INTRODUCCION.

La tcnica de recuperacin de ovocitos de animales sacrificados en camal suministra una fuente abundante de ovocitos obtenidos y a bajo costo los cuales pueden ser madurados, cripreservados, fertilizados y cultivados in vitro hasta alcanzar estados avanzados de desarrollo embrionario. Tambin es til para un ltimo aprovechamiento de hembras sacrificadas por motivos sanitarios, accidentales o reposicin, estos con un dimetro comprendido entre 3 a 6 mm.Los ovarios contienen un gran nmero de ovocitos en diferentes estadios de desarrollo. El transporte de los ovarios se lleva a cabo en un termo que contiene un solucin PBS o en una solucin salina a temperatura ambiente pudindose conservar entre 20-25C durante 6-7 horas sin que afecte la capacidad de desarrollo posterior. En el laboratorio los ovocitos son obtenidos junto a su lquido folicular.

OBJETIVOS:OBJETIVOS GENERALES:Conocer el protocolo de recuperacin de ovocitos de animales post mortem mediante la tcnica de aspiracin folicular.OBJETIVOS ESPECIFICOS:Conocer las tcnicas existentes en la recuperacin de ovocitos post mortem.Conocer la tcnica de aspiracin folicular realizados en bovinos post mortem.

REVISION BIBLIOGRAFIA:

Recoleccin de ovarios en animales post-mortem. La obtencin de ovarios provenientes de vacas sacrificadas en el matadero suministra una fuente abundante de ovocitos obtenidos a bajo costo provenientes de animales en diferentes estados del ciclo estral, que pueden ser madurados, fertilizados y cultivados in-vitro hasta estados del desarrollo embrionario. La recoleccin de ovocitos permite recuperar y aprovechar folculos no ovulatorios, que bajo condiciones fisiolgicas se tornaran en folculos atrsicos, con el fin de aprovechar al mximo el potencial gentico de una donadora por procedimiento in vitro. Se debe evaluar los factores externos que estn involucrados en la manipulacin de los ovocitos antes de realizar el cultivo, ya que estos pueden afectar la expresin de la competencia del desarrollo. La competencia de desarrollo se puede definir como la habilidad que tiene el ovocito fertilizado de formar embriones hasta estados avanzados (blastocito). Dentro de los factores externos que estn relacionados con la manipulacin de los ovarios, se encuentran la temperatura de almacenamiento de los ovarios y el tiempo de recoleccin de los ovocitos despus del sacrificio. El tiempo de recoleccin de los ovocitos de los ovarios igualmente influye en la competencia de desarrollo. (GORDON & LU, 1990), reportan que los ovocitos pueden permanecer en solucin salina a temperatura de 30 a 37 grados C. durante 8 horas sin llegar a afectar su calidad para los procesos de maduracin y fertilizacin in-vitro. Los ovocitos provenientes de ovarios recogidos en el matadero se pueden obtener por dos mtodos: mtodo de corte de ovarios y el mtodo de aspiracin con una jeringa de folculos superficiales mayores de 2 mm. de dimetro.Mtodo de corte:

Los ovarios se transportan al laboratorio en solucin salina suplementada con antibiticos, a temperatura entre 30-37 grados centigrados. En el laboratorio, se hace remocin del tejido adyacente, del cuerpo lteo y de sangre con lavados de solucin salina y alcohol. El mtodo de corte consiste en colocar cada uno de los ovarios en cajas petri que contienen el medio de cultivo y se corta la superficie y el interior de los ovarios a lo largo y a travs de este con cuchillas separadas por 2 mm.

Tambin llamado MTODO SLICING Consiste en la realizacin de cortes longitudinales y transversales con una hoja de bistur, en la superficie del ovario para liberar el contenido folicular en una placa de cultivo. Se observan los complejos cmulo- ovocito al microscopio y se seleccionaron aquellos quepresentenunaomscapasdelasclulasdelcmulosnoexpandidasyuncitoplasmaovocitario homogneo (Hernndez et al., 2012)Con las tcnicas descritas se recuperan similar cantidad de ovocitos por ovario y similar cantidad de ovocitos de calidad por ovario. Por tanto, es posible utilizar cualquiera de estas tcnicas de recuperacin, pero los ovocitos deben ser tomados de folculos de 2-8 mm de dimetro y solamente de aquellos que se encuentren en la superficie del ovario (Gmez etal., 2012)

Mtodo de aspiracin:

Se someten a este procedimiento, folculos superficiales visibles de 2-5 mm. de dimetro con jeringas de 5-10 cc. y aguja calibre 18G. Las investigaciones realizadas por Carolan y col., Hamano y Kuwayama, Lonergan y col., indican que con el mtodo de corte de folculos se obtiene una mayor proporcin de ovocitos y de excelente calidad para estudios in vitro comparado con el mtodo de aspiracin. La disminucin de las tasas de recuperacin y produccin de embriones en el caso de aspiracin folicular puede estar asociado a efectos nocivos sobre las capas de las clulas del cmulus ejercidas por las fuerza de aspiracin. Por otra parte, el mayor nmero de ovocitos obtenidos por el mtodo de corte. Puede estar explicado por la recuperacin de ovocitos provenientes de folculos menores de 2 mm. de dimetro que estn en el interior del folculo; sin embargo, Arlotto y col., (1996) sostienen que estos ovocitos tienen poco potencial para sufrir maduracin meitica y desarrollo embrionario comparado con los ovocitos comparados de los folculos presentes en la superficie del ovario, ya que los ovocitos de folculos internos pueden no haber adquirido an la competencia para la maduracin y desarrollo.El procedimiento consiste en que Los ovarios obtenidos en el matadero sern trasladados en un recipiente isotrmico (termo) al laboratorio. El tiempo transcurrido entre el sacrifico de los animales y la llegada al laboratorio debe ser menos de 6 a 8 horas. Una vez en el laboratorio los ovarios sern lavados 2 a 3 veces con solucin fisiolgica de 0,9% de NaCl a 35 C y conservados en la misma solucin (Figura 1b). Cada alumno deber colocarse los guantes quirrgicos en la mano izquierda con la cual sujetara el ovario secndola previamente con papel toalla y con la otra mano libre sujetara la jeringa y proceder a aspirar el contenido de los folculos. Los COCs (complejo ovocito-cmulos) sern aspirados por puncin de los folculos de tamao entre 3 a 8 mm con una jeringa de 5cc y aguja de 18 x 1. El contenido folicular colectado en la jeringa ser vertida en la placa petri de 100mm y diluida con solucin fisiolgica de 0,9% de NaCl, con el fin de visualizados.

TECNICAS DEL SLICING Y ASPIRACION FOLICULAR EN LA EFICIENCIA DE LA RECUPERACION DE OVOCITOS BOVINOS CRIOLLOS POSTMORTEN EN EL CAMAL.

MATERIAL Y MTODOSEl estudio se llev a cabo en el II semestre del 2011, en el laboratorio de Reproduccin Animal de la Facultad Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional Micaela Bastidas de Apurmac, ubicado en Abancay - Apurmac, a 2 378 msnm. Se procedi segn lo propuesto por Hernandez-Fernandez et al. (2010), para el cual se tomaron 200 ovarios de vacas criollas, sacrificadas en el camal municipal de Abancay. Los ovarios fueron transportados en solucin fisiolgica al 0,9%, a una temperatura entre 30 35C, hasta el laboratorio. Alrededor de 2 horas post-recoleccin de los ovarios, se lavaron por tres veces en solucin fisiolgica al 0,9%. Los ovarios se dividieron en dos grupos: Para la tcnica de slicing se utilizaron 100 ovarios, los cuales se fijaron a una pinza hemosttica curva para con un bistur seccionar longitudinal y transversalmente cada folculo de 2 8 mm de dimetro visibles en la superficie del ovario, y luego fue sumergido para lavarse con una suave presin cada rea seccionado en un medio de lavado entre 5 10 ml en una placa de Petri graduado y protegido de la luz; Para la tcnica de aspiracin folicular, se tomaron 100 ovarios, y de sus folculos visibles de 2 8 mm de dimetro se aspiraron los ovocitos utilizando una jeringa de 10 ml con una aguja de 18G x 1 pulgadas, luego colocados en un medio de lavado entre 5 10 ml en una placa Petri graduado y protegido de la luz. En ambas tcnicas, el contenido de las placas de Petri se repos por 15 min., luego se procedi a decantar el sobrenadante y se tom el sedimento para su observacin en un microscopio estereoscpico a 40X. Los ovocitos encontrados se clasificaron segn lo descrito por Konishi et al. (1996) en 4 categoras, de acuerdo a las clulas del cmulos que lo rodean: Grado I (> 4 estratos), Grado 2 (3 a 4 estratos), Grado 3 (1 a 2 estratos), Grade 4 (desnudado).Solo las categoras A y B fueron consideradas como viable para maduracin in vitro (MIV), fertilizacin invitro (FIV) e in vivo, y como ovocitos de calidad buena.RESULTADOS Y DISCUSIONTcnicas de recuperacin y categorizacin de ovocitosEn cuanto a ovocitos por categoras (Tabla 1): Las tcnicas de recuperacin como el slicing y aspiracin folicular, proveen similar categorizacin de los ovocitos recuperados (p>0.05).

Tabla 1: Tcnicas de recuperacin por categoria de ovocitos

En cuanto a los ovocitos totales: Gonzlez et al. (1992), del total de ovocitos recuperados, encontraron mayor cantidad de ovocitos con la tcnica del slicing (76.88%) que con aspiracin folicular (23.12%) (p