RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO DE ENSAYO. ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE...
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RECREANDO LA DIVERSIDAD EN EL TUBO
DEENSAYO
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ESTRATEGIAS in vivo E in vitro PARA LA GENERACION DE
DIVERSIDAD MOLECULAR
Problemática:1. Necesidad de nuevas actividades2. Métodos basados en la estructura: gran requerimiento
Mediante la evolución dirigida pretendemos mimetizar los procesos naturales de selección
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Ventajas:1. Empleo de elevado número de
variantes2. Posibilidad de resumir siglos de
evolución en días3. Amplio uso en biología molecular
Inconvenientes:1. Necesidad de un buen sistema
de selección
GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
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Librería (población de individuos)
Individuos
Identificación
Generación de diversidad
Selección
Análisis
Materia origen
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EL PROBLEMA DE LA DIVERSIDAD
Repertorio natural de Ab 1012
Oligonucleótidos degenerados (8 aa´s) 208=2x1010
Electroporación E. coli 109/µg ADN
Librería de phage display 108
Librería de ribosome display 1012
Librería combinatoriales >1012
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GENERACIÓN DE DIVERSIDAD
1. Mutagénesis química
2. Mutagénesis con cepas hipermutadoras
3. PCR
4. “DNA shuffling”
5. Phage display
6. Ribosomal display
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MUTAGÉNESIS QUÍMICA
* Mutágeno: EMS, HA, ...
* Supervivencia: 0,1-10%
CEPAS HIPERMUTADORAS
* E. coli XLI-red (mutD mutS mutT)
PCR
* Taq pol: error 1/10000 por ciclo
* sales de manganeso
* nucleótidos desbalanceados
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“DNA SHUFFLING”
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The structure of FabsThe structure of Fabs
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Antigen binding by Antigen binding by CDRs in scFvsCDRs in scFvs
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Expression of antibody Expression of antibody fragments in fragments in E. coliE. coli
VH CH1
VL CL
Anchor-protein
IM
PFab
OM
VH VL
NH2NH2
CH1 CL
SS
COO-COO-
Fab
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Expression of antibody Expression of antibody fragments in fragments in E. coliE. coli
Anchor-proteinVH VLlinker
OM
IM
PscFv
NH2
VH VL
COO-
scFv
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Massive cloning of V-Massive cloning of V-genes by PCRgenes by PCR
B-cellsB-cells
cDNAcDNA
PCRPCR
mRNAmRNA
SpleenSpleen
HybridomaHybridoma
BloodBlood
Combinatorial synthesis
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Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs
VH fragments
VL fragmentsLinker
Homology drivenamplification
Sfi I Not I
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Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs
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Assembly of V genes as Assembly of V genes as scFvsscFvs
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The filamentous phages: The filamentous phages: M13 life cycleM13 life cycle
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N CN1 N2 CTSP
GS-rich linkers
Length in aas 67
19
131 150
39
Function TolA binding F-pili binding Phage morphogenesis
s-s s-s
The protein gp3 of The protein gp3 of M13phageM13phage
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Cloning of scFv genes into Cloning of scFv genes into phagemidsphagemids
bla
Sfi I Not I
ColE1 ori
M13 ori
gene 3
VH VL
(Apr)
pCANTAB-5E
plac
scFv
pIII
M13 phage
pVIII coat
Phagemid DNA
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scFv-SELECTION MIMICS THE scFv-SELECTION MIMICS THE IMMUNE SYSTEM IMMUNE SYSTEM
Antigen
Infect E. coli
****
****
Amplification
**
Binding
**
Phab library
**
****
****
Expression of scFv
Elution
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ARM (RIBOSOME) DISPLAY