagra= región abierta;sitio de flexibilidadsegmentaria

Sitio de unióna antígeno

Sitio de unióna antígeno

Fab Fab

Fc


de la estructura se completó antes de que hubiera técnicas disponibles para secuenciación rápida de dna. Por ende, como una fuente de anticuerpos homogéneos, los inmunólo-gos recurrieron a los productos proteínicos de tumores secre-tores de anticuerpos. Los plasmacitomas son tumores de células plasmáticas, la célula de etapa final de diferenciación de células B, y las células de ese tumor normalmente están situadas en la médula ósea. Cuando una clona única de célu-las plasmáticas se hace cancerosa, se llama plasmacitoma en tanto permanece en un solo hueso. Sin embargo, una vez que metastatiza hacia múltiples sitios de la médula ósea, el tumor se llama mieloma múltiple. Los tumores plasmacitoma o mie-loma secretan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales hacia el suero y los líquidos tisulares de los pacientes, y estos anticuerpos pueden purificarse en grandes cantidades. En lugar de secretar el anticuerpo entero, algunos de estos tumores sólo secretarán las cadenas ligeras, o a veces tanto las cadenas ligeras como los anticuerpos enteros, hacia el suero. Las cadenas lige-ras homogéneas secretadas por estos tumores mieloma se llaman proteínas de Bence-Jones.

Entre mediados y finales del siglo xx se usaron anticuerpos derivados de tumor para generar mucha información respecto a la estructura de anticuerpos y la secuencia de los mismos. Cuando se creó un medio por el cual generar estos tumores artificialmente en ratones, los datos provenientes de tumores de seres humanos se complementaron con información deri-vada de líneas de células murinas generadas en el laboratorio, muchas de las cuales aún se usan.

Los anticuerpos séricos tanto derivados de tumor como purificados también se usaron como antígenos, y los anticuer-pos anti-inmunoglobulina así derivados resultaron ser extra-ordinariamente útiles en la elucidación de la estructura de anticuerpos. Los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpo derivados de una especie de animal (por ejemplo, un conejo), pueden inyectarse en una segunda especie (p. ej., una cabra), o

molécula de anticuerpo dada determina su clase. Así, los anti-cuerpos con una cadena pesada del isotipo μ son de la clase IgM; aquellos con una cadena pesada δ son IgD; aquellos con γ, IgG; aquellos con є, IgE, y aquellos con α, IgA. La longitud de la región constante de las cadenas pesadas es de 330 residuos de aminoácidos (para las cadenas γ, δ y α) o de 440 aminoácidos (para las cadenas μ y ε). De modo correspondiente, los pesos moleculares de las cadenas pesadas varían de acuerdo a su clase. Las cadenas pesadas de IgA, IgD e IgG pesan alrededor de 55 kDa, mientras que los anticuerpos IgM e IgE son aproximada-mente 20% más pesados.

Diferencias menores en las secuencias de aminoácidos de grupos de cadenas pesadas α y γ llevaron a subclasificación adicional de esas cadenas pesadas en subisotipos y, por ende, sus anticuerpos correspondientes, hacia subclases (cuadro 3-2). Hay dos subisotipos de la cadena pesada α, α1 y α2, y, así, dos clases de IgA, IgA1 e IgA2. De modo similar, hay cuatro subiso-tipos de las cadenas pesadas γ, γ1, γ2, γ3 y γ4, con la formación correspondiente de las cuatro subclases de IgG: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, los cuatro subisotipos de cadena γ son γ1, γ2α, γ2β y γ3, y las subclases correspondientes de anticuer-pos IgG de ratón son IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, respectiva-mente.

El análisis adicional reveló que el número exacto de enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de anticuerpos, y las posi-ciones precisas de dichos enlaces, varían entre anticuerpos de distintas clases y subclases (figura 3-22).

Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos pueden servir como antígenosLos principios esenciales de la estructura de anticuerpos se establecieron antes del desarrollo de la tecnología requerida para generar artificialmente anticuerpos monoclonales y, de hecho, gran parte de la investigación básica de determinación

Composición de cadena de las cinco clases de inmunoglobulinacUaDRo 3-2

cadena número de Fórmula clase* pesada dominios de Ig cH Subclases cadena ligera cadena J molecular

IgG γ 3 γ1, γ2, γ3, γ4 (humana) κ o λ Ninguna γ2κ2

γ1, γ2a, γ2b, γ3 (ratón) γ2λ2

IgM μ 4 Ninguna κ o λ Sí (μ2κ2)n

(μ2λ2)n

n = 1 o 5

IgA α 3 α1, α2 κ o λ Sí (α2κ2)n

(α2λ2)n

n = 1, 2, 3, o 4

IgE ϵ 4 Ninguna κ o λ Ninguna ϵ2κ2

ϵ2κ2

IgD δ 3 Ninguna κ o λ Ninguna δ2κ2

δ2λ2

*Véanse en la figura 3-22 las estructuras generales de las cinco clases de anticuerpos.


incluso en otro animal de la misma especie, en el cual el anti-cuerpo o el fragmento de anticuerpo servirá como un antígeno. En el recuadro 3-1 se describe la serie de experimentos en los cuales anticuerpos sintetizados contra fragmentos proteolíticos aislados de moléculas de inmunoglobulina se usaron para ayu-dar a determinar la estructura de la inmunoglobulina. Para entender estos experimentos, y muchos otros en los que tam-bién se usan anticuerpos dirigidos contra inmunoglobulinas enteras o contra fragmentos de inmunoglobulina, es importante comprender bien la naturaleza de los determinantes antigénicos sobre moléculas de inmunoglobulina. Un determinante antigé-nico se define como una región de un antígeno que hace contacto con la región de combinación a antígeno sobre un anticuerpo.

En el cuadro 3-3 se describen los diferentes tipos de anticuerpos que reconocen determinantes de inmunoglobulina.

Los anticuerpos anti-isotipo se dirigen contra determinan-tes antigénicos presentes en la región constante de una clase de anticuerpo de cadena pesada o de cadena ligera particular, pero no sobre cualquiera de las otras. Por ejemplo, un anticuerpo anti-isotipo sólo puede unirse a cadenas pesadas μ humanas, pero no a regiones constantes δ, γ, α o є humanas. De manera alternativa, puede unirse a cadenas ligeras κ, pero no a cadenas ligeras λ. Así, un anticuerpo anti-isotipo sólo se une a una clase o subclase de región constante de anticuerpo única. Los anti-cuerpos anti-isotipo por lo general son específicos para deter-minantes presentes sobre la región constante de anticuerpos

FigurA 3-22 estructuras generales de las cinco clases principales de anticuerpos. Las cadenas ligeras se muestran en sombras más claras y los enlaces disulfuro están indicados mediante líneas negras gruesas. Note que las cadenas pesadas de IgG, IgA e IgD contienen cuatro dominios y una región bisagra, mientras que las cade-nas pesadas de IgM e IgE contienen cinco dominios pero no región bisagra. Las formas poliméricas de IgM e IgA contienen un polipéptido,

llamado cadena J, que está unido por dos enlaces disulfuro a la región Fc en dos monómeros diferentes. La IgM sérica siempre es un pentámero; casi toda la IgA sérica existe como un monómero, aunque a veces hay dímeros, trímeros e incluso tetrámeros. En estas figuras no se muestran los enlaces disulfuro intracadena ni los enlaces disulfuro que unen cade-nas ligeras y pesadas (figura 3-23).

b) IgDVL

Cδ1CL

Cδ2

VH

Cδ3

d) IgA (dímero)

Regiónbisagra

VL

Cγ1CL

Cγ2

VH

Cγ3

c) IgE

Cε1

Cε3

VH

Cε4

VL

CL

Cε2

e) IgM (pentámero)

a) IgG

Cadena J

Regiónbisagra

VL

Cα1

Cα2

VH

Cα3

CL

Cμ1

Cμ3

VH

Cμ4

VL

CL

Cμ2

Cadena J

Enlacedisulfuro


a antígeno y un fragmento Fc por cada molécula de anticuerpo. Los anticuerpos anti-Fab y anti-Fc se producen al inmunizar una especie distinta de animal de la que proporcionó los frag-mentos de anticuerpo, con fragmentos Fab o Fc, respectivamente.

Cada uno de los dominios de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo media funciones específicas

Los anticuerpos protegen al huésped contra infecciones, al unirse a agentes patógenos y facilitar su eliminación. Los anticuerpos de diferentes clases de cadena pesada están especializados para mediar funciones protectoras particulares, como activación de complemento (capítulo 6), aglutinación de agente patógeno, o fagocitosis (capítulo 13), y cada dominio diferente de la mo- lécula de anticuerpo desempeña su propio papel en estos meca-nismos de defensa del huésped. Aquí se examina brevemente la estructura de cada uno de los dominios de cadena pesada de anticuerpo a la vez, empezando con los dominios CH1 y CL, que son los proximales a los dominios VH y VL, respectivamente (figura 3-20).

Dominios CH1 y CL

Como se comentó, la multivalencia del receptor aumenta mucho la fuerza (avidez) de la unión de receptor a antígeno. Los anti-cuerpos han evolucionado para aprovechar esta propiedad al emplear dos sitios de unión a antígeno, cada uno de los cuales puede unirse a determinantes individuales sobre antígenos mul-tivalentes, como los que se encuentran sobre superficies bacte-rianas. Los dominios CH1 y CL sirven para extender los extremos de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo, lo que facilita interacciones con antígenos multivalentes y maximiza la capaci-dad del anticuerpo para unirse a más de un sitio sobre un antí-geno multivalente. Un enlace disulfuro intercadena entre estos dos dominios los mantiene juntos y puede facilitar la capacidad de algunos pares VH-VL para unirse entre sí y formar un sitio de combinación estable.

provenientes de una especie de animal particular, aunque puede ocurrir algo de reactividad cruzada entre especies relacionadas —por ejemplo, ratones y ratas—.

Algunos genes que codifican para cadena pesada o ligera existen en múltiples formas alélicas, y las formas alélicas al ter-nativas del mismo isotipo se denominan alotipos. En general, dos anticuerpos con diferencias alotípicas variarán en sólo algu-nos residuos de una de las cadenas de inmunoglobulina, y estos residuos constituyen los determinantes alotípicos. Los anti-cuerpos antialotipo son generados al inmunizar a un in dividuo de una especie con anticuerpos derivados de un se gundo ani-mal de la misma especie que porta una forma al ternativa (alelo) del gen que codifica para inmunoglobulina par ticular. Des-pués de que ha ocurrido una respuesta inmunitaria, el investigador purifica o selecciona los anticuerpos que reconocen los deter-minantes alotípicos provenientes del individuo inmunizado. Los anticuerpos antialotipo se usan, por ejemplo, para rastrear poblaciones de células particulares en experimentos en los cua-les células B que provienen de una cepa de animales que portan un alotipo particular son transfe ridas hacia una segunda cepa que difiere en el alotipo de in munoglobulina.

Por último, anticuerpos dirigidos contra el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo particular se denominan anticuer-pos anti-idiotípicos. Pueden generarse al inmunizar un animal con grandes cantidades de un anticuerpo monoclonal purifi-cado que, por definición, porta un sitio único de unión a antí-geno. Los anticuerpos provenientes del animal inmunizado que reconocen el sitio de unión a antígeno del anticuerpo original a continuación se pueden purificar. Los anticuerpos anti-idiotípi-cos se usaron en los experimentos iniciales que probaron que el receptor de célula B tenía el mismo sitio de unión a antígeno que el anticuerpo secretado por esa célula B, y ahora se usan para dar seguimiento al destino de células B que portan una especificidad de receptor única en experimentos de inmunolo-calización.

Como se describió, el tratamiento de moléculas de anticuer-pos enteras con la enzima papaína divide la molécula de anti-cuerpo en la región bisagra, y libera dos fragmentos Fab de unión

Tipo de anticuerpo Qué reconoce

Anti-Fab (fragmento, unión a antígeno) Fragmento de anticuerpo generado con papaína, que consta de los dominios VHCH1–VLCL.

Anti-Fc (fragmento, cristalizable) Fragmento de anticuerpo generado con papaína que consta de los dominios CH2CH3 (y, para IgM e IgD, CH4) pareados.

Anti-isotipo Determinantes antigénicos específicos para cada clase de cadena pesada.

Anti-alotipo Determinantes antigénicos que son específicos para alelo —diferencias pequeñas en la región constante de las cadenas ligera y pesada que varían entre individuos.

Anti-idiotipo Determinantes antigénicos característicos de un sitio de combinación de un antígeno particular. Cada anticuerpo tendrá sus propios determinantes idiotípicos característicos hechos de residuos provenientes de las cadenas pesada y ligera que contribuyen a las regiones de unión a antígeno.

Anticuerpos que reconocen otros anticuerposcUaDRo 3-3


Las regiones bisagraLas cadenas pesadas γ, δ y α contienen una secuencia peptídica extendida entre los dominios CH1 y CH2, que no tiene homolo-gía con los otros dominios (figuras 3-20 y 3-22). Esta llamada región bisagra es rica en residuos de prolina, que la hacen en particular flexible y, como consecuencia, los dos extremos de unión a antígeno de anticuerpos IgG, IgD e IgA pueden adoptar una amplia variedad de ángulos uno respecto a otro, lo cual

facilita la unión eficiente a antígeno. La naturaleza extendida de la cadena de aminoácidos en la región bisagra contribuye a la vulnerabilidad de esta parte de la molécula a la división por proteasa, una vulnerabilidad que se explotó ingeniosamente en los experimentos tempranos que caracterizaron la estructura de anticuerpos (recuadro 3-1).

Además de estos residuos de prolina, la región bisagra tam-bién contiene varias cisteínas, que participan en la dimeriza-ción de cadena pesada. El número real de enlaces disulfuro intercadena en la región bisagra varía considerablemente entre diferentes clases y subclases de cadena pesada de anti-cuerpos (figura 3-23) así como entre especies. Al carecer de una región bisagra, las cadenas pesadas de IgE hacen sus enlaces disulfuro entre ca dena pesada entre los dominios CH1 y CH3. En la IgM, los enlaces disulfuro forman puentes entre los pares de cadenas pesadas al nivel de CH3 y CH4. Aunque las cadenas μ y ε carecen de regiones bisagra, tienen un domi-nio de inmunoglobulina adicional que retiene algunas cualida-des tipo bisagra.

Cadenas de carbohidratosLos dos dominios CH2 de las cadenas α, δ y γ, y los dos domi-nios CH3 de las cadenas μ y ε están separados de sus dominios pareja de cadena pesada mediante cadenas laterales de oligosa-cárido que evitan que las dos cadenas pesadas se enclaven una cerca de la otra (figura 3-24). Como resultado, los dominios pares están significativamente más accesibles al ambiente acuoso que los otros dominios de región constante. Se cree que esta accesibilidad contribuye a la capacidad de los anticuerpos IgM e IgG para unirse a componentes del complemento. En general, las inmunoglobulinas están extensamente glucosiladas, y algunos anticuerpos incluso tienen carbohidratos fijos a sus cadenas ligeras.

Los dominios carboxilo terminalLas cinco clases de anticuerpos pueden expresarse como inmunoglobulina de membrana o secretada. Los anticuerpos secretados tienen una secuencia de aminoácidos hidrofílica de

IgG3 IgG4IgG2IgG1

Enlacedisulfuro

FigurA 3-23 estructura general de las cuatro subclases de Igg humana, que difieren en el número y el reordenamiento de los enlaces disulfuro intercadena (líneas negras gruesas) que unen las cadenas pesadas. Una característica notable de la IgG3 humana son sus 11 enlaces disulfuro intercadena.

FigurA 3-24 Los residuos de carbohidrato, que se muestran en color rosa, evitan el contacto estrecho entre los dominios cH2 de Igg1 humana. [PDB ID 1IGT.]


La cristalografía de rayos X se ha usado para definir la base estructural de la unión antígeno-anticuerpo

La cristalografía se ha usado para explorar la naturaleza de la unión antígeno-anticuerpo para un gran número de anticuer-pos, y ha demostrado que una u otra cadena, o ambas cadenas, podrían proporcionar casi todos los residuos de contacto con cualquier antígeno. Así, algunos anticuerpos se unen al antí-geno principalmente por medio de contactos con residuos de la región variable de cadena pesada; la cadena ligera meramente proporciona apoyo estructural para el sitio de unión; sucede lo contrario para otras interacciones antígeno-anticuerpo. Aun otros anticuerpos usan residuos provenientes de ambas cadenas para ponerse en contacto de manera directa con el antígeno. Aun así, casi siempre los contactos entre antígeno y anticuerpo ocurren en una amplia cara, y las protuberancias y depresiones en la superficie del anticuerpo probablemente coinciden con depresiones o abultamientos complementarios en el antígeno. En la figura 3-26 se ilustra la unión de un anticuerpo al extremo de la molécula de hemaglutinina del virus de la gripe. En otro caso bien estudiado de una unión de anticuerpo a la proteína lisozima, se mostró que el área de superficie de interacción es bastante grande; en diferentes pares de anticuerpo-lisozima varía de 650 a 900 Angstroms cuadrados. Dada la unión estre-cha entre un anticuerpo y su antígeno complementario, no debe sorprender que, al menos en algunos casos, la unión de antí-geno a anticuerpo induce un cambio conformacional en el anticuerpo, que puede visualizarse mediante cristalografía de rayos X (figura 3-27).

diversas longitudes en el carboxilo terminal del dominio CH final. En receptores de inmunoglobulina unidos a membrana, esta región hidrofílica es reemplazada por tres regiones (figura 3-25):

• Unasecuencia“espaciadora”hidrofílica,extracelular,deaproximadamente 26 aminoácidos

• Unsegmentotransmembranahidrofílicodealrededorde25 aminoácidos

• Unacolacitoplasmáticamuycorta,deaproximadamentetres aminoácidos

Las células B expresan diferentes clases de inmunoglobulina de membrana en etapas del desarrollo particulares, y bajo con-diciones estimulatorias diferentes. Las células pre-B, inmaduras, sólo expresan IgM de membrana. La coexpresión de IgD de membrana, junto con IgM, es uno de los marcadores de diferen-ciación hacia una célula B por completo madura que todavía no ha encontrado antígeno. Después de la estimulación con antí-geno, la IgD se pierde de la superficie celular, y la región cons-tante de la membrana y la inmunoglobulina secretada pueden cambiar hacia cualquiera de los otros isotipos. La clase de anti-cuerpo secretado por células B estimuladas por antígeno está determinada por citocinas liberadas por células T y células pre-sentadoras de antígeno en la vecindad de la célula B activada. Anticuerpos de diferentes clases de cadena pesada tienen afini-dades selectivas por receptores Fc de superficie celular particu-lares, así como por componentes del sistema de complemento. Las funciones efectoras de clases de anticuerpos particulares se comentan más en los capítulos 6 y 13.

AAA

Transcrito primario

Empalmealternativo

Transcritos procesados

Forma unida a membranaForma secretada

AAAAAA

Segmentohidrofílico

Segmentos unidos a membrana

lgα/lgβ

FigurA 3-25 Las formas de inmunoglobulina de mem-brana en contraposición con secretada se crean mediante empalme de mRna alternativo. Los cuadros de color azul oscuro corresponden a las secciones de transcrito de mRNA de las secuencias de región variable reordenadas, en tanto que los cuadros de color azul claro ilustran las partes del transcrito de mRNA que corresponden a los dominios de región constante individual de los genes que codifican para cadena pesada. El gen que codifica para IgM, que se muestra aquí, contiene una región variable y cuatro exones de región constante. El

segmento de color rosado representa el transcrito que codifica para la porción C terminal de la inmunoglobulina secretada. Los segmentos de color verde representan el transcrito que codifica para las porciones C terminal del receptor de inmunoglobulina unido a membrana, incluso las regiones transmembrana y citoplasmática. El empalme alternativo crea los dos tipos diferentes de moléculas de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas unidas a membrana y secretadas sobre cualquier célula B comparten las regiones de unión a antígeno idénticas y la mayor parte de las secuencias de cadena pesada.


Transducción de señal en células B

Una vez descrita la estructura de las moléculas de anticuerpo y su forma unida a membrana, el receptor de célula B (bcr), ahora se dirigirá la atención a la función del bcr. Recuérdese

que la estructura del bcr es idéntica a la de los anticuerpos que la célula secretará en el momento de la estimulación por antí-geno, excepto por la porción C– terminal de la cadena pesada; esta porción es modificada de modo que fije el receptor a la membrana plasmática de la célula B. Antes del reconocimiento de antígeno, las células B maduras que residen en los tejidos linfoides secundarios, como el bazo o los ganglios linfáticos, expresan formas unidas a membrana tanto de IgM como de IgD.

Como se describió, la cola citoplasmática de la cadena pe sada del bcr es en extremo corta —sólo tiene tres aminoácidos— y, así, uno de los enigmas que tuvieron que resolver quienes explo-raron la activación de antígeno mediado por bcr fue cómo una cola citoplasmática tan corta podía transmitir con eficiencia una señal hacia el citoplasma. Este problema se resolvió cuando experimentos de coinmunoprecipitación revelaron que cada molécula de bcr estaba asociada de manera no covalente con un heterodímero, la Igα/Igβ (figura 3-7a) que se encarga de transdu-cir la señal de antígeno hacia el interior de la célula. Recuerde que las cadenas de Igα/Igβ contienen itam que incluyen residuos de tirosina que quedan fosforilados en el momento de activación por medio del receptor, y sirven como residuos de acoplamiento para componentes de emisión de se ñales torrente abajo. Por ende, el bcr se divide desde los puntos de vista estructural y funcional en dos componentes: un componente de reconoci-miento (el receptor de inmunoglobulina) y un componente de transducción de señal (Igα/Igβ).

En secciones previas de este capítulo se describieron algunos principios generales de la transducción de señal, y se esbozaron tres vías de transducción de señal empleadas comúnmente (figura 3-5, Perspectiva general). En esta sección se muestra cómo esos principios se aplican a los eventos intracelulares que suceden en el momento de interacciones antígeno-receptor en células B.

La unión a antígeno da lugar a acoplamiento de moléculas adaptadoras y enzimas hacia el complejo de membrana de BCR-Igα/Igβ

La unión a antígeno induce alteraciones conformacionales en el bcr, que exponen regiones en los dominios Cμ4 de las cadenas

Antígeno Anticuerpo

a) b)

FigurA 3-26 Simulación por computadora de una interacción entre anticuerpo y antígenos del virus de la gripe. a) El antí-geno (amarillo) se muestra interactuando con la molécula de anticuerpo; la región variable de la cadena pesada está en rojo, y la región variable de la cadena ligera está en azul. b) La complementariedad de las dos moléculas es revelada al separar el antígeno del anticuerpo 8 Å. [Basado en datos de cristalografía de rayos X recabados por P.M. Colman y W.R. Tulip. Tomado de G.J.V.H. Nossal, 1993. Scientific American 269(3):22.]

L1

H3

L2 L3

H1

H2

FigurA 3-27 Puede ocurrir cambio conformacional en el momento de la unión de antígeno a anticuerpo. Esta figura muestra un complejo entre un péptido derivado de la proteasa del HIV y un fragmento Fab proveniente de un anticuerpo antiproteasa. El péptido se muestra en color negro. La línea roja muestra la estructura del frag-mento Fab antes de que se una al péptido, y la línea azul muestra su estructura después de unión. Hay cambios conformacionales importan-tes en los CDR del Fab en el momento de la unión al antígeno; éstos son en especial pronunciados en el CDR1 de la cadena ligera (L1) y CDR3 de la cadena pesada (H3). [Tomado de J. Lescar et al., 1997, Journal of Molecular Biology 267:/207; cortesía de G. Bentley, Institute Pasteur.]


ciona sitios de acoplamiento para múltiples componentes to rrente abajo de la vía de señalización. La proteína adaptadora bcap y CD19, el co-receptor de célula B, también son fosforiladas por estas tirosina cinasas, y sirven para reclutar la enzima PI3 cinasa hacia la membrana plasmática.

Las células B usan muchas de las vías de señalización torrente abajo antes descritasLas vías de emisión de señales torrente abajo usadas por el bcr ahora serán familiares. Las tirosina cinasas Syk y Btk juntas fosforilan y activan PLCγ2, que hidroliza PIP2, como se describió. El aumento resultante de las concentraciones intracitoplasmáticas

pesadas de receptor. Las interacciones entre moléculas receptoras vecinas por medio de estos dominios generan oligomerización de receptor (formación de agrupaciones pequeñas de complejos de antígeno-receptor) y movimiento subsiguiente de estas agru-paciones de receptor hacia regiones de balsas de lípidos especia-lizadas de la membrana de la célula B. Por ende, los residuos itam de Igα/Igβ son acercados mucho a las cinasas de la fami-lia Src, Lyn (figura 3-28), Fyn y Blk. La fosforilación de tirosina de los residuos de itam Igα/Igβ por estas cinasas de la familia Src, en particular Lyn, a continuación proporciona sitios de fijación para la proteína adaptadora blnk y una tirosina cinasa adicional, Syk, que es fosforilada y activada por las cinasas de la familia Src. A continuación, Syk fosforila blnk, lo que propor-

PI3K PI3K

Citoplasma

Antiapoptótica

Fosforilacióny desactivación

Reorganizacióndel citoesqueleto

Supervivencia celular

Núcleo

CD21

Syk

BLNK

Btk

BCAP

Grb-2

SOS

VAV

Akt

Bax Bad

PDK1

PLCγ2

Cascada de laMAP cinasa

Ras

PIP3 PIP3 PIP3

Calmodulina

Lyn Lyn

Calcineurina

P

P

P

P

P

PP

P

P

P

P PPP

P

P

P

CD19

Ca2+

NFAT AP-1NF-κB

Activación de gen

PKC

Rac/Rho/cdc42

lgα/lgβ

FigurA 3-28 vías de transducción de señal que emanan del bcr. La agrupación de receptor mediada por antígeno hacia las regiones balsas de lípidos de la membrana lleva a fosforilación por cinasa de la familia src de los correceptores Igα/Igβ y CD19, las pro-teínas adaptadoras BLNK y BCAP, y la tirosina cinasa, Syk. BCAP y CD19 reclutan PI3 cinasa hacia la membrana, con generación de PIP3 y localización subsiguiente de PDK1 y Akt a la membrana. La fosfori-lación por Akt aumenta la supervivencia celular y lleva a activación de los factores de transcripción NF-κB y CREB, como se describió. La

activación de la isoforma de PLC de célula B, PLCγ2, ocurre en el momento de unión al adaptador localizado a la membrana, BLNK y fosforilación por Syk, lo que da lugar a la generación de DAG e IP3, con activación de las vías de NFAT y NF-κB (véase el texto). Las vías de MAP cinasa son activadas por medio de la unión de Grb2 a BLNK, con activación subsiguiente de Ras y mediante la activación de la proteína GEF, VAV, que activa Rac. [Adaptado de M. E. Conley et al. 2009. Annual Reviews of Immunology 27:199-227.]


de Ca2+ induce la activación de calcineurina y el mo vimiento de nfat hacia el núcleo (figura 3-24). El otro producto de la hi -drólisis del PIP2, el dag (figura 3-12), permanece en la mem-brana y se une a la isoforma de célula B de proteína cinasa C, lo que da pie a la fosforilación y liberación del inhibidor de NF-κB, como se describió para células T (figura 3-17). Esto da lugar a la localización nuclear y activación de NF-κB.

Vías efectoras torrente abajo adicionales desencadenan los muchos otros cambios que tienen lugar en el momento de acti-vación de célula B; por ejemplo, la PI3 cinasa, ahora localizada a la membrana, fosforila PIP2 hacia PIP3 (figura 3-11), lo que permite el reclutamiento de las proteínas que contienen domi-nio ph, PDK1 y Akt. En el momento de la fosforilación por la serina-treonina cinasa PDK1, Akt promueve la supervivencia celular al fosforilar moléculas proapoptóticas, como Bax y Bad, y desactivarlas. También fosforila y activa los factores de transcripción NF-κB y creb, que apoyan las funciones de proliferación, diferenciación y supervivencia de las células B acti vadas.

La vía de la map cinasa (figura 3-16) también es activada durante la activación de células B. La fijación de Grb2 a blnk desencadena la unión del gef sos, seguida por la unión y

activación de Ras, como se describió. De modo similar, Rac, otra proteína G monomérica pequeña de la familia Ras, es acti-vada por la unión de la proteína gef, Vav. Tanto Ras como Rac son proteínas G pequeñas que actúan para iniciar vías de emi-sión de señales de map cinasa. Como se describió, la activación de la vía de la map cinasa culmina en la expresión del factor de transcripción fosforilado Elk. En células B, Elk promueve la síntesis del factor de transcripción Egr-1, que actúa para inducir alteraciones de la expresión de superficie celular de moléculas de adhesión importantes, y finalmente sirve para ayudar a la migración de linfocitos B hacia tejidos linfoides secundarios y dentro de los mismos. Efectores torrente abajo desde Rac pro-mueven la polimerización de actina, lo que facilita más la moti-lidad de células B.

En conclusión, la unión de antígeno en el bcr lleva a múl-tiples cambios de la actividad transcripcional, así como de la localización de células B y la motilidad de las mismas, que juntas dan lugar a su supervivencia, proliferación, diferencia-ción y secreción final de anticuerpos, aumentadas. Como se ejemplifica en el recuadro 3-2, los defectos en proteínas invo-lucradas en la señalización de célula B pueden llevar a inmu-nodeficiencias.

RECUADRO 3-2

Los defectos en la proteína emisora de señales de célula B, Btk, llevan a agammaglobulinemia ligada a X

(continúa)

proteínas están dañadas o cuáles proteínas faltan en síndromes de inmunodeficiencia par ticulares. En 1993, 41 años después de la descripción inicial de la enfermedad, dos grupos reportaron de manera independiente que muchos casos de xla se producían por mutaciones en una tirosina cinasa citoplas-mática llamada tirosina cinasa de Bruton, o Btk; ahora se sabe que un total de 85% de los pacientes afectados por xla tiene mutacio-nes en el gen Btk.

La Btk es un miembro de la familia de tirosina cinasas citoplasmáticas Tec, que se expresan de modo predominante en células hematopoyéticas. Las cinasas de la familia Tec comparten un dominio cinasa C terminal, precedido por dominios SH2 y SH3, un domi-nio rico en prolina, y un dominio PH amino terminal, capaz de unirse a fosfolípidos PIP3 generados por la actividad de la PI3 cinasa. La Btk se expresa tanto en células B como en plaquetas, y es activada después de emisión de señales por medio del bcr, el pre-BCR (que se expresa en células B en desarrollo), los receptores de IL-5 e IL-6, y el receptor de quimiocina CXCR4. Su participación en la señalización pre-BCR explica por qué los niños con xla sufren desarrollo defectuoso de células B.

En 1952, un pediatra, Ogden Bruton, re -portó en la revista Pediatrics el caso de un niño de ocho años de edad que sufrió múl-tiples episodios de neumonía. La electrofo-resis del suero del niño mostró que carecía por completo de globulinas séricas; por ende, esta enfermedad se denominó agam-maglobulinemia. Ésa fue la primera enfer-medad de inmunodeficiencia para la cual un dato de laboratorio explicó los síntomas clí-nicos, y el tratamiento que Bruton aplicó —la administración de inyecciones de gamma-globulina por vía subcutánea— aún se usa. Conforme se reportaron casos similares, se notó que la mayor parte de los casos pediá-tricos de agammaglobulinemia ocurría en varones, mientras que en adultos la enfer-medad parecía afectar a ambos sexos de manera similar. El mapeo cuidadoso de la susceptibilidad de la enfermedad al cromo-soma X dio lugar a que la forma pediátrica de la enfermedad se denominara xla, que significa agammaglobulinemia ligada al cro-mosoma X (X-Iinked agammaglobulinemia).

Con la caracterización de los componen-tes de la vía de transducción de señal de BCR durante los decenios de 1980-1989 y 1990-1999, se tuvo la oportunidad de definir cuáles

La caracterización de las proteínas necesarias para la señalización de células B y T abrió nuevas avenidas de exploración para médicos que estuvieron trabajando con pacientes que sufrían trastornos de inmuno-deficiencia. Los médicos y los es pecialistas en inmunogenética ahora trabajan en estrecha colaboración para diag nosticar pacientes con inmunodeficiencias y tratarlos, para el benefi-cio tanto de la clínica como de las ciencias básicas.

La caracterización de los genes de los cuales dependen trastornos del sistema inmu-nitario es complicada por el hecho de que las deficiencias de anticuerpos pueden produ-cirse por genes defectuosos que codifican para proteínas de células T o B (porque las células T proporcionan factores auxiliares necesarios para la producción de anticuerpos por células B), o incluso por mutaciones en genes que codifican para proteínas en las células del estroma importantes para el desa-rrollo de células B saludables en la mé dula ósea. Aun así, sin importar cuál es la causa, todas las deficiencias de anticuerpos se mani-fiestan en clínica por susceptibilidad aumen-tada a infecciones bacterianas, en particular de los pulmones, los intestinos y (en niños de más corta edad) el oído.

enFoQUe cLínIco


se comenta en el capítulo 6.) El co-receptor de célula B CD21 se une de manera específica a C3d, sobre antígenos cubiertos por C3d. Esta co-unión (co-engagement) del bcr y CD21 lleva el co-receptor y el bcr hacia estrecha aposición uno con otro. Cuando esto sucede, residuos de tirosina sobre la cara citoplas-mática del co-receptor quedan fosforilados por las mismas enzimas que fosforilan los itam sobre Igα/Igβ, lo que propor-ciona sitios de fijación para PI3 cinasa. La localización de la PI3 cinasa al co-receptor aumenta tanto la supervivencia

Las células B también reciben señales por medio de co-receptores

El receptor de inmunoglobulina sobre la membrana de célula B está asociado de manera no covalente con tres moléculas trans-membrana: CD19, CD21 y CD81 (TAPA-1) (figura 3-7a). Los antígenos a veces son presentados al bcr ya unidos de manera covalente a proteínas del complemento, en particular al compo-nente del complemento C3d. (La cascada de complemento

Después de la activación, la Btk se mueve hacia el lado interno de la membrana plas-mática, donde es fosforilada y parcialmente activada (figura 3-28). La activación se com-pleta cuando se autofosforila en un segundo sitio de fosforilación. La Btk se une a la pro-teína adaptadora blnk, junto con PLCγ2. La Btk a continuación fosforila y activa PLCγ2 lo que lleva, como se describió, a flujos de cal-cio y activación de las vías de NF-κB y nfat; por ende, la Btk ocupa una posición funda-mental en la activación de células B y no sorprende que las mutaciones en el gen que la codifica den lugar a consecuencias tan devastadoras.

Se han identificado más de 600 muta-ciones diferentes en el gen btk; casi todas se producen por sustituciones de par de bases único o por la inserción o deleción de menos de cinco pares de bases. Al igual que para otras mutaciones ligadas a X que son mortales sin intervención mé- dica, la enfermedad xla se mantiene en la población por la ge neración de nuevas mutaciones.

Los pacientes con xla por lo general están sanos durante el periodo neonatal (inmediatamente después del nacimiento), cuando aún se benefician de los anticuerpos maternos. No obstante, entre tres y 18 meses de edad empiezan infecciones bacterianas recurrentes, y en la actualidad la edad media en el momento del diagnóstico en la parte no latina de América es de tres años. La xla es un defecto denominado “con fugas”; la mayoría de los niños con mutaciones en btk tiene algo de inmunoglobulina sérica, y algunas células B en la circulación periférica. El pronóstico para pacientes que reciben tratamiento con dosis regulares de gamma-globulina ha mejorado de manera notoria durante los últimos 25 años con el uso de inyecciones profilácticas de gammaglo-bulina.

Las células B en pacientes con xla tie-nen un fenotipo característico que puede usarse para propósitos diagnósticos. La expresión de CD19 es baja y variable en pacientes con xla, mientras que la expre-sión de IgM de membrana, normalmente variable en células B maduras, es relativa-mente alta y consistente en pacientes con xla. Este fenotipo puede observarse en la figura 1, que muestra los perfiles en la cito-metría de flujo de un individuo testigo nor-mal (los dos gráficos de la izquierda) y un paciente con gen btk defectuoso (los dos gráficos de la derecha). En los dos gráficos superiores, se nota que el paciente con xla tiene muy pocas células CD19+ en compara-ción con el testigo, y que las cifras de CD19 sobre la superficie de las células B que exis-ten son más bajas que las que se observan en las células testigo. En los dos gráficos

inferiores se nota que, si bien hay menos células B CD19+ en general en el paciente con btk alterado, todas las células B CD19+ tienen cifras relativamente altas de IgM de superficie, mientras que las cifras de IgM de membrana son mucho más variables en los testigos saludables.

Bruton, O.C. 1952. Agammaglobulinemia. Pedi-atrics 9:722-728.

Conley, M.E., et al. 2009. Primary B cell immuno-deficiencies: Comparisons and contrasts. Annual Review of Immunology 27:199-227.

Tsukuda, S., et al. 1993. Deficient expression of a B cell cytoplasmic tyrosine kinase in human X-linked agammaglobulinemia. Cell 72:279-290.

Vetrie, D., et al. 1993. The gene involved in X-linked agammaglobulinemia is a member of the src family of protein tyrosine kinases. Nature 361:226-233.

sIgM

Anticuerpo del testigo

CD19

CD19

sIgM

CD19

Anticuerpo del testigo

CD19

Testigo Btk

FIGuRA 1Perfiles de FacS de un individuo normal y un paciente con xLa. [Adaptado de Conley et al. 2009. Annual Review of Immunology 27:199.]

RECUADRO 3-2enFoQUe cLínIco (continuación)


celular como las alteraciones del programa de transcripción que acompañan a la activación celular (figura 3-28). CD19 también sirve como un sitio adicional de reclutamiento de PLCγ.

Receptores de célula T y señalización

Las células T se unen a antígenos complejos constituidos de péptidos ubicados en el surco de proteínas del mhc unidas a membrana. Cuando el receptor de célula T hace contacto con su mhc-antígeno peptídico sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, las dos membranas celulares son llevadas hacia aposición estrecha una con otra. Esto añade otro estrato de complejidad al proceso de activación de célula T que no encuentra paralelo en la señalización de célula B. Al margen de esta complejidad adicional, los eventos de activa-ción de célula T aún se despliegan de acuerdo con una mezcla de las estrategias antes descritas, y tienen muchas similitudes con la emisión de señales de receptor de célula B. Aquí, se describe brevemente la estructura del receptor de célula T y a continuación se caracterizan las rutas de emisión de señales por medio de este receptor. El recuadro 3-3 describe los expe-rimentos que dieron lugar al aislamiento y la caracterización del αβTCR.

El receptor de célula T es un heterodímero con regiones variable y constante

Hay dos tipos de receptores de célula T, ambos son heterodí-meros (dímeros constituidos de dos polipéptidos diferentes). Casi todas las células T recirculantes portan he terodímeros αβ, que se unen a ligandos constituidos de un péptido antigé-nico presentado en un surco molecular sobre la superficie de una molécula del mhc tipo I o tipo II. Un se gundo sub grupo de células T expresa, en lugar de esto, un receptor de célula T heterodimérico compuesto de un par diferente de cadenas de proteína, llamadas γ y δ. Las células T que portan receptores γδ tienen patrones de localización particulares (a menudo en tejidos mucosos) y algunas células T γδ reconocen tipos de antígenos diferentes de los que son unidos por células T αβ. Aunque algunas células T γδ reconocen antígenos peptídicos presentados por mhc convencionales, otras células T γδ se unen a porciones de lípido y glicolípido presentadas por moléculas del mhc no canónicas. Aún otras clonas de células T γδ parecen reconocer proteínas de choque por calor auto-generadas o fosfoantígenos derivados de microbios. No ha logrado establecerse todavía una teoría unificada de la natu-raleza precisa de antígenos reconocidos por células T γδ. Empero, esta capacidad de dichas cé lulas para romper las reglas de restricción del mhc tal vez explique la evolución de una diferencia leve en el ángulo entre la región de unión a antígeno y la región constante del receptor de cé lula T, que queda de manifiesto en un análisis cristalográfico de rayos X de los dos tipos de receptor (figura 3-29). A pesar de estas diferencias funcionales en los receptores αβ en contraposi-ción con γδ, sus características bioquímicas esenciales son bastante similares.

Dominios V

Dominios C

γδ TCR111°

αβ TCR147°

FigurA 3-29 comparación de las estructuras cristalinas de TcR 𝛄𝛅 y 𝛂𝛃. La diferencia (puesta de relieve con líneas negras) en el ángulo codo entre formas γδ y αβ forma el TCR.

El resto de este capítulo se enfoca en la estructura y la seña-lización del tipo de tcr αβ dominante, reconociendo que puede haber diferencias menores entre los dos tipos de re ceptores y sus componentes torrente abajo.

Aunque el tcr no es una inmunoglobulina en sí, las proteí-nas del tcr son miembros de la superfamilia de proteínas inmunoglobulina y, por ende, las estructuras dominio de hete-rodímeros de tcr αβ y γδ son notoriamente similares a las de las inmunoglobulinas (figura 3-19). La cadena α tiene un peso molecular de 40 a 50 kDa, y la cadena β es de 40 a 45 kDa. Al igual que las cadenas ligeras de anticuerpo, las cadenas de tcr tienen dos dominios tipo inmunoglobulina, cada uno de los cuales contiene un enlace disulfuro intracadena que abarca 60 a 75 aminoácidos. El dominio Cα del tcr difiere de casi todos los dominios de inmunoglobulina en que posee sólo una lámina β única, en lugar de un par, y el resto de la secuencia muestra plegamiento más variable. El dominio amino terminal (varia-ble) en ambas cadenas muestra notoria variación de secuencia, pero las secuencias del resto de cada cadena están conservadas (son constantes). Cada uno de los dominios variables de tcr tiene tres regiones hipervariables, que parecen ser equivalentes a las regiones determinantes de la complementariedad (cdr) en las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Una cuarta región hipervariable sobre la cadena β de tcr no parece tener contacto con el antígeno, y, por ende, su importancia funcional es incierta.

En el extremo C terminal del dominio constante, cada ca -dena de tcr contiene una secuencia conectora corta, en la cual un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con la otra cadena del heterodímero. En posición C– terminal a este disul-furo hay una región transmembrana de 21 o 22 aminoácidos, que ancla cada cadena en la membrana plasmática. Los domi-nios transmembrana de las cadenas alfa y beta de tcr son poco comunes por cuanto cada uno de ellos contiene residuos de aminoácido con carga positiva que promueven la interacción con residuos con carga negativa correspondientes sobre las cadenas del complejo CD3 transductor de señal. Por último, al igual que los bcr, cada cadena de tcr sólo contiene una cola citoplasmática muy corta en el extremo carboxilo terminal.

rísticas bioquímicas del tcr se entendieron después que las del bcr, hasta el decenio de 1980-1989, cuando un importante avance científico —la capacidad para sintetizar anti-cuerpos monoclonales a partir de tumores

vamente más tratable. Sin embargo, los investigadores dedicados a caracterizar el receptor de célula T (tcr) no disfrutaron de la misma ventaja, porque el tcr no es secre-tado en forma soluble. Por ende, las caracte-

El descubrimiento del receptor de células T αβUna vez que los científicos habían esta-blecido que el bcr era simplemente una forma unida a membrana del anticuerpo secretado, la elucidación de la estructura del bcr se convirtió en un problema significati-

Se inmuniza ratones conovoalbúmina (OVA)

Se espera varios díasSe extirpan ganglios linfáticosSe cultivan células T del ganglio linfático con OVA

Generación de un hibridoma de células Tcon especificidad de antígeno conocida

1

FIGuRA 1La generación de anticuerpos específicos para el tcr

Se diluyen las células fusionadas de modo quecada célula contenga un hibridoma de células Túnico. Se permite que las células se dividan paraformar clonas y se prueba cada clona respectoa su capacidad para secretar IL-2 cuando esestimulada con péptidos de ovoalbúmina. Sehacen crecer clonas individuales de hibridomasde células T que reconocen OVA.

3

Se añade polietilénglicol para inducir fusiónde células T específicas para antígeno conlínea de células T de vida prolongada

2

Se inmuniza a un nuevo ratón concélulas provenientes de un hibridomade células T específico para OVA

Se espera varios díasSe aísla el bazo

Producción de anticuerpos que se unena TCR sobre el hibridoma de células T

4

Se fusionan células B provenientes delbazo con línea de células B a largo plazo

5

Se recolectan anticuerpos monoclonalesque se unen a líneas de células T

Selección y expansión de las clonas de células B alargo plazo que secretan anticuerpos monoclonalesque se unen al hibridoma de células T

6

96

exPeRImenTo cLáSIco

linfático recolectadas (figura 1, paso 1). Des-pués de cierto tiempo en cultivo, fusionaron estas células T específicas para ova, activa-das, con células derivadas de un tumor de células T (figura 1, paso 2); de este modo generaron varios cultivos de hibridoma de células T de vida prolongada que recono-cieron péptidos de ova en el contexto del mhc del ratón original, un alelo del mhc llamado H-2d. A continuación diluyeron las células fusionadas en cada cultivo, lo que generó varias líneas de hibridoma de células T en las cuales todas las células en una línea de hibridoma individual se derivaron del pro ducto de un evento de fusión único (fi -gura 1, paso 3); esto se denomina clonación por dilución limitante. De esta manera, aisla-ron un hibridoma de células T que expresó un tcr capaz de reconocer un péptido pro-veniente de la ova, en el contexto de proteí-nas del mhc clase 2 provenientes de ratones de la cepa H-2d.

Entonces esas células T podían utilizarse como antígenos e inyectarlas en un ratón (figura 1, paso 4). Algunos días más tarde se extirpó el bazo de este animal, y las células B del ratón se fusionaron con células tumora-les de la línea B (figura 1, paso 5). Después de cultivar para estabilizar los híbridos, los investigadores clonaron los hibridomas de células B y seleccionaron una línea de hibri-doma de células B que produjo anticuerpos

de células B construidos de manera artificial, o hibridomas— hizo técnicamente más fac-tible el análisis del tcr.

Un hibridoma es un producto de fusión de dos células. Los hibridomas de células B se generan al fusionar de manera artificial linfocitos de vida breve, productores de anti-cuerpos, con células tumorales de vida pro-longada a fin de generar células hijas de vida prolongada que secretan grandes cantida-des de anticuerpos monoclonales. (El tér-mino monoclonal se refiere al hecho de que todas las células en un cultivo de hibri-doma dado se derivan de la clona única de células y, por ende, portan el mismo dna; los detalles de la tecnología se describen en el capítulo 20.) Aunque esta técnica se desarro-lló por vez primera para la generación de células B de vida prolongada, los científicos que trabajaban en el laboratorio de John Kappler y Philippa Marrack también la apli-caron a linfocitos T.

Los investigadores empezaron por inmu-nizar un ratón con la proteína ovoalbúmina (ova), y permitieron que células T específi-cas para ova se dividieran y diferenciaran durante algunos días, y después recolecta-ron los ganglios linfáticos del animal inmuni-zado. Para enriquecer su población inicial con tantas células T específicas para ova como fue posible, durante varias horas culti-varon con ova in vitro las células de ganglio

monoclonales que se unieron de manera específica al hibridoma de células T (figura 1, paso 6). Lo que es más importante, estos anticuerpos interfirieron con la capacidad de las células T para reconocer su antígeno cognado (figura 1, paso 7). El hecho de que este anticuerpo monoclonal inhibió la unión de antígeno a tcr sugirió que el anticuerpo se estaba uniendo de manera directa al receptor, y estaba compitiendo con el antí-geno por unión al tcr. A continuación usa-ron estos anticuerpos para inmunoprecipitar el tcr desde preparaciones de membrana solubilizadas con detergente, y purificaron la proteína tcr (figura 1, paso 8).

De modo concurrente con estos experi-mentos, en los laboratorios de Stephen Hedrick y de Mark Davis en los nih y de Tak Mak en Toronto, se habían estado buscando los genes que codifican para receptor de célula T, y se habían logrado avances. Estos experimentos, así como investigación subsi-guiente realizada por Susumu Tonegawa, que completó la identificación de los genes que codifican para el tcr, se describen con detalle en el capítulo 7.Haskins et al. 1983. The major histocompatibility

complex-restricted antigen receptor on T cells. I. Isolation with a monoclonal antibody. The Jour-nal of Experimental Medicine 157:1149-1169.

Haskins et al. 1984. The major histocompatibility complex-restricted antigen receptor on T cells. Annual Review of Immunology 2:51-66.

OVAOVA

Identificación de anticuerpo monoclonal que interfiere con elreconocimiento de antígeno por células de hibridoma de células T

La mezcla de hibridomade células T con célulaspresentadoras de OVA enausencia de anticuerpo dalugar a la proliferación dehibridoma de células T

La mezcla de hibridomade células T con célulaspresentadoras de OVA enpresencia de anticuerpo dalugar a proliferación nulade hibridoma de células T

7

Las dos cadenas del receptor αβpueden observarse en la línea 1del gel, corriendo una arriba dela otra a aproximadamente 40a 45 kDa. Se mostró que las dosbandas de peso molecular másalto que se observan en esta línearepresentan bandas inespecíficas.

Bandas de TCR αβ de 45 kDa

8

97

RECUADRO 3-3


ζη (zeta, eta). (Note que las cadenas γ y δ de CD3 son distintas de las cadenas que constituyen el tcr γδ.) Al igual que Igα e Igβ, las colas citoplasmáticas de las moléculas de CD3 están salpicadas de secuencias itam que sirven como sitios de aco-plamiento para proteínas adaptadoras después de fosforilación de tirosina inducida por activación. Cada uno de los dímeros CD3 contiene aminoácidos con carga negativa en su dominio transmembrana que forman enlaces iónicos con los residuos que tienen carga positiva sobre las regiones intramembrana del receptor de célula T.

El complejo de transducción de señal de célula T incluye CD3

Del mismo modo que la señalización de célula B requiere la participación del complejo de transducción de señal Igα/Igβ, la emisión de señales por medio del tcr depende de un com-plejo de proteínas denominadas en conjunto CD3 (figura 3-30). El complejo CD3 está constituido de tres dímeros, un par δє (delta épsilon), un par γє (gamma épsilon), y un tercer par que consta de dos moléculas de CD3ζ (zeta) o un heterodímero

NH2α

γε

β

S

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS

SS S

NH2

++

+− − − − − −

εδ

9

COOH COOH

COOH(248)

COOH(282)

COOHCOOH COOH

COOH

143

ITAM

30

TCR

NH2 NH2NH2 NH2

90 105

116 130 130

160185 185

106

150

105 80

22

90

23

91

134

184

140

201

222 255

a)

ζ ζ

γε

δε

ζζ

ITAM

TCR

TCR–CD3b)

+

−

−

−

+

+

FigurA 3-30 Diagrama del complejo de TcR-cD3, que constituye el receptor de unión a antígeno de célula T. a) Los componentes del complejo CD3 incluyen los homodímeros ζζ (de manera alternativa, un heterodímero ζη) más heterodímeros γϵ y δϵ. Los dominios externos de las cadenas γ, δ y ϵ de CD3 constan de plie-gues de inmunoglobulina, que facilita su interacción con el receptor de célula T y uno con otro. Las colas citoplasmáticas largas de las cadenas CD3 contienen una secuencia común, el motivo de activación de inmu-norreceptor basado en tirosina (Immunoreceptor Tyrosine Activation Motif [itam]), que funciona en la transducción de señal; estas secuencias se muestran como cuadros de color azul. b) También pueden ocurrir interacciones iónicas entre las regiones transmembrana que tienen carga opuesta en el tcr y las cadenas CD3. Se muestran las interacciones pro-puestas entre los componentes de CD3 y el TCR αβ. [Adaptado de M.E. Call y K.W. Wucherpfenning, 2004. Molecular mechanisms for the assembly of the T cell receptor-CD3 complex. Molecular Immunology 40:1295.]


Los co-receptores de célula T CD4 y CD8 también se unen al mhc

El receptor de célula T está asociado de manera no covalente con varias moléculas accesorias sobre la superficie celular (cuadro 3-4). Con todo, las únicas dos de esas moléculas que también reconocen el mhc-antígeno peptídico son CD4 y CD8. Recuérdese que las células T maduras pueden subdivi-dirse en dos poblaciones de acuerdo con su expresión de CD4 o CD8 sobre la membrana plasmática. Las células T CD4+ reconocen péptidos que están combinados con moléculas del mhc clase II, y funcionan principalmente como células T auxiliares o re guladoras, mientras que las células T CD8+ reco-nocen antígeno que es expresado sobre la superficie de mo -léculas del mhc clase I, y funcionan principalmente como células T citotóxicas.

CD4 es una glucoproteína de membrana monomérica de 55 kDa que contiene cuatro dominios tipo inmunoglobulina extra-celulares (D1 a D4), una región transmembrana hidrofóbica, y una cola citoplasmática larga que contiene tres residuos de serina que pueden ser fosforilados (figura 3-31). CD8 adopta la forma de un heterodímero αβ u homodímero αα enlazado con enlace disulfuro (no son lo mismo que las cadenas α y β que constituyen el heterodímero de tcr). Las cadenas tanto α como β del CD8 son glucoproteínas pequeñas de aproximada-mente 30 a 38 kDa. Cada cadena consta de un dominio tipo inmunoglobulina, extracelular, único, una región tallo, una re -gión transmembrana hidrofóbica, y una cola citoplasmática que contiene 25 a 27 residuos, varios de los cuales pueden ser fosfo-rilados.

Los dominios extracelulares de CD4 y CD8 se unen a re -giones conservadas de moléculas del mhc clase II y clase I, respectivamente (figura 3-7b). La co-unión de una molécula del mhc única tanto por el tcr como por su co-receptor CD4 o CD8 aumenta la avidez de la unión de célula T a su blanco. Esta co-unión también acerca mucho los dominios citoplasmáticos del TCR/CD3 y el co-receptor respectivo, y ayuda a iniciar la cascada de eventos intracelulares que activan una célula T.

La señalización por medio del receptor de antígeno, incluso cuando se combina con la que ocurre por medio de CD4 o CD8, es insuficiente para activar una célula T que no ha tenido con-tacto previo con antígeno (una célula T virgen). Una célula T virgen necesita recibir simultáneamente señales por medio del tcr y su co-receptor, CD28, para ser activada. Las moléculas de tcr y CD28 sobre una célula T virgen deben co-unirse al mhc-péptido presentado y el ligando CD28, CD80 (o CD86), respectivamente, sobre la célula presentadora de antígeno para que ocurra activación completa. Ya se hizo alusión a los eventos de señalización mediados por CD28, que incluyen la estimulación de la síntesis de interleucina-2 por la célula T, y se comentan a fondo en el capítulo 11.

FigurA 3-31 estructura general de los correceptores cD4 y cD8; los dominios tipo Ig se muestran como círculos. CD8 adopta la forma de un heterodímero αβ o un homodímero αα. La mo-lécula de CD4 monomérica contiene cuatro dominios con plegamiento Ig; cada cadena en la molécula de CD8 contiene uno.

S

SS

SS

S

CD8

D3

D4

SS

D2

SS

CD4

D1

SS α β

FUNCIÓN

nombre Ligando adhesión Transducción miembro de de señal la superfamilia Ig

CD4 MHC clase II + + +

CD8 MHC clase I + + +

CD2 (LFA-2) CD58 (LFA-3) + + +

CD28 CD80, CD86 ? + +

CTLA-4 CD80, CD86 ? + −

CD45R CD22 + + +

CD5 CD72 ? + −

Moléculas accesorias de células T seleccionadas que participan en la transducción de señal de células TcUaDRo 3-4


fosforilados de las cadenas CD3ζ. ZAP-70 es activada por fosfo-rilación mediada por Lck, y fosforila muchas moléculas adapta-doras, incluso SLP-76 y LAT, así como enzimas importantes en la activación de células T, como PLCγ1.

Las células T usan estrategias de señalización torrente abajo similares a las de las células BDel mismo modo que en las células B, las señales iniciadoras en el receptor de antígeno de células T con eventos de fosforilación de tirosina a continuación son diseminadas a enzimas y fac-tores de transcripción intracelulares usando una red de mo- léculas adaptadoras y enzimas.

En células T, una de las moléculas adaptadoras más tempra-nas que se incorpora en el complejo de emisión de señales es LAT (proteína enlazadora de células T activadas [Linker protein of activated T cells]), una proteína transmembrana asociada con balsas de lípidos en la membrana plasmática. Después de ligadura a tcr, lat es fosforilada en múltiples residuos por ZAP-70, y estos residuos fosforilados ahora proporcionan sitios de acoplamiento para varias enzimas importantes que portan

La Lck es la primera tirosina cinasa activada en la señalización de célula TCuando el receptor de célula T interactúa con su antígeno unido a célula, receptores, co-receptores y moléculas emisoras de se -ñales se agrupan hacia las balsas de lípidos ricas en colesterol de la membrana plasmática (figura 3-32). La tirosina cinasa de la familia Src, Lck, en circunstancias normales se encuentra aso-ciada con CD4 y CD8, y la asociación entre Lck y CD4 es en particular estrecha. La agrupación (inducida por antígeno) del complejo de receptor-co-receptor lleva Lck hacia la vecindad de la tirosina fosfatasa asociada a membrana, CD45, que elimina el grupo fosfato inhibitorio sobre Lck. La fosforilación recíproca por moléculas de Lck cercanas en sus sitios de tirosina activado-res (figura 3-9) a continuación induce a Lck para que fosforile residuos de itam de CD3. (Note que estos eventos tem pranos corren parejos con los inducidos en células B por la cinasa de la familia SRC, Lyn, que también está regulada por la actividad de fosfatasa de CD45.)

Una vez que los itam de CD3 son fosforilados, una segunda tirosina cinasa, ZAP-70, se acopla en los residuos de tirosina

DAG Rac/Rho/cdc42

TCR/CD3 CD4

Lck

NFAT

Calmodulina

Calcineurina

Ca2+

s s

PI3K

ZAP-70

CD28

CD45

Supervivencia

Reorganizacióndel citoesqueleto

Cascada deMAP cinasa

NF-κB AP-1

Citoplasma

Núcleo

P

P

SLP76

GADS

VAV

P

P P

P

P

P

P

P

P

P

P

LAT

PLCγ1

Akt

Bax Bad

PDK1

PIP3

Grb-2

Activación de gen

PIP3

Itk

PKCθ

Grb-2

SOS

Ras

P

FigurA 3-32 vías de transducción de señal que emanan del tcr. La unión de antígeno a célula T activa la cinasa de la familia src, Lck, que fosforila la cinasa ZAP-70. La ZAP-70 a su vez fosforila las moléculas adaptadoras LAT, SLP76 y GADS que forman un andamio que permite la fosfo-rilación y activación de PLCγ1 y PKCθ, con los efectos consi-guientes sobre la activación de factor de transcripción descrita en el texto. Las proteínas GEF Vav y SOS también son activadas en el momento de la unión a LAT, lo que conduce a activación de la vía del factor de transcripción Ras/MAP cinasa y la vía Rac/Rho/cdc42; ello da pie a cambios de la forma de la célula y la motilidad de la misma. La PI3 cinasa, translocada hacia el lado citoplasmático de CD28, forma PIP3, lo que induce la localización de las enzimas PDK1 y Akt a la membrana. Esto lleva a más activación de NF-κB y super-vivencia celular aumentada, como se describió.


dominios SH2, incluso PLCγ1 (figura 3-32). La lat fosforilada también se une a la proteína adaptadora gads, que está asociada de manera constitutiva con el adaptador SLP-76. Esta combinación de proteínas adaptadoras es crucial para la señalización de receptor de célula T; proporciona el marco estructural para casi todos los eventos de emisión de señales torrente abajo.

Muchos de estos eventos torrente abajo ahora serán familia-res. PLCγ1, localizado a la membrana plasmática por unión a lat, es más activado por fosforilación de tirosina, mediada por la cinasa Itk (que pertenece a una familia de cinasa denominada cinasas Tec). Como se describió, PLCγ1 desintegra PIP2, lo que libera IP3, que induce la liberación de calcio y la activación de nfat por medio de la activación de calcineurina. El dag creado por hidrólisis de PIP2 se une, en células T, a una forma especia-lizada de pkc llamada la PKCθ (theta). Como se describió, esta parte de la cascada de emisión de señales culmina de modo similar en la degradación de los inhibidores de NF-κB y la translocación del factor de transcripción activo hacia el núcleo (figura 3-17).

La lat fosforilada también se asocia con el dominio SH2 de Grb2, la ahora familiar molécula adaptadora que introduce componentes de la vía Ras al complejo de señalización. Recuerde que Grb2 se une de manera constitutiva a sos, el gef que facilita

la activación de la vía Ras. En células T, la vía Ras es importante tanto para la activación del factor de transcripción AP-1, que funciona para emitir señales para la secreción de citocina, como para el paso de señales que reorganizan el citoesqueleto de actina para liberación de citocina dirigida.

Así, al igual que para células B, la unión de tcr-antígeno conduce a una multitud de consecuencias, entre ellas regulación ascendente de factor de transcripción, reorganización del cito-esqueleto, y secreción de citocina. De nuevo, al igual que para células B, la emisión de señales de células T también afecta la expresión de moléculas de adhesión como integrinas sobre la su perficie celular y quimiocinas, que tiene efectos subsi-guientes sobre la localización celular.

Está claro que la descripción de la señalización de la inmu-nidad adaptativa ofrecida en este capítulo representa sólo la punta del iceberg, y estas cascadas de emisión de señales con-tienen más componentes y resultados que aquellos a los que puede hacerse alusión en este breve esbozo. No obstante, del mismo modo que las proteínas adaptadoras proporcionan un andamio para que el sistema inmunitario organice sus proteí-nas emisoras de señales, los autores esperan que este capítulo haya proporcionado un andamio similar para la organización de los pensamientos del lector respecto a estos procesos fasci-nantes y complejos.

r e s u m e n

■ Los antígenos se unen a receptores por medio de interacciones de enlace no covalentes.

■ Las interacciones entre antígenos y receptores del sistema inmu-nitario son aumentadas por interacciones simultáneas entre co-receptores expresados por linfocitos y moléculas sobre células presentadoras de antígeno o sobre antígenos complejos.

■ Casi todas las interacciones receptor-antígeno son multivalentes, y esta multivalencia aumenta significativamente la avidez de la interacción de unión de receptor-antígeno.

■ La unión de antígeno a receptor induce una cascada de señalización en la célula que porta el receptor, que da pie a alteraciones de la motilidad, las propiedades adhesivas y el programa de transcrip-ción de la célula activada.

■ La señalización de antígeno es iniciada por células tanto T como B por agrupación de receptor mediada por antígeno. Los recep-tores agrupados están situados en regiones especializadas de las membranas, llamadas balsas de lípidos.

■ Las proteínas CD3 e Igα/Igβ, que son elementos de transducción de señal asociados con receptor de células B y T, son fosforiladas sobre motivos de activación de inmunorreceptor basados en tirosina (Immuno-receptor Tyrosine Activation Motifs [itam]), y éstos sirven como puntos de acoplamiento para moléculas adaptadoras.

■ Enzimas emisoras de señales torrente abajo y gef se acoplan sobre las moléculas adaptadoras y hacen contacto con sus sustra-tos. Estas enzimas incluyen fosfolipasa Cγ, que desintegra PIP2 hacia dag e IP3. La interacción de IP3 con receptores localizados al er lleva a la liberación de calcio intracelular y la activación de proteínas reguladas por calcio, como la fosfatasa calcineurina. La calcineurina desfosforila el factor de transcripción nfat, lo que permite que éste tenga acceso al núcleo. El dag se une a la pro-teína cinasa C y la activa, lo que finalmente conduce a activación

de NF-κB. El acoplamiento de la molécula adaptadora Grb2 a proteínas adaptadoras facilita su unión a la proteína gef, sos, y la activación de la vía de la map cinasa, lo que da por resultado activación del factor de transcripción AP-1.

■ El receptor de antígeno sobre células B es una forma unida a membrana de la molécula de inmunoglobulina de cuatro cade-nas que la célula B secreta en el momento de estimulación. Una molécula de inmunoglobulina comúnmente se conoce como un anticuerpo. Los anticuerpos tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras.

■ Los anticuerpos secretados por células B en el momento de estimulación se clasifican de acuerdo con la secuencia de ami-noácidos de la cadena pesada, y anticuerpos de diferentes clases desempeñan diversas funciones durante una respuesta inmuni-taria.

■ La señalización de antígeno en células B procede de acuerdo con las estrategias de emisión de señales compartidas entre muchos tipos de células.

■ El receptor de antígeno sobre células T no es una molécula de inmunoglobulina, aunque sus dominios de proteína están clasifi-cados como pertenecientes a la superfamilia de proteínas inmu-noglobulina.

■ Casi todas las células T portan receptores constituidos por un heterodímero αβ que reconoce un antígeno complejo, que con-siste en un péptido corto insertado en un surco en la superficie de una proteína codificada por el complejo principal de histo-compatibilidad (mhc) de genes.

■ Algunas células T portan receptores formados de cadenas recep-toras γδ que reconocen una gama diferente de antígenos.

■ La señalización de antígeno en células T comparte muchas estrate-gias características con la señalización de célula B.


r e F e r e n c i A s

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Sitios web útiles

www.genego.com Este sitio ofrece una base de datos de vías metabólicas y reguladoras en la cual pueden efectuarse búsquedas.

www.nature.com/subject/cellsignaling Es una colección de artículos de investigación originales, revisiones y comentarios respecto a la emisión de señales celulares.

http://stke.sciencemag.org El sitio web de Signal Transduc-tion Knowledge Environment, mantenido por la revista Science. Es un excelente sitio, pero partes del mismo están cerradas a quienes carecen de una suscripción.

www.signaling-gateway.org Este portal es presentado por la University of California en San Diego, y es apoyado por Genentech y Nature. Un excelente recurso, completo, con artículos especiales.

www.qiagen.com/geneglobe/pathwayview.aspx Qia-gen. Un útil sitio web comercial.

www.biosignaling.com Parte de Springer Science+Business Media.

www.youtube.com Muchos videos y animaciones excelentes de sitios web de emisión de señales están disponibles en Youtube, demasiado numerosos como para mencionarlos aquí. Simplemente hay que escribir las vías en un navegador de web e ingresar. Sin em -bargo, es necesario conocer de dónde proviene el video. No todos los videos son exactos, de modo que es necesario verificar los he -chos con la literatura médica publicada.

www.hhmi.org/biointeractive/immunology/tcell.html Película del Howard Hughes Medical Institute (HHMI): Cloning an Army of T Cells for Immune Defense.


P r e g u n t A s d e e s t u d i o

1. La familia nfat es una familia omnipresente de factores de transcripción.

a. En condiciones de reposo, ¿dónde está ubicado el nfat en una célula?

b. En condiciones activadas, ¿dónde está ubicado el nfat en una célula?

c. ¿Cómo se libera desde su estado en reposo y se le permite que se reubique?

d. Los fármacos inmunosupresores, como la ciclosporina, ac -túan por medio de inhibición de la fosfatasa calcineu-rina. Si nfat es omnipresente, ¿cómo cree que estos fármacos pueden actuar con tan pocos efectos secunda-rios sobre otros procesos de señalización dentro del cuerpo?

2. Durante los primeros días de los experimentos diseñados para detectar el receptor de célula T, varios grupos de investigación diferentes encontraron que los anticuerpos dirigidos contra proteínas de inmunoglobulina parecieron unirse al receptor de célula T. Dado lo que ahora se sabe acerca de la estruc-tura de las inmunoglobulinas y el receptor de célula T, ¿por qué esto no es por completo sorprendente?

3. ¿Cierto o falso? Explique sus respuestas. Las interacciones entre receptores y ligandos en la superficie

celular:

a. están mediadas por interacciones covalentes.b. pueden dar lugar a la creación de nuevas interacciones co -

valentes dentro de la célula.

4. Describa cómo las manipulaciones experimentales que siguen se usaron para determinar la estructura de anticuerpos.

a. Reducción y alquilación de la molécula de anticuerpob. Digestión enzimática de la molécula de anticuerpoc. Detección de fragmentos de inmunoglobulina por anti-

cuerpo

5. ¿Qué es un itam, y qué proteínas modifican el itam en Igα e Igβ?

6. Defina una proteína adaptadora. Describa cómo una interac-ción entre proteínas que portan SH2 y grupos de tirosina fos-forilados (pY) ayuda a transducir una señal desde el receptor de célula T hacia la proteína cinasa ZAP-70.

7. La IgM tiene 10 sitios de unión a antígeno por cada molécula, mientras que la IgM sólo tiene dos. ¿Esperaría que la IgM fuera capaz de unirse a cinco veces más sitios antigénicos en un antígeno multivalente que la IgG? ¿Por qué sí/por qué no?

8. Usted y otra compañera están estudiando un receptor de cito-cina sobre una célula B que tiene un Kd de 10–6 M. Usted sabe que los sitios receptores de citocina sobre la superficie celular deben estar ocupados al menos 50% para que la célula B reciba una señal de citocina desde una célula T auxiliar. Su compa-ñera de laboratorio mide la concentración de citocina en la sangre del animal de experimentación y detecta una concen-tración de 10–7 M. Ella le dice a usted que el efecto que ustedes han estado midiendo posiblemente no podría depender de las citocina que están estudiando. Usted está en desacuerdo. ¿Por qué?

9. La activación de cinasas de la familia Src es el primer paso en varios tipos diferentes de vías de señalización. Por ende tiene sentido biológico que la actividad de esta familia de tirosina cinasas esté regulada de manera en extremo estrecha. Describa cómo la fosforilación de cinasas de la familia Src puede suministrar señales tanto activadoras como inhibidoras a cinasas Src.

10. Usted ha generado una clona de células T en la cual la tirosina cinasa de la familia Src, Lck, es inactiva. Estimula esa clona con su péptido antigénico cognado, presentado sobre la plata-forma de mhc apropiada, y hace pruebas para secreción de interleucina-2, como una medida de activación de células T. ¿Espera ver secreción de IL-2 o no? Explique.

11. Nombre una proteína que se ha mostrado que es defectuosa en muchos casos de agammaglobulinemia ligada a X, y describa cómo una reducción de la actividad de esta proteína podría llevar a inmunodeficiencia.

12. Las proteínas receptoras de células B y T tienen regiones in -tracitoplasmáticas notoriamente cortas, de sólo algunos aminoácidos. ¿Cómo puede usted conciliar esta característica estructural con la necesidad de emitir una señal al interior de la célula de la presencia de antígeno unido?

13. Describa una manera en la cual la estructura de los anticuer-pos está muy bien adaptada a su función.

14. Como un estudiante graduado, su asesor ha dado a usted una clona de células T que parece estar constitutivamente (siem-pre) activada, aunque a un bajo nivel, incluso en ausencia de estimulación antigénica, y le ha pedido que averigüe por qué. Su compañero de pupitre le sugiere empezar por verificar la secuencia de su gen lck, o el estado de la actividad de Csk en la célula. Usted está de acuerdo en que son buenas ideas. ¿Cuál es su razonamiento?

Receptores y señalización: receptores de célula B y de...

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