ACTIVIDAD TOXICOLOGICA DE LA FRACCION ALCALOIDEA DE LOS TALLOS DE LA Jatropha macrantha M. Arg. (Huanarpo macho) EN ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps).

RENEE M. CONDORI APAZA

EVELYN K. PAREDES PAREDES

Universidad Nacional San Agustín de Arequipa

ANTECEDENTES GENERALES

JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

La Jatropha macrantha M.Arg. (huanarpo macho) es una planta

silvestre con sustancias químicas de gran utilidad en medicina, siendo usada por los pobladores de las zonas rurales como energizante, sin tener conocimiento que probablemente puedan causar algunos efectos secundarios en su salud; por ello el estudio científico del vegetal nos sirve para conocer el grado toxicológico de la fracción alcaloidea de esta planta, por lo que la evaluación de la actividad toxicológica de la fracción alcaloidea se hace imprescindible, para poder tener un criterio científico sobre el uso de esta planta tan difundida entre nuestra población.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Estudiar actividad toxicológica de la fracción alcaloidea de los tallos de la Jatropha macrantha M. Arg. (Huanarpo macho) en artemia salina (Brine Shrimps)

 

OBJETIVOS ESPECIFICOS. Incubar y obtener la artemia salina (larvas marinas) en el estadio

adecuado para realizar nuestras pruebas de toxicidad.

Evaluar la actividad toxicológica de las fracciones alcaloideas obtenidas mediante el método del DL5o en Artemia salina.

Jatropha macrantha M. Arg. Huanarpo Macho

Esta especie pertenece a la familia Euphorbiaceae, comprende alrededor de 290 géneros y más de 750 especies, casi cosmopolitas, particularmente rica en trópicos, pero extendiéndose a las regiones templadas de ambos hemisferios. En el Perú comprende 57 géneros, 305 especies de las cuales 88 son endémicas. Las especies endémicas más comunes son: Jatropha curcas L. y la Jatropha macrantha M. Arg.

Es un arbusto monoico algo suculento, hojas alternas partidas palmadas trilobadas, presenta inflorescencia reunidas en el ápice de las ramas, flores hermafroditas actinomorfas, cáliz y corola presentes, sépalos pentámeros con estambres, numerosos filamentos libres, ovario súpero trilocular, fruto capsular dividido en tres monocarpos. Arbusto latescente endémico, con flores rojas.

Principios Activos

Son componentes esenciales de las plantas que nos sirven parte esencial de los fármacos y es por eso que no todos los componentes químicos elaborados por la planta, poseen igual interés para la fitoquímica .Los denominados “principios activos” son frecuentemente alcaloides o heterósidos; ambos merecen, por ello, especial atención. Otros grupos, como los glúcidos, grasas y proteínas, tienen importancia dietética y muchos, como los almidones y las gomas, se emplean en técnica farmacéutica, aunque carecen de señalada acción farmacológica. Otras sustancias como el oxalato cálcico, sílice, lignina y materiales colorantes, pueden ser materias coadyuvantes en la identificación de drogas y en la detección de adulteraciones.

Principales Alcaloides en el Comercio

ALCALOIDES PROCEDENCIA ACCIÓN FISIOLÓGICA SALES OFICIALES1. Aconitina Aconitum napellus Diurético, sudorífico, antineurálgico, anestésico local.

2. Apomorfina Deshidratación de la morfina Cardiodepresor, emético, expectorante sedativo, hipnótico. Clorhidrato

3. Arecolina Areca catechu Catártico, sialagogo, miótico, antihelmíntico. Bromhidrato

4. Atropina Beleño, belladona, plantas del género Datura y otras solanáceas.

Antiespasmódico, estimulante, anhidrótico, antisialagogo, analgésico, midriático.

Sulfato

5. Berberina Agracejo Antiperiódico, estomáquico, tónico.

6. Brucina Nuez vómica Como la estricnina pero más débil. Sulfato7. Cinconidina Quina Tónico, antiperiódico, como la quinina, pero más débil. Sulfato

8. Cinconina Quina Tónico, antiperiódico, como la quinina, pero más débil. Sulfato

9. Cocaína Hojas de coca y de otras especies del género Erythroxylon Estimulante, anestésico local, sedante, antisialagogo, midriático, anodino, anhidrótico, antiprurítico.

Clorhidrato

10. Codeína Metilación de la morfina. Analgésico, hipnótico, sedante. Fosfato, sulfato.11. Colquicina Colchicum autumnale Antigotoso, antirreumático, antineurálgico, analgésico.

12. Efedrina Efedra Vasoconstrictor, para el tratamiento de la fiebre del heno, asma, insuficiencia circulatoria, envenenamiento con narcóticos.

Clorhidrato, sulfato

13. Emetina Ipecacuana Emético, expectorante, antipirético, amebicida (específico en la disentería amibiana).

Clorhidrato

14. Ergonovina Oxitócico, hemostático uterino. Maleato15. Ergotamina Cornezuelo Oxitócico, hemostático uterino, antineurálgico en la jaqueca. Tartrato

16. Escopolamina Género Datura y otras solanáceas Midriático, hipnótico, sedante. Bromhidrato17. Esparteína Spartium scoparius, Anagyris foétida Estimulante cardiaco, diurético.18. Estricnina Nuez vómica Tónico, estimulante, eximotor. Nitrato, fosfato, sulfato

19. Fisostigmina Physostigma venenosum Sedante, antineurálgico, diaforético, depresor purgante, miótico, sialagogo, antitetánico.

Salicilato

20. Hidrastina Hydrastis canadensis Antiséptico, astringente, hemostático, tónico, alterante, emenagogo, sedante cardiaco.

21. Hiosciamina Beleño, belladona, plantas del género Datura y otras solanáceas

Hipnótico, sedante cerebral, midriático Bromhidrato, sulfato

22. Lobelina Lobelia Expectorante, emético, estimulante respiratorio

23. Morfina Opio ( 15%) Narcótico, sedante, hipnótico, analgésico. Clorhidrato, sulfato

24. Nicotina Tabaco Irritante local, paralizante, parasiticida

25. Pilocarpina Jaborandi Diurético, sialagogo, galactogogo, galactagogo, miótico, diaforético.

Clorhidrato, nitrato

26. Quinidina Quina Inhibidor de la fibrilación auricular, antiperiódico, tónico, antiséptico.

Sulfato, gluconato

27. Quinina Quina Tónico, emenagogo, antiperiódico, antiséptico, antipirético. Sulfato, bisulfato, clorhidrato, diclorhidrato, fosfato

28. Yohimbina Yohimbe Afrodisiaco, anestésico local, midriático.

Fracción Alcaloidea de la Jatropha macrantha M. Arg. Huanarpo Macho

La fracción alcaloidea es un compuesto orgánico extraido mediante procesos químicos de una planta de origen natural (generalmente vegetal), nitrogenado, derivados generalmente de aminoácidos, mas o menos básicos, de distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas y que responden a reacciones comunes de precipitación.

ACTIVIDAD TOXICOLÓGICA

Uno de los aspectos importantes para la evaluación de la actividad toxicológica es la relación entre la concentración de un compuesto químico a la cual se expone un organismo y el consecuente efecto nocivo que le produce. Esta relación, conocida como relación dosis-respuesta, constituye entonces la base para la evaluación del peligro y el riesgo generado por las sustancias químicas en el medio donde se encuentren las muestras biológicas.

La actividad biológica es la capacidad que tiene el material de interactuar químicamente con los tejidos del organismo, es una expresión que describe los efectos beneficiosos o nocivos de una droga o extracto en organismos vivos.

Tanto las investigaciones biológicas básicas como las investigaciones aplicadas, han determinado muchos adelantos importantes de la ciencia médica. Por eso resulta indispensable seguir realizando investigaciones en ambas clases con el fin de descubrir las causas, mecanismos, prevención y tratamiento de enfermedades que aun no son bien conocidas por el hombre, así como para probar la eficacia e inocuidad de muchos de los principios activos utilizados en medicina humana y veterinaria, y en general para avanzar en el conocimiento biológico.

DOSIS LETAL DL50

La DL50 se utiliza para encontrar umbrales de toxicidad para determinadas sustancias; en el desarrollo de pesticidas se utiliza para determinar los límites de resistencia de insectos, por ejemplo, ante ciertos biocidas. En la investigación fitoquímica valiéndose del principio de la farmacología es simplemente la toxicología a bajas concentraciones o toxicología es la farmacología a concentraciones altas, se puede correlacionar la bioactividad con el valor de la DL50 y al mismo tiempo su grado de toxicidad.

La determinación de la DL50 requiere de la estadística cuantal, para lo cual es necesario transformar los valores de respuesta obtenidos en unidades Anglit, Logit o Probit y las dosis suministradas en unidades logarítmicas conocidas como dosis metamétricas. Existen algunos programas especializados que realizan este tipo de cálculos automáticamente, pero su confiabilidad depende de la persona o institución que los haya desarrollado.

El periodo de tiempo durante el cual se expone el estimulo debe ser especificado, por ejemplo, 24 horas, esto con el fin de comparar y estimar la potencia relativa del estimulo. Como organismo de prueba se puede utilizar Artemia salina.

Análisis Probit Mediante Tabla Finney

El análisis Probit requiere de la Tabla correspondiente a Finney para Convertir el % de mortalidad a Probits .

ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps)

La artemia salina es un pequeñísimo camarón que vive en las aguas salobres e hipersalinas de todo el mundo. Este pequeño crustáceo pertenece a la subclase de los anostráceos su nombre científico es Brine Shrimps y conforma el plancton de las aguas continentales salobres.

Son unos pequeños seres (alrededor de dos centímetros de longitud como máximo) que no paran quietos en ningún momento, moviendo su cola frenéticamente, y realizando multitud de tareas mientras los observamos.

En su estado adulto alcanza un tamaño de 8 - 13 mm. de longitud.

ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps))

CLASIFICACIÓN SISTEMÁTICA

La clasificación sistemática de la artemia hasta el nivel de género es dado por Flossner (1972):

Clase: Crustacea

Subclase: Branquiopoda

Orden: Anostraca

Familia: Artemiidae

Género: Artemia

MORFOLOGÍA Y CICLO DE VIDA

Los lagos salados y estanques de las salinas con poblaciones de Artemia se encuentran distribuidos por todo el mundo. En ciertos momentos del año, grandes cantidades de minúsculas partículas marrones (de 200 a 300 micras de diámetro) aparecen flotando en la superficie del lago y son arrojadas sobre las orillas por la acción de las olas y el viento. Este polvo aparentemente inerte está formado por quistes secos inactivos en estado de criptobiosis (“durmientes”) manteniéndose así tanto tiempo como permanezcan secos.

ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps))

Una vez puestos en agua de mar, los quistes bicóncavos se hidratan tomando forma esférica y el embrión recobra su metabolismo reversible interrumpido. Tras unas 24 horas la membrana externa de los quistes se rompe (“breaking”) y aparece el embrión rodeado de la membrana de aclosión. Durante las horas siguientes, el embrión abandona completamente la cáscara del quiste: colgando entretanto de la cáscara vacía a la cual permanece todavía unido (estado de “umbrella”). Dentro de la membrana de eclosión se completa el desarrollo del nauplio, sus apéndices comienzan a moverse y en un breve periodo de tiempo la membrana de eclosión se rasga (= “hatching”) emergiendo el nauplio que nada libremente.

ARTEMIA SALINA ( (Brine Shrimps))

El primer estado larvario (también llamado estado I) mide entre 400 y 500 micras de longitud, tiene un color pardo anaranjado (por acumulación de reservas vitelinas) y posee tres pares de apéndices: el primer par de antenas (también llamadas anténulas y que tienen una función sensorial) el segundo par de antenas (con función locomotora y filtradora) y las mandíbulas (con una función de toma de alimento). Un único ocelo de color rojo también llamado ojo nauplial se encuentra situado en la cabeza entre el primer par de antenas. La cara ventral del animal se encuentra cubierta por un amplio labro que interviene en la toma de alimento (transfiriendo las partículas desde las setas filtradoras hasta la boca). El estado larvario I no se alimenta ya que su aparato digestivo no es todavía funcional (permaneciendo aún cerrados la boca y el ano).

Tras aproximadamente 24 horas, el animal muda al segundo estado larvario (también llamado estado II). Pequeñas partículas alimenticias (tales como células de microalgas, bacterias, detritus) con un tamaño que varía entre 1 y 40 micras son filtradas por el segundo par de antenas, siendo entonces ingeridas por un aparato digestivo ya funcional.

ARTEMIA SALINA (Brine Shrimps))

La larva continúa su crecimiento apareciendo diferenciaciones a lo largo de las 15 mudas. Así van apareciendo unos apéndices lobulares pares en la región torácica que se diferenciarán posteriormente en toracópodos, se desarrollan ojos complejos laterales a ambos lados del ojo nauplial. Desde el estado X en adelante, se producen importantes cambios tanto morfológicos como funcionales por ejemplo: las antenas pierden su función locomotriz y se transforman en elementos de diferenciación sexual. Los futuros machos desarrollan unos apéndices curvados y prensiles mientras que las antenas de las hembras degeneran en apéndices sensoriales. Los adultos de Artemia miden hasta 10 mm de longitud en las poblaciones bisexuales y hasta 20 mm en las poblaciones partenogeneticas.

IMPORTANCIA DE LA ARTEMIA SALINA EN LAS INVESTIGACIONES

Actualmente, la Artemia salina se utiliza como especie de bioensayo para una variedad de

objetivos tales como:

Investigación de la fuente de toxicidad en mezclas de sustancias químicas y muestras ambientales, tamizaje de toxicidad aguada de sustancias químicas, detección de toxinas naturales en comestibles y farmacéuticos, estudios de modelos de acción toxica de sustancias, y estudios de la transferencia trófica de contaminantes.

El potencial de Artemia para investigación y aplicaciones en toxicología acuática se ha explorado desde 1975 en el laboratorio de Investigación Biológica en Toxicología Acuática de la Universidad Estatal de Ghent, Bélgica. En 1981 se desarrollo el primer ensayo estandarizado de ecotoxicología marina: el ensayo ARC (Agencia de Residuos de Cataluya), que es un ensayo de 24 horas para determinar la concentración letal media (CL50 o DL50) en nauplios de instares II y III.

La confiabilidad y precisión de este ensayo fue investigado durante un extenso ejercicio de calibración involucrando a 80 laboratorios americanos y europeos, dando resultados muy satisfactorios. La experiencia obtenida desde entonces ha abierto el camino para mejorar uno de los ensayos de tamizaje más sencillos, más reproducible y rentable en toxicología acuática

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Toxicidad frente artemia salina Toxicidad frente artemia salina

DESCAPSULAMIENTO DE QUISTES DE ARTEMIA SALINA

Hidratar el huevo de artemia y tenerlo por una hora con aireación. Lavar los quistes con HCl 1 N (4 – 7 min). Regresar los huevos al papel filtro y lavarlos con agua de la llave

hasta que pierdan el olor a cloro (unos 5 minutos). Pasar los huevos a la incubadora con agua de mar y esperar la

eclosión en 24 horas, teniendo en cuenta las siguientes especificaciones:

T = 26 a 28 ºC. Salinidad = 32'5 gr/l. o 1.022 Tiempo de 24 a horas. Oxigenación casi a saturación

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES A EVALUARA EVALUAR

Las fracciones de alcaloides obtenidas denominadas ECl2(Esta fracción proviene de extracción clorofórmica) y EEAT (Esta fracción proviene del extracto de acetato de etilo de alcaloides totales) por los métodos descritos anteriormente libres de los diferentes solventes que los extrajeron (estado sólido) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO ≤ 0.2 %), para formar una solución patrón de 15000 ppm en el caso de la fracción ECl2 y una solución patrón de 10000 ppm en el caso de la fracción EEAT, a partir de las cuales se prepararon las diluciones para obtener diferentes concentraciones.

BIOENSAYOBIOENSAYO

Luego de incubar los huevos de artemia salina por 24 horas, se colectaron las artemias con una pipeta Pasteur, a cada tubo de ensayo se agregó 10 de estos organismos, cada tubo contenía 5 ml solución salina, las diluciones preparadas y levadura que se uso como alimento adicional para las artemias. Se incluyeron grupos control y blanco en cada evaluación (solución salina y solución salina + DMSO), dichos tubos se incubaron en el equipo de cultivo para artemia salina con oxigenación. La evaluación se inicio en forma paralela. Los experimentos se establecieron bajo un diseño completamente aleatorio, con cuatro repeticiones incluyendo los grupos control y blanco. La evaluación de mortalidad de artemia salina se registró a las 24 horas después de la aplicación de los tratamientos.

BIOENSAYOBIOENSAYO

Luego de la incubación se examinaron los tubos de ensayo, haciendo el respectivo conteo de la cantidad de artemias salinas muertas (no móviles).Se procedió de la misma manera en las dos muestras seleccionadas a evaluar (ECl2 y EEAT). El cálculo de la concentración de la fracción o sustancia que provocó la muerte del 50% de las artemias se determinó a través del análisis Probit.

RESULTADOS

DOSIS LETAL (DL50) DE LA FRACCIÓN ECl2

Dosis

(ppm)

Log (Dosis) Porcentaje de

Mortalidad (%)

Probit

46.88 1.67 9.20 3.67

93.75 1.97 23.64 4.28

187.5 2.27 40.71 4.76

375 2.57 59.56 5.24

750 2.87 78.99 5.80

1500 3.17 95.60 6.70

Grafico Porcentaje de Mortalidad (%) VS Log (Dosis)

Grafico de Log (Dosis) VS Probit

CÁLCULO DE LA DOSIS LETAL DL50 PARA LA FRACCIÓN ECl2

CALCULO EXPERIMENTAL: M = 0.50 – 0.4071M = 0.0929 Log DL50 = Log (187.5) + (0.0929 Log 2)

Log DL50 = 2.273 + 0.0279

Log DL50 = 2.3009

DL50 = 199.94 ppm

CALCULO SEGÚN FINNEY: y = 1.922x + 0.4217 

Donde: y = 5 

5 = 1.9229x + 0.4217 1.9229x = 5 – 0.4217

x = 5 – 0.4217 / 1.9229 x = 2.38

Como x = Log dosisLog dosis = 2.38

Dosis = 239.88 ppm

CALCULO EXPERIMENTAL: M = 0.50 – 0.4071M = 0.0929 Log DL50 = Log (187.5) + (0.0929 Log 2)

Log DL50 = 2.273 + 0.0279

Log DL50 = 2.3009

DL50 = 199.94 ppm

CALCULO SEGÚN FINNEY: y = 1.922x + 0.4217 

Donde: y = 5 

5 = 1.9229x + 0.4217 1.9229x = 5 – 0.4217

x = 5 – 0.4217 / 1.9229 x = 2.38

Como x = Log dosisLog dosis = 2.38

Dosis = 239.88 ppm

DOSIS LETAL (DL50) DE LA FRACCIÓN EEAT

Dosis

(ppm)

Log (Dosis) Porcentaje de

Mortalidad (%)

Probit

31.25 1.49 6.86 3.50

62.5 1.80 17.22 4.05

125 2.09 34.07 4.58

250 2.40 53.91 5.09

500 2.70 75.76 5.68

1000 3.00 91.33 6.35

Grafico Porcentaje de Mortalidad (%) VS Log (Dosis)

Grafico de Log (Dosis) VS Probit

CÁLCULO DE LA DOSIS LETAL DL50 PARA LA FRACCIÓN EEAT

CALCULO EXPERIMENTAL :M = 0.50 – 0.3407M = 0.1593Log DL50 = Log (125) + (0.1593 Log 2)

Log DL50 = 2.0969 + 0.0479

Log DL50 = 2.1448

DL50 = 139.57 ppm

CALCULO SEGÚN FINNEY :y = 0.561x + 2.91 

Donde: y = 5 5 = 0.561x + 2.910.561x = 5 – 2.91

x = 5 – 2.91 / 0.561 x = 2.09

Como x = Log dosis Log dosis = 2.09

Dosis = 123.02 ppm

CALCULO EXPERIMENTAL :M = 0.50 – 0.3407M = 0.1593Log DL50 = Log (125) + (0.1593 Log 2)

Log DL50 = 2.0969 + 0.0479

Log DL50 = 2.1448

DL50 = 139.57 ppm

CALCULO SEGÚN FINNEY :y = 0.561x + 2.91 

Donde: y = 5 5 = 0.561x + 2.910.561x = 5 – 2.91

x = 5 – 2.91 / 0.561 x = 2.09

Como x = Log dosis Log dosis = 2.09

Dosis = 123.02 ppm

CONCLUSIONES

En el transcurso del presente estudio de investigación el ensayo de letalidad en Artemia Salina es muy usualmente utilizado para evaluar la bioactividad de extractos de plantas y muy en especial en especies de plantas de medicina tradicional, por tanto mediante la DL50 se logro obtener la dosis letal de las fracciones alcaloideas siguientes; con respecto a la primera fracción alcaloidea EEAT = 123.02 ppm y la segunda fracción alcaloidea ECl2 = 239.88 ppm.

En el ensayo de letalidad por medio de las artemias salinas en el estadio de nauplio que es el más adecuado para este análisis podemos decir que el posible mecanismo por el cual actúan los extractos de la fracción alcaloidea es a traves de la bomba sodio y potasio ya que está presente en toda célula viva.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Finney, D. J., Ed. (1952). Probit Analysis. Cambridge, England, Cambridge University Press.

Finney, D. J. and W. L. Stevens (1948). "A table for the calculation of working probits and weights in probit analysis." Biométrica 35(1-2).

Greenberg, B. G. (1980). "Chester I. Bliss, 1899-1979." International Statistical Review / Revue Internationale de Statistique 8(1).

Bordwell F.G. (1988). Equilibrium acidities in dimethyl sulfoxide solution. The Survival of Artemia Salina (Brine Shrimp) in various media, P. C.

Croghan-Department of Zoology, University of Cambridge (Received 10 July 1957).

Boone, E. & Baas Becking, L. G. M. (1931). Salt effects on eggs and nauplii of Artemia talina L.J. gen. Pkytiol.

Jacobi, E. F. & Baas Becking, L. G. M. (1933). Salt antagonism and effect of concentration innauphi of Artemia salina L. Tijdschr. ned. Dierk..

Investigando por un sueño, la Ciencia.!!!Investigando por un sueño, la Ciencia.!!!