Replicación de los viroides nucleares
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DEPARTAMENTO DE GENÉTICA REPLICACIÓN DE LOS VIROIDES NUCLEARES: MOTIVOS ESTRUCTURALES Y ENZIMAS IMPLICADOS EN EL PROCESAMIENTO IN VIVO DE SUS INTERMEDIARIOS OLIGOMÉRICOS Mª EUGENIA GAS LÓPEZ UNIVERSITAT DE VALENCIA Servei de Publicacions 2008
Transcript of Replicación de los viroides nucleares
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA REPLICACIÓN DE LOS VIROIDES NUCLEARES: MOTIVOS ESTRUCTURALES Y ENZIMAS IMPLICADOS EN EL PROCESAMIENTO IN VIVO DE SUS INTERMEDIARIOS OLIGOMÉRICOS Mª EUGENIA GAS LÓPEZ
UNIVERSITAT DE VALENCIA Servei de Publicacions
2008
Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el dia 4 de Decembre de 2007 davant un tribunal format per:
- D. Vicente Conejero Tomás - D. Juan Antonio García Álvarez - D. Vicente Pallás Benet - D. Alfredo Berzal Herranz - Dª. Rosa de Frutos Illán
Va ser dirigida per: D. Ricardo Flores Pedauyé Dª. Carmen Hernández Fort D. José Antonio Daròs Arnau ©Copyright: Servei de Publicacions Mª Eugenia Gas López Depòsit legal: I.S.B.N.:978-84-370-7066-7
Edita: Universitat de València Servei de Publicacions C/ Artes Gráficas, 13 bajo 46010 València Spain Telèfon: 963864115
A
La estructura del complejo formado entre la ribonucleasa bacteriana III de Aquifex aecolius y su
producto de reacción de la portada corresponde a la entrada de la base de datos PDB 2ez6 (Gan
et. al., Cell 2006).
B
Departament de Genètica
Replicación de los viroides nucleares: motivos estructurales y enzimas
implicados en el procesamiento in vivo de sus intermediarios
oligoméricos
Memoria presentada por
Mª EUGENIA GAS LÓPEZ
para optar al grado de
DOCTOR EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Directores
DR. RICARDO FLORES PEDAUYÉ DR. CARMEN HERNÁNDEZ FORT
DR. JOSÉ ANTONIO DARÒS ARNAU
Valencia, 2007
C
Don Ricardo Flores Pedauyé, Doctor en Ciencias Químicas, Profesor de Investigación del Consejo
Superior de Investigaciones Científicas, Doña Carmen Hernández Fort, Doctor en Ciencias
Biológicas, Científico Titular del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, y Don José
Antonio Daròs Arnau, Doctor en Ciencias Biológicas, Científico Titular del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (Universidad
Politécnica de Valencia- Consejo Superior de Investigaciones Científicas) de Valencia.
CERTIFICAN:
que Doña Mª Eugenia Gas López ha realizado bajo su dirección el trabajo que con el título
“Replicación de los viroides nucleares: motivos estructurales y enzimas implicados en el
procesamiento in vivo de sus intermediarios oligoméricos”, presenta para optar al grado de Doctor
en Ciencias Biológicas.
Para que así conste a los efectos oportunos, firman el presente certificado en Valencia, a 8 de
octubre del 2007.
Firmado: Ricardo Flores Pedauyé Carmen Hernández Fort José Antonio Daròs Arnau
D
A mis padres
E
“Jamás desesperes, aún estando en las más sombrías aflicciones,
pues de las nubes negras cae un agua limpia y fecundante”.
Miguel de Unamuno
F
________________________________________________________________________Resumen
RReessuummeenn
Los viroides, los agentes infecciosos más pequeños descritos hasta la fecha (246-401 nt), están
constituidos únicamente por una molécula circular de RNA de simple cadena. A pesar de su tamaño
y de no codificar proteínas son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y
causar enfermedades en plantas susceptibles gracias a su capacidad para interaccionar con factores
del huésped. Dichas propiedades biológicas y moleculares hacen de estos patógenos un excelente
modelo para abordar el estudio de cuestiones básicas sobre la relación entre la estructura del RNA y
su función.
La replicación de los viroides transcurre según un mecanismo de círculo rodante en el que sólo
intervienen intermediarios de RNA. Este proceso conlleva tres etapas: i) la transcripción reiterada
del RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al cual se la asigna arbitrariamente la
polaridad positiva, ii) el corte de los RNAs oligoméricos de una o de ambas polaridades, y iii) la
ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. Mientras que para los viroides
cloroplásticos (familia Avsunviroidae) se conoce el sitio de corte de los RNAs oligoméricos y la
actividad catalítica implicada (ribozimas de cabeza de martillo que sus RNAs de ambas polaridades
pueden adoptar), para los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) ambos aspectos son
controvertidos.
En el presente trabajo hemos abordado el estudio del procesamiento (corte de los RNAs
oligoméricos de polaridad positiva y ligación de los RNAs monoméricos lineales) de los viroides
nucleares utilizando una metodología in vivo basada en plantas de Arabidopsis thaliana que
expresan transcritos diméricos de tres miembros de la familia Pospiviroidae. Mediante el análisis
del extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo (en plantas transgénicas o en
plantas huésped infectadas), hemos identificado el sitio de corte en un motivo conservado en la
familia: la rama superior de la región central conservada (CCR, central conserved region). Las
secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean pueden adoptar un
plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario palindrómico en
RNAs oligoméricos.
El sitio de corte determinado se localiza en posiciones estructuralmente equivalentes en los tres
viroides estudiados, lo que sugiere la implicación de una o de ambas estructuras en la etapa de
corte. Los datos obtenidos con varias líneas transgénicas de A. thaliana que expresan cDNAs
diméricos de uno de los tres viroides mutados en posiciones definidas de la CCR han permitido
concluir que el sustrato de la reacción de corte debe ser la estructura de RNA bicatenario
G
________________________________________________________________________Resumen
palindrómico y que el bucle E, presente en la conformación en varilla de algunos miembros de la
familia, participa en la reacción de ligación aunque no es el único motivo estructural relevante. Es
de destacar que el modelo propuesto en este trabajo es aplicable a todos los miembros de la familia
Pospiviroidae, y difiere de los modelos previos basados en estudios in vitro que tienen una
aplicación más restringida.
Los sitios de corte en la conformación que contiene el RNA bicatenario palindrómico generan
RNAs monoméricos lineales con extremos 3’ con dos nucleótidos protuberantes, la huella
característica de las RNasas III. La caracterización de los grupos químicos terminales de los RNAs
monoméricos lineales procesados in vivo indica la presencia de extremos 5’-P, 3’-OH compatibles
con la actividad de una enzima de esta familia y con una RNA ligasa distinta a la única
caracterizada en plantas.
H
___________________________________________________________________________Índice
I
INTRODUCCIÓN
1. Aspectos generales de los viroides ................................................................................... 3
1.1. Propiedades estructurales ............................................................................................. 3
1.1.1. Estructura primaria y clasificación ................................................................... 3
1.1.2. Estructura secundaria ........................................................................................ 5
1.1.3. Dominios estructurales y motivos de secuencia ................................................ 6
1.1.4. Estructuras secundarias alternativas y elementos de estructura terciaria ......... 9
1.2. Localización subcelular de los viroides ...................................................................... 11
1.3. Replicación de los viroides ......................................................................................... 12
1.3.1. Mecanismo del círculo rodante ......................................................................... 12
1.3.2. Transcripción de los intermediarios replicativos............................................... 14
1.3.2.1. RNA polimerasas implicadas en la síntesis de los RNAs viroidales .. 14
1.3.2.2. Sitio de inicio de la transcripción de los intermediarios replicativos .. 15
1.3.3. Actividades enzimáticas implicadas en el corte y ligación de los intermediarios
replicativos ........................................................................................................ 18
2. Procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva en la familia
Pospiviroidae ....................................................................................................................... 20
2.1. Localización subcelular................................................................................................ 20
2.2. Sitio de procesamiento ................................................................................................ 22
2.2.1. Ensayos de infectividad in vivo ......................................................................... 22
2.2.2. Procesamiento in vitro ...................................................................................... 24
2.2.3. Procesamiento in vivo en Arabidopsis thaliana................................................. 25
2.3. Motivos estructurales implicados................................................................................. 26
2.3.1. Horquilla I/RNA bicatenario palindrómico ....................................................... 26
2.3.2. Tetrabucle GNRA.............................................................................................. 28
3. Familia de las ribonucleasas III ....................................................................................... 32
3.1. Papel en la regulación génica ...................................................................................... 32
3.2. Clasificación................................................................................................................. 32
3.3. Substratos ..................................................................................................................... 33
3.3.1. Clase 1 ............................................................................................................... 33
3.3.2. Clase 2 ............................................................................................................... 34
3.3.3. Clase 3 ............................................................................................................... 34
3.3.4. Clase 4 ............................................................................................................... 34
___________________________________________________________________________Índice
II
3.4. Mecanismo de corte ..................................................................................................... 35
4. RNA ligasas......................................................................................................................... 37
4.1. RNA ligasa 1 del fago T4............................................................................................. 38
4.2. tRNA ligasas de plantas y Saccharomyces cerevisiae ................................................. 40
OBJETIVOS........................................................................................................................... 41
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material biológico .............................................................................................................. 47
1.1. Plantas .......................................................................................................................... 47
1.2. Bacterias ....................................................................................................................... 47
1.2.1. Escherichia coli ................................................................................................. 47
1.2.2. Agrobacterium tumefaciens ............................................................................... 47
2. Ensayos biológicos de infectividad ................................................................................... 48
3. Extracción y purificación de ácidos nucleicos ................................................................ 48
3.1. Preparación de ácidos nucleicos totales ....................................................................... 48
3.2. Cromatografía sobre celulosa no iónica ....................................................................... 48
3.3. Fraccionamiento con LiCl 2 M .................................................................................... 49
4. Electroforesis ...................................................................................................................... 49
4.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)....................................................... 49
4.1.1. Condiciones no desnaturalizantes...................................................................... 49
4.1.2. Condiciones desnaturalizantes........................................................................... 49
4.1.2.1. PAGE desnaturalizante en presencia de TBE 1X y urea 8 M.............. 50
4.1.2.2. PAGE desnaturalizante en presencia de TBE 0.25X y urea 8 M......... 50
4.1.2.3. PAGE desnaturalizante TBE 1X y urea 7 M........................................ 50
4.1.3. Doble PAGE ...................................................................................................... 50
4.1.4. Elución de ácidos nucleicos de geles de poliacrilamida.................................... 51
4.2. Electroforesis en geles de agarosa................................................................................ 51
5. Hibridación molecular de ácidos nucleicos...................................................................... 51
5.1. Electrotransferencia de los RNAs a membranas para análisis por hibridación
Northern....................................................................................................................... 51
5.2. Impresiones de tejido ................................................................................................... 52
___________________________________________________________________________Índice
III
5.3. Fijación de ácidos nucleicos a membranas de nylon.................................................... 52
5.4. Obtención de sondas de RNA marcadas radiactivamente por transcripción
in vitro .......................................................................................................................... 52
5.5. Prehibridación e hibridación ....................................................................................... 53
6. Marcaje radiactivo de los DNAs patrones de tamaño .................................................... 53
6.1. Eliminación del grupo 5’-P .......................................................................................... 53
6.2. Fosforilación radiactiva del extremo 5’ ...................................................................... 53
7. Determinación del extremo 5’ de un RNA viroidal mediante extensión del
cebador................................................................................................................................ 54
7.1. Marcaje radiactivo del extremo 5’ del cebador............................................................ 54
7.2. Retrotranscripción ........................................................................................................ 54
8. Determinación del extremo 5’ de un RNA viroidal monomérico mediante
“RLM-RACE” (RNA Ligase-Mediated Amplification of cDNAs Ends) ........................ 55
8.1. Tratamiento previos del RNA ...................................................................................... 55
8.1.1. Polinucleótido quinasa del fago T4 ................................................................... 55
8.1.2. Fosfatasa alcalina de ternera.............................................................................. 55
8.2. Ligación de un adaptador de RNA al extremo 5’ de los RNAs ................................... 56
8.3. Retrotranscripción del RNA ........................................................................................ 56
8.4. Amplificación del cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa ............... 56
8.5. Clonación de los productos de amplificación .............................................................. 57
9. Determinación del extremo 3’ de un RNA viroidal monomérico mediante
3’ RACE.............................................................................................................................. 57
9.1. Tratamiento con fosfatasa alcalina de ternera .............................................................. 57
9.2. Poliadenilación del extremo 3’ .................................................................................... 57
9.3. Retrotranscripción ........................................................................................................ 57
9.4. Amplificación del cDNA mediante PCR y clonación.................................................. 58
10. Ligación de los RNAs monoméricos y lineales del CEVd procesados in vivo............. 58
10.1. Síntesis in vitro de un RNA monomérico del CEVd control .................................... 59
10.2. Tratamiento con polinucleótido quinasa del fago T4 o con fosfatasa alcalina
de ternera.................................................................................................................... 60
10.3. Incubación con RNA ligasa 1 del fago T4 o con tRNA ligasa de A. thaliana .......... 60
11. Manipulación de microorganismos ................................................................................ 60
___________________________________________________________________________Índice
IV
11.1. Obtención de células de E. coli DH5α competentes para su transformación
por choque térmico.................................................................................................... 60
11.2. Transformación de células de E. coli DH5α competentes mediante choque
térmico ...................................................................................................................... 61
11.3. Obtención de células de A. tumefaciens competentes para su
transformación por electroporación .......................................................................... 61
11.4. Transformación de células de A. tumefaciens competentes por electroporación...... 61
12. Purificación de plásmidos bacterianos........................................................................... 62
13. Secuenciación de DNA..................................................................................................... 62
13.1. Secuenciación manual ............................................................................................... 62
13.2. Secuenciación automática ......................................................................................... 63
14. Transformación estable de plantas de A. thaliana con cDNAs diméricos del
CEVd................................................................................................................................. 63
14.1. Generación de las construcciones ............................................................................. 63
14.1.1. Fosforilación de los cebadores...................................................................... 63
14.1.2. Mutagénesis dirigida..................................................................................... 63
14.1.3. Ligación de los plásmidos conteniendo cDNAs monoméricos mutados...... 64
14.1.4. Amplificación de los cDNAs monoméricos mutados .................................. 66
14.1.5. Ligación de los cDNAs monoméricos para producir cDNAs dimérico ....... 66
14.1.6. Clonación de los cDNAs diméricos en el vector pBKS+ ............................. 66
14.1.7. Subclonación de los cDNAs diméricos en el vector de transformación
pCK45........................................................................................................... 66
14.2. Transformación de A. thaliana mediante el método de la inmersión floral .............. 67
15. Transformación transitoria de G. aurantiaca y S. lycopersicum con cDNAs
diméricos del CEVd ........................................................................................................ 68
16. Análisis de las progenies recuperadas de plantas transformadas
transitoriamente con cDNAs diméricos mutados del CEVd........................................ 68
RESULTADOS
1. Sitio de procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva de los viroides de
la familia Pospiviroidae ...................................................................................................... 73
___________________________________________________________________________Índice
V
1.1. Transcritos diméricos de polaridad positiva del CEVd son procesados
correctamente en plantas transgénicas de A. thaliana ................................................. 73
1.2. Infectividad de los RNAs monoméricos circulares del CEVd y HSVd procesados
in vivo........................................................................................................................... 75
1.3. Sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del CEVd................................ 78
1.4. Sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del HSVd................................ 83
1.5. Sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del ASSVd ............................. 86
2. Motivos implicados en el procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva
del CEVd............................................................................................................................. 89
2.1. Efecto de mutaciones que afectan a la región central de la rama superior de la CCR
sobre el procesamiento de un transcrito dimérico de polaridad positiva del CEVd .... 91
2.2. Efecto de mutaciones que afectan a posiciones adyacentes de la rama superior de
la CCR sobre el procesamiento de un transcrito dimérico de polaridad positiva del
CEVd............................................................................................................................ 94
2.3. Mutantes en la rama inferior de la CCR que afectan al bucle E tienen un marcado
efecto sobre la ligación pero no sobre el corte de un transcrito dimérico de polaridad
positiva del CEVd ........................................................................................................ 97
2.4. Ensayos de infectividad de cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones
específicas .................................................................................................................... 98
3. Caracterización de los extremos de los RNAs viroidales monoméricos y lineales
procesados in vivo: enzimas implicadas en el procesamiento ........................................ 100
3.1. Extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd aislados de plantas
transgénicas de A. thaliana .......................................................................................... 100
3.2. Extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del HSVd y ASSVd aislados de
plantas transgénicas de A. thaliana .............................................................................. 102
3.3. Extremo 3’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd aislados de plantas
transgénicas de A. thaliana .......................................................................................... 103
3.4. Ligación in vitro de RNAs monoméricos lineales del CEVd procesados in vivo........ 105
DISCUSIÓN
1. Sitio de procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva de los miembros
de la familia Pospiviroidae ................................................................................................. 113
___________________________________________________________________________Índice
VI
2. Motivos estructurales implicados en el procesamiento de los oligómeros de
polaridad positiva del CEVd ............................................................................................. 116
2.1. Corte de los oligómeros................................................................................................ 116
2.2. Ligación de los RNAs monoméricos lineales .............................................................. 119
3. Naturaleza química de los extremos de los RNAs monoméricos lineales del
CEVd................................................................................................................................... 119
4. Modelo para el procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva de la
familia Pospiviroidae .......................................................................................................... 123
5. A. thaliana como modelo para el estudio del procesamiento de los RNAs viroidales .. 125
CONCLUSIONES.................................................................................................................. 127
BIBLIOGRAFÍA.................................................................................................................... 131
AGRADECIMIENTOS......................................................................................................... 157
IInnttrroodduucccciióónn
1
2
______________________________________________________________________Introducción
3
11.. AAssppeeccttooss ggeenneerraalleess ddee llooss vviirrooiiddeess
Durante los años 1970 y 1971 Theodor O. Diener, investigando el agente causal de la
enfermedad del tubérculo fusiforme de la patata, descubrió un nuevo replicón infeccioso con un
genoma aproximadamente diez veces menor que el del más pequeño de los virus conocidos al que
denominó viroide (Diener, 1971; 2003). Casi cuarenta años más tarde los viroides siguen siendo los
agentes infecciosos más pequeños, con una gama de huéspedes restringida a ciertas
monocotiledóneas y dicotiledóneas en las que frecuentemente provocan enfermedades de
importancia económica.
Al estar únicamente compuestos por una molécula de RNA circular de simple cadena
(246-401 nt) no codificante (Diener, 2001) y no requerir la cooperación de un virus auxiliar, los
viroides necesitan utilizar la maquinaria transcripcional del huésped para su replicación. Toda la
información necesaria para completar su ciclo infeccioso reside en la capacidad de su estructura
primaria y de orden superior para interaccionar con factores del huésped. Esta situación también
conlleva que los efectos patogénicos inducidos por los viroides son consecuencia de la interacción
directa de su RNA genómico, o de un derivado del mismo, con una o más dianas celulares
(Flores et al., 2005a).
En principio los viroides podrían ser precursores primitivos de los virus actuales o RNAs virales
degenerados, pero sus características moleculares y biológicas, así como la ausencia de similitud de
secuencia con RNAs virales, hacen poco probable esta hipótesis. También se propuso para los
viroides un posible origen a partir de intrones, elementos transponibles o plásmidos
(Diener, 1981; 1989). Sin embargo, el descubrimiento posterior de la presencia de ribozimas en
algunos de ellos ha llevado a considerarlos fósiles moleculares que tuvieron su origen en el mundo
de RNA que se postula antecedió a la aparición de la vida celular basada en el DNA y las proteínas
(Diener, 1989).
1.1. Propiedades estructurales
1.1.1. Estructura primaria y clasificación
Como ya se ha indicado, los viroides están compuestos exclusivamente por una pequeña
molécula de RNA circular de tan sólo 246 a 401 nucleótidos, si excluimos aquellos viroides con
repeticiones internas (Tabler y Tsagris, 2004; Flores et al., 2005a; Daròs et al., 2006; Ding y
Itaya, 2007).
En la actualidad se han caracterizado biológica y molecularmente unas 30 especies (Flores et
al., 2005b) y numerosas variantes de secuencia de las mismas (Fig. 1). El análisis de sus estructuras
______________________________________________________________________Introducción
4
primarias ha permitido agruparlas en dos grandes familias: Pospiviroidae, con el viroide del
tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd, Potato spindle tuber viroid) como especie tipo, y
Avsunviroidae, cuya especie tipo es el viroide del manchado solar del aguacate
(ASBVd, Avocado sunblotch viroid). Los miembros de la primera familia se caracterizan por la
presencia de una serie de motivos de secuencia y estructura conservados entre los que destaca una
región central conservada (CCR, central conserved region), por replicarse y acumularse en el
núcleo, y por la ausencia de dominios de autocorte ribozimáticos. Por el contrario, los miembros
POSPIVIROIDE
HSVd (Viroide del enanismo del lúpulo) 297 nt Ohno et al., 1983a HOSTUVIROIDE
CCCVd (Viroide del cadang-cadang del cocotero) 246 nt Haseloff et al., 1982 CtiVd (Viroide del tinangaja del cocotero) 254 nt Keese et al., 1988HLVd (Viroide latente del lúpulo) 256 nt Puchta et al., 1988CVd-IV (Viroide IV de los cítricos) 284 nt Puchta et al., 1991
COCADVIROIDE
ASSVd (Viroide de la piel cicatrizada de la manzana) 329 nt Hashimoto y Koganezawa, 1987 CVd-III (Viroide III de los cítricos) 294 nt Rakowski et al., 1994ADFVd (Viroide del fruto picado del manzano) 306 nt Di Serio et al., 1996GYSVd-1 (Viroide del moteado amarillo de la vid) 367 nt Koltunow y Rezaian, 1988GYSVd-2 (Viroide 2 del moteado amarillo de la vid) 363 nt Koltunow et al., 1989CBLVd (Viroide de la hoja curvada de los cítricos) 318 nt Ashulin et al.,1991PBCVd (Viroide de los chancros pustulosos del peral) 315 nt Hernández et al., 1992AGVd (Viroide australiano de la vid) 369 nt Rezaian, 1990
APSCAVIROIDE
CbVd-1 (Viroide 1 del coleus blumei) 248 nt Spieker et al., 1990 CbVd-2 (Viroide 2 del coleus blumei) 301 nt Spieker, 1996b
CbVd-3 (Viroide 3 del coleus blumei) 361 nt Spieker et al., 1996
COLEVIROIDE
ASBVd (Viroide del manchado solar del aguacate) 247 nt Symons, 1981 AVSUNVIROIDE
PLMVd (Viroide del mosaico latente del melocotonero) 337 nt Hernández y Flores, 1992
CChMVd (Viroide del moteado clorótico del crisantemo)399 nt Navarro y Flores, 1997PELAMOVIROIDE
POSPIVIROIDAE
AVSUNVIROIDAE
PSTVd (Viroide del tubérculo fusiforme de la patata) 359 nt Gross et al., 1978 TCDVd (Viroide del enanismo clorótico del tomate) 360 nt Singh et al., 1999MPVd (Viroide de la papita mexicana) 360 nt Martínez-Soriano et al., 1996
CEVd (Viroide de la exocortis de los cítricos) 371 nt Gross et al., 1982CSVd (Viroide del enanismo del crisantemo) 356 nt Haseloff y Symons, 1981
TPMVd (Viroide de la planta macho del tomate) 360 nt Kiefer et al., 1983
TASVd (Viroide del enanismo apical del tomate) 360 nt Kiefer et al., 1983IrVd 1 (Viroide 1 de iresine) 370 nt Spieker, 1996aCLVd (Viroide latente de columnea) 370 nt Hammond et al., 1989a
ELAVIROIDE ELVd (Viroide latente de la berenjena) 333 nt Fadda et al., 2003a
POSPIVIROIDE
HSVd (Viroide del enanismo del lúpulo) 297 nt Ohno et al., 1983a HOSTUVIROIDE
CCCVd (Viroide del cadang-cadang del cocotero) 246 nt Haseloff et al., 1982 CtiVd (Viroide del tinangaja del cocotero) 254 nt Keese et al., 1988HLVd (Viroide latente del lúpulo) 256 nt Puchta et al., 1988CVd-IV (Viroide IV de los cítricos) 284 nt Puchta et al., 1991
COCADVIROIDE
ASSVd (Viroide de la piel cicatrizada de la manzana) 329 nt Hashimoto y Koganezawa, 1987 CVd-III (Viroide III de los cítricos) 294 nt Rakowski et al., 1994ADFVd (Viroide del fruto picado del manzano) 306 nt Di Serio et al., 1996GYSVd-1 (Viroide del moteado amarillo de la vid) 367 nt Koltunow y Rezaian, 1988GYSVd-2 (Viroide 2 del moteado amarillo de la vid) 363 nt Koltunow et al., 1989CBLVd (Viroide de la hoja curvada de los cítricos) 318 nt Ashulin et al.,1991PBCVd (Viroide de los chancros pustulosos del peral) 315 nt Hernández et al., 1992AGVd (Viroide australiano de la vid) 369 nt Rezaian, 1990
APSCAVIROIDE
CbVd-1 (Viroide 1 del coleus blumei) 248 nt Spieker et al., 1990 CbVd-2 (Viroide 2 del coleus blumei) 301 nt Spieker, 1996b
CbVd-3 (Viroide 3 del coleus blumei) 361 nt Spieker et al., 1996
COLEVIROIDE
ASBVd (Viroide del manchado solar del aguacate) 247 nt Symons, 1981 AVSUNVIROIDE
PLMVd (Viroide del mosaico latente del melocotonero) 337 nt Hernández y Flores, 1992
CChMVd (Viroide del moteado clorótico del crisantemo)399 nt Navarro y Flores, 1997PELAMOVIROIDE
POSPIVIROIDAE
AVSUNVIROIDAE
PSTVd (Viroide del tubérculo fusiforme de la patata) 359 nt Gross et al., 1978 TCDVd (Viroide del enanismo clorótico del tomate) 360 nt Singh et al., 1999MPVd (Viroide de la papita mexicana) 360 nt Martínez-Soriano et al., 1996
CEVd (Viroide de la exocortis de los cítricos) 371 nt Gross et al., 1982CSVd (Viroide del enanismo del crisantemo) 356 nt Haseloff y Symons, 1981
TPMVd (Viroide de la planta macho del tomate) 360 nt Kiefer et al., 1983
TASVd (Viroide del enanismo apical del tomate) 360 nt Kiefer et al., 1983IrVd 1 (Viroide 1 de iresine) 370 nt Spieker, 1996aCLVd (Viroide latente de columnea) 370 nt Hammond et al., 1989a
ELAVIROIDE ELVd (Viroide latente de la berenjena) 333 nt Fadda et al., 2003a
Figura 1. Clasificación de los viroides caracterizados molecularmente (Flores et al., 2005b). Éstos se agrupan en dos familias, Pospiviroidae y Avsunviroidae, que se dividen en cinco y tres géneros, respectivamente. Las especies tipo de cada género se destacan en gris. Para cada especie se indica la abreviatura de su nombre en inglés, junto con el nombre en castellano, el tamaño en nucleótidos de una variante típica y el trabajo en donde se describió su estructura molecular.
______________________________________________________________________Introducción
5
de la segunda familia no poseen estos motivos, se replican y acumulan en el cloroplasto, y sus
RNAs de ambas polaridades se autocortan a través de estructuras ribozimáticas de cabeza de
martillo.
Figura 2. Ejemplos de estructuras secundarias de mínima energía libre predichas para los viroides. (A) Conformación en varilla para el PSTVd. (B) Conformación de tipo cuasi-varilla para el viroide de los chancros pustulosos del peral (PBCVd, Pear blister canker viroid). (C) Conformación altamente ramificada para el PLMVd. En los cuadros se destaca una región para la que se ha propuesto dos estructuras alternativas: en varilla (cuadro superior) y cruciforme (cuadro inferior). Los puntos indican interacciones canónicas Watson-Crick y las líneas discontinuas una interacción terciaria entre dos bucles.
1.1.2. Estructura secundaria
El análisis de las secuencias viroidales muestra que todos ellas presentan un contenido en G+C
mayor del 50%, a excepción del ASBVd dónde solamente es del 38%, y un elevado grado de
autocomplementariedad. Mediante cálculos termodinámicos se ha determinado la estructura
secundaria de mínima energía libre que adoptan los RNAs viroidales en condiciones nativas. Para la
______________________________________________________________________Introducción
6
mayor parte de ellos la conformación más estable predicha es en varilla o cuasi-varilla, en la que
regiones de apareamiento intramolecular se alternan con pequeños bucles de bases desapareadas
(Fig. 2A y 2B). Sin embargo, excepciones a esta norma son el viroide del mosaico latente del
melocotonero (PLMVd, Peach latent mosaic viroid) y el viroide del moteado clorótico del
crisantemo (CChMVd, Chrysanthemun chlorotic motle viroid), que presentan una estructura
secundaria de mínima energía libre altamente ramificada y estabilizada por un seudonudo (Fig. 2C).
Las conformaciones obtenidas con esta metodología in silico no tienen necesariamente que
reflejar las que adoptan in vitro o in vivo, aunque existen datos experimentales en favor de estas
estructuras: i) la conformación del PSTVd observada in vitro por microscopía electrónica es en
varilla (Sogo et al., 1973; Sänger et al., 1976), ii) la correlación entre la conservación de la
estructura secundaria de una variante de secuencia del PSTVd, generada in vitro, y su infectividad
en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum (Wassenegger et al., 1994), iii) las repeticiones de
secuencia observadas en el viroide del cadang-cadang del cocotero (CCCVd, Coconut cadang-
cadang viroid) y en el viroide de la exocortis de los cítricos (CEVd, Citrus exocortis viroid) ocurren
de forma tal que preservan sus estructuras secundarias en varilla (Haseloff et al., 1982; Semancik et
al., 1994; Fadda et al., 2003b), iv) las estructuras secundarias propuestas para el viroide del
enanismo del crisantemo (CSVd, Chrysanthemum stunt viroid), el PSTVd y PLMVd se han
confirmado mediante estudios de digestión in vitro con RNasas (Haseloff y Symons, 1981; Gast
et al., 1996; Bussière et al., 2000), v) la presencia de mutaciones compensatorias en diferentes
variantes de secuencia del CChMVd (Navarro y Flores, 1997; De la Peña et al., 1999; Gago et al.,
2005) y, vi) las interacciones terciarias que contribuyen a estabilizar las estructuras ramificadas en
el PLMVd y CChMVd son consistentes con que ambos viroides adopten estructuras in vivo muy
similares a las predichas in silico (Fig. 2C) (Bussière et al., 2000; Gago et al., 2005).
1.1.3. Dominios estructurales y motivos de secuencia
A partir del análisis comparado de parejas de secuencias viroidales, en 1985 se propuso un
modelo que dividía la conformación en varilla de todos los viroides entonces conocidos, excepto el
ASBVd, en cinco dominios (Keese y Symons, 1985). Como se muestra en la Figura 3, el dominio
central (C) se encuentra flanqueado por los dominios patogénico (P) y variable (V), quedando en los
extremos de la estructura los dominios terminales derecho e izquierdo (TR y TL). En un principio se
asignó una función a cada dominio; por ejemplo, el dominio P se asoció con los efectos patogénicos
en el PSTVd y otros viroides estrechamente relacionados con éste, y el domino C se implicó en
replicación. Sin embargo, la situación es más compleja ya que ciertas funciones como la inducción
de síntomas parecen estar controladas por determinantes discretos situados en más de un dominio
______________________________________________________________________Introducción
7
(Sano et al., 1992; Reanwarakorn y Semancik, 1998; Qi y Ding, 2003a).
Dentro de estos cinco dominios estructurales se han caracterizado una serie de regiones de
secuencia conservadas (Fig. 3). La más importante es la CCR, situada en el dominio C, que está
constituida por dos series de nucleótidos en las hebras superior e inferior flanqueados en el caso de
la primera por dos repeticiones invertidas imperfectas. Se pueden diferenciar hasta cinco tipos de
CCRs según su secuencia conservada, siendo las del PSTVd, la del viroide del enanismo del lúpulo
(HSVd, Hop stunt viroid) y la del CCCVd más similares entre sí que con las del viroide de la piel
cicatrizada de la manzana (ASSVd, Apple scar skin viroid) y la del viroide 1 del Coleus blumei
(CbVd-1, Coleus blumei viroid 1). Otra región es la denominada región terminal conservada
(TCR, terminal conserved region) (Koltunow y Rezaian, 1988; Flores et al., 1997) situada en la
rama superior del dominio TL en los viroides de los géneros Pospiviroide, Apscaviroide y en los dos
viroides de mayor tamaño del género Coleviroide, los viroides 2 y 3 del Coleus blumei (CbVd-2 y
CbVd-3, respectivamente) (Flores et al., 1997). La ausencia de esta región en el viroide CbVd-1 de
248 nucleótidos y en los miembros de menor tamaño de la familia sugiere su necesidad únicamente
en los viroides de un tamaño superior a los 300 nucleótidos. Por último, en este mismo dominio
estructural, TL, se ha descrito una horquilla terminal conservada (TCH, terminal conserved hairpin)
en los miembros de los géneros Hostuviroide y Cocadviroide, todos ellos con un tamaño de 300
nucleótidos o inferior y sin TCR (Puchta et al., 1988; Flores et al., 1997). La estricta conservación
de estas regiones en secuencia y localización sugiere una función importante que por el momento se
desconoce.
AC
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NNNNNN: :
5´
5´ 3´
3´
BUCLE E
N:
CCR
Figura 3. Estructura secundaria en varilla propuesta para la mayoría de los miembros de la familia Pospiviroidae. En la parte superior se indica la localización de los dominios C (central), P (patogénico), V (variable), y TL y TR (terminal izquierdo y derecho, respectivamente). Los nucleótidos que forman parte de las regiones conservadas CCR por un lado, y por otro TCR y TCH, aparecen en azul y verde, respectivamente. Las flechas que flanquean la rama superior de la CCR indican los nucleótidos que, junto con los estrictamente conservados, forman repeticiones invertidas imperfectas. En la parte inferior se muestra el denominado bucle E, elemento de estructura terciaria caracterizado en la CCR del PSTVd. Las letras N indican los nucleótidos no conservados y las de mayor tamaño los nucleótidos característicos del bucle E. La línea en forma de S señala los nucleótidos que se entrecruzan mediante irradiación con luz ultravioleta. Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas.
______________________________________________________________________Introducción
8
El tipo de CCR junto con la presencia o ausencia de TCR y TCH, han sido utilizados como
criterio para clasificar a los miembros de la familia Pospiviroidae en varios géneros (Flores
et al., 1997; 2005b) (Fig. 1). La situación es diferente en los cuatro viroides que forman la familia
Avsunviroidae, ya que el ASBVd, PLMVd, CChMVd y el viroide latente de la berenjena (ELVd,
Eggplant latent viroid) no presentan regiones conservadas a excepción de los elementos de
secuencia que participan en la formación de las estructuras ribozimáticas de cabeza de martillo. En
el ASBVd se han caracterizado unos motivos de secuencia adyacentes a los sitios de iniciación de la
transcripción de ambas cadenas de este viroide que presentan una cierta similitud con promotores de
genes cloroplásticos (Navarro y Flores, 2000), aunque motivos similares no existen en los otros
miembros de la misma familia.
Las ribozimas de cabeza de martillo constituyen uno de los sistemas de RNA catalítico más
simple que existen en la naturaleza, capaces de inducir el corte específico de un enlace fosfodiéster
mediante una transesterificación teóricamente reversible (Fig. 4). Los productos liberados tras la
reacción tienen extremos 5´-OH y 2´,3´-fosfodiéster cíclico.
Figura 4. La reacción de corte ribozimático comienza con el ataque del oxígeno en 2´ sobre el fósforo y conduce a la liberación del oxígeno en 5´ por un mecanismo SN2 (A). El estado de transición de la reacción es una bipirámide trigonal (B), y los productos resultantes contienen un 2´,3-fosfodiéster cíclico y 5´-OH (C) (Symons, 1992; Przybilski y Hammann, 2006).
La estructura de cabeza de martillo se denominó así por la forma bidimensional que
inicialmente se propuso, constituida por tres hélices, I, II y III que suelen estar cerradas por bucles
terminales pequeños, dispuestas alrededor de una región central donde se sitúan once nucleótidos
conservados que forman el bolsillo catalítico de la ribozima. El análisis estructural por cristalografía
de rayos X de diversas ribozimas de cabeza de martillo ha identificado una serie de interacciones
específicas para cada uno de los nucleótidos del bucle central que son críticas para la actividad
catalítica. En el modelo tridimensional propuesto la ribozima adquiere un plegamiento en forma de
ligación
A B C
corte
______________________________________________________________________Introducción
9
γ en el que las hélices I y II forman los brazos superiores y la hélice III la base (Fig. 5). Las tres
hélices son del tipo A, pero mientras que entre la I y la II existe un pequeño ángulo, la II y la III son
prácticamente colineales.
2
II
III
I
1
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C
I
1
II
III
2
Figura 5. Estructuras de la ribozima de cabeza de martillo. Representación de la secuencia de esta ribozima tal y como fue originalmente propuesta (Forster y Symons, 1987a) (A), y de acuerdo a los datos de cristalografía de rayos X obtenidos para una ribozima en trans (Scott et al., 1996) (B) o en cis (Martick y Scott, 2006) (C). Los nucleótidos estricta o altamente conservados en las ribozimas de cabeza de martillo naturales se muestran sobre un fondo negro. El sitio de autocorte se señala con una flecha. N representa cualquier nucleótido y H cualquier nucleótido excepto G. Las líneas continuas y los puntos indican interacciones canónicas Watson-Crick y no canónicas, respectivamente.
1.1.4. Estructuras secundarias alternativas y elementos de estructura terciaria
Además de la conformación más estable, los viroides pueden adoptar estructuras secundarias
metaestables que de manera transitoria se forman en procesos de desnaturalización térmica (Henco
et al., 1979; Riesner et al., 1979) (Fig. 6), y que asimismo podrían generarse durante la replicación
o como consecuencia de la interacción del RNA viroidal con proteínas (Riesner, 1991).
En los miembros de la familia Pospiviroidae estas estructuras metaestables se caracterizan por
la presencia de una serie de horquillas, alguna de las cuales se ha asociado con una función
concreta. De las cuatro propuestas destaca la horquilla I (HPI, hairpin I), conservada en todos los
miembros de la familia por estar formada por la hebra superior de la CCR y las repeticiones
invertidas que la flanquean, e implicada en el procesamiento de los intermediarios oligómericos
generados durante la replicación (Visvader et al., 1985; Meshi et al., 1985; Diener, 1986). Los
estudios de desnaturalización térmica indicaron que el tallo de la HPI estaría formado por el
apareamiento de las repeticiones invertidas que flanquean la rama superior de la CCR (Henco et al.,
1979). Años más tarde, a partir del análisis de otros miembros de la familia, se propuso la existencia
de bucles internos o pares no canónicos en el tallo de la horquilla que lo extendían dejando un bucle
terminal formado únicamente por cuatro nucleótidos (Flores et al., 1997) (Fig. 7). La presencia de
dichos apareamientos se confirmó posteriormente mediante digestión in vitro con RNasas (Gast
A CB
______________________________________________________________________Introducción
10
et al., 1998). La horquilla II (HPII), presente sólo en los miembros del género Pospiviroide, surge
del apareamiento de secuencias situadas en la hebra inferior de la estructura en varilla a ambos
lados de la CCR. Diversos estudios han mostrado que esta horquilla es crítica para mantener la
infectividad del PSTVd y sugieren que en la síntesis de los oligómeros de polaridad negativa podría
actuar como sitio de unión a factores de transcripción (Riesner, 1990; Loss et al., 1991; Qu et al.,
1993; Candresse et al., 2001; Schroder y Riesner, 2002). Las horquillas III (HPIII) y IV (HPIV)
pueden formarse únicamente en el PSTVd y en el viroide latente de columnea (CLVd, Columnea
latent viroid) (Owens et al., 2003), respectivamente.
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14
28
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183
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100ºC
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359
77ºC
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77ºC
HPI
HPIII
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A
B
C
Figura 6. Mecanismo de desnaturalización térmica propuesto para el PSTVd. Al aumentar la temperatura la molécula sufre una serie de transiciones desde la conformación en varilla (A) hasta una conformación de simple cadena sin apareamientos internos (C). Durante este proceso se distingue una transición altamente cooperativa en la que todos los pares de bases de la estructura nativa se rompen y se forman tres horquillas particularmente estables (HPI, HPII, HPIII) (B) (Riesner, 1990). Los números se refieren al tamaño en nucleótidos de cada una de las regiones de simple cadena.
También se han caracterizado elementos de estructura terciaria en miembros de la familia
Pospiviroidae, siendo el más relevante el bucle E detectado en la CCR del PSTVd mediante
radiación UV (Branch et al., 1985) y modificación con dimetilsulfato (Gast et al., 1996), y cuya
existencia in vivo ha sido demostrada recientemente (Wang et al., 2007; Eiras et al., 2007) (Fig. 3).
Aunque se desconoce su función se le ha relacionado con el procesamiento de los intermediarios
replicativos (Baumstark et al., 1997; Schrader et al., 2003; Owens y Baumstark, 2007),
patogenicidad (Qi y Ding, 2003a), adaptación al huésped (Wassenegger et al., 1996; Zhu et al.,
2002; Qi y Ding, 2002) y transcripción (Zhong et al., 2006). Este elemento se encuentra presente
______________________________________________________________________Introducción
11
también en el 5S rRNA (Fox y Wose, 1975). En la familia Avsunviroidae, y más concretamente
para los miembros del género Pelamoviroide, se han propuesto interacciones canónicas entre
nucleótidos de bucles que forman parte de horquillas (“kissing loop”). En el PLMVd se han descrito
este tipo de interacciones mediante estudios de digestión in vitro con nucleasas (Bussière et al.,
2000) y a partir de estudios de variabilidad natural (Ambrós et al., 1998; 1999; Pelchat et al., 2000).
En el CChMVd estudios de variabilidad natural combinados con mutagénesis dirigida, bioensayo y
análisis de las progenies resultantes han mostrado una interacción de este tipo entre regiones
similares de este viroide que es crítica para el plegamiento in vitro y para la viabilidad in vivo (Gago
et al., 2005).
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C-G
PSTVdC G
G AA AU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
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C
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U C
G A
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G-CU-GC-G
C-GU-A
G-C
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C-GC-G
A-U
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C CU A
G CC G
C-GC-GG-C
A-U
C-G
G-CG-C
U-AU-AC-GC-G
G-U
U-A
CCCVd
G AA A
C G
C-GC-GU-A
C-G
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
C G
UUCCCGCCGC
GGUGGGGA
CCCCUCGCCGGGG
CGAGGG
CGGAACUAA
ACUCGUGGUUCC
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UCCCGAGAA
CCGCUUUUUCUCUAUCU
AACUUGUUGGGG
CGAGGGUGU
UUAGCC
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UGGAACCGCAGUUGGUUCC
U
GCUUCAGGGAUCC C
GUGGA
AACAACUGAAGC
CGGGGAAACCUGGAGCGA
ACUGGC
AAA
GCGCUGUCGCUUCGG
CUAC
UACCCG
AAAGGAC
CCCUUU
GGUGGGGAGUG
CACCCCUCGCC
C
AC
CCAGCGGCCG
CGCCCGCAGG
AC
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CC
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CGGGUGU
CC
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GAAACAGGGUUU
UCACCCUU
CCUUUC
HPII
CC
HPII
HPI HPI HPIIIHPIII
G A
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C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
HSVdC G
G AA A
C-GG-C
C-GC G
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C
ASSVd
U C
G A
U AC G
G-CU-GC-G
C-GU-A
G-C
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
CbVd1
C CU A
G CC G
C-GG-C
A-U
C-G
G-CG-C
U-AU-AC-GC-G
G-U
U-A
CCCVd
G AA A
C G
C-GU-A
C-G
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
C G
G A
C-G
PSTVdC G
G AA AU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
HSVdC G
G AA A
C-GC-GG-C
C-GC G
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C
ASSVd
U C
G A
U AC G
G-CU-GC-G
C-GU-A
G-C
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
CbVd1
C CU A
G CC G
C-GC-GG-C
A-U
C-G
G-CG-C
U-AU-AC-GC-G
G-U
U-A
CCCVd
G AA A
C G
C-GC-GU-A
C-G
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
C G
UUCCCGCCGC
GGUGGGGA
CCCCUCGCCGGGG
CGAGGG
CGGAACUAA
ACUCGUGGUUCC
UGUGGUU
CACACCU
GACCUC
CUGACAAG
AAAAGA
AAAAAGAAGGCGG CUCGG
AGGAGC
UCCCGAGAA
CCGCUUUUUCUCUAUCU
AACUUGUUGGGG
CGAGGGUGU
UUAGCC
CU
UGGAACCGCAGUUGGUUCC
U
GCUUCAGGGAUCC C
GUGGA
AACAACUGAAGC
CGGGGAAACCUGGAGCGA
ACUGGC
AAA
GCGCUGUCGCUUCGG
CUAC
UACCCG
AAAGGAC
CCCUUU
GGUGGGGAGUG
CACCCCUCGCC
C
AC
CCAGCGGCCG
CGCCCGCAGG
AC
CG
AGGAG
UUCCU
UA
CC
AUUCCCG
CGGGUGU
CC
UU
GAAACAGGGUUU
UCACCCUU
CCUUUC
HPII
CC
HPII
HPI HPI HPIIIHPIII
Figura 7. Estructura secundaria del PSTVd en la que en azul, rojo y verde se indican los nucleótidos que según los estudios de desnaturalización térmica forman el tallo de las horquillas I, II y III, respectivamente. En la parte superior se representa las estructuras de la horquilla I de cada una de las especies tipo de la familia Pospiviroidae propuestas a partir del análisis de sus estructuras primarias (Flores et al., 1997). Las letras en blanco indican nucleótidos conservados en posiciones similares en todas las estructuras, los guiones interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas.
1.2. Localización subcelular de los viroides
Los primeros estudios de esta naturaleza se basaron en la obtención de fracciones subcelulares
mediante centrifugación diferencial para después analizar su contenido en RNA viroidal. Los
resultados permitieron asociar al PSTVd, CEVd y HSVd a fracciones nucleares (Diener, 1971;
Semancik et al., 1976; Takahashi et al., 1982). Investigaciones posteriores utilizando preparaciones
de núcleos purificados, protoplastos y secciones finas de hojas de plantas infectadas en las que se
combinó la hibridación in situ con la microscopía láser confocal de barrido, permitieron localizar al
PSTVd específicamente en el nucleolo (Harders et al., 1989; Qi y Ding, 2003b). Resultados
______________________________________________________________________Introducción
12
similares se han encontrado para otros miembros de la familia Pospiviroidae, lo que ha permitido
concluir que el sitio de acumulación de éstos es nuclear (Bonfiglioli et al., 1994; 1996). Mediante
técnicas similares se ha ubicado en el cloroplasto a dos miembros de la familia Avsunviroidae, el
ASBVd y PLMVd (Mohamed y Thomas, 1980; Lima et al., 1994; Bonfiglioli et al., 1994; Bussière
et al., 1999). La diferente localización subcelular del ASBVd y PLMVd (y muy probablemente del
CChMVd y ELVd) con respecto a la de los miembros de la familia Pospiviroidae implica que las
interacciones de estos RNAs con componentes del huésped deben ser diferentes en ambas familias.
1.3. Replicación de los viroides
Elucidar los mecanismos de replicación sigue siendo en la actualidad una de las líneas de trabajo
más atractivas dentro de la investigación de estos patógenos. Son muchas las preguntas que todavía
quedan por responder, como por ejemplo qué enzimas están implicadas y cómo los viroides
modifican su especificidad, qué elementos estructurales de los viroides son claves en ese proceso y
cómo estos RNAs evaden los mecanismos de defensa de sus huéspedes.
1.3.1. Mecanismo del círculo rodante
Teniendo en cuenta la naturaleza circular de los RNAs viroidales así como la ausencia de una
contraparte de DNA homólogo al CEVd y PSTVd en plantas infectadas (Grill y Semancik, 1978;
Zaitlin et al., 1980; Branch y Dickson, 1980), se propuso un mecanismo de replicación de círculo
rodante con sólo intermediarios de RNA (Branch y Robertson, 1984; Ishikawa et al., 1984;
Hutchins et al., 1985). Este mecanismo también está sostenido por la detección en plantas
infectadas de un conjunto de RNAs viroidales diferentes del RNA genómico que se acumulan a una
concentración inferior a la de éste, para los que se postuló un papel de intermediarios replicativos.
Entre éstos caben destacar RNAs de polaridad negativa en plantas infectadas por el CEVd (Grill y
Semancik, 1978), así como RNAs oligómericos de esta misma polaridad o de ambas polaridades en
plantas infectadas por el PSTVd, CEVd y ASBVd, respectivamente (Branch et al., 1981; Rohder y
Sänger, 1981; Bruening et al., 1982; Hutchins et al., 1985).
El primer modelo de replicación para RNAs de tipo viroidal por un mecanismo de círculo
rodante es original de Branch y Robertson (1981), y fue formulado para explicar la replicación del
PSTVd. Posteriormente, estos autores propusieron dos alternativas denominadas simétrica y
asimétrica, atendiendo al tipo de molécula que se utiliza como molde en la segunda parte del ciclo
(Branch y Robertson, 1984) (Fig. 8).
En este modelo, el RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al que se asigna
arbitrariamente la polaridad positiva, es reconocido por una RNA polimerasa que después de varios
______________________________________________________________________Introducción
13
ciclos de elongación da lugar a un oligómero de polaridad complementaria que puede seguir dos
vías diferentes. Por un lado, en la variante asimétrica este oligómero puede servir directamente de
molde para la síntesis de otros oligómeros de polaridad positiva, que son luego cortados a
monómeros lineales y ligados a las correspondientes moléculas circulares maduras. Por otro lado,
en la variante simétrica el oligómero de polaridad negativa es cortado y ligado dando lugar a
moléculas monoméricas circulares de la misma polaridad, que sirven como molde en un segundo
círculo rodante que es simétrico del primero. La molécula clave que permite diferenciar entre las
dos variantes es el monómero circular de polaridad negativa: su presencia indica que la replicación
sigue la variante simétrica del modelo.
Rz
5’
Rz5’OH2’
3’P
5’
3’
5’
5’FH
3’5’ 3’
5’3’1 1
2
3
1
1
2
2
3
3
5’
5’OH2’P3’
5’3’
(+) (-)
(+)
(-)
Rz
5’
Rz5’OH2’
3’P
5’
3’
5’
5’FH
3’5’ 3’
5’3’1 1
2
3
1
1
2
2
3
3
5’
5’OH2’P3’
5’OH2’P3’
5’3’
(+) (-)
(+)
(-)
Figura 8. Mecanismo de círculo rodante con intermediarios de RNA propuesto para la replicación de los RNAs de tipo viroidal (adaptado de Branch y Robertson, 1984; Symons, 1992; Flores et. al., 2005a). En la parte superior de la figura se representa la variante simétrica del modelo seguida por los miembros de la familia Avsunviroidae en el cloroplasto, en la que los oligómeros viroidales se autocortan ribozimáticamente (Rz) generando RNAs lineales de longitud completa con extremos 5’-OH y 2’,3’-fofodiéster. En la parte inferior se muestra la variante asimétrica, seguida por los miembros de la familia Pospiviroidae en el núcleo, donde sólo opera un círculo rodante y un factor del huésped (FH) media el corte de los RNAs oligoméricos. Las moléculas viroidales de polaridad positiva y negativa se representan en verde y amarillo, respectivamente. Las puntas de flecha indican el sitio de corte. Los números 1, 2 y 3 se refieren a las etapas de transcripción, corte y ligación, respectivamente.
Aunque el monómero circular de polaridad negativa del PSTVd puede iniciar la infección en
plantas transgénicas que expresan constitutivamente RNAs de esta polaridad (Feldstein et
al., 1998), y la incubación de RNAs oligómericos de polaridad negativa de este viroide con
______________________________________________________________________Introducción
14
extractos de patata sana conduce a las correspondientes formas monoméricas circulares (Tsagris
et al., 1987a), nunca se han detectado estas moléculas en plantas infectadas de forma natural. Esto
ha llevado a concluir que dicho viroide, y por extensión los de su familia, se replican por la variante
asimétrica del modelo (Branch et al., 1988). Por el contrario, la detección en el tejido infectado por
los miembros de la familia Avsunviroidae de los monómeros circulares de polaridad negativa
(Hutchins et al., 1985; Daròs et al., 1994; Bussière et al., 1999; Navarro et al., 1999; Delgado et
al., 2005), así como la observación de que los RNAs de ambas polaridades son capaces de
autocortarse in vitro (Hutchins et al., 1986; Hernández y Flores, 1992; Navarro y Flores, 1997;
Fadda et al., 2003a), sugieren que estos viroides se replican siguiendo la variante simétrica del
modelo.
1.3.2. Transcripción de los intermediarios replicativos
1.3.2.1. RNA polimerasas implicadas en la síntesis de los RNAs viroidales
La replicación de un viroide no tiene necesariamente que ocurrir en el mismo compartimento
subcelular en el que se acumula mayoritariamente, ya que podría ser sintetizado en un lugar y
posteriormente ser traslocado a otro. Sin embargo, de la detección de una serie de intermediarios
replicativos del PSTVd en el núcleo (Spiesmacher et al., 1983) y del ASBVd en el cloroplasto
(Navarro et al., 1999), se ha concluido que tanto la replicación como la acumulación de los
miembros de la familia Pospiviroidae tiene lugar en el núcleo mientras que los de la familia
Avsunviroidae se replican y acumulan en el cloroplasto (Fig. 8).
Para investigar qué RNA polimerasa nuclear se encuentra implicada en la replicación de los
miembros de la familia Pospiviroidae se han realizado estudios in vivo e in vitro con α-amanitina,
un octapéptido fúngico capaz de inhibir a las RNA polimerasas II y III a bajas y altas
concentraciones respectivamente, pero no así a la RNA polimerasa I (Roeder, 1976; Marzluff y
Huang, 1984; Cox y Golberg, 1988). Siguiendo esta metodología se ha concluido que la enzima
implicada en la transcripción del PSTVd (Schindler y Mülbach, 1992), CEVd (Flores y Semancik,
1982; Flores, 1989; Rivera-Bustamante y Semancik, 1989) y HSVd (Mühlbach y Sänger, 1979;
Yoshikawa y Takahashi, 1986), es la RNA polimerasa II, hipótesis sustentada por los resultados de
un trabajo en el que se observó que la RNA polimerasa II purificada de plantas de tomate sanas es
capaz de transcribir in vitro un RNA de polaridad positiva del PSTVd (Rackwitz et al., 1981). En
acuerdo con estas observaciones, años más tarde se demostró la interacción in vivo de la RNA
polimerasa II y el CEVd, pues partiendo de una fracción enriquecida en cromatina purificada de
plantas de tomate infectadas por este viroide se inmunoprecipitó la RNA polimerasa II asociada a
RNAs viroidales de ambas polaridades con un anticuerpo monoclonal específico del dominio
______________________________________________________________________Introducción
15
carboxiterminal de la subunidad mayor de dicha polimerasa (Warrilow y Symons, 1999). Sin
embargo, la RNA polimerasa implicada en la replicación del ABSVd es insensible a niveles altos de
α-amanitina (Marcos y Flores, 1992), por lo que debe ser distinta de las RNA polimerasas II y III.
Hasta la fecha se conocen dos actividades implicadas en la transcripción de los genes
cloroplásticos: una RNA polimerasa semejante a la RNA polimerasa de eubacterias como
Escherichia coli, codificada en el genoma del cloroplasto (PEP, de plastid encoded polymerase), y
una RNA polimerasa codificada en el núcleo (NEP, de nuclear encoded polymerase). Puesto que
ambas actividades son insensibles a la α-amanitina, cualquiera de ellas podría estar implicada en la
replicación de los miembros de la familia Avsunviroidae. Para discernir entre estas alternativas se
han llevado a cabo estudios con metodologías distintas que no han llegado a un acuerdo. Mientras
que los resultados de un trabajo empleando tagetitoxina, una toxina fúngica capaz de inhibir la PEP
pero no la NEP, sugirieren que esta última es la enzima implicada en la replicación del ASBVd
(Navarro et al., 2000), estudios de trascripción in vitro con el PLMVd y la RNA polimerasa de
E. coli sugieren la participación de una RNA polimerasa de tipo PEP (Pelchat et al., 2001; 2002).
Sin embargo, la implicación de la RNA polimerasa codificada en el cloroplasto parece poco
probable teniendo en cuenta que los niveles de replicación y acumulación del PLMVd son
particularmente elevados en las áreas sintomáticas de hojas de melocotonero que presentan una
clorosis extrema denominada “calico”. Dicha sintomatología muy probablemente se debe a la
interrupción del paso de los proplastidios a cloroplastos como consecuencia de un defecto en el
procesamiento de los precursores de los RNAs ribosómicos plastídicos (Rodio et. al, datos no
publicados). Estas observaciones se ajustan más con la participación de un RNA polimerasa de tipo
NEP en la replicación del PLMVd, ya que otros estudios sugieren que esta polimerasa actúa en los
primeros estadios del desarrollo de los plastidios durante los que serían transcritos los genes
implicados en la síntesis del aparato de transcripción y traducción del cloroplasto, entre los que se
encuentran las diferentes subunidades de la RNA polimerasa de tipo PEP (Hajdukiewicz
et al., 1997).
Así pues, y a pesar de existir en plantas una actividad RNA polimerasa dependiente de RNA
(Schiebel et al., 1988), los datos disponibles muestran que los viroides son reconocidos y transcritos
por RNA polimerasas cuyos moldes en condiciones fisiológicas normales son DNAs bicatenarios.
Queda por determinar cómo estas enzimas son capaces de reconocer moldes de RNA
monocatenario y transcribirlos.
1.3.2.2. Sitio de inicio de la transcripción de los intermediarios replicativos
Dada la naturaleza circular de los viroides y su mecanismo de replicación de círculo rodante, es
______________________________________________________________________Introducción
16
teóricamente factible pensar que no es necesario un punto específico para iniciar la síntesis de las
nuevas cadenas y que, por tanto, ésta podría iniciarse de forma inespecífica en distintas regiones de
la molécula. Aunque esta estrategia podría representar una ventaja, los datos experimentales indican
que la transcripción de los viroides comienza a partir de determinadas secuencias específicas o
promotores.
Respecto a la familia Pospiviroidae, se han realizado trabajos encaminados a identificar el punto
de inicio de la transcripción de las cadenas de polaridad negativa del PSTVd mediante estudios de
transcripción in vitro con el RNA circular monomérico de polaridad positiva y un extracto nuclear
de patata (Kolonko et al., 2006), o con la RNA polimerasa II purificada de tomate o de germen de
trigo (Tabler y Tsagris, 1990). Los resultados no son coincidentes, pues mientras en el primero de
ellos se determinaron dos posibles sitios de iniciación adyacentes situados en el bucle terminal
izquierdo (U359 y C1), en el segundo se identificó la G168 situada en la HPIII como el punto de inicio
(Fig. 9). Esta discrepancia puede derivar del uso de metodologías in vitro que no siempre reflejan lo
que ocurre in vivo.
3’
G168
NÚCLEO
(+)
5’ 3’(-)
3’
C1
3’
UA
B
359
3’
G168
NÚCLEO
(+)
5’ 3’(-)5’ 3’(-)
3’
C1
3’
UA
B
359
Figura 9. Sitios de inicio de la síntesis de las cadenas de polaridad negativa propuestos para el PSTVd por Kolonko et al., (2006) (A) y por Tabler y Tsagris (1990) (B). Los RNAs viroidales de polaridad positiva y negativa se representan en verde y amarillo, respectivamente.
En la familia Avsunviroidae, los sitios de inicio de la transcripción de los RNAs de polaridad
positiva y negativa del ABSVd se encuentran en regiones ricas en A+U situadas en el bucle
terminal derecho de las moléculas circulares de ambas polaridades (Fig. 10A). Estos datos se han
obtenido mediante la combinación de experimentos de adición de caperuza (“capping”) in vitro con
[α-32P] GTP y la enzima guanililtransferasa, que marca específicamente el grupo 5’ trifosfato
característico de los transcritos primarios cloroplásticos, con ensayos de protección con
ribonucleasas (Navarro y Flores, 2000). Las secuencias en torno al sitio de inicio son similares en
______________________________________________________________________Introducción
17
ambos casos y presentan cierta similitud con los promotores de la RNA polimerasa NEP, que es la
que parece catalizar la reacción (ver apartado 1.3.2.1). El análisis mediante extensión del cebador
del extremo 5’ de RNAs subgenómicos del PLMVd purificados de melocotonero, que se generarían
presumiblemente como consecuencia de la replicación, y de transcritos sintetizados mediante la
RNA polimerasa de E. coli, sitúan el sitio de inicio de la síntesis de cadenas de polaridad positiva y
negativa en el bucle terminal izquierdo (Pelchat et al., 2001; 2002) (Fig. 10B). Sin embargo las
variantes del PLMVd capaces de inducir la sintomatología calico presentan una inserción de 12-13
nucleótidos (que contiene el correspondiente determinante de patogenicidad) que se localiza en el
bucle terminal izquierdo (Malfitano et al., 2003; Rodio et al., 2006). Este resultado hace poco
probable que dicha parte de la molécula albergue el sitio de inicio, ya que la inserción produce una
cierta reordenación de su estructura secundaria. Además, estudios realizados con RNAs
monoméricos lineales de este mismo viroide purificados de tejido infectado, en los que se combinó
reacciones de marcaje in vitro de los grupos 5’ trifosfato libre con una metodología de RML-RACE
(RNA Ligase-Mediated Rapid Amplification of cDNA Ends), sitúan el inicio de transcripción de las
cadenas de polaridad positiva y negativa en la base de una horquilla de gran tamaño que pueden
adoptar los RNAs de ambas polaridades (Fig. 10C). Estos extremos 5’ se confirmaron mediante
experimentos de extensión del cebador en los que se empleó como molde RNAs monoméricos
lineales purificados de tejido infectado (Delgado et al., 2005).
CLOROPLASTO
ABSVd A3’ 3’
PLMVd
B
3’
3’
C
3’
3’
(+)(+)
(+)(+)(+)
(+)(+)(-)(-)
(-)(-)
(-)(-)
CLOROPLASTO
ABSVd A3’ 3’
PLMVd
B
3’
3’
C
3’
3’
(+)(+)
(+)(+)(+)
(+)(+)(-)(-)
(-)(-)
(-)(-)
Figura 10. Sitios de inicio de la síntesis de las cadenas de polaridad positiva y negativa propuestos para el ASBVd (Navarro y Flores, 2000) (A), y para el PLMVd (Pelchat et al., 2001; 2002; Delgado et al., 2005) (B y C). Los RNAs viroidales de polaridad positiva y negativa se representan en verde y amarillo, respectivamente.
______________________________________________________________________Introducción
18
1.3.3. Actividades enzimáticas implicadas en el corte y ligación de los intermediarios
replicativos
La segunda actividad enzimática requerida en el proceso replicativo es una RNasa capaz de
procesar los RNAs oligoméricos para generar las correspondientes formas monoméricas lineales.
En los miembros de la familia Avsunviroidae dicha actividad está contenida en las propias cadenas
de RNA, pues se trata de una ribozima y no de una enzima del huésped (Hutchins et al., 1986;
Hernández y Flores, 1992; Daròs et al., 1994; Navarro y Flores, 1997; Fadda et al., 2003a). Existen
numerosos trabajos sobre el mecanismo de corte de las ribozimas de cabeza de martillo empleando
modelos artificiales en trans que permiten el estudio de las constantes cinéticas en ausencia de
proteínas. En estos trabajos se comprobó que el corte eficiente in vitro requiere concentraciones de
magnesio entre 5 y 10 mM, cuando las concentraciones in vivo están alrededor de 0.5 mM. Esta
discrepancia, que resulta de la notable reducción que sufre la constante catalítica de las ribozimas
actuando en trans en relación a las ribozimas naturales que actúan en cis, es debida a las
modificaciones de las primeras en los bucles 1 y 2 que flanquean al centro catalítico (Khvorova
et al., 2003; De la Peña et al., 2003). Estos datos sostienen la existencia de interacciones terciarias
entre dichos bucles que podrían ayudar en la formación y estabilización del centro activo,
permitiendo la catálisis en condiciones de bajo magnesio. Además, dichas interacciones podrían
estar estabilizadas por proteínas, como sugiere la caracterización de una de ellas que facilita el
autocorte in vitro de un RNA dimérico de polaridad positiva del ASBVd (Daròs y Flores, 2002).
La actividad de las ribozimas debe estar regulada durante la replicación viroidal para así
compatibilizar el autocorte de los RNAs oligómericos con la acumulación de un cierto nivel de
RNAs monoméricos circulares necesarios como molde para las sucesivas rondas de replicación.
Con este propósito parecen operar dos mecanismos. Algunas estructuras de cabeza de martillo,
como las del ABSVd, tienen una hélice III corta de dos o tres pares de bases cerrada por un pequeño
bucle que las hace termodinámicamente inestables y provoca que el autocorte de un RNA
monomérico sea muy ineficaz. Sin embargo, en los correspondientes intermediarios replicativos
diméricos u oligómericos las secuencias de dos ribozimas consecutivas pueden formar una
estructura de doble cabeza de martillo con una hélice III extendida que promueve un autocorte muy
eficaz (Forster et al., 1988). Para aquellos RNAs monoméricos que se autocortan eficientemente
como los del PLMVd, ELVd y CChMVd, se ha propuesto un segundo mecanismo según el cual la
formación de las estructuras de cabeza de martillo se vería dificultada por la formación de una
conformación alternativa estable que no promueve el autocorte. Ambos mecanismos tienen en
común la alternancia entre dos conformaciones, una activa para el autocorte que se adoptaría
______________________________________________________________________Introducción
19
transitoriamente durante la transcripción, y otra que lo bloquea y favorece la ligación (Forster y
Symons, 1987b).
En los viroides de la familia Pospiviroidae no hay consenso acerca de si las actividades
catalíticas que mediarían el corte de los oligómeros de polaridad positiva y la ligación de los
monómeros lineales generados, residen o no en la propia molécula viroidal. En uno de los primeros
trabajos en que se defendió la existencia de una actividad ribozimática que mediaría el corte durante
el ciclo replicativo (Robertson et al., 1985), se observó que un transcrito dimérico del PSTVd era
capaz de autocortarse en una proporción entre 1-5% al incubarlo en condiciones que estimulaban el
autocorte de otros RNAs. Sin embargo, más tarde se comprobó que RNAs oligómericos de ambas
polaridades del PSTVd sintetizados in vitro eran incapaces de autocortarse o autoligarse al
incubarlos en diferentes condiciones, y que el autocorte detectado en el trabajo anterior se debía a
una contaminación de uno de los componentes del tampón de incubación (Tsagris et al., 1987b).
Trabajos posteriores demostraron el procesamiento correcto de RNAs oligómericos del PSTVd
sintetizados in vitro al incubarlos con extractos nucleares de patata, lo que sugiere la participación
de actividades enzimáticas del huésped (Tsagris et al., 1987a; Baumstark y Riesner, 1995;
Baumstark et al., 1997). Sorprendentemente también se ha observado que una ribonucleasa fúngica,
la T1, es capaz de catalizar el procesamiento correcto y completo de un transcrito del PSTVd de
longitud superior a la unitaria, sugiriendo la posibilidad de que una endonucleasa celular sea capaz
de catalizar tanto la reacción de corte como la de ligación in vivo (Tsagris et al., 1991; Steger et
al., 1992). A pesar de estos últimos estudios, algunos autores han seguido defendiendo la existencia
de ribozimas (aunque no de cabeza de martillo) en los miembros de la familia Pospiviroidae,
atribuyendo al alto número de conformaciones que la molécula de RNA viroidal puede adoptar la
dificultad para encontrar las condiciones experimentales que permitan observar el autocorte in vitro
(Symons, 1992). En esa línea, los proponentes de dicha hipótesis mostraron que un transcrito in
vitro conteniendo únicamente el dominio central del CCCVd era capaz de autocortarse en
condiciones específicas (Liu y Symons, 1998). Sin embargo, la idea mayoritariamente aceptada es
que en la familia Pospiviroidae el corte y la ligación (ver más abajo) están mediadas por dos
enzimas del huésped.
La última actividad enzimática implicada en la replicación de los RNAs viroidales es una RNA
ligasa que catalizaría la circularización de los momómeros lineales generados en la etapa anterior.
Como ya se ha mencionado, los miembros de las dos familias viroidales se replican en
compartimentos celulares diferentes. Por tanto, las RNA ligasas que median las reacciones de
circularización deben ser distintas. Ya se ha señalado en este apartado que estudios realizados sobre
el procesamiento de transcritos del PSTVd de longitud superior a la unitaria con extractos nucleares
______________________________________________________________________Introducción
20
de patata indican que la última etapa del procesamiento también estaría mediada por una enzima del
huésped. La correspondiente RNA ligasa podría tener propiedades similares a las caracterizadas en
extractos de germen de trigo (Konarska et al., 1981) y Chlamydomonas reinharditti, ya que ambas
son capaces de circularizar in vitro moléculas lineales monoméricas del PSTVd aisladas de tejido
infectado (Branch et al., 1982; Kikuchi et al., 1982) y, además, la primera actúa sobre RNAs con
extremos 5’-OH y 2’,3’-fosfodiéster cíclico consistentes con los generados por alguna RNasa
nuclear. Como los extremos producidos en las reacciones de autocorte mediadas por las ribozimas
de cabeza de martillo de los miembros de la familia Avsunviroidae son de la misma naturaleza,
también se ha presumido aquí la participación de una RNA ligasa de características similares a la de
germen de trigo, si bien de localización cloroplástica.
Aunque lo más probable es que en la etapa de circularización intervenga una RNA ligasa del
huésped, se ha observado la autoligación in vitro en ausencia de proteínas de los RNAs lineales
monoméricos del PSTVd y PLMVd obtenidos también in vitro (Baumstark et al., 1997; Lafontaine
et al., 1995). Sin embargo, el enlace fosfodiéster producido mayoritariamente en el PLMVd es 2’-5’
(Côté y Perreault, 1997) y no 3’-5’ que es el que de forma natural se halla en la práctica totalidad de
los RNAs. Un análisis posterior del enlace existente en los RNAs circulares de este viroide aislado
de tejido infectado ha mostrado que cerca de 90% de los mismos son 2’-5’ (Côté et al., 2001), lo
que ha llevado a estos autores a proponer que el mecanismo de circularización que actuaría in vivo
para el PLMVd sería autocatalítico. Sin embargo, esta clase de enlaces atípicos 2’-5’ no parecen
existir en el ASBVd (Molina-Serrano et al., datos no publicados), lo que cuestiona la hipótesis
anterior.
A lo largo de esta Introducción se han descrito los aspectos generales de mayor interés
característicos de los viroides. Como las cuestiones específicas que se abordan en esta Memoria son
el estudio del sitio de la molécula donde se produciría el procesamiento de los intermediarios
replicativos de los viroides de la familia Pospiviroidae, del motivo estructural que lo dirige, y de la
naturaleza química de los extremos del RNA monomérico y lineal producto de la reacción de corte,
a continuación se hace una presentación más detallada de estos aspectos.
22.. PPrroocceessaammiieennttoo ddee llooss oolliiggóómmeerrooss ddee ppoollaarriiddaadd ppoossiittiivvaa eenn llaa ffaammiilliiaa
PPoossppiivviirrooiidaaee
2.1. Localización subcelular
La RNA polimerasa II, la enzima implicada en la transcripción de las cadenas de los miembros
______________________________________________________________________Introducción
21
de la familia Pospiviroidae, presenta una localización nucleoplásmica. Sin embargo, estudios de
hibridación in situ con núcleos purificados de plantas de tomate infectadas con el PSTVd indican
que tanto las cadenas de polaridad positiva como negativa se localizan únicamente en el nucleolo
(Harders et al., 1989). Aunque esta observación se sugirió un posible transporte de los RNAs
viroidales desde el nucleoplasma al nucleolo (Harders et al., 1989), no hay pruebas directas que
sustenten dicha idea. Aplicando la misma técnica a cortes de tejidos infectados con otros dos
miembros de la familia se observó una localización predominantemente nuclear para los RNAs del
CEVd, y otra predominantemente nucleolar para los del CCCVd (Bonfiglioli et al., 1996). La
explicación a esta aparente paradoja se encontró estudiando la localización subcelular del PSTVd
mediante hibridación in situ, tanto en plantas infectadas de Nicotiana benthamiana y de tomate
como en cultivos celulares obtenidos a partir de las primeras (Qi y Ding, 2003b). En este estudio se
observó que los RNAs de polaridad positiva y negativa del PSTVd presentan distinta localización
subcelular: mientras que los RNAs de polaridad negativa se encuentran sólo en el nucleoplasma, los
de polaridad positiva se localizan tanto en el nucleoplasma como en el nucleolo, pero con un patrón
espacial distinto. Estos autores propusieron un modelo del ciclo replicativo de los viroides adaptado
al contexto subcelular, según el cual, la síntesis de los RNAs viroidales oligómericos de polaridad
Figura 11. Mecanismo de círculo rodante asimétrico seguido en la replicación de los miembros de la familia Pospiviroidae (Adaptado de Qi y Ding, 2003b, y Flores et al., 2005a). La molécula circular de polaridad positiva que entraría en la célula a través de los plasmodesmos, sirve de molde para la síntesis de un oligómero de polaridad complementaria que permite la síntesis de un RNA oligomérico de polaridad positiva. Dicha síntesis es catalizada por la RNA polimerasa II (RNA pol II) en el nucleoplasma. El procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva por factores del huésped podría ocurrir en el nucleoplasma y/o en el nucleolo. Los RNAs viroidales de polaridad positiva y negativa se han representado en verde y amarillo, respectivamente. Las puntas de flecha indican el sitio de corte. Los números 1, 2 y 3 denotan las etapas de transcripción, corte y ligación, respectivamente. PD y FH son las abreviaturas para plasmodesmo y factor del huésped, respectivamente.
5’
3’
5’
FH5’ 3’
5’3’
2
3
5’23
5’ 3’
RNA pol II
RNA pol II
PD 3’
1 1
NÚCLEOPLASMA
CITOPLASMA
NUCLEOLO(+)
(-)
RNA ligasa
5’
3’
5’
FH5’ 3’
5’3’
2
3
5’23
5’ 3’
RNA pol II
RNA pol II
PDPD 3’
1 1
NÚCLEOPLASMA
CITOPLASMA
NUCLEOLO(+)
(-)
RNA ligasa
______________________________________________________________________Introducción
22
positiva y negativa tendría lugar en el nucleoplasma quedando los segundos retenidos en este
compartimento en tanto que los primeros podrían ser procesados en el nucleoplasma o en el
nucleolo. Los RNAs viroidales monoméricos y circulares de polaridad positiva generados podrían
moverse entre ambos compartimentos subcelulares, y salir al citoplasma de la célula para a través
de los plasmodesmos infectar las células vecinas (Fig. 11).
El nucleolo es un buen candidato para ser el compartimento subcelular donde tendría lugar el
procesamiento de los intermediarios replicativos, pues diversos trabajos sitúan en este
compartimento el procesamiento de los RNAs ribosómicos y de transferencia (Lewis y
Tollervey, 2000). Además, se ha observado que en plantas los precursores de RNAs mensajeros
policistrónicos y de pequeños RNAs nucleolares (snoRNA) (Leader et al., 1997) son transportados
al nucleolo para su procesamiento (Shaw et al., 1998).
2.2. Sitio de procesamiento
A pesar de los numerosos estudios realizados por diversos grupos, no se ha llegado a un
consenso ni en el sitio de corte, ni en la existencia de sitios alternativos, ni en el motivo estructural
que lo dirige. La dificultad del estudio de esta etapa se debe principalmente a la baja concentración
de los intermediarios replicativos en plantas huésped infectadas, que hace imposible su aislamiento
y caracterización de un modo directo. A esta limitación hay que añadir que los RNAs viroidales
monoméricos y lineales presentes en plantas huésped infectadas forman una población heterogénea
debido a que no todos provienen del corte de los oligómeros de polaridad positiva. La rotura de los
RNAs viroidales monoméricos y circulares por puntos lábiles de la molécula por la acción de
RNasas celulares que median procesos de degradación también da lugar a RNAs monoméricos
lineales, y no existen marcadores asociados a este proceso que permitan identificar a la
subpoblación de RNAs resultantes.
Estas circunstancias han hecho necesario desarrollar estrategias que simplifiquen el estudio del
procesamiento (corte de los oligómeros y ligación de las formas monoméricas lineales generadas)
con el propósito de responder a algunas de las preguntas iniciales. A continuación se describen las
distintas metodologías que se han empleado.
2.2.1. Ensayos de infectividad in vivo
Estudios realizados por distintos grupos demostraron que tanto construcciones monoméricas de
varios miembros de la familia Pospiviroidae como ciertos transcritos derivados de las mismas no
eran infecciosos al bioensayarlos en plantas huésped. Sin embargo, las construcciones resultaban
muy infecciosas si incluían varias copias del cDNA (Cress et al., 1983; Ohno et al., 1983b; Tabler y
______________________________________________________________________Introducción
23
Sänger, 1984; Meshi et al., 1984). Estos resultados sugerían que sólo las construcciones que, como
mínimo, presentasen duplicada la región de la molécula que incluía el sitio de corte serían capaces
de generar monómeros lineales perfectos y en consecuencia infectar la planta. Así pues, la estrategia
para confirmar esta hipótesis consistió en comparar la infectividad de construcciones viroidales de
tamaño superior a la unidad pero inferior al de un dímero que diferían únicamente en la región
duplicada (Fig. 12). En ocasiones, estas duplicaciones eran consecuencia fortuita de la identidad
entre ciertas regiones de la molécula viroidal y las secuencias de los sitios de clonación múltiple de
algunos vectores.
3 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 1
1 2 3
6 5 4
2 3 4 5 6 1 22 3 4 5 6 1 2
3 4 5 6 1 2 33 4 5 6 1 2 33 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1
1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
2 3 4 5 6 1 22 3 4 5 6 1 2
2 3 4 5 6 1 22 3 4 5 6 1 2
Figura 12. Identificación del sitio de procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva de miembros de la familia Pospiviroidae mediante ensayos de infectividad. Esta estrategia se basa en que una construcción será infecciosa sólo si presenta duplicada la región que incluye el sitio de procesamiento (indicado con unas tijeras). La división en seis regiones de la estructura secundaria en varilla del viroide no tiene significado biológico; en azul se ha señalado la posición de la CCR, y en verde y naranja las secuencias que la flanquean. Las ramas superior e inferior de la estructura secundaria se indican en color oscuro y claro, respectivamente. Los cuadros coloreados corresponden a regiones del cDNA viroidal (izquierda), o a sus transcritos (derecha).
Mediante este tipo de estudios varios grupos cartografiaron el sitio de corte en la rama superior
de la CCR tras comprobar que la repetición de once nucleótidos de la misma era el tamaño mínimo
requerido para que una construcción de tamaño superior a la unidad fuera infecciosa. Además, estos
trabajos pusieron de manifiesto la importancia que tenía sobre la infectividad el sitio de apertura de
la molécula circular y las secuencias del vector adyacentes a los extremos 3’ y 5’ de los transcritos
viroidales (Tabler y Sänger, 1984; Visvader et al., 1985; Meshi et al., 1985; Hashimoto y
Machida, 1985; Candresse et al., 1990).
______________________________________________________________________Introducción
24
Más tarde, se propuso la existencia de sitios alternativos de procesamiento a partir de los
resultados de un trabajo en el que se comparó la infectividad de transcritos diméricos mutados en
posiciones específicas de la rama superior de la CCR, sintetizados a partir de cDNAs quiméricos
del PSTVd y del viroide de la planta macho del tomate (TPMVd, Tomato planta macho viroid), con
la de sus correspondientes transcritos silvestres. Ambos tipos de transcritos diméricos presentaron
una infectividad similar, y el análisis de las progenies reveló que las mutaciones no eran estables.
Estos resultados llevaron a los autores a proponer la existencia de sitios que actuarían con baja
frecuencia únicamente cuando el corte en la rama superior de la CCR diese lugar a progenies no
viables (Hammond et al., 1989b).
Sin embargo, dos trabajos realizados con el CEVd mostraron que la duplicación de una región
de la secuencia viroidal no era condición indispensable para la infectividad de una construcción. El
primer estudio puso de manifiesto que transcritos monoméricos exactos, sin ninguna repetición y
sin secuencias de vector, sintetizados in vitro y abiertos en distintos puntos de la molécula eran
infecciosos (Rigden y Rezaian, 1992). En el segundo trabajo se comparó la infectividad de varias
construcciones monoméricas que diferían entre sí en el punto por el que se había abierto la molécula
viroidal y en la diana de restricción usada para la ligación de los cDNAs en el sitio de clonación
múltiple del plásmido. Los resultados obtenidos mostraron que la infectividad de los transcritos se
correlacionaba con la capacidad de sus extremos, formados por secuencias del vector y del viroide,
para adoptar una estructura apareada (Rakowski y Symons, 1994) (Fig. 13).
3 4 5 621
1 2 3
6 5 4
4 5 6 1 2 3
3 4 5 633 44 55 6621 2211
1 2 3
6 5 4
4 5 6 1 2 34 5 6 1 2 34 5 6 1 2 3
Figura 13. La infectividad de los transcritos viroidales monoméricos depende de la capacidad de sus extremos para formar una estructura apareada que permita la proximidad física de los mismos. Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12.
2.2.2. Procesamiento in vitro
La puesta a punto de distintos sistemas para el estudio del procesamiento in vitro ha conducido a
2
______________________________________________________________________Introducción
25
varios grupos a localizar el sitio de corte en la rama superior de la CCR. La digestión controlada
con la ribonucleasa T1 de un transcrito monomérico del PSTVd seguido de una repetición de 22
nucleótidos de la rama superior de la CCR identificó dicho sitio entre los nucleótidos 80 y 81
incluidos en la región duplicada (Tsagris et al., 1991). Un año más tarde, utilizando el mismo
sistema experimental, estos autores propusieron la existencia de sitios alternativos (Tabler et al.,
1992). Sin embargo, el origen fúngico de la enzima cuestionaba la extrapolación de estos resultados
a un sistema viroide-planta huésped. Con el fin de obviar esta reserva, otro grupo puso a punto un
sistema para estudiar el procesamiento en condiciones próximas a la situación fisiológica. Los
autores del trabajo mostraron que un transcrito monomérico del PSTVd con una repetición de 17
nucleótidos de la rama superior de la CCR era procesado correctamente al incubarlo con un extracto
nuclear de patata sanas (Baumstark y Riesner, 1995), y más tarde con el mismo sistema
identificaron el sitio de procesamiento en la rama superior de la CCR entre los nucleótidos 95 y 96
(Baumstark et al., 1997).
Finalmente, un tercer trabajo cartografió el sitio de corte de los oligómeros del CCCVd en la
rama inferior de la CCR, tras comprobar que un transcrito formado únicamente por esta región de la
molécula era capaz de autocortarse bajo determinadas condiciones de desnaturalización e
incubación (Liu y Symons, 1998).
Figura 14. Análisis mediante PAGE desnaturalizante e hibridación Northern de RNAs viroidales purificados de plantas transgénicas de A. thaliana transformadas con cDNAs diméricos de polaridad positiva de distintos miembros de la familia Pospiviroidae. Carril 0, RNAs de plantas de A. thaliana no transformada. Carriles 1, 2 y 3, RNAs de tres líneas transgénicas independientes que expresan dímeros de polaridad positiva del CEVd (A), HSVd (B), CCCVd (C), ASSVd (D), CbVd-1 (E) y ASBVd (F). El tiempo de exposición no fue el mismo en todas las autorradiografías. (Reproducido de Daròs y Flores, 2004).
2.2.3 Procesamiento in vivo en Arabidopsis thaliana
Recientemente se ha demostrado que A. thaliana posee la maquinaria enzimática necesaria para
el correcto procesamiento a formas circulares de RNAs diméricos de polaridad positiva de
diferentes miembros de la familia Pospiviroidae expresados transgénicamente, si bien con una
______________________________________________________________________Introducción
26
eficiencia de procesamiento variable (Daròs y Flores, 2004) (Fig. 14). Estos resultados sugirieron
que la especificidad del sitio de corte es una característica intrínseca del RNA viroidal determinada
por su capacidad para adoptar una estructura secundaria que lo haga accesible a una RNasa celular.
Además, tal y como ocurre en plantas huésped, la maquinaria enzimática responsable del corte y
ligación en A. thaliana no actúa sobre RNAs viroidales de polaridad negativa, ya que la expresión
transgénica de un dímero de polaridad negativa del HSVd no indujo su procesamiento.
Así pues, los datos obtenidos hacen de A. thaliana una herramienta muy útil para el estudio del
procesamiento in vivo de los miembros de la familia Pospiviroidae porque, a diferencia de lo que
ocurre en plantas huésped, las formas monoméricas lineales en este sistema proceden
mayoritariamente del corte del transcrito dimérico (Fig. 15).
1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 23 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 2
1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 23 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 2
1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 23 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 2
1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 23 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 1
2 3 4 5 6 1 2
1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 11 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
Figura 15. Origen de los RNAs viroidales monoméricos y lineales en la familia Pospiviroidae. (A) En plantas huésped, los RNAs viroidales monoméricos y lineales tienen su origen en el procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva y en procesos de degradación de los RNAs monoméricos circulares que conducen a una población heterogénea en sus extremos. (B) En plantas de A. thaliana transformadas con cDNAs diméricos de distintos miembros de la familia Pospiviroidae, los RNAs viroidales monoméricos y lineales constituyen una población más homogénea en sus extremos al proceder mayoritariamente del corte de los transcritos diméricos. Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12.
2.3. Motivos estructurales implicados
2.3.1. Horquilla I/RNA bicatenario palindrómico
Los ensayos de infectividad con transcritos derivados de cDNAs monoméricos del CEVd
localizaron el sitio de procesamiento en la rama superior de la CCR (Visvader et al., 1985). El
estudio de las estructuras adoptadas por las secuencias que lo contenían condujo a estos autores a
proponer tres conformaciones, conservadas en todos los miembros de la familia, como las
responsables del reclutamiento de los factores del huésped requeridos: la estructura en varilla, la
1 2 3
6 5 4
A B
Ligación
Corte
Degradación Corte
Ligación
3 4 5 6 1 2 3
1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 1
1 2 3 4 5 6 12 3 4 5 62 3 4 5 6 1 2 21
______________________________________________________________________Introducción
27
HPI y una estructura de RNA bicatenario palindrómico que pueden adoptar los RNAs diméricos u
oligoméricos por apareamiento de las secuencias que forman la HPI.
En 1986, Diener propuso que la RNasa celular que media el corte actuaría sobre la última de
estas estructuras, basándose en su conservación y en la influencia del plásmido empleado sobre la
infectividad de un cDNA monomérico del PSTVd con extremos BamHI. El análisis de las
secuencias que flanquean el sitio de clonación permitió correlacionar la infectividad de las
construcciones con la repetición de una secuencia de la rama superior de la CCR (Tabler y
Sänger, 1984; Owens et al., 1986). Cuando la duplicación tenía una longitud de 11 nucleótidos, la
construcción era infecciosa, pero si únicamente incluía los seis primeros la infectividad era muy
baja o nula. Esta observación fue interpretada como un requerimiento para la estabilización de la
estructura adoptada transitoriamente por el RNA durante su síntesis.
U CGGA CC GGAUCC
CGCUUCAG
GGAUCC CCGGG
GAAACCUGGAGCG
1 2 3
5 46
BamHI
6 1´
34
5
6´1
5´
3´ 4´
6´1
5´
3´ 4´
A
B CAG C G GG GAAA C CU
2´BamHI94 95
C AGGGGGAAACCU
2 BamHI9495
U CGGA CC GGAUCC
CGCUUCAG
GGAUCC CCGGG
GAAACCUGGAGCG
CGCUUCAG
GGAUCC CCGGG
GAAACCUGGAGCG
1 2 3
5 46
BamHI
6 1´
34
5
6´1
5´
3´ 4´
6´1
5´
3´ 4´
6´1
5´
3´ 4´
6´1
5´
3´ 4´
A
B CAG C G GG GAAA C CU
2´BamHI94 95
C AGGGGGAAACCU
2 BamHI9495
Figura 16. (A) Estructura secundaria en varilla propuesta para el PSTVd en la que sólo se indica la secuencia que forma la horquilla I. (B) Estructura que puede adoptar un RNA dimérico del PSTVd y que dirigiría su procesamiento (Diener, 1986). Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas. Con una línea negra se enmarcan las secuencias duplicadas de seis y once nucleótidos que resultan de la clonación de un cDNA monomérico con extremos BamHI en distintos vectores (la duplicación de seis nucleótidos se ha sombreado en gris). Asimismo se indica la posición de los nucleótidos 94 y 95 entre los que podría tener lugar el corte. Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12.
Las secuencias que incluyen el sitio de corte forman parte de una región de 32 pares de bases,
algunos de ellos no canónicos (Fig. 16). Esta estructura presenta una energía libre superior a la
nativa, y su estabilidad se reduce en RNAs viroidales de tamaño inferior al de un dímero, lo que
explicaría que la repetición de seis nucleótidos no fuese infecciosa. El modelo no explica la
______________________________________________________________________Introducción
28
formación de esta estructura ni el procesamiento, aunque sugiere que el corte de los oligómeros de
polaridad positiva del PSTVd se produciría entre los nucleótidos situados en la región central de la
misma.
2.3.2. Tetrabucle GNRA
La formulación del modelo basado en el RNA bicatenario palindrómico llevó a estudiar los
requerimientos del procesamiento de un RNA de polaridad positiva del PSTVd con una duplicación
de 17 nucleótidos de la rama superior de la CCR, bien mediante incubación con RNasa T1 (Steger
et al., 1992) o con un extracto nuclear de patata sana (Baumstark y Riesner, 1995).
BamHI
1 2 3
6 5 4
A
TriH
ExR5’3’
23
456
1 2’
ExM3
45
6
1 2’ 23’
5’
BExL
6
2
5
3
4
3´5’
1 2’
2 3 4 5 6 1 22 3 4 5 6 1 2
6
25
34
3´
5´
1
2´
E
E
BamHI1 2 3
6 5 4
A
TriH
ExR5’3’
23
456
1 2’
ExR5’3’
23
456
1 2’
ExM3
45
6
1 2’ 23’
5’
ExM3
45
6
1 2’ 23’
ExM3
45
6
1 2’ 23’
5’
BExL
6
2
5
3
4
3´5’
1 2’
2 3 4 5 6 1 22 3 4 5 6 1 2
6
25
34
3´
5´
1
2´
E
E
Figura 17. (A) Estructura secundaria en varilla propuesta para el PSTVd en la que se indica la posición de la diana de restricción de la enzima BamHI. (B) Estructuras secundarias (ExL, ExR, ExM y TriH) que puede adoptar un RNA del PSTVd con extremos BamHI sintetizado a partir de un cDNA que incluye un monómero completo seguido de una repetición de 17 nucleótidos de la CCR (representado por un rectángulo coloreado a la izquierda). La transcripción del cDNA añade uno y cuatro nucleótidos en los extremos 5’ y 3’ de la secuencia viroidal, respectivamente. La letra E indica la posición del bucle E. Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12.
Análisis in silico de las estructuras secundarias que este RNA podía adoptar, junto con
experimentos de desnaturalización térmica e hibridación con oligonucleótidos (Baumstark y
Riesner, 1995), identificaron cuatro posibles conformaciones que si bien coexisten en solución
acuosa pueden promoverse específicamente con distintos tratamiento térmicos (entre -15 ºC y
______________________________________________________________________Introducción
29
90 ºC) en tampones de diversa fuerza iónica (Fig. 17). Tres de las conformaciones difieren en las
estructuras que adoptan las regiones duplicadas. Si una de las dos secuencias repetidas permanece
desapareada se denominan ExL y ExR en función de su posición en la región 3’ (“Left”) o 5’
(“Right”), mientras que si las dos secuencias repetidas interaccionan entre sí la conformación recibe
el nombre de ExM. La estructura denominada TriH (de TriHelical) es la propuesta por Diener
(1986), pero sólo presenta dos de las tres hélices debido a que no es un RNA dimérico completo
(Hecker et al., 1988).
ExME
ExL
ExMTL
Bucle GNRA
Bucle E
A AA
G
ExME
ExL
ExMTL
Bucle GNRA
Bucle E
A AA
G
Figura 18. Estructuras secundarias que puede adoptar un RNA del PSTVd con una repetición de 17 nucleótidos de la rama superior de la CCR sintetizado a partir de un cDNA monomérico con extremos BamHI. Las conformaciones ExL y ExME incluyen el denominado bucle E, cuya secuencia y estructura aparece ampliada en la parte superior. La conformación ExMTL está formada por tres horquillas cuyas secuencias y estructuras se muestran ampliadas. Los nucleótidos característicos de los distintos motivos se representan en letra hueca, las estrellas indican interacciones no canónicas, y la línea en forma de S señala los nucleótidos G98 y U260 que se entrecruzan mediante irradiación con luz UV. Tan sólo la conformación ExMTL es procesada cuando se incuba con un extracto nuclear de patata sana. El punto de corte se indica con una punta de flecha negra en la horquilla con el tetrabucle GNRA y blanca en el bucle E. (Adaptado de Baumstark et al., 1997). Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12.
______________________________________________________________________Introducción
30
Los resultados de la incubación de cada una de estas estructuras con un extracto nuclear condujo
a proponer la conformación ExM como la única activa para el procesamiento in vitro (Baumstark y
Riesner, 1995). Esta estructura es metaestable en las condiciones de temperatura y sal en las que se
realizó el ensayo, y sólo en presencia de las proteínas del extracto nuclear se impide su transición a
la conformación ExL que es la termodinámicamente más estable.
En trabajos previos in vitro se había descrito que la radiación ultravioleta induce un
entrecruzamiento entre los nucleótidos G98 y U260 del PSTVd que forman parte del denominado
bucle E (Branch et al., 1985). Debido a su proximidad al posible sitio de corte, y con el propósito de
definir mejor el motivo estructural que dirige el procesamiento, se exploró la presencia del bucle E
en cada una de las conformaciones que puede adoptar el RNA del PSTVd con la repetición de 17
nucleótidos. El análisis de los RNAs previamente irradiados reveló que el bucle E estaba presente
únicamente en la conformación ExL pero no en la ExM que también debería contenerlo (Fig. 17).
Esta discrepancia se explicó por la distinta composición de los tampones empleados para el
procesamiento y el entrecruzamiento in vitro, con y sin Mg2+, respectivamente. Un nuevo análisis
in silico de la conformación ExM, con la restricción de no formar el bucle E, identificó una
conformación alternativa ramificada con un tetrabucle GNRA (ExMTL). La repetición de los
experimentos de irradiación con luz UV en presencia de Mg2+ permitió observar que la transición
de la conformación ExMTL a la ExME (el superíndice indica la presencia del bucle E) no está
favorecida cinéticamente y una vez el RNA adopta esta última, que presenta el bucle E, evoluciona
lentamente a la conformación ExL (Fig. 18) (Baumstark et al., 1997).
EE
Corte en 5’Corte en 5’
5’
E
5’
E
Corte en 3’Corte en 3’
5’3’
E
5’3’
E
LigaciónLigación
AA
AG AA
AG
Figura 19. Mecanismo propuesto para el procesamiento de los intermediarios replicativos del género Pospiviroide (adaptado de Baumstark et al., 1997). El RNA viroidal adopta una conformación ramificada con un tetrabucle GNRA que dirige el primer corte que ocurre en la región 5’ de la molécula. La liberación del fragmento cortado induce un cambio conformacional en el RNA, que pasa a adoptar una estructura en varilla estabilizada por el bucle E, donde la región 3’ del RNA interacciona sólo parcialmente con la secuencia enfrentada de la rama inferior de la CCR. Sobre esta estructura tiene lugar el segundo corte. Los extremos 5’ y 3’ del RNA quedan enfrentados, lo que facilita su unión por una RNA ligasa. La letra E indica la posición del bucle E. Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12.
______________________________________________________________________Introducción
31
La conservación del tetrabucle GNRA en todos los viroides del género Pospiviroide y los
análisis del procesamiento in vitro condujeron a proponer un modelo según el cual la especificidad
del corte de los intermediarios replicativos ocurre entre los nucleótidos 95 y 96 (Fig. 18), y está
dirigida por la estructura ramificada con un tetrabucle GNRA que subsiguientemente cambia a una
conformación extendida con el bucle E que promueve la ligación (Fig. 19) (Baumstark et al., 1997).
G CG CC GC G
-----
G CG CC GC G
-----
ExL ExMTL
Bucle E3’
5’
5’
3’
A AUC
G C
U C259
.. .. .. ....A AUC
G C
U C259
.... .... .... ........
Figura 20. Estructuras secundarias que puede adoptar un RNA del PSTVd formado únicamente por el dominio central (C) y una repetición de 17 nucleótidos de la rama superior de la CCR. La conformación ExL es la más estable termodinámicamente y la ExMTL la más favorable cinéticamente. En el bucle E, la línea en forma de S señala los nucleótidos que se entrecruzan mediante irradiación con luz UV y las letras huecas señalan las posiciones mutadas en el estudio. Los guiones representan las interacciones canónicas Watson-Crick y los dos puntos interacciones no canónicas. El código de colores empleado se detalla en el pie de la Fig. 12.
Con la intención de determinar la importancia de cada uno de los elementos estructurales
identificados, se estudió el efecto de una serie de mutaciones (que afectan a nucleótidos del bucle E,
del tetrabucle GNRA o del par G:U que precede al sitio de corte) sobre el procesamiento de un
RNA del PSTVd al incubarlo con un extracto nuclear de patata sana (Schrader et al., 2003). En esta
ocasión se empleó un mini-RNA sintetizado in vitro formado únicamente por el dominio central del
PSTVd y la duplicación de 17 nucleótidos de la rama superior de la CCR (Fig. 20). Con este mini-
RNA se observó que la CCR contiene todos los requerimientos estructurales y funcionales
necesarios para el procesamiento, ya que la incubación de este transcrito estabilizado en su
conformación activa con el extracto nuclear generó RNAs monoméricos lineales y circulares. El
análisis de los mutantes mostró que: i) el tetrabucle GNRA es esencial para el procesamiento al
estabilizar la conformación ExMTL, ii) el par G:U contribuye al reconocimiento del sitio de corte en
la región 5’, iii) la C259, único nucleótido desapareado del bucle E (Fig. 20), es esencial para la
ligación de los extremos 3’ y 5’, y iv) la estabilidad de las conformaciones ExL y ExMTL son
importantes para el procesamiento. El modelo propuesto, sin embargo, tan sólo es válido para los
viroides del género Pospiviroide al ser los únicos que presentan el bucle E y la posibilidad de
______________________________________________________________________Introducción
32
adoptar la estructura ramificada con un tetrabucle GNRA.
33.. FFaammiilliiaa ddee llaass rriibboonnuucclleeaassaass IIIIII
3.1. Papel en la regulación génica
Las ribonucleasas III (Drider y Condon, 2004; Gan et al., 2006; Ji, 2006; MacRae y
Doudna, 2007) constituyen una familia de endoribonucleasas específicas de RNAs de doble cadena
(dsRNA) presentes en todos los organismos, excepto en arqueobacterias, que desempeñan funciones
importantes en el procesamiento del RNA (Robertson et al., 1968) y en el control de la expresión
génica postranscripcional (Court, 1993; Krainer, 1997; Wu et al., 2000). Por ejemplo, las RNasas
III de bacterias pueden controlar la expresión génica a través de dos vías distintas: por su actividad
catalítica o como proteínas de unión a RNA. El primer tipo de control lo ejercen a través de la
degradación de dsRNAs, naturales o artificiales, en pequeños fragmentos de doble cadena con un
tamaño entre 10 y 18 pares de bases (Robertson y Dunn, 1975; Dunn, 1982; Robertson, 1982;
Court, 1993). El segundo tipo de control lo realizan modificando con su unión la estructura de
ciertos RNAs mensajeros (mRNA) con el propósito de suprimir o activar su expresión (Altuvia
et al., 1987; Calin-Jageman y Nicholson, 2003a). Pero el gran interés despertado por los
componentes de esta familia se debe a la implicación de algunos de ellos en el proceso de
interferencia de RNA (Bernstein et al., 2001; Carthew, 2001).
3.2. Clasificación
Los miembros de esta familia se caracterizan por: i) la presencia en el dominio con actividad
nucleolítica (endoNs) del motivo ERLEFLGD, ii) la estructura αβββα de su dominio de unión a
dsRNA (dsRBD), y iii) la generación de productos con extremos 5’-P y 3’-OH, éste último
protuberante en dos nucleótidos. En función de la complejidad de la cadena polipeptídica, la familia
se divide en cuatro clases cuyos miembros tipo son la RNasa III de E. coli (Robertson et al., 1968),
Rnt1p de Saccharomyces cerevisiae (Elela et al., 1996), Drosha de Drosophila melanogaster (Lee
et al., 2003) y Dicer de Homo sapiens (Provost et al., 2002) (Fig. 21).
La clase 1 incluye a las enzimas bacterianas que presentan en la región N-terminal un único
dominio endoNs y en la C-terminal un dominio dsRBD. Las proteínas de la clase 2, además de los
dominios existentes en las enzimas bacterianas, tienen una región N-terminal altamente variable de
aproximadamente 200 aminoácidos; a esta categoría pertenecen las RNasas III de hongos. La clase
3 la forman exclusivamente proteínas de origen animal. Su representante, Drosha, contiene una
región N-terminal de aproximadamente 900 aminoácidos seguida de dos dominios endoNs y un
______________________________________________________________________Introducción
33
dominio dsRBD. La región N-terminal de los homólogos de humanos y ratón incluye dos motivos
de unión proteína-proteína, una región rica en prolinas (PRR) y otra rica en serinas y argininas
(RS). La clase 4 representada por la Dicer humana tiene homólogos en Schizosaccharomyces
pombe, plantas y animales. La proteína Dicer humana presenta dos dominios endoNs, un dominio
dsRBD y una región N-terminal de aproximadamente 1500 aminoácidos que incluye tres dominios
más: el primero con actividad RNA helicasa (DExD/H-box), el segundo de función desconocida
(DUF283, Domain of Unknown Function) y el último implicado en el reconocimiento del extremo
3’ del RNA (PAZ, Piwi-Argonaute-Zwille).
dsRBDendoNsHelicasa RSPRR PAZDUF283
Clase 1
Clase 2
Clase 3
Clase 4
dsRBDdsRBDendoNsendoNsHelicasaHelicasa RSRSPRRPRR PAZPAZDUF283DUF283
Clase 1
Clase 2
Clase 3
Clase 4
Figura 21. Dominios presentes en las proteínas pertenecientes a la familia de las ribonucleasas III. Estas enzimas se clasifican en cuatro clases en función de la complejidad de la cadena polipeptídica cuyos miembros tipos son: la RNasa III de E coli, Rnt1p de S. cerevisiae, Drosha de D. melanogaster y Dicer de H. sapiens, respectivamente. El significado de las abreviaturas es: helicasa (dominio con actividad helicasa), PRR (región rica en prolinas), DUF283 (dominio de función desconocida), RS (región rica en serinas), PAZ (Piwi-Argonaute-Zwille), endoNs (dominio con actividad nucleolítica) y dsRBD (dominio de unión a RNA de doble cadena).
3.3. Substratos
3.3.1. Clase 1
Los sustratos típicos de la RNasa III de E. coli son RNAs celulares o víricos que incluyen en su
secuencia dos segmentos complementarios capaces de formar un dsRNA (Paddock et al., 1976;
Young y Steitz, 1978). Estudios in vitro han demostrado que esta enzima es capaz de cortar
cualquier dsRNA independientemente de su secuencia (Robertson, 1982). Sin embargo, in vivo, las
enzimas de esta clase reconocen determinados elementos en sus sustratos que dirigen la actividad
catalítica hacia posiciones específicas de los mismos. A pesar de los múltiples estudios realizados,
no existe un consenso acerca de la secuencia diana reconocida por la RNasa III de E. coli, aunque se
______________________________________________________________________Introducción
34
sabe que dsRNAs con conformación A y que adoptan estructuras secundarias en horquilla son
cortados eficazmente si el tallo de la misma está perfectamente apareado y tiene una longitud de al
menos dos vueltas de hélice. Si bien la enzima en condiciones estándar cataliza el corte de las dos
cadenas del RNA, la presencia de bucles internos puede provocar que el corte ocurra únicamente en
una de ellas (Calin-Jageman y Nicholson, 2003b). También se han identificado determinadas
secuencias que dificultan la unión de la ribonucleasa (Zhang y Nicholson, 1997; Conrad y
Rauhut, 2002).
3.3.2. Clase 2
La enzima más estudiada de esta clase es Rnt1 de S. cerevisiae. Rnt1 participa en la regulación
de determinados mRNAs (Nin-Kreiselman et al., 2003), en el procesamiento de los precursores de
los rRNAs (pre-rRNAs) y pequeños RNAs nucleares y nucleolares (snRNAs y snoRNA,
respectivamente) (Chanfreau et al., 1998; Henras et al., 2004), y en el control de la longitud de los
telómeros (Larose et al., 2007). Diversos estudios han identificado dos tetrabucles del tipo (A/U)
GNN (Wu et al., 2001; Lebars et al., 2001) y AAGU (Ghazal y Elela, 2006) como los
determinantes que serían reconocidos por el dominio dsRBD de la enzima y la posicionaría, pues el
corte se produce siempre a una distancia fija entre 14 y 16 pares de bases a partir de los tetrabucles.
3.3.3. Clase 3
La enzima Drosha de D. melanogaster está implicada en la maduración de unos pequeños RNAs
denominados microRNAs (miRNAs) que actúan como reguladores de la expresión génica (Lee
et al., 2003). La proteína ortóloga de humanos participa además en el procesamiento de los pre-
rRNAs (Wu et al., 2000). Las ribonucleasas de esta clase reconocen específicamente a sus sustratos
sólo si están asociadas a una segunda proteína, que se une específicamente a regiones del RNA
flanqueadas por secuencias de simple y doble cadena y posiciona al dominio endoNs.
3.3.4. Clase 4
Las enzimas tipo Dicer participan en el silenciamiento específico de ciertos genes mediante la
degradación de dsRNAs en pequeños fragmentos de doble cadena de entre 21 y 27 pares de bases
(Bernstein et al., 2001). Se presume que el tamaño constante y definido de los productos de las
ribonucleasas de esta clase viene determinado por la unión del dominio PAZ al extremo 3’ del
RNA, que sitúa al dominio endoNS en el punto de corte al estar unidos ambos por una hélice de
tamaño definido (Song et al., 2003; Lingel et al., 2003; Yan et al., 2003; Ma et al., 2004).
______________________________________________________________________Introducción
35
3.4. Mecanismo de corte
La reciente cristalización del complejo entre la ribonucleasa III bacteriana de Aquifex aeolicus y
su producto de reacción ha revelado un complejo altamente simétrico en el que: i) la especificidad
de sustrato está dirigida por los dominios dsRBD y endoNs, ii) la unión de la enzima al RNA está
controlada por el dominio dsRBD, iii) la asociación de dos dominios endoNs es esencial para la
formación de un centro catalítico activo, iv) la interacción entre el RNA y la proteína está mediada
por cuatro motivos de unión al RNA en la proteína (RBM) y tres cajas en el RNA (Gan et al., 2006)
(Fig. 22A).
D
M
P
P
M
D
RBM4
RBM2
RBM3
RBM1
Subunidad2
Subunidad1
RBM4
RBM2
RBM3
RBM1
Corte 2
Corte 1
3’ 5’
RNA
RNasa III
R+10
R+5
R-10
R-5
R+1
R0
R-1
R-1
R0
R+1
R-5
R+5
R+10
R-10
D
M
P
P
M
D
RBM4
RBM2
RBM3
RBM1
endoNS2dsRBD
endoNS1
RBM4
RBM3
Corte 2
Corte 1
3’ 5’
RNA
Dicer
R+10
R+5
R-10
R-5
R+1
R0
R-1
R-1
R0
R+1
R-5
R+5
R+10
R-10
A B
D
M
P
P
M
D
RBM4
RBM2
RBM3
RBM1
Subunidad2
Subunidad1
RBM4RBM4
RBM2RBM2
RBM3RBM3
RBM1RBM1
Corte 2
Corte 1
3’ 5’
RNA
RNasa III
R+10
R+5
R-10
R-5
R+1
R0
R-1
R-1
R0
R+1
R-5
R+5
R+10
R-10
D
M
P
P
M
D
RBM4
RBM2
RBM3
RBM1
endoNS2dsRBD
endoNS1
RBM4RBM4
RBM3RBM3
Corte 2
Corte 1
3’ 5’
RNA
Dicer
R+10
R+5
R-10
R-5
R+1
R0
R-1
R-1
R0
R+1
R-5
R+5
R+10
R-10
A B
Figura 22. Interacciones entre las RNasas III y un RNA de doble cadena (reproducido de Gan et al., 2006). Las elipses representan los motivos de unión al RNA presentes en la proteína (RBM1, RBM2, RBM3 y RBM4), los rectángulos negros las cajas de unión a la proteína presentes en el RNA, distal (D), proximal (P) y media (M), y los rectángulos verdes o rojos con la letra R las bases del RNA numeradas de 0 a 10 comenzando desde la situada en el extremo 5’ tras el corte del RNA (indicado con una flecha) y asignando el signo + o – a los nucleótidos situados a un lado u otro del sitio de corte. (A) Interacciones entre la RNasa III de Aquifex aeolicus y un RNA de doble cadena que adopta una estructura secundaria en horquilla. En verde y rojo se indican las interacciones entre las subunidades de la proteína y las cadenas del RNA. (B) Interacciones entre la enzima Dicer y un RNA de doble cadena. En verde se ha representado el dominio endonucleolítico 1 (endoNS1), y en rojo el endoNS2 y el dominio de unión a RNA (dsRBD).
______________________________________________________________________Introducción
36
Las tres cajas de interacción con la proteína, situadas en el RNA en la región delimitada por los
10 pares de bases adyacentes al punto de corte, se denominan: proximal (a un nucleótido del punto
de corte), distal (formada por los dos últimos pares de bases) y media (constituida por los dos pares
de bases que separan las cajas anteriores). De los cuatro motivos RBM, los dos primeros se
incluyen en el dominio dsRBD (de estructura αβββα) y los dos segundos en el dominio endoNS
(formado por una α-hélice 310). RBM1 está formado por la primera hélice α, RBM2 por el bucle
que conecta la primera y segunda hoja β, RBM3 por la región N-terminal de la cuarta hélice α, y
RBM4 por el bucle que une las hélices α 5 y 6. Aunque los cuatro motivos son importantes, RBM1
parece ser el más crítico tanto en el reconocimiento como en la unión al dsRNA, y es posible que
también participe en la organización del centro activo al interaccionar con la caja proximal del
RNA. Las interacciones que se establecen entre RBM3 y el RNA determinan el punto de corte y
facilitan la conformación del centro activo. RBM2 y RBM4 interaccionan con las cajas media y
distal del RNA, respectivamente. Debido a que la distancia entre RBM3 y RBM4 es fija, el sitio de
unión del segundo puede tener un papel importante en determinar el sitio de corte (Fig. 22A y 23).
Figura 23. Estructura del complejo formado entre la ribonucleasa bacteriana de Aquifex aecolius y su producto de reacción. El RNA de doble cadena se representa en gris, y los motivos de unión al RNA de la proteína se indican en rojo (RBM1 y RBM2) y azul (RBM3 y RBM4). Las esferas en púrpura simbolizan iones metálicos divalentes implicados en la reacción de corte. (Reproducido de MacRae y Doudna, 2007).
______________________________________________________________________Introducción
37
El mecanismo de formación del complejo entre la enzima y el RNA ocurriría en tres etapas: i) la
enzima se une al RNA a través de RBM1 y RBM2 de uno de los dsRBD, ii) el dsRBD aproxima el
RNA al endoNDs, permitiendo a RBM3 y RBM4 reconocer el sustrato, y iii) la unión de un
segundo dsRBD coloca al sustrato en la posición correcta e impide su movimiento (Gan
et al., 2006). Aunque la unión del complejo no tenga lugar por este mecanismo, las interacciones
entre el RNA y la proteína indican que RBM1 y RBM2 tienen un papel dominante en el
reconocimiento y en la unión a los dsRNAs, mientras que RBM3 y RBM4 seleccionan
específicamente alguno de ellos y determinan el sitio de corte.
Cuando las enzimas se unen a dsRNA largos, como mínimo de 22 pares de bases, RBM3 y
RBM4 de las dos subunidades actúan conjuntamente en la identificación del sustrato y en la
determinación del sitio de corte en ambas cadenas del RNA. Cuando se unen a RNAs de menor
tamaño, una subunidad proporciona a RBM1 y RBM3, y la otra a RBM2 y RBM4. A pesar de que
la secuencia aminoacídica de los RBM puede no estar conservada, sí que parece estarlo el patrón de
las interacciones entre ellos y las tres cajas del RNA. La estructura del complejo entre la
ribonucleasa III y el RNA indica que se produce un único corte en cada una de las cadenas dentro
de cada sitio activo, por lo que la dimerización del endoNs es esencial para la función de la
RNasa III. Las proteínas Drosha y Dicer presentan dos endoNs capaces de formar entre ellos una
asociación intramolecular, pero sólo uno de ellos parece ser necesario para el reconocimiento y la
unión a un dsRNA (Han et al., 2004; Zhang et al., 2004; MacRae et al., 2006) (Fig. 22B).
44.. RRNNAA lliiggaassaass
La identificación en la mayoría de los grandes fila de actividades enzimáticas que catalizan la
unión de moléculas de RNA a través de la formación de un enlace fosfodiéster (RNA ligasas), es
una medida de la importancia que tienen estos procesos de ligación y reparación del RNA. Las
RNA ligasas, junto a las DNA ligasas y las enzimas implicadas en la adición de caperuza (cap) a los
mRNA constituyen la superfamilia de las nucleotidil transferasas.
Hasta la fecha se han identificado dos familias de RNA ligasas, denominadas Rnl1 y Rnl2,
aunque recientemente se ha propuesto una tercera llamada DraRnl (Raymond y Shuman, 2007). La
familia Rnl1, con una distribución filogenética restringida a algunos eucariotas y a virus de los
mismos, incluye a la RNA ligasa 1 del bacteriófago T4 (Silber et al., 1972; Wang et al., 2003) y a
las tRNA ligasas de hongos (Westaway et al., 1988) y plantas (Pick et al., 1986; Pick y
Hurwitz, 1986; Englert y Beier, 2005). Las enzimas de esta primera familia están implicadas en la
reparación de pequeñas mellas en regiones de simple cadena de los RNAs de transferencia (tRNA),
______________________________________________________________________Introducción
38
o en la región codificante de RNAs mensajeros, producidas por endonucleasas específicas de
secuencia involucradas en: i) procesos de modificación del RNA como la eliminación de los
intrones de los precursores de los tRNAs (Abelson et al., 1998), y ii) mecanismos de respuesta
activados por infecciones virales (Amitsur et al., 1987), o por la acumulación de proteínas plegadas
incorrectamente en el retículo endoplásmico (Sidrauski et al., 1996).
La familia Rnl2, presente en los tres dominios filogenéticos, incluye a la RNA ligasa 2 del fago
T4 y a las RNA ligasas implicadas en la edición de los mRNAs de los kinetoplastidios (Ho y
Shuman, 2002). Las enzimas de la segunda familia son capaces de reparar mellas en RNAs
bicatenarios (Blanc et al., 1999; Palazzo et al., 2003; Nandakumar et al., 2004).
La familia DraRnl se limita a bacterias y a bacteriófagos, aunque se ha propuesto la existencia
de proteínas homólogas en eucariotas. Sólo se ha caracterizado la RNA ligasa de
Deinococcus radiodurans y hasta el momento se desconoce su función. Los estudios bioquímicos
realizados sugieren que esta RNA ligasa se parece a la Rnl2 desde el punto de vista funcional, pero
se diferencia en que la reacción de ligación intermolecular está favorecida respecto a la
circularización (Raymond y Shuman, 2007).
A continuación de detallan las principales características de las RNA ligasas utilizadas en esta
Memoria.
4.1. RNA ligasa 1 del fago T4
La RNA ligasa 1 del fago T4 (Rnl1) (Uhlenbeck, 1983; Wang et al., 2003), cataliza la
formación de un enlace 3’,5’-fosfodiéster entre extremos 5’-P y 3’-OH del RNA mediante una
reacción enzimática que transcurre en tres etapas y requiere ATP como fuente de energía. En la
primera etapa tiene lugar el ataque de una lisina del centro activo al fósforo α de la molécula de
ATP, provocando la formación de un intermediario enzimático covalentemente adenilado y una
molécula de pirofosfato. A continuación se forma un intermediario de RNA adenilado por la
transferencia de la molécula de AMP desde la enzima al extremo 5’ del RNA. Finalmente, se
produce la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo 3’-OH y el extremo 5’ del RNA
adenilado, a la vez que se libera la molécula de AMP (Fig. 24A).
La función in vivo de la enzima Rnl1 es la reparación del corte producido en el bucle del
anticodón del tRNA de la lisina de E. coli por la endonucleasa bacteriana ACNasa. Este corte
resulta de la activación de un mecanismo de defensa ante la infección por el fago. La actividad de la
endonucleasa sobre el tRNA produce una mella con extremos 5’-OH y 2’,3’-fosfodiéster cíclico que
no pueden ser ligados por la Rnl1. El fago responde con una enzima que modifica los extremos del
tRNA y que contiene tres actividades: 2’,3’ ciclo-fosfodiesterasa, 3’ fosfatasa y polinucleótido
______________________________________________________________________Introducción
39
quinasa. Esta enzima multifuncional abre el enlace cíclico, elimina el grupo fosfomonoéster
presente en el extremo 3’ de la molécula del RNA, y transfiere el fosforilo γ de la molécula de ATP
al extremo 5’-OH del RNA (Uhlenbeck, 1983; Amitsur et al., 1987; Galburt et al., 2002)
(Fig. 24A).
EpA
E
Appp
pp
P
OH
OH
OH
OH+
P
P
5’
2’
3’OH
P+
+OH P
OH+
OH
P
OH
Appp
App
PNK
Rnl1
EpA
E
Appp
pp
tRNAligasa
P
OH
OH+
Gpp
Gppp
Gpp
Gppp
P
P
OH+
Ap-P
OH
OH+
P
OHAp-P+
Ap Ap
5’
2’
3’OH
P+Endo Endo
A B
Figura 24. Actividades enzimáticas implicadas en la ligación de los tRNAs. (A) La infección del fago T4 induce en E. coli el corte del tRNA de la lisina por una endonucleasa (endo) que da lugar a dos RNAs con extremos 5’-OH y 2’,3’-fosfodiéster cíclico, que no pueden ser ligados por la RNA ligasa 1 (Rnl1) del fago que actúa únicamente sobre RNAs con extremos 5’-P y 3’-OH. Ante esta situación el fago responde con la T4 polinucleótido quinasa (PNK) que contiene tres actividades enzimáticas (2’,3’ ciclo-fosfodiesterasa, 3’ fosfatasa y polinucleótido quinasa propiamente dicha) necesarias para modificar los extremos y que éstos puedan ser ligados por Rnl1. (B) En eucariotas la eliminación de los intrones de los tRNAs difiere del mecanismo anterior en que la ligación de las dos mitades del tRNA genera un grupo 2’-fosfomonoéster, 3’,5’- fosfodiéster, y en que todas las actividades implicadas en la unión residen en la tRNA ligasa, incluida la 2’ fosfotransferasa necesaria para la eliminación del grupo fosforilo en posición 2’ en el producto final. La letra E es una abreviatura de enzima y el asterisco indica la procedencia del grupo fosforilo retenido en el producto de ligación.
______________________________________________________________________Introducción
40
4.2. tRNA ligasas de plantas y Saccharomyces cerevisiae
En un estudio con extractos de germen de trigo se descubrió una actividad enzimática capaz de
ligar intramolecularmente un RNA de 70 nucleótidos con extremos 2’,3’-fosfodiéster cíclico y 5’-P
ó 5’-OH dando lugar a un grupo atípico 2’-fosfomonoéster, 3’,5’-fosfodiéster (Konarska
et al., 1981; 1982). Más tarde se comprobó que la estructura de los substratos y de los productos
implicados en la reacción catalizada por la tRNA ligasa de S. cerevisiae eran los mismos que los de
la enzima de germen de trigo, y que la función de la tRNA ligasa de levadura in vivo era la
eliminación de los intrones presentes en los precursores de los tRNAs nucleares (pre-tRNAs) (Greer
et al., 1983).
Aunque la eliminación de los intrones implica las mismas actividades enzimáticas en todos los
eucariotas, a continuación se detalla el mecanismo que tiene lugar en S. cerevisiae por ser uno de
los más estudiados. El proceso se inicia con la actuación de una endonucleasa que libera al intrón y
divide al tRNA en dos mitades con extremos 5’-OH y 2’,3’-fosfodiéster cíclico. La ligación de estos
extremos transcurre en tres etapas en las que la tRNA ligasa (Phizicky et al., 1986; Apostol
et al., 1991; Sawaya et al., 2003): i) abre el enlace 2’,3’-fosfodiéster cíclico mediante su actividad
ciclofosfodiesterasa dando lugar a grupos 2’-P y 3’-OH, ii) fosforila el grupo 5’-OH gracias a su
actividad quinasa dependiente de GTP, y iii) tras ser adenilada transfiere el grupo AMP al extremo
5’-P del RNA a la vez que une las dos mitades del tRNA generando enlaces 2’ fosfomonoéster,
3’,5’-fosfodiéster mediante su actividad adeniltransferasa (Fig. 24B).
Las tres actividades descritas en la enzima de S. cerevisiae se identificaron en un estudio in vitro
de la tRNA ligasa de A. thaliana, sugiriendo su implicación in vivo en la eliminación de los intrones
de los pre-tRNAs, aunque no pueden excluirse otras funciones.
OObbjjeettiivvooss
41
42
________________________________________________________________________Objetivos
43
OObbjjeettiivvooss
En la presente Tesis se han realizado una serie de trabajos encaminados a profundizar en el
estudio del procesamiento de los RNAs oligómericos de polaridad positiva de los miembros de la
familia Pospiviroidae durante su replicación. Como sistemas experimentales se han utilizado
plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con cDNAs diméricos del CEVd, HSVd y ASSVd,
así como plantas huésped infectadas por cada uno de los viroides. Los objetivos específicos
planteados han sido:
I) Cartografiar el sitio de corte de los RNAs oligómericos de polaridad positiva de los tres
viroides mediante la determinación del extremo 5’ de las formas viroidales monoméricas y lineales
aisladas de plantas transgénicas y de plantas huésped.
II) Estudiar los motivos estructurales implicados en las etapa de corte y ligación del ciclo
replicativo mediante la generación de líneas de A. thaliana transformadas con cDNAs diméricos del
CEVd mutados en posiciones específicas.
III) Determinar los grupos químicos presentes en los extremos de los RNAs viroidales
monoméricos y lineales procesados in vivo con el fin de aportar datos acerca de las enzimas
involucradas en las etapas de corte y ligación del ciclo replicativo.
44
MMaatteerriiaalleess yy MMééttooddooss
45
46
_______________________________________________________________Materiales y métodos
47
11.. MMaatteerriiaall bbiioollóóggiiccoo
1.1. Plantas
Como fuente de tejido infectado con el CEVd, HSVd y ASSVd se utilizaron hojas de
Gynura aurantiaca DC., hojas de Cucumis sativus L. y frutos de Malus domestica Borkh,
respectivamente. Como tejido sano se emplearon hojas o frutos, dependiendo del viroide, de plantas
del mismo cultivar exentas de la enfermedad.
Para la expresión de dímeros de polaridad positiva o negativa de distintos miembros de la
familia Pospiviroidae se emplearon plantas de Arabidopsis thaliana del ecotipo Columbia 0.
Algunas de las líneas transgénicas de A. thaliana utilizadas en la caracterización del extremo 5’ de
los correspondientes RNAs monoméricos lineales se describieron en un trabajo previo (Daròs y
Flores, 2004), mientras que otras se generaron durante la realización del presente estudio. Las
plantas se cultivaron en cámaras, a 20-22 ºC con iluminación fluorescente y fotoperiodo de día
largo (16 h de luz, 8 h de oscuridad), o en invernadero con luz natural y una temperatura en torno a
25 ºC.
Para el cultivo in vitro de plántulas de A. thaliana, las semillas se esterilizaron con un
tratamiento de hipoclorito sódico al 50% y Triton X-100 al 0.02% durante 7 min, seguido por cinco
lavados con agua estéril. A continuación, las semillas se sembraron en placas Petri con medio MS
(Murashige y Skoog, 1962) suplementado con agar (0.8%), MES (0.05%) y sacarosa (1%). Para la
selección de las plantas transgénicas se añadió al medio kanamicina (100 mg/l).
Con objeto de favorecer y sincronizar su germinación, las semillas se mantuvieron en agua
estéril un mínimo de 72 h a 4 ºC antes de ser transferidas a cámaras de cultivo in vitro. Las
plántulas resultantes se cultivaron en estas condiciones durante aproximadamente una semana y se
transfirieron a un sustrato compuesto por turba, vermiculita y perlita (2:1:1). Tras 24 h en
condiciones de alta humedad para favorecer su enraizamiento, se continuó el cultivo en las
condiciones antes descritas.
1.2. Bacterias
1.2.1. Escherichia coli
Para la propagación y purificación de plásmidos se utilizó la cepa E. coli DH5α, que se creció
en medio Luria-Bertani (LB) líquido o en placa en presencia del antibiótico adecuado (ampicilina
50 mg/l o kanamicina 100 mg/l) a 37 ºC durante una noche.
1.2.2. Agrobacterium tumefaciens
Se utilizó la cepa C58C1 de A. tumefaciens tanto para las transformaciones estables de
_______________________________________________________________Materiales y métodos
48
A. thaliana como para las transformaciones transitorias de Solanum lycopersicum L. cv. Rutgers y
G. aurantiaca. En ambos casos se creció en medio LB en presencia de los antibióticos adecuados
(kanamicina 100 mg/l y rifampicina 50 mg/l) a 28 ºC.
22.. EEnnssaayyooss bbiioollóóggiiccooss ddee iinnffeeccttiivviiddaadd
Los bioensayos con RNA monomérico circular del CEVd y HSVd se realizaron sobre plantas de
S. lycopersicum y C. sativus, respectivamente, cultivadas con ciclos de 32 °C y 16 h de luz y a
27 ºC y 8 h de oscuridad. La inoculación se realizó sobre los cotiledones de las plantas de
S. lycopersicum o sobre las dos primeras hojas verdaderas de las plantas de C. sativus, previamente
espolvoreadas con un agente abrasivo (carborundum), extendiéndose el inóculo con ayuda de una
punta de pipeta. Los inóculos se prepararon en presencia de tampón K2HPO4 50 mM. Para el
bioensayo de cada muestra se utilizaron bloques de tres plantas, incluyendo siempre un bloque
inoculado sólo con tampón como control negativo, y otro inoculado con RNAs monoméricos
circulares del CEVd o HSVd purificados de G. aurantiaca o de C. sativus, respectivamente, como
control positivo. Los síntomas en los controles positivos aparecieron aproximadamente a los 21 días
después de la inoculación.
33.. EExxttrraacccciióónn yy ppuurriiffiiccaacciióónn ddee áácciiddooss nnuucclleeiiccooss
3.1. Preparación de ácidos nucleicos totales
La obtención de ácidos nucleicos totales a partir de hojas de planta infectada se realizó mediante
fenol tamponado (Pallás et al., 1987). El tejido (10 g) se homogeneizó con un Polytron
(Kinematica) en presencia de 40 ml de fenol (saturado con agua y neutralizado con NaOH a pH 7) y
16 ml de tampón de extracción (Tris-HCl 125 mM, pH 8.9, EDTA 15 mM, SDS 0.8%,
β-mercaptoetanol 0.8%). Después de una centrifugación a 8000 rpm durante 15 min, la fase acuosa
se recuperó y se extrajo de nuevo con 0.5 volúmenes de fenol saturado y neutralizado. Los ácidos
nucleicos de la segunda fase acuosa se precipitaron con etanol y se resuspendieron en 10 ml de STE
(Tris-HCl 50 mM, pH 7.2, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM).
3.2. Cromatografía sobre celulosa no iónica
Esta modalidad de cromatografía de reparto se realizó para enriquecer las preparaciones en
RNAs con alto grado de estructura secundaria (Franklin, 1966; Semancik, 1986). El extracto de
ácidos nucleicos correspondiente a 10 g de peso fresco se llevó a un volumen final de 37 ml
conteniendo etanol al 35% y STE, y se le añadió 1.25 g de celulosa no iónica (CF 11, Whatman). La
_______________________________________________________________Materiales y métodos
49
mezcla se agitó un mínimo de 2 h a temperatura ambiente y a continuación la celulosa se lavó tres
veces con 30 ml de etanol al 35% en tampón STE. Los ácidos nucleicos unidos a la misma se
eluyeron tres veces con 3.33 ml de tampón STE, se recuperaron por precipitación etanólica y se
resuspendieron en un volumen apropiado de agua destilada estéril.
3.3. Fraccionamiento con LiCl 2 M
Con objeto de obtener preparaciones parcialmente enriquecidas en RNAs viroidales, los
extractos se fraccionaron con LiCl 2 M, recuperándose la fracción soluble donde se acumulan
mayoritariamente los RNAs viroidales usados durante la realización de esta tesis. Las preparaciones
de ácidos nucleicos resuspendidos en agua se mezclaron con el volumen necesario de STE 10X y
LiCl 10 M para obtener una concentración final 1X y 2 M respectivamente, se dejaron en baño de
hielo durante una noche y se centrifugaron a 8000 rpm durante 30 min. Los ácidos nucleicos de la
fracción soluble se recuperaron por precipitación con etanol y se resuspendieron en un volumen
adecuado para su posterior análisis. La fracción insoluble se desechó.
44.. EElleeccttrrooffoorreessiiss
4.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE)
4.1.1. Condiciones no desnaturalizantes
Los RNAs y los DNAs de tamaño reducido (fragmentos de restricción de plásmidos
recombinantes o productos de amplificación por PCR), se analizaron en geles de poliacrilamida
(concentración inicial de acrilamida 5% p/v, relación acrilamida:bisacrilamida 40:1) de 13 X 13 X
0.2 cm. Las electroforesis se realizaron a intensidad constante de 80 mA durante 1 h y 30 min en
presencia del tampón TAE (Tris 40 mM, acetato sódico 20 mM, EDTA 1 mM, ajustado a pH 7.2
con ácido acético) en el gel y en los electrodos (Morris y Smith, 1977). Antes de ser aplicadas se les
añadió a las muestras glicerol al 33%, azul de bromofenol y cianol de xileno al 0.01% cada uno, y
EDTA 1 mM, pH 8. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 µg/ml).
4.1.2. Condiciones desnaturalizantes
Para el análisis de los RNAs en estas condiciones se utilizaron geles de poliacrilamida
(concentración inicial de acrilamida 5% p/v, relación acrilamida:bisacrilamida 40:1) de 13 X 13 X
0.2 cm conteniendo 8 M urea y dos tipos de tampón, TBE 1X o TBE 0.25X. Para la purificación de
los cebadores empleados en el análisis de los extremos 5’ y 3’ de los RNAs viroidales monoméricos
y lineales se emplearon geles de poliacrilamida (concentración inicial de acrilamida 20% p/v,
_______________________________________________________________Materiales y métodos
50
relación acrilamida:bisacrilamida 19:1) conteniendo 8 M urea y tampón TBE 1X. Los geles se
tiñeron con bromuro de etidio salvo indicación en otro sentido.
4.1.2.1. PAGE desnaturalizante en presencia de TBE 1X y urea 8 M
Los cebadores y las preparaciones de ácidos nucleicos se separaron en geles de poliacrilamida
en presencia de tampón TBE 1X (Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2.5 mM, pH 8.3)
(Sambrook et. al., 1989) en los electrodos, y TBE 1X más urea en el gel. Antes de su aplicación en
el gel, las muestras se desnaturalizaron durante 1.5 min a 95 ºC en presencia de 20 mg de urea o de
Tris-HCl 5 mM, pH 8, EDTA 0.5 mM, formamida 50% y los colorantes (azul de bromofenol y
cianol de xileno al 0.00125%, cada uno), respectivamente y se enfriaron rápidamente en hielo. Las
electroforesis se realizaron a un voltaje constante de 200 V durante 3.5 h.
4.1.2.2. PAGE desnaturalizante en presencia de TBE 0.25 X y urea 8 M
Este tipo de electroforesis se efectuó en geles de las mismas características que los del apartado
anterior salvo que el tampón utilizado fue TBE 0.25X en lugar de TBE 1X. La disminución de la
fuerza iónica del tampón produce un aumento en la separación entre las formas circulares y las
lineales correspondientes a un mismo RNA viroidal. Las condiciones eléctricas fueron intensidad
constante de 17 mA durante 2.5 h con un voltaje limitante de 350 V.
4.1.2.3. PAGE desnaturalizante TBE 1X y urea 7 M
Los productos de las reacciones de retrotranscripción realizadas para determinar el extremo 5’
de los RNAs viroidales mediante la técnica de extensión del cebador así como las escaleras de
secuenciación se separaron en geles de poliacrilamida del 6 % (relación acrilamida:bisacrilamida
19:1) en tampón TBE 1X en los electrodos y TBE 1X mas urea en el gel. Las muestras se
desnaturalizaron durante 1.5 min a 95 ºC en EDTA 10 mM, formamida 47.5% y los colorantes (azul
de bromofenol y cianol de xileno al 0.025%, cada uno), y se enfriaron rápidamente en hielo antes de
ser aplicadas en el gel.
Se emplearon geles de 40 X 30 X 0.1 cm y las electroforesis se llevaron a cabo a potencia
constante de 55 W. Una vez concluidas, los geles se secaron en una unidad “Heto Dry GD-1”
(Allerod) a 80 ºC durante 2.5 h y se revelaron con una película sensible a rayos X (“Super RX”
Fujifilm) o una placa lectora (“phosphorimage”), analizándose con el equipo “Fujifilm FLA-5100”
y el programa Image Reader FLA-5100 e Image Gauge 4.0.
4.1.3. Doble PAGE
La purificación y detección de los RNAs viroidales monoméricos se realizó mediante dos
_______________________________________________________________Materiales y métodos
51
electroforesis sucesivas (Schumacher et al., 1983; Flores et al., 1985). Tras una primera separación
en condiciones no desnaturalizantes, se tiñó el gel con bromuro de etidio y a continuación se cortó
el fragmento del mismo delimitada en unos casos por las bandas de 300 y 400 nucleótidos (nt) del
marcador de múltiplos de 100 pares de bases de DNA, y en otros por el RNA monomérico lineal del
CEVd y el RNA celular 7S. Seguidamente este fragmento se depositó sobre un segundo gel
desnaturalizante (TBE 0.25X, urea 8 M) en el que se separan las formas circulares y lineales de los
RNAs viroidales.
4.1.4. Elución de ácidos nucleicos de geles de poliacrilamida
Los fragmentos de los geles conteniendo los ácidos nucleicos de interés se cortaron, congelaron
y trituraron en un tubo Eppendorf de 1.5 ml con ayuda de un émbolo. Los ácidos nucleicos se
eluyeron añadiendo un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y un volumen de
tampón de elución (Tris-HCl 0.2 M, pH 8.9, SDS 5%, EDTA 0.1 M, pH 7). Tras una agitación
vigorosa y centrifugación (5 min a 8000 rpm), la fase acuosa se recuperó y la orgánica se extrajo de
nuevo con 0.5 volúmenes de tampón de elución. La segunda fase acuosa se combinó con la primera
y los ácidos nucleicos se recuperaron por precipitación etanólica.
Los RNAs viroidales monoméricos y los cebadores empleados para la determinación de sus
extremos 5’ y 3’, se eluyeron de los fragmentos de gel por difusión durante toda la noche a 37 ºC en
presencia de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, SDS 0.1%, EDTA 1 mM), y se
recuperaron por precipitación etanólica.
4.2. Electroforesis en geles de agarosa
Para la separación del DNA en función de su tamaño se emplearon geles de agarosa al 1% (p/v)
en tampón TAE. Las electroforesis se realizaron a voltaje constante de 75 ó 100 V con un amperaje
limitante de 100 ó 120 mA para geles de tamaño 8 X 6.5 X 0.5 cm ó 15 X 13.5 X 0.5 cm,
respectivamente. Para recuperar los fragmentos de DNA separados se utilizó el estuche “Qiaquick”
(QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante, salvo que la elución de los fragmentos de
DNAs retenidos en la columna se hizo con 30 µl de agua destilada estéril.
55.. HHiibbrriiddaacciióónn mmoolleeccuullaarr ddee áácciiddooss nnuucclleeiiccooss
5.1. Electrotransferencia de los RNAs a membranas para análisis por hibridación Northern
Las preparaciones de RNA separadas en un gel desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) o mediante
doble PAGE se transfirieron, previa tinción con bromuro de etidio, e incubación en tampón de
electrotransferencia 1X (fosfato sódico 25 mM, pH 6.5), a una membrana de nylon Hybond-N
_______________________________________________________________Materiales y métodos
52
(Amersham Pharmacia Biotech), humedecida con el mismo tampón, utilizando una unidad TE 50X
Transphor (Hoefer) durante 2 h a un amperaje constante de 1 A.
5.2. Impresiones de tejido
Las plantas de G. aurantiaca y S. lycopersicum en las que se expresaron transitoriamente
construcciones diméricas del CEVd, o las plantas infectadas mecánicamente con RNAs
monoméricos del CEVd purificados a partir de plantas transgénicas de A. thaliana y a partir de
plantas de G. aurantiaca, fueron analizadas a las seis semanas de su inoculación mediante
impresiones de tejido sobre membranas de nylon Hybond-N, que posteriormente fueron hibridadas
con la sonda pdBCEVP3/ XbaI (Tabla 1) en las condiciones que se detallan en el apartado 5.5.
Tabla 1. Plásmidos recombinantes utilizados para la síntesis por transcripción in vitro de sondas de RNA radiactivas
Plásmido y enzima usado en su linealización RNA polimerasa Identidad y polaridad del transcrito pBdCEVP3/ XbaI1 T3 CEVd (-) pBdCEVP3/ XhoI T7 CEVd (+) pBdHSVd/ SalI2 T7 HSVd (-) pBdHSVd/ HindIII T3 HSVd (+) pBdASSVd(G73)/ EcoRI3 T7 ASSVd (-) pBdASSVd(G73)/ BamHI T3 ASSVd (+)
1 Contiene un dímero del CEVd clonado en el sitio de restricción PstI e insertado en el mismo sitio del vector pBluescript KS+.
2 Contiene un dímero del HSVd clonado en el sitio de restricción ClaI e insertado en el mismo sitio del vector pBluescript KS+.
3 Contiene un dímero del ASSVd clonado por la posición 90 en los sitios BamHI y EcoRI del vector pBluescript KS+.
5.3. Fijación de ácidos nucleicos a membranas de nylon
Los ácidos nucleicos se fijaron covalentemente a las membranas de nylon mediante irradiación
UV (140 mJ/cm2) con un aparato UVC 500 (Hoefer).
5.4. Obtención de sondas de RNA marcadas radiactivamente por transcripción in vitro
Las reacciones de transcripción se efectuaron en un volumen de 20 µl conteniendo Tris-HCl
40 mM, pH 8, MgCl2 6 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mM, espermidina 2 mM, ATP, CTP y GTP
0.5 mM cada uno, 20 µCi de [α-32P] UTP (400 Ci/mmol), 20 U de inhibidor de RNasa (RNasin,
Promega), 20 U de T3 o T7 RNA polimerasa (Roche Applied Science) y 1 µg de plásmido
linealizado (Tabla 1). Después de una incubación durante 1 h a 37 ºC se añadieron 15 U de DNasa I
libre de RNasas (Roche Applied Science) con el fin de degradar el molde de DNA, y la reacción se
incubó 15 min a la misma temperatura. Las sondas se purificaron por cromatografía de exclusión en
_______________________________________________________________Materiales y métodos
53
una columna de Sephadex G-50 (Roche Applied Science) y se cuantificaron con un contador de
centelleo líquido.
5.5. Prehibridación e hibridación
Las membranas se prehibridaron a 70 ºC un mínimo de 1 h en presencia de la solución de
hibridación (formamida 50%, ficoll 0.1%, polivinilpirrolidona 0.1%, fosfato sódico 65 mM, pH 6.5,
NaCl 60 mM, citrato sódico 7.5 mM, EDTA 10 mM, SDS 1% y DNA de esperma de salmón
desnaturalizado 100 µg/ml). Las sondas marcadas radiactivamente (106 cpm/5 ml solución de
hibridación) se desnaturalizaron durante 2 min a 95 ºC en presencia de 100 µl de la solución de
hibridación y a continuación se añadieron a la solución con la que se prehibridaron las membranas.
Las membranas se hibridaron a 70 ºC con la sonda durante 16 h y seguidamente se lavaron dos
veces durante 15 min con tampón SSC 2X (SSC 1X contiene NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM,
pH 7) y SDS 0.1% a temperatura ambiente, y dos veces más con tampón SSC 0.1X y SDS 0.1% a
55 ºC, excepto en el análisis comparado de las plantas transgénicas de A. thaliana transformadas
con dímeros de polaridad positiva o negativa del CEVd en el que la temperatura de lavado fue de
70 ºC para evitar la hibridación cruzada de las sondas. Las membranas fueron reveladas con una
película sensible a rayos X (“Super RX” Fujifilm) o una placa lectora (“phosphorimage”).
66.. MMaarrccaajjee rraaddiiaaccttiivvoo ddee llooss DDNNAAss ppaattrroonneess ddee ttaammaaññoo
6.1. Eliminación del grupo 5’-P
La reacción se incubó durante 1 h a 37 ºC en un volumen final de 50 µl conteniendo Tris-HCl
50 mM, pH 8.5, MgCl2 5 mM, 3 U de fosfatasa alcalina de gamba (Roche Applied Science) y 10 µg
del patrón de DNA pBR322/HaeIII (Roche Applied Science). Una vez finalizada la reacción se
subió el volumen a 200 µl con agua y se añadió un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico
(25:24:1). Tras una agitación vigorosa, la mezcla se centrifugó a 14000 rpm durante 5 min. Los
DNAs presentes en la fase acuosa se precipitaron con 2 volúmenes de etanol y 0.1 volumen de
acetato sódico 3 M, pH 5.5, y se resuspendieron en 20 µl de agua destilada estéril.
6.2. Fosforilación radiactiva del extremo 5’
La reacción se efectuó en un volumen de 20 µl conteniendo Tris-HCl 50 mM, pH 7.6, MgCl2
10 mM, β-mercaptoetanol 10 mM, 30 µCi de [γ-32P] ATP (3000 Ci/mmol), 5 U de polinucleótido
quinasa del fago T4 (Roche Applied Science) y 3.5 µg del patrón de DNA previamente
desfosforilado. Después de una incubación de 1 h y 15 min a 37 ºC, la enzima se inactivó con un
_______________________________________________________________Materiales y métodos
54
tratamiento de 15 min a 65 ºC y los DNAs se purificaron por cromatografía de exclusión en una
columna de Sephadex G-50.
77.. DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell eexxttrreemmoo 55’’ ddee uunn RRNNAA vviirrooiiddaall mmeeddiiaannttee eexxtteennssiióónn ddeell
cceebbaaddoorr
7.1. Marcaje radiactivo del extremo 5’ del cebador
La reacción de fosforilación se incubó durante 30 min a 37 ºC en un volumen final de 20 µl
conteniendo Tris-HCl 50 mM, pH 7.6, MgCl2 10 mM, β-mercaptoetanol 10 mM, 60 µCi de [γ-32P]
ATP (3000 Ci/mmol), 10 U de polinucleótido quinasa del fago T4 y 800 ng de los cebadores P1-P8
(Tabla 2) purificados mediante PAGE desnaturalizante. A continuación la enzima se inactivó con
un tratamiento de 15 min a 65 ºC. Finalmente, el volumen de reacción se llevó a 200 µl con agua y
se mezcló con 3 volúmenes de etanol, 0.1 volumen de acetato sódico 3 M, pH 5.5, 0.1 volumen
MgCl2 0.1 M y 1 µg de glicógeno (“GlycoBlue” Ambion). Después de una centrifugación a
14000 rpm durante 45 min el sedimento conteniendo el cebador se lavó con etanol al 70% y se
resuspendió en 20 µl de agua destilada estéril.
Tabla 2. Cebadores empleados en la determinación del extremo 5’ de los RNAs viroidales monoméricos y lineales
RNA Cebador: Secuencia 5’ a 3’ Posición1 Longitud CEVd P1:d(GGGACCCAATCTAGGGTTCCGAGGGC) 369-344 26 CEVd P2: d(TTCTCCGCTGGACGCCAGTGATCCGC) 172-147 26 CEVd P3: d(TCCCCGGGGATCCCTGAAGGACTTC) 100-76 25 CEVd P4: d(GCTTCAGCGACGATCGGATGTGGAGCC) 229-203 27 HSVd P5: d(CAGAGCCTCTACTCCAGAGCACCG) 148-129 24 HSVd P6: d(GAGCAGGGGTGCCACCGGTCGC) 234-213 22 ASSVd P7: d(TCAACACCGTACGTTCTTGTAG) 187-166 22 ASSVd P8: d(GACTAGCGGCGCGAAGAGTAGGTGG) 234-210 25 Adaptador comercial P10: d(GGAGCACGAGGACACTGACATGG) 6-28 23 Adaptador comercial P11: d(GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA) 15-40 26
1 Numeración respecto a la secuencia de referencia cada uno de los viroides (M34917 con la delección de una guanina entre las posiciones 70 y 75 para el CEVd, Y09352 para el HSVd, y AF421195 para el ASSVd) y del adaptador de RNA comercial (P9, ver apartado 8.2).
7.2. Retrotranscripción
La desnaturalización y anillamiento del RNA (5-50 ng) y del correspondiente cebador
específico en una relación molar 1:10 (Tabla 2) se efectuó calentando durante 5 min a 95 ºC y
_______________________________________________________________Materiales y métodos
55
enfriando rápidamente en hielo. La reacción de retrotranscripción (volumen final 20 µl) se incubó
durante 45 min a 55 ºC, 10 min a 60 ºC, 5 min a 65 ºC y 15 min a 70 ºC, en presencia de Tris-HCl
50 mM, pH 8.3, KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 5 mM, 0.5 mM de cada uno de los dNTPs, 40 U
de inhibidor de RNasa y 200 U de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de
Moloney (SuperScriptTM III, Invitrogen).
88.. DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell eexxttrreemmoo 55’’ ddee uunn RRNNAA vviirrooiiddaall mmeeddiiaannttee ““RRLLMM--RRAACCEE””
((RRNNAA LLiiggaassee--MMeeddiiaatteedd RRaappiidd AAmmpplliiffiiccaattiioonn ooff ccDDNNAA EEnnddss))
8.1. Tratamientos previos del RNA
Los RNAs viroidales monoméricos purificados mediante doble PAGE y posteriormente eluídos
(ver apartado 4.1.4), se dividieron en tres fracciones que recibieron un tratamiento distinto. Una
fracción se incubó sin enzima alguno, otra con polinucleótido quinasa del fago T4 y la última con
fosfatasa alcalina de ternera. Los RNAs resuspendidos en agua se desnaturalizaron a 95 ºC durante
1.5 min y se enfriaron rápidamente en hielo antes de incubarlos con el resto de los componentes.
Una vez finalizados los tratamientos, se llevó el volumen de reacción a 200 µl con agua, se añadió
1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó vigorosamente y se centrifugó
a 14000 rpm durante 5 min. Tras la centrifugación se separó la fase acuosa y se repitió el
tratamiento una vez más. La fase acuosa se mezcló con 3 volúmenes de etanol, 0.1 volumen de
acetato sódico 3 M, pH 5.5, y 1 µg de glicógeno. Después de una centrifugación a 14000 rpm
durante 30 min el sedimento conteniendo el RNA tratado se lavó con etanol al 70% y se
resuspendió en 7.5 µl de agua destilada estéril.
8.1.1. Polinucleótido quinasa del fago T4
La reacción de fosforilación se incubó 30 min a 37 ºC en un volumen final de 30 µl conteniendo
Tris-HCl 50 mM, pH 7.6, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, espermidina 0.1 mM, EDTA 0.1 mM,
ATP 1 mM, 5 U de inhibidor de RNasa, 15 U de polinucleótido quinasa del fago T4 (Fermentas) y
5-10 ng de los RNAs viroidales monoméricos y lineales.
8.1.2. Fosfatasa alcalina de ternera
Las reacciones de desfosforilación se llevaron a cabo en un volumen final de 30 µl conteniendo
Tris-HCl 50 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.5, ATP 1 mM, 5 U de inhibidor de RNasa, 1 U de fosfatasa
alcalina de ternera (Roche Applied Science) y 5-10 ng de los RNAs viroidales monoméricos y
lineales. Tras incubar las mezclas de reacción 30 min a 50 ºC, el RNA se desnaturalizó otra vez
_______________________________________________________________Materiales y métodos
56
1.5 min a 95 ºC, se añadió 5 U de inhibidor de RNasas y 10 U de fosfatasa alcalina de ternera y se
incubó de nuevo otros 30 min a 50 ºC.
8.2. Ligación de un adaptador de RNA al extremo 5’ de los RNAs
Los RNAs viroidales previamente tratados y resuspendidos en 7.5 µl de agua se mezclaron con
0.25 µg del adaptador de RNA comercial P9, [5’-
(CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA)-3’], se calentaron
5 min a 65 ºC y se enfriaron rápidamente en hielo. A continuación, se incubaron durante 1 h a 37 ºC
en un volumen final de 15 µl con Tris-acetato 33 mM, pH 7.8, acetato potásico 66 mM, acetato
magnésico 10 mM, DTT 0.5 mM, ATP 1 mM, 10 U de inhibidor de RNasas y 5 U de RNA ligasa 1
del fago T4 (Epicentre). Una vez concluido este tiempo, las mezclas de reacción se trataron con
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico tal y como se ha detallado en el apartado 8.1. El RNA ligado y
precipitado se resuspendió en 10 µl de agua destilada estéril.
8.3. Retrotranscripción del RNA
Para la reacción de síntesis de la primera hebra de cDNA se ajustó la cantidad de RNA ligado al
adaptador en función del viroide, y se empleó 5 ng de los cebadores P4, P6 o P8 (Tabla 2)
purificados de gel. Las condiciones y el resto de los componentes de la reacción fueron los mismos
que los indicados en el apartado 7.2. Una vez finalizada la reacción, se añadieron 3 volúmenes de
etanol, 0.1 volumen de acetato sódico 3 M, pH 5.5, 0.1 volumen MgCl2 0.1 M y 1 µg de glicógeno.
Después de una centrifugación a 14000 rpm durante 30 min, el sedimento conteniendo los cDNAs
se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 20 µl de agua destilada estéril.
8.4. Amplificación del cDNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa
Las reacciones de amplificación por PCR se realizaron en un volumen final de 50 µl
conteniendo la mitad del cDNA sintetizado en la reacción de retrotranscripción, 200 ng de cada uno
de los dos cebadores (P10, específico del adaptador comercial, y P2, P5 y P7, complementarios a
las secuencias del CEVd, HSVd y ASSVd, respectivamente, Tabla 2), Mg2Cl 1.5 mM,
dNTPs 0.4 mM y 1 U de una mezcla de Taq DNA polimerasa y Tgo DNA polimerasa (Expand
High Fidelity PCR System, Roche Applied Science). Las condiciones de amplificación consistieron
en una desnaturalización previa de 2 min a 94 ºC, 35 ciclos de 30 s a 94 ºC, 30 s a la temperatura de
anillamiento (58 ºC, 55 ºC y 60 ºC para el CEVd, HSVd y ASSVd, respectivamente) y 1 min a
68 ºC, con una extensión final de 10 min a 68 ºC.
Para el análisis realizado sobre RNAs monoméricos lineales purificados a partir de plantas de
_______________________________________________________________Materiales y métodos
57
A. thaliana que expresan un dímero de polaridad positiva del HSVd, fue necesario una segunda
reacción de PCR en las que se usó como molde 1 µl de una dilución 1/10 del producto de la primera
reacción y los cebadores P5 y P11 (Tabla 2). Los productos de amplificación se analizaron por
PAGE no desnaturalizante.
8.5. Clonación de los productos de amplificación
Los productos de PCR se eluyeron del gel tal y como se indica en el apartado 4.1.4. y se
clonaron en el vector pTZ57R/T (Fermentas). Para las reacciones de ligación se siguió el protocolo
proporcionado por el fabricante (“InsTAclone™ PCR Cloning Kit”, Fermentas) pero empleando
una relación molar inserto:vector de 5:1. Las reacciones de ligación, en un volumen final de 10 µl,
contenían: 55 ng de plásmido, 15-30 ng de inserto, 2 µl de PEG 4000 (50% p/v), 4.8 µg de
seroalbúmina bovina (BSA), Tris-HCl 40 mM, pH 7.8, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0.5 mM
y 5 U de T4 DNA ligasa. La reacción se incubó a 22 ºC durante un mínimo de 2 h y un máximo de
16 h.
99.. DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell eexxttrreemmoo 33’’ ddee uunn RRNNAA vviirrooiiddaall mmoonnoomméérriiccoo mmeeddiiaannttee 33’’
RRAACCEE
9.1. Tratamiento con fosfatasa alcalina de ternera
Los RNAs viroidales monoméricos y lineales purificados a partir de preparaciones de ácidos
nucleicos de plantas transgénicas de A. thaliana mediante el sistema de doble PAGE se dividieron
en dos fracciones, una se incubó con la fosfatasa alcalina de ternera como se indica en el apartado
8.1.2., y la otra con todos los componentes de la reacción a excepción del enzima.
9.2. Poliadenilación del extremo 3’
Aproximadamente 5-10 ng de RNA lineal se incubó a 30 ºC durante 20 min en un volumen final
de 20 µl conteniendo Tris-HCl 10 mM, pH 7.0, KCl 25 mM, MnCl2 0.35 mM, EDTA 0.1 mM,
BSA 50 µg/ml, glicerol 5%, 40 U de inhibidor de RNasas, ATP 0.1 mM y 600 U de poliadenilato
polimerasa de levadura (USB). Una vez concluida la reacción, se llevó el volumen a 200 µl con
agua y se añadió 1 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1). El RNA se recuperó
por precipitación etanólica como se indica en el apartado 8.1 y se resuspendió en 10 µl de agua
estéril.
9.3. Retrotranscripción
Para la síntesis de la primera hebra de cDNA se empleó el RNA previamente poliadenilado y el
_______________________________________________________________Materiales y métodos
58
cebador P12 (Tabla 3), cuyo extremo 3’ es complementario a la cola de poliA incorporada. El resto
de componentes de la reacción y los tiempos de incubación son los indicados en el apartado 7.2.
Una vez finalizada la reacción, los ácidos nucleicos se recuperaron por precipitación etanólica y se
resuspendieron en 10 µl de agua destilada estéril.
9.4. Amplificación del cDNA mediante PCR y clonación
Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 50 µl conteniendo la mitad
del cDNA sintetizado en la reacción de retrotranscripción, 200 ng de cada uno de los dos cebadores,
P12 y P13 (Tabla 3), este último complementario a la secuencia del CEVd; el resto de componentes
fueron los mismos que los indicados en el apartado 8.4. Las reacciones se iniciaron con una
desnaturalización de 2 min a 94 ºC seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 ºC, 30 s a 55 ºC y 1 min a
68 ºC, con una extensión final de 10 min a 68 ºC. Los productos de amplificación se analizaron por
PAGE no desnaturalizante. Para la clonación de los productos de PCR en el vector pTZ57R/T se
procedió como se ha indicado en el apartado 8.5.
Tabla 3. Cebadores empleados en la determinación del extremo 5’ de los RNAs viroidales monoméricos y lineales del CEVd
Cebador: Secuencia 5´ a 3´ Posición LongitudP12: d(CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGCT(17)V) 40 P13: d(GGAAACCTGGAGGAAGTCG) 98-1161 20
1 Numeración respecto a una variante idéntica a la variante M34917 excepto por la presencia de una deleción entre las posiciones 70 y 75.
1100.. LLiiggaacciióónn ddee llooss RRNNAAss mmoonnoomméérriiccooss lliinneeaalleess ddeell CCEEVVdd pprroocceessaaddooss iinn vviivvoo
RNAs monoméricos lineales del CEVd aislados de la planta huésped G. aurantiaca o de plantas
transgénicas de A. thaliana (Daròs y Flores, 2004), se incubaron con dos RNAs ligasas, la RNA
ligasa 1 del fago T4 (Rnl1) (Uhlenbeck, 1983) o la tRNA ligasa de A. thaliana (Englert y
Beier, 2005), esta última cedida amablemente por D. Molina. Como control se utilizó un RNA
monomérico del viroide con extremos 5’-P (G97) y 3’-OH (G96) generado in vitro (Fig. 25).
Tabla 4. Cebadores específicos del CEVd empleados en la síntesis de un cDNA monomérico del viroide bajo el control del promotor T7, cuya secuencia se ha indicado en verde
Cebador: Secuencia 5´ a 3´ Posición1 LongitudP14: d(TAATACGACTCACTATAGGGAAACCTGGAGGAAGTCGAGG) 97-110 40 P15: d(CGGGGATCCCTGAAGGACTTCTTC) 96-73 24
1 Numeración respecto a una variante idéntica a la variante M34917 excepto por la presencia de una deleción entre las posiciones 70 y 75.
_______________________________________________________________Materiales y métodos
59
10.1. Síntesis in vitro de un RNA monomérico del CEVd control
Una vez identificado el sitio de corte in vivo de los oligómeros de polaridad positiva del CEVd,
se sintetizó un cDNA monomérico con los mismos extremos, bajo el control del promotor T7
(Fig. 25). Dicho cDNA se obtuvo mediante una reacción de PCR en un volumen final de 50 µl
conteniendo 100 ng del plásmido pBdCEVP3 como molde (Tabla 1), 200 ng de cada uno de los
cebadores, P14 y P15 (Tabla 4), dNTPs 1 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8.9, KCl 10 mM, (NH4)2SO4
5 mM, MgSO4 2mM y 2.5 U de Pwo DNA polimerasa (Roche Applied Science). La reacción se
inició con una desnaturalización previa de 2 min a 94 ºC seguida de 30 ciclos de 30 s a 94 ºC, 30 s a
60 ºC y 1 min a 68 ºC, con una extensión final de 10 min a 68 ºC. Una vez finalizada la reacción se
llevó el volumen a 200 µl con agua, se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y
el DNA se precitó como se indica en el apartado 8.1 y se resuspendió en 30 µl de agua destilada
estéril.
pBCEVP3
PCR
T7
TAP
5´P OH 3´
5´PPP OH 3´
pBCEVP3
PCR
T7
TAP
5´P OH 3´
5´PPP OH 3´
pBCEVP3
PCR
T7
TAPTAP
5´P OH 3´
5´PPP OH 3´5´PPP OH 3´
A continuación se realizó una reacción de transcripción en un volumen de 50 µl conteniendo
Tris-HCl 40 mM, pH 8, MgCl2 6 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mM, espermidina 2 mM, NTPs 1 mM,
40 U del inhibidor de RNasa, 30 U de T7 RNA polimerasa y 30 µl molde (el producto de la
reacción de amplificación anterior). Tras una incubación de 1 h a 37 ºC, se añadieron 15 U de
DNasa I libre de RNasa y la reacción se incubó 15 min a la misma temperatura. Los productos se
analizaron por PAGE desnaturalizante en TBE 1X y la banda correspondiente al RNA de longitud
unitaria se recortó del gel. Dicho RNA se eluyó por difusión durante toda la noche a 37 ºC en
presencia de tampón de elución (Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, SDS 0.1%, EDTA 1 mM) y se recuperó
por precipitación etanólica.
El precipitado se resuspendió en agua y se incubó 1 h a 30 ºC en un volumen final de 50 µl
conteniendo acetato sódico 50 mM, pH 6, EDTA 1mM, β-mercaptoetanol 0.1%,
Figura 25. Síntesis in vitro de un RNA monomérico del CEVd con extremos 5’-P (G97), 3’- OH (G96). La rama superior de la CCR y el promotor T7 se han representado en azul y naranja, respectivamente, los cebadores utilizados en la reacción de amplificación de la PCR como flechas de los mismos colores. Las enzimas T7 RNA polimerasa y la pirofosfatasa ácida de tabaco (TAP) se representan con una elipse naranja y morada, respectivamente. Los RNAs se representan en colores oscuros y los fragmentos de DNA en colores claros.
_______________________________________________________________Materiales y métodos
60
Triton X-100 0.01%, 20 U de inhibidor de RNasa y 25 U de pirofosfatasa ácida de tabaco (TAP,
Epicentre). Una vez concluida la reacción, la muestra se extrajo con 1 volumen de
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y el RNA se recuperó por precipitación etanólica.
10.2. Tratamiento con polinucleótido quinasa del fago T4 o con fosfatasa alcalina de ternera
Los RNAs monoméricos y lineales del CEVd sintetizados in vitro, o procesados in vivo en
G. aurantiaca o en plantas transgénicas de A. thaliana, se trataron con polinucleótido quinasa o con
fosfatasa alcalina de ternera como se ha indicado en los apartados 8.1.1 y 8.1.2.
10.3. Incubación con RNA ligasa 1 del fago T4 o con tRNA ligasa de A. thaliana
Los RNAs resuspendidos en agua se desnaturalizaron 5 min a 65 ºC y se enfriaron rápidamente
en hielo antes de incubarse 30 min a 37 ºC en un volumen final de 20 µl conteniendo Tris- acetato
33 mM, pH 7.8, acetato potásico 66 mM, acetato magnesico 10 mM, DTT 0.5 mM, ATP 1 mM, 5 U
de la RNA ligasa 1 (Rnl1) del fago T4 y aproximadamente 2 ng de cada uno de los moldes. Como
control se utilizó una reacción adicional con 125 ng de RNA monómerico de ABSVd procedente de
autocorte.
Las reacciones de ligación con la tRNA ligasa de A. thaliana se realizaron en un volumen final
de 20 µl conteniendo el RNA molde (las mismas cantidades que las indicadas para la reacción
anterior), ATP 1 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, DTT 5 mM, MgCl2 4 mM y 0.5 µl de enzima
purificada. Tras una incubación de 30 min a 30 ºC, las reacción con la Rnl1 y tRNA ligasa se
finalizaron con la adición de un volumen del tampón de parada (Tris-HCl 10 mM, pH 8,
EDTA 1mM, formamida 98% y los colorantes azul de bromofenol y cianol de xileno al 0.0025%,
cada uno) y 125 ó 250 ng de RNA heterólogo, respectivamente. Con el propósito de conseguir una
separación nítida de las muestras y evitar un retardo de las formas viroidales monoméricas durante
la electroforesis se añadió RNA heterólogo a las muestras. Experimentalmente se comprobó que las
reacciones incubadas con la tRNA ligasa requerían más cantidad de RNA heterólogo. Los productos
de las reacciones de ligación se analizaron mediante PAGE desnaturalizantes del 5% (TBE 1X) e
hibridación Northern como se indica en el apartado 5.
1111.. MMaanniippuullaacciióónn ddee mmiiccrroooorrggaanniissmmooss
11.1. Obtención de células de E. coli DH5α competentes para su transformación por choque
térmico
Una colonia de E. coli DH5α se cultivó en 5 ml de medio líquido LB a 37 ºC en agitación
_______________________________________________________________Materiales y métodos
61
(200 rpm) durante toda la noche. Este preinóculo se añadió a 200 ml de LB en un matraz
Erlenmeyer estéril de 1 l y se incubó a 37 ºC en agitación hasta una DO600 de 0.5. El cultivo,
previamente enfriado en hielo, se centrifugó a 6000 rpm durante 10 min a 4 ºC manteniendo las
condiciones de esterilidad. El sedimento se lavó con 15 ml de tampón 1 (acetato potásico 30 mM,
pH 5.8, RbCl 0.1M, MnCl2 50 mM, CaCl2 10 mM, glicerol 15%). Después del lavado el cultivo se
centrifugó a 6000 rpm 10 min a 4 ºC. El sedimento bacteriano se resuspendió en 8 ml de tampón 2
(MOPS 10 mM, pH 7, RbCl 10 mM, CaCl2 75 mM, glicerol 15%) y se fraccionó en alícuotas
(200 µl) que se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaron a -80 ºC hasta su
utilización.
11.2. Transformación de células de E. coli DH5α competentes mediante choque térmico
La transformación de células competentes DH5α se llevó a cabo mediante choque térmico
según se describe en Sambrook et al. (1989). Las células se sembraron en placas Petri con medio
LB suplementado con los antibióticos adecuados según el tipo de plásmido utilizado. Cuando el
vector empleado permitió seleccionar las células transformadas por α-complementación, se
añadieron al medio 45 µl de X-Gal (25 mg/ml, Duchefa Biochemie). Las placas se incubaron toda
la noche a 37 ºC.
11.3. Obtención de células de A. tumefaciens competentes para su transformación por
electroporación
Una colonia de A. tumefaciens (cepa C58C1), aislada por triple estría, sirvió para inocular 5 ml
de medio líquido LB con rifampicina (50 mg/l) que fue incubado durante 24 h a 30 ºC. Al día
siguiente este preinóculo se añadió a 200 ml de LB con el antibiótico en un matraz Erlenmeyer
estéril de 1 l y se incubó a 30 ºC a 200 rpm hasta alcanzar una DO600 de 1. El cultivo previamente
enfriado en hielo se centrifugó a 8000 rpm 15 min a 4 ºC manteniendo las condiciones de
esterilidad, y el sedimento se lavó dos veces con agua previamente enfriada a 0 ºC centrifugando
tras cada lavado el cultivo a 8000 rpm durante 15 min a 4 ºC. El sedimento final se resuspendió en
8 ml de glicerol estéril (10%) y se repartió en alicuotas (40 µl) que se congelaron inmediatamente
en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 ºC hasta su utilización.
11.4. Transformación de células de A. tumefaciens competentes por electroporación
Aproximadamente 0.5-1 µl de la preparación de plásmido bacteriano con la construcción de
interés se añadió a un vial de células competentes descongeladas previamente en hielo. La mezcla
se transfirió a una cubeta de electroporación, estéril y enfriada en hielo, con una separación entre
electrodos de 0.1 cm que fue sometida a 1.25 mV, 25 µF y 200 Ω en un electroporador
_______________________________________________________________Materiales y métodos
62
“Multiporator” (Eppendorf). Las células transformadas se resuspendieron en 1 ml de medio LB
estéril, se incubaron durante 3 h a 30 ºC con agitación (200 rpm), y se sembraron en placa Petri en
medio LB suplementado con los antibióticos adecuados.
1122.. PPuurriiffiiccaacciióónn ddee pplláássmmiiddooss bbaacctteerriiaannooss
Para este propósito se utilizó el estuche “High Pure Plasmid Isolation” (Roche Applied Science)
siguiendo las instrucciones del fabricante.
1133.. SSeeccuueenncciiaacciióónn ddee DDNNAA
Para este fin se empleó el método de terminación de las cadenas que hace uso de
didesoxirribonucleótidos (Sanger et al., 1977).
Tabla 5. Cebadores y moldes empleados en las reacciones de secuenciación manual
Viroide Molde Cebador: Secuencia 5’ a 3’ Posición6 LongitudCEVd pBmCEVdB1 P2: d(TTCTCCGCTGGACGCCAGTGATCCGC) 172-147 26 CEVd pBmCEVdS2 P4: d(GCTTCAGCGACGATCGGATGTGGAGCC) 229-203 27 HSVd pBmHSVdE3 P5: d(CAGAGCCTCTACTCCAGAGCACCG) 148-129 24 HSVd pBmHSVdE P6: d(GAGCAGGGGTGCCACCGGTCGC) 234-213 22 ASSVd pUmASSVd4 P7: d(TCAACACCGTACGTTCTTGTAG) 187-166 22 ASSVd pTmASSVd5 P8: d(GACTAGCGGCGCGAAGAGTAGGTGG) 234-210 25
1 Contiene un monómero del CEVd clonado por el sitio BamHI e insertado en el mismo sitio del vector pBluescript KS+.
2 Contiene un monómero del CEVd clonado por el sitio SalI e insertado en el mismo sitio del vector pBluescript KS+. 3 Contiene un monómero del HSVd clonado por el sitio EcoRI e insertado en el mismo sitio del vector pBluescript KS+. 4 Contiene un monómero de polaridad positiva del ASSVd clonado por la posición 90 en el sitio SmaI del vector
pUC18. 5 Contiene un monómero de polaridad positiva del ASSVd clonado por la posición 235 en el vector pTZ57R/T. 6 Numeración respecto a la secuencia de referencia cada uno de los viroides (M34917 con la delección de una guanina
entre las posiciones 70 y 75 para el CEVd, Y09352 para el HSVd, y AF421195 para el ASSVd).
13.1. Secuenciación manual
Se utilizaron los reactivos suministrados en el estuche “Thermo Sequenase Cycle Sequencing
Kit” (USB) siguiendo las instrucciones del fabricante, empleándose los moldes y cebadores,
marcados internamente con 5 µCi [α-32P] dNTPs (400Ci/mmol), indicados en la Tabla 5. Los
productos se analizaron por PAGE desnaturalizante en geles de secuenciación del 6% (relación
acrilamida:bisacrilamida 19:1) en presencia de urea 8 M y TBE 1X.
_______________________________________________________________Materiales y métodos
63
13.2. Secuenciación automática
Con este propósito se utilizaron terminadores fluorescentes y cebadores de los vectores
empleados o, cuando fue necesario, cebadores diseñados “ex profeso”. Para la secuenciación de los
cDNAs clonados en el vector binario pCK45 se empleó el cebador P16 de secuencia
[5’-d(CATCGCAAGACCGGCAACAGGATTC)-3’]. Los productos marcados se resolvieron en un
secuenciador capilar ABI 3100 (Applied Biosystems).
1144.. TTrraannssffoorrmmaacciióónn eessttaabbllee ddee ppllaannttaass ddee AA.. tthhaalliiaannaa ccoonn ccDDNNAAss ddiimméérriiccooss ddeell
CCEEVVdd
Un esquema de la estrategia que se siguió para la obtención de construcciones diméricas se
muestra en la Figura 26.
14.1. Generación de las construcciones
14.1.1. Fosforilación de los cebadores
La reacción se incubó durante 30 min a 37 ºC en un volumen final de 50 µl conteniendo
Tris-HCl 50 mM, pH 7.6, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, espermidina 0.1 mM, EDTA 0.1 mM,
ATP 1 mM, 10 U de polinucleótido quinasa del fago T4 (Fermentas) y 25 µg de cebador (Tabla 6).
Transcurrido este tiempo la enzima se inactivó calentando la muestra 10 min a 70 ºC.
14.1.2. Mutagénesis dirigida
Partiendo de la construcción pBmCEVP3, que contiene un monómero del viroide clonado por el
sitio PstI e insertado en el mismo sitio del vector pBluescript KS+, se modificaron posiciones
concretas de la secuencia del CEVd mediante una reacción de PCR en la que el cebador homólogo
incluyó en su extremo 5’ la mutación de interés y el segundo cebador fue complementario a la
región adyacente cubierta por el primer cebador.
Las reacciones de amplificación se realizaron en un volumen final de 50 µl conteniendo 0.2 ng
de la construcción pBmCEVP3, 0.5 µg de cada uno de los dos cebadores fosforilados de polaridad
opuesta (Tabla 6), dNTPs 1 mM, 2.5 U de Pwo DNA polimerasa, Tris-HCl 10 mM, pH 8.85,
KCl 25 mM, (NH4)2SO4 5 mM, y MgSO4 2 mM. Las condiciones de las reacciones consistieron en
una desnaturalización inicial de 2 min a 94 ºC, 30 ciclos de 30 s a 94 ºC, 30 s a la temperatura de
anillamiento específica de cada cebador, 3 min 30 s a 72 ºC, y una extensión final de 10 min a
72 ºC. Los productos de amplificación se analizaron en geles de agarosa al 1% y el correspondiente
al plásmido linealizado conteniendo el cDNA mutado se eluyó como se indica en el apartado 4.2 y
_______________________________________________________________Materiales y métodos
64
se resuspendió en un volumen final de 10 µl de agua destilada estéril.
P1
Elución
45 370 1 44
P2
Ligación
PCR
P3
P4
Elución
Ligación
Elución
pBKS(+)
EcoRVLigación
pBKS(+) + cDNA dimérico
EcoRI SalI
Digestión
EcoRI SalI
pCK45
EcoRI/SalILigación
PCR
pCK45 + cDNA dimérico
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pBKS(+)
pBKS(+)
pBmCEVP3P1
Elución
45 370 1 44
P2
Ligación
PCR
P3
P4
Elución
Ligación
Elución
pBKS(+)
EcoRVLigación
pBKS(+) + cDNA dimérico
EcoRI SalI
Digestión
EcoRI SalI
pCK45
EcoRI/SalILigación
PCR
pCK45 + cDNA dimérico
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pBKS(+)
pBKS(+)
pBmCEVP3
Figura 26. Método utilizado para la obtención de cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones específicas de su secuencia, simbolizadas con una línea roja, y su clonación en el vector de transformación pCK45. La rama superior de la CCR se ha representado en azul.
14.1.3. Ligación de los plásmidos conteniendo cDNAs monoméricos mutados
Las reacciones de ligación se efectuaron en un volumen final de 15 µl conteniendo 10 µl del
plásmido lineal amplificado, Tris-HCl 40 mM, pH 7.8, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0.5 mM
y 5 U de DNA ligasa del fago T4 y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Transcurrido
ese tiempo se transformaron células de E. coli DH5α con la mitad del volumen de ligación como se
ha indicado en el apartado 11.2. El resto de la ligación se incubó durante 16 h a 14 ºC. La presencia
_______________________________________________________________Materiales y métodos
65
de los cambios esperados se comprobó mediante secuenciación automática de los clones.
Tabla 6. Cebadores utilizados para la obtención de los cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones específicas
En cada caso se indica la pareja de cebadores empleados en la obtención de los cDNAs diméricos, las temperaturas de anillamiento, la secuencia de los cebadores con la posición modificada subrayada, y la posición de los mismos con referencia a una variante del CEVd idéntica a la variante M34917 excepto en que la segunda presenta la inserción de una guanina entre las posiciones 70 y 74. Las letras h y c indica los cebadores homólogos y complementarios, respectivamente.
Mutante Cebadores T Secuencia 5´a 3´ Posición#1
P24 (h) P23 (c)
68 ºC d(CCCTGGGGAAACCTGGAGGAAGTC) d(ATCCCTGAAGGACTTCTTCCCCGC)
92-115 91-68
#2
P36 (h) P33 (c)
68 ºC d(AGGGAAACCTGGAGGAAGTCGAGG) d(GGGGATCCCTGAAGGACTTCTTCC)
96-118 95-72
#3
P25 (h) P23 (c)
68 ºC d(CCCTAGGGAAACCTGGAGGAAGTC) d(ATCCCTGAAGGACTTCTTCCCCGC)
92-115 91-68
#4
P35 (h) P33 (c)
60 ºC d(GAGGAAACCTGGAGGAAGTCGAGG) d(GGGGATCCCTGAAGGACTTCTTCC)
96-118 95-72
#5
P34 (h) P33 (c)
60 ºC d(GTGGAAACCTGGAGGAAGTCGAGG) d(GGGGATCCCTGAAGGACTTCTTCC)
96-118 95-72
#6
P32 (h) P33 (c)
60 ºC d(GCGGAAACCTGGAGGAAGTCGAGG) d(GGGGATCCCTGAAGGACTTCTTCC)
96-118 95-72
#7 P39 (h) P40 (c)
60 ºC d(CCGCGCGGAAACCTGGAGGAAG) d(ATCCCTGAAGGACTTCTTCCCC)
92-113 91-70
#8 P17 (h) P18 (c)
61 ºC d(CGGGCAAACCTGGAGGAAGTCGAG) d(GGCATCCCTGAAGGACTTCTTCCC)
95-118 94-71
#9
P26 (h) P27 (c)
68 ºC d(GGTAACCTGGAGGAAGTCGAGGTC) d(CCGGGGATCCCTGAAGGACTTC)
98-121 97-76
#10
P28 (h) P27 (c)
68 ºC d(GGCAACCTGGAGGAAGTCGAGGTC) d(CCGGGGATCCCTGAAGGACTTC)
98-121 97-76
#11
P29 (h) P27 (c)
68 ºC d(GGACACCTGGAGGAAGTCGAGGTC) d(CCGGGGATCCCTGAAGGACTTC)
98-121 97-76
#12 P31 (h) P27 (c)
68 ºC d(GGAACCCTGGAGGAAGTCGAGGTC) d(CCGGGGATCCCTGAAGGACTTC)
98-121 97-76
#13
P30 (h) P27 (c)
68 ºC d(GGAATCCTGGAGGAAGTCGAGGTC) d(CCGGGGATCCCTGAAGGACTTC)
98-121 97-76
#14
P22 (h) P23 (c)
68 ºC d(TCCCGGGGAAACCTGGAGGAAGTC) d(ATCCCTGAAGGACTTCTTCCCCGC)
92-115 91-68
#15
P21 (h) P20 (c)
58 ºC d(GACAACCCGGTGGAAACAACTGAAG) d(TCCAGAGAGAAGCTCCGGGCGAGG)
263-287 262-239
#16
P19 (h) P20 (c)
58 ºC d(GACCACCCGGTGGAAACAACTGAAG) d(TCCAGAGAGAAGCTCCGGGCGAGG)
263-287 262-239
#17 P41 (h) P42 (c)
60 ºC d(GACGTCCTTCAGGGATCCCCG) d(TTCCCCGCCGCCTCTTTTTTC)
76-96 75-55
#18 P37 (h) P38 (c)
60 ºC d(GGTAGTCGAGGTCGGGGGGGAC) d(TCCAGGTTTCCCCGGGGATCC)
109-130 108-88
#silvestre (wt)
P43 (h) P45 (c)
65 ºC d(GGCAGGAAAAGAAAAAAGAGGCGG) d(TGCAGGGTCAGGTGAGCACCAC)
45-68 44-23
_______________________________________________________________Materiales y métodos
66
14.1.4. Amplificación de los cDNAs monoméricos mutados
La reacción se llevó a cabo como se ha detallado en el apartado 14.1.2., a excepción de los
cebadores que fueron el P43 y el P44 (Tabla 6), los moldes utilizados (las construcciones con los
cDNAs monoméricos mutados), y las condiciones de incubación que consistieron en 30 ciclos de
30 s a 94 ºC, 30 s a 65 ºC, 40 s a 72 ºC con una extensión final de 3 min 30 s a 72 ºC. Los productos
se analizaron por PAGE no desnaturalizante en geles del 5%, y la banda del tamaño esperado se
eluyó del gel como se indica en el apartado 4.1.4., se recuperó por precipitación etanólica y se
resuspendió en 10 µl de agua destilada estéril.
14.1.5. Ligación de los cDNAs monoméricos para producir cDNAs diméricos
La reacción se realizó en un volumen final de 15 µl conteniendo los 10 µl del cDNA
monomérico mutado y el resto de componentes descritos en el apartado 14.1.3. y se incubó 1 h a
temperatura ambiente. Una vez concluido el tiempo de reacción se llevó el volumen a 200 µl con
agua estéril, se extrajo con un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) y los
ácidos nucleicos se recuperaron por precipitación etanólica y se resuspendieron en 10 µl de agua
destilada estéril. Los productos se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%, y el
cDNA dimérico se recortó del gel y se eluyó como se indica en el apartado 4.2.
14.1.6. Clonación de los cDNAs diméricos en el vector pBKS+
En un volumen final de 15 µl se mezclaron 30 ng de vector pBKS+ digerido en EcoRV con una
cantidad de tres a cinco mayor (en términos molares) del inserto y con el resto de componentes
detallados en el apartado 14.1.3. La reacción se incubó de 2 a 3 h a temperatura ambiente, ó 16 h a
14 ºC. Transcurrido ese tiempo la mitad de la reacción de ligación se utilizó para transformar
células de E. coli DH5α. A continuación los clones que contenían cDNAs diméricos en tandem
clonados en orientación 5’-3’ se seleccionaron mediante digestión con enzimas de restricción
apropiados, y se secuenciaron para confirmar que no se había introducido ningún cambio en la
secuencia de los cDNAs durante la segunda amplificación por PCR.
14.1.7. Subclonación de los cDNAs diméricos en el vector de transformación pCK45
Con el propósito de liberar los cDNAs diméricos clonados en el vector pBKS+, 10 µg de cada
construcción se incubó durante 16 h a 37 ºC con 40 U de las enzimas de restricción EcoRI y SalI
(Fermentas). Una vez finalizada la digestión los productos se separaron mediante electroforesis en
geles de agarosa al 1% y los cDNAs diméricos se purificaron como se indica en el apartado 4.2. A
continuación, para linealizar el vector de transformación pCK45 (Fig. 27), 4 µg del mismo se
_______________________________________________________________Materiales y métodos
67
digirieron con las mismas enzimas pero con la mitad de unidades y durante el mismo periodo de
tiempo. Una vez concluida la incubación el vector linealizado se purificó, sin pasar por gel,
mediante el estuche “Qiaquick” (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las
reacciones de ligación se efectuaron en un volumen final de 10 µl conteniendo 100 ng del vector
pCK45 linealizado, una cantidad de tres veces mayor (en términos molares) de inserto,
Tris-HCl 40 mM, pH 7.8, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 0.5 mM, y 5 U de DNA ligasa del
fago T4. La mezcla se calentó 5 min a 55 ºC y se enfrió rápidamente en hielo antes de la adición de
la enzima. La reacción de ligación se prolongó durante 16 h a 22 ºC.
Figura 27. Mapa del vector de transformación pCK45 en el que se clonaron los cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones específicas.
14.2. Transformación de A. thaliana mediante el método de la inmersión floral
Este proceso se realizó por el mtodo de la inmersión floral descrito por Clough y Bent (1998).
Las semillas de A. thaliana se sembraron en macetas y las plantas resultantes se cultivaron en
condiciones de día largo hasta que el tallo de la inflorescencia primaria alcanzó unos 10 cm de
altura. En ese momento para favorecer la brotación de las inflorescencias secundarias el tallo se
decapitó y la transformación se realizó cuando empezaron a aparecer las primeras flores.
Una colonia aislada de A. tumefaciens con la construcción correspondiente se utilizó para
inocular 200 ml de medio líquido LB con kanamicina (100 mg/l) y rifampicina (50 mg/l) en un
_______________________________________________________________Materiales y métodos
68
matraz Erlenmeyer estéril de 1 l que se incubó a 28 ºC con agitación (200 rpm) hasta conseguir una
DO600 de 0.8. Las células se recogieron por centrifugación a 8000 rpm durante 15 min a 4 ºC y se
resuspendieron en 200 ml de una solución de sacarosa al 5% y el surfactante Silwet L-77 al 0.05%.
Las yemas florales se sumergieron en esta solución durante 10 s hasta quedar totalmente empapadas
y posteriormente las plantas se cubrieron con una bolsa de plástico que se retiró al día siguiente. Las
plantas se siguieron cultivando en condiciones de día largo en fitotrón o en invernadero hasta el
momento de recolección de las semillas.
1155.. TTrraannssffoorrmmaacciióónn ttrraannssiittoorriiaa ddee GG.. aauurraannttiiaaccaa yy SS.. llyyccooppeerrssiiccuumm ccoonn ccDDNNAAss
ddiimméérriiccooss ddeell CCEEVVdd
La infiltración con los cDNAs diméricos mutados del CEVd, clonados en el vector pCK45, se
realizó sobre las dos primeras hojas verdaderas de plantas de S. lycopersicum y sobre las dos hojas
apicales de plantas de G. aurantiaca (con 8-10 hojas) cultivadas con ciclos de 32°C y 16 h de luz y
27°C y 8 h de oscuridad.
Con el propósito de conseguir los cultivos necesarios para la transformación se empleó una
colonia aislada de A. tumefaciens con la construcción correspondiente para inocular 200 ml de
medio líquido LB con kanamicina (100 mg/l) y rifampicina (50 mg/l) en un matraz Erlenmeyer
estéril de 1 l que se incubó a 28 ºC con agitación (200 rpm) hasta conseguir una DO600 de 0.5. Las
células se recogieron por centrifugación a 8000 rpm durante 15 min a 4 ºC y se resuspendieron en
25 ml de una solución de MES-NaOH 10 mM, pH 5.6, MgCl2 10 mM y acetosiringona 150 µM, y
se incubaron 2 h a 28 ºC. Una vez transcurrido este tiempo el envés de las hojas se infiltró
presionando con una jeringa de 5 ml cargada con el cultivo, comprobando su entrada en el
apoplasto. Para el bioensayo de cada muestra, se utilizaron bloques de cinco plantas, incluyendo
siempre como controles negativos uno inoculado sólo con tampón y otro con el plásmido de
transformación sin inserto, y como control positivo un tercero con plantas inoculadas con RNAs
monoméricos circulares del CEVd purificados de G. aurantiaca. Tras la inoculación, las plantas se
siguieron cultivando en las mismas condiciones hasta la aparición de los síntomas.
1166.. AAnnáálliissiiss ddee llaass pprrooggeenniieess rreeccuuppeerraaddaass ddee ppllaannttaass ttrraannssffoorrmmaaddaass
ttrraannssiittoorriiaammeennttee ccoonn ccDDNNAAss ddiimméérriiccooss mmuuttaaddooss ddeell CCEEVVdd Para este fin se empleó el estuche “Titan One Tube RT-PCR System” (Roche Applied Science)
siguiendo las instrucciones del fabricante y haciendo uso de los cebadores P43 y P44 (Tabla 6). Los
_______________________________________________________________Materiales y métodos
69
productos de la amplificación se analizaron mediante PAGE no desnaturalizante en geles del 5%, y
la banda de tamaño esperado se eluyó del gel como se indica en el apartado 4.1.4, se recuperó por
precipitación etanólica y se resuspendió en 10 µl de agua destilada estéril. El cDNA purificado se
clonó en el vector pTZ57R/T como se ha detallado en el apartado 8.5.
70
RReessuullttaaddooss
71
72
_______________________________________________________________________Resultados
73
11.. SSiittiioo ddee pprroocceessaammiieennttoo ddee llooss oolliiggóómmeerrooss ddee ppoollaarriiddaadd ppoossiittiivvaa ddee llooss
mmiieemmbbrrooss ddee llaa ffaammiilliiaa PPoossppiivviirrooiiddaaee
El modo más directo para identificar el sitio de procesamiento es analizar los intermediarios
replicativos o los RNAs viroidales monoméricos lineales purificados de plantas huésped infectadas.
Sin embargo, la baja acumulación de los primeros dificulta su aislamiento y caracterización, y la
heterogeneidad de los segundos impide asociar los extremos 5’ presentes en la población con el
mecanismo que los originó. No todos los RNAs monoméricos lineales proceden del corte de los
oligómeros de polaridad positiva, pues algunos derivan de la ruptura de las formas monoméricas
circulares, las más abundantes, como consecuencia de su degradación in vivo o in vitro durante la
manipulación. Estas limitaciones han obligado a desarrollar estrategias que simplifiquen el análisis
pero, a pesar de los repetidos intentos, el sitio de procesamiento no ha sido determinado de forma
inequívoca debido a que las conclusiones se sustentan en pruebas indirectas o análisis sesgados de
la molécula mediante metodologías in vitro. Con el fin de aportar datos que permitiesen identificar
este sitio claramente se eligió A. thaliana como sistema heterólogo tras observar que contiene las
enzimas necesarias para procesar correctamente transcritos diméricos de polaridad positiva de
miembros representativos de la familia Pospiviroidae expresados transgénicamente (Daròs y
Flores, 2004). Esta metodología tiene la ventaja de ser in vivo y de emplear construcciones
diméricas que atenúan el sesgo del análisis.
El estudio se centró en el CEVd, HSVd, y ASSVd, cada uno perteneciente a un género distinto,
ya que la importancia del procesamiento dentro del ciclo replicativo llevó a pensar en la
conservación del sitio en la estructura primaria y/o secundaria de todos los miembros de la familia.
1.1. Transcritos diméricos de polaridad positiva del CEVd son procesados correctamente en
plantas transgénicas de A. thaliana
El estudio del procesamiento de transcritos diméricos de polaridad positiva y negativa del HSVd
en plantas transgénicas de A. thaliana, puso de manifiesto que la capacidad de interaccionar con las
enzimas celulares es una característica intrínseca de las moléculas viroidales, tal y como ocurre en
plantas huésped (Daròs y Flores, 2004). Para confirmar estos resultados con un segundo miembro
de la familia Pospiviroidae, preparaciones de ácidos nucleicos obtenidas de plantas de ginura
infectadas con CEVd y de plantas transgénicas de A. thaliana expresando transcritos diméricos de
polaridad positiva o negativa de dicho viroide, se separaron mediante simple PAGE
desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) o doble PAGE, y se analizaron por hibridación Northern
utilizando dos ribosondas para detectar los RNAs viroidales de ambas polaridades (Fig. 28). En los
_______________________________________________________________________Resultados
74
geles de poliacrilamida desnaturalizantes las formas circulares de los viroides quedan retrasadas con
respecto a sus formas lineales de igual tamaño. Cuando las muestras fueron analizadas en este tipo
de geles se comprobó que el corte del transcrito primario y la ligación de las moléculas lineales
generadas tiene lugar únicamente en plantas transgénicas que expresan un dímero de polaridad
positiva (Fig. 28A y 28B, carril 4), que en A. thaliana los niveles de acumulación de las formas
monoméricas lineales es superior al de las formas circulares a diferencia de lo que ocurre en una
planta huésped (Fig. 28A, comparar carriles 2 y 4), y que la expresión de un dímero de polaridad
negativa sirve de molde para la síntesis de un oligómero de polaridad complementaria (Fig. 28A,
carril 5). Para confirmar que a pesar de no ser una planta huésped A. thaliana tiene las enzimas
necesarias para la replicación, las preparaciones de ácidos nucleicos se separaron mediante doble
PAGE antes de su análisis. Este sistema (ver más adelante), consiste en el fraccionamiento del
extracto inicial mediante una primera electroforesis en condiciones no desnaturalizantes seguida de
una segunda en condiciones desnaturalizante (TBE 0.25X, urea 8 M), que permite una separación
mayor de las formas viroidales monoméricas entre sí y con los RNAs celulares que pudieran
interferir en la detección posterior. Dicha metodología reveló que la expresión de un dímero de
polaridad negativa sirve de molde para la síntesis de un oligómero de polaridad complementaria,
molécula sobre la que actúa la maquinaria enzimática de corte y ligación (Fig. 28C, carril 5). La
baja concentración de formas monoméricas lineales generadas a partir del transcrito dimérico de
Figura 28. Análisis de RNAs del CEVd purificados de ginura y A. thaliana mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) (A y B), o doble PAGE (C), e hibridación Northern utilizando ribosondas para detectar los RNAs de polaridad positiva (A y C) y negativa del viroide (B). Carriles 1 y 2, RNA de tejido de ginura sano e infectado con CEVd, respectivamente. Carril 3, RNA de plantas de A. thaliana no transformadas. Carriles 4 y 5, RNA de plantas de A. thaliana que expresan un dímero de polaridad positiva y negativa del CEVd, respectivamente. Las posiciones del transcrito primario y de los RNAs monoméricos circulares y lineales del CEVd (CEVdC y CEVdL, respectivamente) están indicados junto a los geles. Para facilitar la detección de las formas monoméricas de polaridad positiva generadas a partir del transcrito dimérico de polaridad negativa, el extracto de plantas infectadas de ginura se diluyó y la cantidad de RNA aplicada en el carril 5 fue el doble que la aplicada en el carril 4.
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5(A) (B) (C)
CEVdL
CEVdC
CEVdL
CEVdC
Transcrito primario
PAGE desnaturalizante Doble PAGE
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5(A) (B) (C)
CEVdL
CEVdC
CEVdL
CEVdC
Transcrito primario
PAGE desnaturalizante Doble PAGE
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5(A) (B) (C)
CEVdL
CEVdC
CEVdL
CEVdC
Transcrito primario
PAGE desnaturalizante Doble PAGE
_______________________________________________________________________Resultados
75
polaridad negativa indica que en este sistema experimental los niveles de replicación son muy
bajos, ya que la infección de una planta huésped susceptible con una concentración equivalente de
RNAs monoméricos circulares da lugar a una elevada cantidad de formas viroidales.
Así pues, estos resultados confirmaron que en A. thaliana los RNAs viroidales monoméricos y
lineales proceden mayoritariamente del corte del transcrito primario, a diferencia de lo que ocurre
en una planta infectada dónde únicamente una fracción de las mismas son consecuencia del corte de
los RNAs oligómericos y donde no existen marcadores químicos que permitan identificar a dicha
fracción.
1.2. Infectividad de los RNAs monoméricos circulares del CEVd y HSVd procesados in vivo
Para confirmar que las formas monoméricas circulares generadas en plantas transgénicas son
equivalentes a las de plantas huésped, se comparó la infectividad de los RNAs monoméricos
circulares del CEVd y HSVd purificados de plantas transgénicas de A. thaliana con los aislados de
plantas de ginura y pepino infectadas con formas monoméricas circulares de uno u otro viroide,
respectivamente. Conviene señalar que la variante de secuencia del HSVd utilizada para infectar
plantas huésped y en la obtención de las plantas transgénicas es la misma, mientras que con el
CEVd se empleó una variante para transformar A. thaliana y una población de RNAs viroidales
mantenidos mediante pases seriados en ginura para infectar plantas huésped.
A B
Figura 29. Ensayo de infectividad de los RNAs monoméricos circulares del CEVd. (A) En la izquierda se muestra una planta de tomate sana, y en la parte central y derecha plantas infectadas con RNAs purificados de A. thaliana y ginura, respectivamente. (B) En la parte superior, media e inferior se muestran hojas de plantas de tomate sanas e infectadas con los RNAs aislados de A. thaliana y ginura, respectivamente. La intensidad de los síntomas (enanismo, clorosis y epinastia) es más acusada en las plantas inoculadas con formas circulares purificadas de ginura.
_______________________________________________________________________Resultados
76
Como huésped experimental del CEVd se empleó tomate teniendo en cuenta estudios previos en
los que se observó que requiere un título viroidal inferior que ginura para su infección. Se utilizaron
bloques de tres plantas en el estadío de dos hojas verdaderas, uno inoculado con tampón como
control negativo, y los otros dos inoculados con 10 ng de formas monoméricas circulares
purificadas de ginura o de A. thaliana. A las tres semanas las plantas inoculadas con tampón
permanecieron asintomáticas, las plantas inoculadas con RNAs circulares de ginura presentaron
epinastia, clorosis foliar y enanismo, mientras que las inoculadas con formas circulares de
A. thaliana mostraron los mismos síntomas pero con una intensidad menor (Fig. 29). A las cinco
semanas de la inoculación se recogió material de cada planta y se analizó mediante impresiones de
tejido sobre membranas de nylon, confirmándose que todas las plantas inoculadas con formas
circulares estaban infectadas (Fig. 30).
Figura 30. Análisis de plantas de tomate inoculadas mecánicamente con RNAs monoméricos circulares del CEVd mediante impresión de tejido e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa a las cinco semanas de su inoculación. (A) Plantas inoculadas con tampón. (B) y (C) Plantas inoculadas con formas viroidales aisladas de plantas transgénicas de A. thaliana y ginura, respectivamente. Cada planta se analizó por duplicado.
Los RNAs viroidales recuperados de plantas infectadas se analizaron mediante clonaje y
secuenciación. Las variantes de secuencia recuperadas de plantas infectadas con formas circulares
aisladas de ginura presentaron un mayor número de cambios con respecto a la secuencia de
referencia, fundamentalmente en el dominio patogénico, circunstancia que podría explicar la mayor
intensidad de los síntomas mostrados por estas plantas (Tabla 7). Estos datos son consistentes con la
procedencia de los RNAs ensayados, pues la población de formas monoméricas circulares aisladas
de ginura está formada por variantes de secuencia que han sufrido un proceso de selección y
adaptación al huésped mediante pases seriados, a diferencia de las formas recuperadas de plantas
transgénicas de A. thaliana.
A
B
C
_______________________________________________________________________Resultados
77
Para el ensayo de infectividad de los RNAs circulares del HSVd se eligió pepino como huésped
experimental. En el estadio de dos cotiledones y primera hoja verdadera se inocularon tres bloques
de tres plantas, uno con tampón como control negativo y los otros dos con 20 ng de formas
circulares purificadas de plantas transgénicas de A. thaliana o de pepino. A las tres semanas de la
inoculación las plantas control permanecieron asintomáticas mientras que las restantes mostraron
los síntomas típicos de clorosis, epinastia y enanismo con intensidad similar independientemente
del origen de los RNAs viroidales (Fig. 31).
Tabla 7. Cambios encontrados en las variantes de secuencia del CEVd recuperadas de plantas de tomate inoculadas con RNAs monoméricos circulares de ginura o de A. thaliana
CGGGAUCUUUCU
UG AG GUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U
CUUCAA
CCCCAAA
CCGCUUUUCUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
10 20 30 40 50 60 70 80
290300310320
330340350360
TL P
220
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
10 20 30 40 50 60 70 80 90100
110120 130 140 150 160 170 180
190200210
230240250260270280
290300310320
330340350360
CGGGAUCUUUCU
UG AG GUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U
CUUCAA
CCCCAAA
CCGCUUUUCUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
10 20 30 40 50 60 70 80
290300310320
330340350360
TL P
220
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
10 20 30 40 50 60 70 80 90100
110120 130 140 150 160 170 180
190200210
230240250260270280
290300310320
330340350360
1 La posición de los cebadores y de las mutaciones está indicada respecto a una variante idéntica a la variante M34917
excepto en que la primera presenta una deleción entre las posiciones 70 y 74. El símbolo ∇ indica inserción de una guanina. En la parte inferior se muestra la estructura en varilla propuesta para el CEVd con la región que contiene los cambios ampliada. Las abreviaturas TL y P hacen referencia a los dominios terminal izquierdo y patogénico, respectivamente.
En resumen, los datos obtenidos apoyan el modelo de A. thaliana para el estudio del
procesamiento in vivo pues, al igual que ocurre en una planta huésped, los factores implicados
actúan específicamente sobre las formas viroidales de polaridad positiva, y los RNAs viroidales
monoméricos circulares generados presentan infectividad como los generados en un huésped típico.
A continuación se analizó si el sitio de procesamiento de los transcritos diméricos expresados
Procedencia Cebadores1 Clon Cambios encontrados1 Ginura 45-68, 44-23 1 U6→A; ∇ G70-G74 ; A300→G; G312→A; U313→A; C349→UGinura 45-68, 44-23 2 U6→A; ∇G70-G74; A300→G; G312→A; C349→U Ginura 45-68, 44-23 3 U6→A; ∇ G70-G74; A300→G; G312→A; C349→U Ginura 45-68, 44-23 4 U6→A; ∇ G70-G74; A300→G; G312→A; C349→U Ginura 45-68, 44-23 5 U6→A; ∇ G70-G74; A79→G; A300→G; G312→A; C349→U
A. thaliana 45-68, 44-23 6 ∇ G70-G74; A320→ U A. thaliana 45-68, 44-23 7 ∇ G70-G74: A320→ U A. thaliana 45-68, 44-23 8 ∇ G70-G74 A. thaliana 45-68, 44-23 9 Sin cambios A. thaliana 45-68, 44-23 10 Sin cambios
_______________________________________________________________________Resultados
78
transgénicamente coincide con el de los oligómeros de polaridad positiva, determinando el extremo
5’ de los RNAs monoméricos lineales aislados de plantas transgénicas de A. thaliana y de plantas
infectadas.
A B
Figura 31. Ensayo de infectividad de los RNAs monoméricos del HSVd. (A) En la izquierda se muestra una planta de pepino sana y en la parte central y derecha plantas infectadas con RNAs purificados de plantas transgénicas de A. thaliana y pepino, respectivamente. (B) En la parte superior se muestra una hoja, una flor y un fruto de una planta sana, y en la parte media e inferior hojas y flores de plantas infectadas con RNAs purificados de plantas de A. thaliana y pepino, respectivamente. Las plantas infectadas mostraron los síntomas de enanismo, epinastia, clorosis, y desarrollo anómalo de las flores.
1.3. Sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del CEVd
Para la identificación del extremo 5’ de los RNAs viroidales monoméricos y lineales procesados
in vivo se eligió la técnica de extensión del cebador (Fig. 32). Esta metodología consiste en la
síntesis de una molécula de DNA complementaria (cDNA) a partir del RNA objeto de estudio en
presencia de dNTPs y cebadores específicos marcados radiactivamente. Los productos de las
retrotranscripciones se analizan mediante PAGE desnaturalizante en paralelo a un patrón de
tamaño, o a una escalera de secuenciación realizada sobre un cDNA homólogo con el mismo
cebador empleado en la retrotranscripción. El tamaño del cDNA indica la distancia en nucleótidos
que separa el extremo 5’ del cebador del extremo 5’ del RNA. Sin embargo, la interpretación de los
resultados no es tan directa cuando se trabaja con viroides debido a la formación de estructuras
secundarias que pueden detener a la polimerasa antes de alcanzar el extremo del RNA. Un modo de
solventar este inconveniente es comparar los productos obtenidos sobre las formas monoméricas
_______________________________________________________________________Resultados
79
lineales y circulares, ya que en principio ambos moldes pueden adoptar las mismas estructuras
secundarias.
C
A C G T RT
A
B
AAGGCC
5’ 3'
5’3’
Retrotranscripción
5’ 3’
C
A C G T RT
A
B
AAGGCC
5’ 3'
5’3’
Retrotranscripción
5’ 3’
Figura 32. Técnica de extensión del cebador empleada en la determinación del extremo 5’ de los RNAs viroidales monoméricos lineales. (A) Anillamiento de las formas monoméricas lineales purificadas con un cebador específico (flecha amarilla) marcado radiactivamente. (B) Reacción de retrotranscripción. (C) Análisis del cDNA sintetizado mediante PAGE desnaturalizante, junto a la escalera de secuenciación (A, C, G, T) realizada con el mismo cebador sobre un cDNA monomérico del viroide. La banda de la escalera de secuenciación que comigre con el cDNA elongado (en verde) indica el extremo 5’ del RNA. La secuencia del extremo 5’ del RNA se indica en verde. El RNA se representa en color oscuro y el DNA en colores claros.
El análisis se comenzó con el CEVd, miembro del género Pospiviroide, por ser de los tres
viroides estudiados el que presenta una mayor acumulación de RNAs monoméricos lineales en
plantas transgénicas (Daròs y Flores, 2004), circunstancia que debía facilitar la identificación del
sitio de corte. Con el fin de aislar las formas viroidales monoméricas, las preparaciones de ácidos
nucleicos totales procedentes de tejido de ginura infectado o de plantas de A. thaliana transgénicas
que expresan un dímero de polaridad positiva, se separaron mediante dos electroforesis
consecutivas en geles de poliacrilamida del 5% (doble PAGE) (Fig. 33). La primera electroforesis
en condiciones no desnaturalizantes permitió, con la ayuda de marcadores de tamaño apropiados,
recortar el fragmento del gel donde comigran las formas lineales y circulares del viroide. A
continuación los ácidos nucleicos contenidos en el mismo se resolvieron en un segundo gel
desnaturalizante en condiciones de baja fuerza iónica (TBE 0.25X, urea 8 M), lo que posibilitó una
clara separación entre las formas circulares y lineales (Fig. 33). Una vez concluida la segunda
electroforesis los RNAs viroidales fueron eluídos del gel para su caracterización posterior.
Es de destacar que la acumulación de los RNAs viroidales monoméricos lineales en los
extractos de plantas transgénicas de A. thaliana es superior a la de las correspondientes formas
_______________________________________________________________________Resultados
80
circulares, a diferencia de lo que ocurre en plantas de ginura infectadas (Fig. 33B), posiblemente
debido a una ligación menos eficiente de las moléculas lineales o a una inestabilidad mayor de las
formas circulares.
A
B
CEVd
CEVdC
CEVdL
7S
100
500
1000
11121314151617181920
CEVdL
CEVdC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11121314151617181920
7S 7S
A
B
CEVd
CEVdC
CEVdL
7S
100
500
1000
1112131415161718192011121314151617181920
CEVdL
CEVdC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1112131415161718192011121314151617181920
7S 7S
Tras comprobar mediante simple PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) e hibridación
Northern la ausencia de otros RNAs del CEVd en cada una de las muestras, se determinó el
extremo 5’ de las formas monoméricas lineales purificadas de A. thaliana mediante extensión del
cebador. El patrón de retrotranscripción que se obtuvo con los cebadores P1, P2 y P3 fue
coincidente: un producto mayoritario que localizó el sitio de corte del transcrito primario en la rama
superior de la CCR (Fig. 34), indicando que las moléculas monoméricas lineales proceden
mayoritariamente de dicho transcrito y no de la degradación de los RNAs monoméricos circulares.
Este sitio es consistente con los datos obtenidos previamente por algunos grupos mediante
bioensayos de infectividad (Visvader et al., 1985; Meshi et al., 1985; Hammond et al., 1989b;
Figura 33. Fraccionamiento de RNAs purificados de plantas de ginura infectadas con el CEVd y de plantas transgénicas de A. thaliana mediante doble PAGE preparativa y tinción con bromuro de etidio. (A) La fracción de ácidos nucleicos solubles en LiCl 2 M, procedentes de plantas de ginura infectadas (carriles 1-10) y de plantas de A. thaliana transformadas con un dímero de polaridad positiva de dicho viroide (carriles 13-20), se separaron en una primera electroforesis en condiciones no desnaturalizantes. (B) Los ácidos nucleicos contenidos en el fragmento del gel delimitado por las bandas del CEVd y el RNA 7S, o por las bandas de 300 y 400 nucleótidos, se separaron en una segunda electroforesis en condiciones desnaturalizantes de baja fuerza iónica (TBE 0.25X, urea 8 M). Una vez finalizada, los RNAs monoméricos circulares (CEVdC) y lineales (CEVdL) fueron eluídos. Carril 11, preparación control de RNA de plantas de ginura infectadas con el CEVd. Carril 12, marcador de múltiplos de 100 pares de bases.
_______________________________________________________________________Resultados
81
Candresse et al., 1990), o metodologías in vitro (Baumstark et al., 1997; Schrader et al., 2003). Sin
embargo ninguna de las dos metodologías ha permitido determinar claramente el sitio de
procesamiento pues el empleo de cualquiera de ellas ha dado lugar a resultados contradictorios.
1 2 3 4
540
267213124/123
104
80
57
A
B
CGGGAUCU
UUCU
UGAG GUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
A
ACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40
320360
P1 (259 nt) nt)
CGGGAUCU
UUCU
UGAG GUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
A
ACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40
320360
P1 (259 nt) nt)
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AA
80 120 160
200240280
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AA
80 120 160
200240280
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
CGGGAUCU
UUCU
UGAGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G A AAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40 80 120 160
200240280
320360
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
P1 (259 nt) nt)
CGGGAUCU
UUCU
UGAGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G A AAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40 80 120 160
200240280
320360
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
P1 (259 nt) nt)
1 2 3 4
540
267213124/123
104
80
57
A
B
CGGGAUCU
UUCU
UGAG GUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
A
ACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40
320360
P1 (259 nt) nt)
CGGGAUCU
UUCU
UGAG GUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
A
ACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40
320360
P1 (259 nt) nt)
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AA
80 120 160
200240280
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AA
80 120 160
200240280
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
CGGGAUCU
UUCU
UGAGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G A AAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40 80 120 160
200240280
320360
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
P1 (259 nt) nt)
CGGGAUCU
UUCU
UGAGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
GA CCCUG
CAG GC AG
G A AAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCC CCGGG
GAA AC
CUGGAGG AAGUCGA
GGUCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAG
CUCGU
CUCCUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
40 80 120 160
200240280
320360
P2 (60 nt)P3 (361 nt)
P1 (259 nt) nt)
Figura 34. Análisis por PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) de los productos de las reacciones de retrotranscripción realizada sobre formas monoméricas lineales del CEVd con la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney, [α-32P] dCTP y los restantes dNTPs no marcados. Carriles 1-3, cDNAs sintetizados a partir de los RNAs monoméricos lineales purificados de A. thaliana con los cebadores P1, P2 y P3, respectivamente, con el producto mayoritario marcado por un asterisco. Carril 4, patrones de DNA (pBR322/HaeIII) marcados radiactivamente con 32P con sus tamaños en nucleótidos a la derecha. (B) Estructura secundaria propuesta para el CEVd. La posición de los cebadores se indica en negrita y con una flecha. Junto al nombre del cebador y entre paréntesis se indica la distancia en nucleótidos que separa a cada uno del extremo 3’ de la rama superior de la CCR (cuya secuencia se ha sombreado en azul).
Si el procesamiento del transcrito dimérico en plantas transgénicas corresponde al de los RNAs
oligómericos de polaridad positiva en plantas huésped, una fracción de las formas monoméricas
lineales purificadas de estas últimas debían presentar el extremo 5’ cartografiado en A. thaliana.
Una vez identificada la región que incluye el sitio de corte, y con el fin de sintetizar cDNAs de
pequeño tamaño que permitieran una buena resolución de las bandas durante la electroforesis y
dificultaran la formación de estructuras secundarias, se eligieron los cebadores P2 y P4 que anillan
en el dominio terminal derecho. En este segundo análisis, los productos de las retrotranscripciones
_______________________________________________________________________Resultados
82
se separaron en paralelo a las escaleras de secuenciación obtenidas sobre cDNAs monoméricos del
CEVd con los mismos cebadores. Entre los RNAs monoméricos lineales aislados de A. thaliana se
determinó un único extremo 5’ correspondiente a la G97, presente también en una fracción de las
moléculas lineales purificadas de ginura pero ausente en las formas monoméricas circulares
(Fig. 35, carriles 5, 6 y 7). Estos resultados localizan el sitio de corte en la rama superior de la CCR
entre los nucleótidos G96 y G97.
A
B
T A C G ml-A.thaliana
ml-ginura
mc-ginura
AUCCCCGGGGA
GG
G
A
5’
3’
A
1 2 3 4 5 6 7
ml-A. thaliana
ml-ginura
mc-ginura
T A C G
1 2 3 4 5 6 7
GGGG
GGAUCCCC
AA
5’
3’
A
P2 P4
GUA
GAAGCCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAG
CUUCUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
A
GUA
GAAGCCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAG
CUUCUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
A
GCUUCGG UCGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGC
P2
P4
GU
CU
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUC
G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
CCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
60 120180
240300360
P2
P4
GU
CU
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUC
G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
CCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
60 120180
240300360
P2
P4
A
B
T A C G ml-A.thaliana
ml-ginura
mc-ginura
AUCCCCGGGGA
GG
G
A
5’
3’
A
1 2 3 4 5 6 7
ml-A. thaliana
ml-ginura
mc-ginura
T A C G
1 2 3 4 5 6 7
GGGG
GGAUCCCC
AA
5’
3’
A
P2 P4
GUA
GAAGCCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAG
CUUCUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
A
GUA
GAAGCCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAG
CUUCUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
A
GCUUCGG UCGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAUUCCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGC
P2
P4
GU
CU
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUC
G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
CCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
60 120180
240300360
P2
P4
GU
CU
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUC
G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCGG
CGGGG
AAGAAG
CCUUCAG
G G AUCCCCG G
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
60 120180
240300360
P2
P4 Figura 35. Determinación del sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del CEVd. (A) PAGE desnaturalizante en la que se comparan las escaleras de secuenciación obtenidas a partir de los plásmidos pBmCEVdB y pBmCEVdS (carriles 1-4) con los productos de las retrotranscripciones sobre RNAs monoméricos empleando los cebadores P2 y P4 marcados radiactivamente, respectivamente. Carril 5, cDNAs sintetizados a partir de formas monoméricas lineales (ml) purificadas de A. thaliana. Carriles 6 y 7, cDNAs sintetizados a partir de ml y formas monoméricas circulares (mc) purificadas de ginura, respectivamente. El nucleótido 5’ de las ml generadas por el corte de los RNAs oligoméricos se indica con un asterisco (G97). (B) Estructura secundaria propuesta para el CEVd. La secuencia de la HPI se señala en azul, y la posición de los cebadores en negrita y con una flecha.
_______________________________________________________________________Resultados
83
El análisis de los productos de la retrotranscripción sobre RNAs monoméricos lineales
purificados de ginura confirmó que sólo una fracción de los mismos tiene su origen en el corte de
los RNAs oligómericos, ya que el correspondiente extremo 5’ no fue el único identificado
(Fig. 35A, carril 6). El resto podría reflejar sitios particularmente sensibles a degradación in vivo
(Kikuchi et al., 1982; Tsagris et al., 1987b) o in vitro durante la manipulación del RNA (Gast
et al., 1998), o sitios alternativos de procesamiento (Hammond et al., 1989b; Tabler et al., 1992;
Rakowski y Symons, 1994).
Es interesante destacar que el sitio de corte identificado se encuentra dentro de un motivo de
secuencia conservado en todos los miembros de la familia Pospiviroidae, la horquilla I (HPI), y más
concretamente en su tetrabucle terminal a continuación de un dinucleótido CG conservado (Flores
et al., 1997) (Fig. 36). Además este sitio coincide con el determinado para el PSTVd en un trabajo
anterior siguiendo una metodología in vitro (Baumstark et al., 1997). Sin embargo, en este último se
concluyó que el motivo que dirige el corte de los oligómeros de polaridad positiva en los viroides
del género Pospiviroide es la formación de una estructura ramificada con un tetrabucle del tipo
GNRA (ver apartado 2.3.2. de la Introducción).
C-G
PSTVdC G
G AA AU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100......
C-G
PSTVdC GC G
G AA AU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100......
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...
1.4. Sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del HSVd
Si el sitio de procesamiento está estructuralmente conservado en los miembros de la familia
Pospiviroidae, el estudio del extremo 5’ de las formas monoméricas lineales del HSVd (género
Hostuviroide) procesadas in vivo debía situarlo en la posición equivalente de la HPI. El análisis
mediante simple PAGE desnaturalizante (urea 8 M, TBE 1X) e hibridación Northern de RNAs de
plantas de pepino infectadas, o de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan un dímero de
Figura 36. Estructura de la horquilla I (HPI) del PSTVd y CEVd. Las letras en blanco, los guiones y los puntos representan nucleótidos conservados en posiciones similares, interacciones canónicas Watson-Crick e interacciones no canónicas, respectivamente. Con una línea discontinua azul se enmarca la secuencia del tetrabucle GNRA. El sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del PSTVd identificado previamente (Baumstark et al., 1997) y del CEVd (determinado en este trabajo), se indican con una punta de flecha.
_______________________________________________________________________Resultados
84
polaridad positiva, reveló que la forma viroidal más abundante en los dos sistemas es la circular
(datos no mostrados). Estos resultados sugieren que la eficiencia del corte del transcrito primario y
de la ligación de los monómeros lineales resultantes es característica de cada viroide. Con el
propósito de purificar los RNAs viroidales monoméricos lineales, la fracción de RNAs solubles en
LiCl 2 M de las dos especies vegetales analizadas se separaron mediante doble PAGE (Fig. 37).
Tras la segunda electroforesis las formas monoméricas lineales no se detectaron mediante tinción
con bromuro de etidio al quedar enmascaradas por RNAs celulares de tamaño similar.
A
B
CEVd
CEVdC
CEVdL
HSVdC
ab
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2
7S
3 4 5 6 7 8 9 1 2
CEVd7S
1011 12 13 14 15 16
1 2
CEVdC
CEVdL
HSVdC
ab
10 11 12 13 14 15 16
7S7S
A
B
CEVd
CEVdC
CEVdL
HSVdC
ab
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2
7S
3 4 5 6 7 8 9 1 2
CEVd7S
1011 12 13 14 15 16
1 2
CEVdC
CEVdL
HSVdC
ab
10 11 12 13 14 15 16
7S7S
Figura 37. Fraccionamiento de RNAs purificados de plantas de pepino infectadas con el HSVd y de plantas transgénicas de A. thaliana mediante doble PAGE preparativa y tinción con bromuro de etidio. (A) La fracción de ácidos nucleicos solubles en LiCl 2 M procedentes de plantas de pepino infectadas (carriles 3-9) y de plantas de A. thaliana transformadas con un dímero de polaridad positiva de dicho viroide (carriles 10-16), se separaron en una primera electroforesis en condiciones no desnaturalizantes. (B) Los ácidos nucleicos contenidos en el fragmento del gel delimitada por el CEVd y el RNA 7S, se separaron en una segunda electroforesis en condiciones desnaturalizantes de baja fuerza iónica (TBE 0.25X, urea 8 M). Carril 1, preparación control de RNA de plantas de ginura infectadas con el CEVd. Carril 2, patrón de RNA de 300 nucleótidos. Las formas circulares del viroide (HSVdC) y los ácidos nucleicos contenidos en el fragmento del gel delimitado por las líneas horizontales a y b se eluyeron. Las posiciones de los RNAs monoméricos circular y lineal del CEVd (CEVdC y CEVdL, respectivamente), del RNA 7S, y de los RNAs monoméricos circulares del HSVd (HSVdC), se indicadan junto a los geles.
Tras cuantificar las formas monoméricas circulares y lineales purificadas y confirmar la ausencia
de otros RNAs viroidales mediante hibridación Northern, se llevó a cabo la retrotranscripción de
cada molde con los cebadores P5 y P6. En el análisis de las formas monoméricas lineales
procedentes de A. thaliana con el P6 se identificaron cuatro extremos 5’, todos ellos presentes en
las formas monoméricas lineales purificadas de pepino, entre los que se encuentra la G83 (Fig. 38,
_______________________________________________________________________Resultados
85
carril 5) situada en el tetrabucle de la HPI en una posición equivalente a la determinada en el
CEVd y en el PSTVd (Fig. 39). Con el P5 se determinó un sólo extremo 5’ correspondiente a la
G84, una posición inmediatamente anterior a la esperada (Fig. 38, carril 5), aunque el estudio del
sitio de corte con este mismo cebador mediante una metodología diferente lo situó en la G83 (ver
más adelante). La diferencia en el número de extremos identificados con los dos cebadores se
debe probablemente a un anillamiento más débil del P5 con los RNAs, como sugiere la
A
B
GAG
CCCG
GGC
AA
G
AA3´
5´A
G
C
1 2 3 4 5 6 7
T A C G ml-A.thaliana
ml-pepino
mc-pepino
mc-pepino
ml-pepino
GCAT ml-A. thaliana
G
3’
GAG
CCCG
GGC
AA
G
AA
5’A
C
1 2 3 4 5 6 7
P6P5
160
G C G GUG C UCUGGA GUA GAGGCU
CUGCCUUCGA
AACAC
CAUCG
AU
P5
CG GA
80
200
AC CUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAU
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
P6
CG GA
80
200
AC CUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAU
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
P6
A AAUG GGG
ACG G
A
4080 120
160200240280
GGCAU
GCA A
AG AAA AA
AAC U AGGCAG GG A
GGUGCU U
A CCUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAUCCA GCGA G AGGCGUGGA GA GA G GGCC G CG GUG C UCUGGA GUA GAG
GCU
CUGCCUUCGA
AACAC
CAUCG
AUCG
UCCC
UUC
UUCUUUACCUUCU
UCUGG
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
UCGC
UCC
AACCUGCUU
UUGUU
CUAUCU
GCGC
CUCUGCCGCGG
AUCCU
CUCUUGAGCCCC
UC
UUC UCGAG
U U GCCGC
AA
P6
P5A AAU
G GGGA
CG GA
4080 120
160200240280
GGCAU
GCA A
AG AAA AA
AAC U AGGCAG GG A
GGUGCU U
A CCUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAUCCA GCGA G AGGCGUGGA GA GA G GGCC G CG GUG C UCUGGA GUA GAG
GCU
CUGCCUUCGA
AACAC
CAUCG
AUCG
UCCC
UUC
UUCUUUACCUUCU
UCUGG
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
UCGC
UCC
AACCUGCUU
UUGUU
CUAUCU
GCGC
CUCUGCCGCGG
AUCCU
CUCUUGAGCCCC
UC
UUC UCGAG
U U GCCGC
AA
P6
P5
A
B
GAG
CCCG
GGC
AA
G
AA3´
5´A
G
C
1 2 3 4 5 6 7
T A C G ml-A.thaliana
ml-pepino
mc-pepino
mc-pepino
ml-pepino
GCAT ml-A. thaliana
G
3’
GAG
CCCG
GGC
AA
G
AA
5’A
C
1 2 3 4 5 6 7
P6P5
160
G C G GUG C UCUGGA GUA GAGGCU
CUGCCUUCGA
AACAC
CAUCG
AU
P5
CG GA
80
200
AC CUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAU
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
P6
CG GA
80
200
AC CUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAU
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
P6
A AAUG GGG
ACG G
A
4080 120
160200240280
GGCAU
GCA A
AG AAA AA
AAC U AGGCAG GG A
GGUGCU U
A CCUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAUCCA GCGA G AGGCGUGGA GA GA G GGCC G CG GUG C UCUGGA GUA GAG
GCU
CUGCCUUCGA
AACAC
CAUCG
AUCG
UCCC
UUC
UUCUUUACCUUCU
UCUGG
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
UCGC
UCC
AACCUGCUU
UUGUU
CUAUCU
GCGC
CUCUGCCGCGG
AUCCU
CUCUUGAGCCCC
UC
UUC UCGAG
U U GCCGC
AA
P6
P5A AAU
G GGGA
CG GA
4080 120
160200240280
GGCAU
GCA A
AG AAA AA
AAC U AGGCAG GG A
GGUGCU U
A CCUGAG
A A AGG GCC CCG GCAACUCUU
C UA GAAUCCA GCGA G AGGCGUGGA GA GA G GGCC G CG GUG C UCUGGA GUA GAG
GCU
CUGCCUUCGA
AACAC
CAUCG
AUCG
UCCC
UUC
UUCUUUACCUUCU
UCUGG
CUCU
UCU
UGGAG
ACGC
GACCGG
UGGC
ACC
CCUGCUCGGU
UCGC
UCC
AACCUGCUU
UUGUU
CUAUCU
GCGC
CUCUGCCGCGG
AUCCU
CUCUUGAGCCCC
UC
UUC UCGAG
U U GCCGC
AA
P6
P5
Figura 38. Determinación del sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del HSVd. (A) PAGE desnaturalizante en la que se compara las escaleras de secuenciación obtenidas a partir del plásmido pBmHSVdE (carriles 1-4) con los productos de las retrotranscripciones empleando los cebadores P5 y P6 marcados radiactivamente. Carril 5, cDNAs sintetizados a partir de formas monoméricas lineales (ml) purificadas de A. thaliana. Carriles 6 y 7, cDNAs sintetizados a partir de ml y formas monoméricas circulares (mc) purificadas de pepino, respectivamente. El nucleótido 5’ de las ml generadas por el corte de los RNAs oligómericos se indica con un asterisco (G83). (B) Estructura secundaria propuesta para el HSVd. La secuencia de la HPI se señala en azul, y la posición de los cebadores en negrita y con una flecha.
_______________________________________________________________________Resultados
86
intensidad del cDNA sintetizado. El origen más probable para el resto de los extremos 5’
identificados es la ruptura de las formas circulares por sitios lábiles de su estructura, aunque no se
puede descartar la presencia de sitios alternativos de procesamiento.
C-G
PSTVdC G
G AA AU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100......
C-G
PSTVdC GC G
G AA AU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100......
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...G A
-85
70-
...
HSVdC GC G
C-GG-C
C-GC-GC-GG-C
C-GC G
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C
...A A
Figura 39. Estructura de la horquilla I (HPI) del PSTVd, CEVd y HSVd. Las letras en blanco, los guiones y los dos puntos representan nucleótidos conservados en posiciones similares, interacciones canónicas Watson-Crick e interacciones no canónicas, respectivamente. El sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva de cada viroide se indica con una punta de flecha. Con una línea discontinua azul se enmarca la secuencia del tetrabucle GNRA. El sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del PSTVd identificado previamente (Baumstark et al., 1997), y del CEVd y HSVd (determinados en este trabajo), se indican con una punta de flecha.
Los datos obtenidos con el HSVd sustentan el papel de la HPI en el procesamiento pero no
excluyen el modelo previamente propuesto para las especies del género Pospiviroide (Baumstark
et al., 1997; Schrader et al., 2003), ya que si bien RNAs diméricos de este viroide no pueden
adoptar una estructura ramificada equivalente a la del PSTVd, la región que contiene el sitio de
corte sí puede formar un tetrabucle GNRA (Fig. 39).
1.5. Sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del ASSVd
Con el fin de discriminar cuál de las dos estructuras, la HPI o la que contiene el tetrabucle
GNRA determina el sito de procesamiento, se incluyó en el estudio el ASSVd (género
Apscaviroide) ya que los RNAs diméricos de este viroide sólo pueden formar la HPI (ver más
adelante). Las formas viroidales monoméricas se purificaron de preparaciones de ácidos nucleicos
de plantas de A. thaliana transformadas con un cDNA dimérico de polaridad positiva y de frutos de
manzano infectados siguiendo la metodología detallada anteriormente (Fig. 40). La acumulación de
los RNAs viroidales monoméricos circulares y lineales en los extractos obtenidos de plantas
transgénicas fue aproximadamente la misma, situación intermedia a la observada en el CEVd y
HSVd (ver Fig. 14).
_______________________________________________________________________Resultados
87
A
CEVd7S
1 2 3 4 5 6 7 8 9
B 1 2
CEVdC
CEVdL
ASSVdC
ASSVdL
3 4 5 6 7 8 9
CEVd7S
1 2 10 11 12 13 14 15 16
1 2
CEVdC
CEVdL ab
ASSVdC
1011 1213 14 15 16
7S7S
A
CEVd7S
1 2 3 4 5 6 7 8 9
B 1 2
CEVdC
CEVdL
ASSVdC
ASSVdL
3 4 5 6 7 8 9
CEVd7S
1 2 10 11 12 13 14 15 16
1 2
CEVdC
CEVdL ab
ASSVdC
1011 1213 14 15 16
7S7S
Figura 40. Fraccionamiento de RNAs procedentes de frutos de manzano infectados con el ASSVd y de plantas transgénicas de A. thaliana mediante doble PAGE preparativa y tinción con bromuro de etidio. (A) La fracción de ácidos nucleicos solubles en LiCl 2 M purificados de frutos infectados de manzano (carriles 3-9) y de plantas de A. thaliana transformadas con un cDNA dimérico de polaridad positiva del dicho viroide (carriles 10-16), se separaron en una primera electroforesis en condiciones no desnaturalizantes. (B) Los ácidos nucleicos contenidos en el fragmento de gel delimitado por las bandas del CEVd y el RNA 7S, se separaron en una segunda electroforesis en condiciones desnaturalizantes de baja fuerza iónica (TBE 0.25X, urea 8 M). Una vez finalizada, los RNAs monoméricos circulares (ASSVdC) y lineales (ASSVdL) fueron eluídos. En la preparación de A. thaliana la baja acumulación de ASSVdL impidió su detección con la tinción por lo que se eluyeron los ácidos nucleicos delimitados por las líneas horizontales a y b. Carril 1, preparación control de RNA de plantas de ginura infectadas con el CEVd. Carril 2, patrón de RNA de 300 nucleótidos. La posición de los RNAs monoméricos circular y lineal del CEVd (CEVdC y CEVdL, respectivamente) y del ASSVd se indican junto a los geles.
El sitio de corte del transcrito dimérico del ASSVd expresado en A. thaliana se determinó por
retrotranscripción de las formas monoméricas lineales purificadas con los cebadores P7 y P8. El
análisis de los productos sintetizados en ambas reacciones fue coincidente: dos cDNAs cuyos
extremos 5’ corresponden con la A91 y la U320 (o la A321), presentes también entre los RNAs
monoméricos lineales purificados de frutos de manzano infectados. Es importante destacar que el
primero de ellos (Fig. 41, carriles 5 y 6) localiza el sitio de corte en la misma posición de la
estructura secundaria de la HPI aún cuando su secuencia difiere notablemente de las anteriores
(Fig. 42). Este resultado no coincide con el propuesto recientemente para el viroide III de los
cítricos (CVd-III, Citrus viroid III) (Owens y Baumstark, 2007), otro miembro del género
Apscaviroide, aunque en este trabajo el sitio de procesamiento se ha inferido de estudios in silico y
del modelo propuesto previamente para el PSTVd (Baumstark et al., 1997; Schrader et al., 2003).
_______________________________________________________________________Resultados
88
No hay datos in vitro o in vivo que sustenten este sitio, a diferencia del identificado en el presente
trabajo.
A
B
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAG
160
P7
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAG
160
P7
ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
U
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GC
GGAC
UCCGGGUG
UAG
C
80
240P8
ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
U
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GC
GGAC
UCCGGGUG
UAG
C
80
240P8
ACGT ml-A. thaliana
ml-manzana
mc-manzana
1 2 3 4 5 6 7
ACGAAGGCCGG
GCUGCU5’
3’
1 2 3 4 5 6 7
ACGAAGGCCGG
AGUAGA5’
3’
ACGT ml-A. thaliana
ml-manzana
mc-manzana
P7 P8
GGU
AAACACCGUG
C
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
320
GGU
AAACACCGUG
C
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
320
UGGU
AAACACCGUG
CGGU CCU
GUGG UUCG C
CCCG
CCAACGC
AGAUA
GAUAAAGAAAA
CGAG GAGA
AGAA GG
A ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
UGC CAGC
ACUAA
GCCGGACGG
CGCC
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAGGC
CCUGUCCGC
CGCUG
CGC
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GCGGAC
UCCGGGUG
UAG
CCCCC
UGUUCUCUC
ACGCUC
UUUUUCUUUG
ACGCAGCG
GCGGGUGGG
UUC
CC
AGGG
UAAA
AC
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
40 80 120 160
200240280
320 P8 P7
UGGU
AAACACCGUG
CGGU CCU
GUGG UUCG C
CCCG
CCAACGC
AGAUA
GAUAAAGAAAA
CGAG GAGA
AGAA GG
A ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
UGC CAGC
ACUAA
GCCGGACGG
CGCC
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAGGC
CCUGUCCGC
CGCUG
CGC
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GCGGAC
UCCGGGUG
UAG
CCCCC
UGUUCUCUC
ACGCUC
UUUUUCUUUG
ACGCAGCG
GCGGGUGGG
UUC
CC
AGGG
UAAA
AC
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
40 80 120 160
200240280
320 P8 P7
A
B
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAG
160
P7
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAG
160
P7
ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
U
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GC
GGAC
UCCGGGUG
UAG
C
80
240P8
ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
U
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GC
GGAC
UCCGGGUG
UAG
C
80
240P8
ACGT ml-A. thaliana
ml-manzana
mc-manzana
1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7
ACGAAGGCCGG
GCUGCU5’
3’
ACGAAGGCCGG
GCUGCU5’
3’
1 2 3 4 5 6 7
ACGAAGGCCGG
AGUAGA5’
3’
ACGT ml-A. thaliana
ml-manzana
mc-manzana
P7 P8
GGU
AAACACCGUG
C
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
320
GGU
AAACACCGUG
C
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
320
UGGU
AAACACCGUG
CGGU CCU
GUGG UUCG C
CCCG
CCAACGC
AGAUA
GAUAAAGAAAA
CGAG GAGA
AGAA GG
A ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
UGC CAGC
ACUAA
GCCGGACGG
CGCC
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAGGC
CCUGUCCGC
CGCUG
CGC
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GCGGAC
UCCGGGUG
UAG
CCCCC
UGUUCUCUC
ACGCUC
UUUUUCUUUG
ACGCAGCG
GCGGGUGGG
UUC
CC
AGGG
UAAA
AC
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
40 80 120 160
200240280
320 P8 P7
UGGU
AAACACCGUG
CGGU CCU
GUGG UUCG C
CCCG
CCAACGC
AGAUA
GAUAAAGAAAA
CGAG GAGA
AGAA GG
A ACU CACCUG
UCGUC
GUCGAC
GAAGGC CGG
UGAG
AAAGG
AGC
UGC CAGC
ACUAA
GCCGGACGG
CGCC
CUCG CACC
AGU
UCCG CU GUGGG
UUCG
CCUACA
AGAA
CGU
ACGGUGUUGAGGC
CCUGUCCGC
CGCUG
CGC
UGC
CACCU
ACUC
UUCG
CGCC
GCUAGUCGA
GCGGAC
UCCGGGUG
UAG
CCCCC
UGUUCUCUC
ACGCUC
UUUUUCUUUG
ACGCAGCG
GCGGGUGGG
UUC
CC
AGGG
UAAA
AC
ACA
AU
AGGUGUUU
CCC
40 80 120 160
200240280
320 P8 P7
Figura 41. Determinación del sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del ASSVd. (A) PAGE desnaturalizante en las que se comparan las escaleras de secuenciación obtenidas a partir del plásmido pUmASSVd y pTmASSVd (carriles 1-4) con los productos de las retrotranscripciones empleando los cebadores P7 y P8 marcados radiactivamente, respectivamente. Carriles 5, cDNAs sintetizados a partir de formas monoméricas lineales (ml) purificadas de A. thaliana. Carriles 6 y 7, cDNAs sintetizados a partir de ml y formas monoméricas circulares (mc) purificadas de frutos de manzano infectados, respectivamente. El extremo 5’ de las ml generadas por el corte de los RNAs oligómericos se indica con un asterisco (A91). (B) Estructura secundaria propuesta para el ASSVd. La secuencia de la HPI se señala en azul, y la posición de los cebadores en negrita y con una flecha. El segundo extremo 5’ identificado entre las ml de A. thaliana se indica en fondo negro.
_______________________________________________________________________Resultados
89
En resumen, el estudio de los RNAs monoméricos lineales de tres miembros de la familia
Pospiviroidae procesados in vivo identificó el sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva
en el tetrabucle terminal de la HPI (Fig. 42), una estructura metaestable conservada en todos los
viroides de dicha familia por estar formada por las secuencias que componen la rama superior de la
CCR y las repeticiones invertidas que la flanquean.
ASSVd
U C
G A
U AC G
G-CU-GC-G
C-GU-A
G-C
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
80-
-91
...
...
PSTVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100......
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...G A
-85
70-
...
HSVdC G
A A
C-GG-C
C-GC G
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C
...
ASSVd
U C
G A
U AC G
G-CU-GC-G
C-GU-A
G-C
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
U C
G A
U AC G
G-CU-GC-G
C-GU-A
G-C
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
C GC G
G-CU-GC-G
G-CU-GC-G
C-GU-A
G-CC-GU-A
G-C
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
C-GU-AC-G
C-GC-G
A-U
80-
-91
...
...
PSTVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
C GC G
G AA A
C-GU-A
C-GC-GU-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100......
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...
CEVdC G
G AA A
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80-
-100
...
...G A
-85
70-
...
HSVdC G
A A
C-GG-C
C-GC G
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C
...G A
-85
70-
...
HSVdC GC G
A A
C-GG-C
C-GC-GC-GG-C
C-GC G
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C
...
Figura 42. Estructura de la horquilla I (HPI) del PSTVd, CEVd, HSVd y ASSVd. Las letras en blanco, los guiones y los dos puntos representan nucleótidos conservados en posiciones similares, interacciones canónicas Watson-Crick e interacciones no canónicas, respectivamente. Con una línea azul o roja discontinua se enmarcan los nucleótidos que forman el tetrabucle GNRA en el PSTVd, CEVd y HSVd, y los situados en posición equivalente en el ASSVd, respectivamente. Estos últimos no forman un tetrabucle GNRA. El sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva del PSTVd identificado previamente (Baumstark et al., 1997) y del CEVd, HSVd y ASSVd (determinados en este trabajo), se indican con una punta de flecha.
22.. MMoottiivvooss iimmpplliiccaaddooss eenn eell pprroocceessaammiieennttoo ddee llooss oolliiggóómmeerrooss ddee ppoollaarriiddaadd
ppoossiittiivvaa ddeell CCEEVVdd
El sitio de procesamiento identificado en el presente trabajo coincide con el determinado para el
PSTVd en un trabajo anterior, donde se propuso que la especificidad del corte de los oligómeros de
polaridad positiva está dirigida por una estructura ramificada con un tetrabucle GNRA, que
subsiguientemente cambia a una conformación extendida con un bucle E que promueve la ligación
(Baumstark et al., 1997). Nuestros datos no apoyan este modelo ya que el ASSVd no puede adoptar
dicha estructura ramificada. Sin embargo, la HPI está conservada en todos los miembros de la
familia, y las secuencias que la componen pueden alternativamente formar en RNAs oligoméricos
una estructura de RNA bicatenario palindrómico que hace tiempo se propuso como el sustrato de la
reacción de corte (Diener, 1986; Hecker et al., 1988). La observación de que la secuencia del
tetrabucle terminal de la HPI de todos los miembros de la familia es palindrómica nos condujo a
_______________________________________________________________________Resultados
90
considerar que la interacción de dos HPI por sus bucles terminales podía desencadenar la formación
de dicha estructura de RNA bicatenario, ya que este tipo de interacciones terciarias desempeñan un
papel relevante en el reconocimiento entre RNAs (Brunel et al., 2002) (Fig. 43).
Con la finalidad de discernir cuál de los dos motivos, el tetrabucle GNRA o la HPI/RNA
bicatenario palindrómico, determina el corte de los oligómeros y asimismo estudiar la función del
bucle E en la ligación de los RNAs monoméricos lineales, se construyeron 16 líneas de A. thaliana
transformadas con cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones específicas.
A
CB
N RA
G
UG
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’ 5’
3’
G
C
C
G C
CG
G
5’3’
C G
GC
C G
GC
A
CB
N RA
G
UG
3’
3’
3’
5’
5’
5’
N RA
G
UG
3’
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’ 5’
3’
G
C
C
G C
CG
G
5’3’
C G
GC
C G
GC
Figura 43. (A) Estructura secundaria de mínima energía libre predicha para el CEVd. Para detalles sobre el código de colores empleado ver el pie de la Fig. 12. (B) Estructura ramificada con un tetrabucle tipo GNRA propuesta para dirigir el procesamiento del PSTVd (Baumstark et al., 1997). (C) Mecanismo propuesto en el presente trabajo para la adopción de la estructura que contiene el sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva de la familia Pospiviroidae. La interacción de dos HPI por sus tetrabucles terminales da lugar a una estructura de RNA bicatenario palindrómico. Únicamente se ha indicado la posición de los nucleótidos conservados en cada uno de los motivos. Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas, respectivamente.
Para determinar la fracción de moléculas monoméricas lineales generadas por el corte del
transcrito primario y la de circulares originadas por la ligación de las primeras, las preparaciones de
RNAs procedentes de cada una de las líneas transgénicas se separaron en geles de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (TBE 1X, urea 8 M) o mediante doble PAGE (TBE 0.25X, urea
8 M), y se analizaron por hibridación Northern con ribosondas de polaridad negativa (Fig. 44). Por
cada línea transgénica se analizaron dos plantas independientes, difiriendo los valores estimados en
menos de un 10% en todos los casos.
_______________________________________________________________________Resultados
91
C
T+T1+T2
B1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
A
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 61087 nt
T
Corte
Ligación
109 nt 607 nt370 nt
L
480 nt 607 nt
T2
109 nt 978 nt
T1
Corte (%) = [(L+C)/(T1+T2+T+C+L)]*100Ligación (%) = [C/ (C+L)]*100
C
L
C
T+T1+T2
B1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
1 2 3
6 5 4
A
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 61 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 61 2 3 4 5 61087 nt
T
Corte
Ligación
109 nt 607 nt370 nt
L
109 nt 607 nt370 nt
LL
480 nt 607 nt
T2
480 nt 607 nt
T2
109 nt 978 nt
T1
109 nt 978 nt
T1
Corte (%) = [(L+C)/(T1+T2+T+C+L)]*100Ligación (%) = [C/ (C+L)]*100
C
L
Figura 44. Procesamiento de transcritos diméricos del CEVd expresados en plantas transgénicas de A. thaliana. (A) Estructura secundaria predicha para el CEVd. El código de colores utilizado se detalla en el pie de la Fig. 12. El sitio de corte se indica con unas tijeras. Los números situados en la parte inferior de cada fragmento muestran los tamaños en nucleótidos de los RNAs. Las letras T, T1, T2, C y L hacen referencia al transcrito primario, a los RNAs generados tras el corte del mismo en un único sitio, a los RNAs monoméricos lineales, y a los RNAs monoméricos circulares, respectivamente. En la parte inferior se indica cómo se ha estimado la fracción (%) de corte y ligación de cada uno de los RNAs. (B) Análisis de RNAs de plantas transgénicas que expresan un dímero de polaridad positiva del CEVd silvestre, mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa. Las flechas indican la posición de cada uno de los RNAs descritos en el panel (A).
2.1. Efectos de mutaciones que afectan a la región central de la rama superior de la CCR
sobre el procesamiento de un transcrito dimérico de polaridad positiva del CEVd
Las mutaciones se eligieron en función de su efecto discriminatorio sobre: i) la horquilla con un
tetrabucle apical GAAA, ii) la HPI/RNA bicatenario palindrómico, ambas estructuras formadas por
secuencias de la rama superior de la CCR, y iii) el bucle E formado por un grupo de nucleótidos de
la rama superior e inferior de la CCR (Fig. 45). Para facilitar la comprensión las mutaciones se han
dividido en tres grupos en función de si se localizan: en la región central de la rama superior de la
CCR, en posiciones periféricas de la rama superior de la CCR, o en la rama inferior de la CCR (los
efectos de los dos últimos grupos se explican en las secciones siguientes).
El mutante #1 (C95→U) no tiene efecto sobre la estabilidad del tallo de la HPI y sólo debilita el
tallo de la horquilla con un tetrabucle apical GAAA (un par G:C es sustituido por un par G:U)
(Fig. 45). Sin embargo, en la estructura de RNA bicatenario palindrómico, esta mutación afecta a un
par conservado filogenéticamente en todos los miembros de la familia Pospiviroidae (Fig. 7)
situado en posiciones muy cercanas a los sitios de corte en ambas cadenas (Fig. 45). Por lo tanto, si
el corte está dirigido por la estructura de RNA bicatenario palindrómico, cambios en esta posición
_______________________________________________________________________Resultados
92
deberían tener un efecto negativo; este fue el caso, la fracción de corte se redujo hasta un 38%
respecto al control (Fig. 46).
Los resultados con el mutante #2 (G96→A) también apoyan la idea anterior porque el cambio no
modifica la estabilidad del tallo de la HPI y fortalece la del tallo de la horquilla con el tetrabucle
apical GAAA (un par G:U es sustituido por un A:U) (Fig. 45). Pero en la estructura de RNA
bicatenario palindrómico esta mutación también afecta a un par conservado en la familia
Pospiviroidae adyacente a los sitios de corte de ambas cadenas, los cuales ya no se encuentran
dentro de una hélice ininterrumpida rica en pares GC (Fig. 45). La fracción de corte descendió por
debajo del 20% respecto al control, lo que es consistente con un papel clave de la estructura de
RNA bicatenario palindrómico en esta reacción (Fig. 46).
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-C G-
U A- 100A A90G A
U A-5’ 3’
95
(#7)G
80110
95
U(#1)G C-
G(#7)
G C-
A U-100
A G90A A
A U-G U-G C-U A-C G-C G-
G C-G C-
A U-
A(#3)
3’ 5’
U(#3)
A(#2)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
(#1)U(#3)U
(#3)A(#2)A
(#7)C(#6)C(#5)U(#4)A
80110
C G-
C G-
C G-G C-
G C-
95
C G-C G-
G C-G C-G C-G C-A U-A U-C G-C G-
U A-U A-U G-U G-
C G-C G-C G-C G-
U A-U A- 100A A90G AG A
U A-U A-5’ 3’
95
(#7)G
80110
95
U(#1)G C-G C-
G(#7)
G C-G C-
A U-100
A GA G90A AA A
A U-G U-G C-U A-C G-C G-
G C-G C-
A U-
A U-A U-G U-G U-G C-G C-U A-U A-C G-C G-C G-C G-
G C-G C-G C-G C-
A U-A U-
A(#3)
3’ 5’
U(#3)
A(#2)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
(#1)U(#3)U
(#3)A(#2)A
(#7)C(#6)C(#5)U(#4)A
80110
C G-C G-
C G-C G-
C G-C G-G C-G C-
G C-G C-
95
5’ 3’
U-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
(#7)G
U(#1)U(#3)
A(#2)A(#3)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
90
95
110
G AA A......
C-G
C-G
5’ 3’
U-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
(#7)G
U(#1)U(#3)
A(#2)A(#3)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
90
95
110
G AA A......
G AA A......
C-G
C-GA AG AG-CG-CG-UC-GC-G
G(#7)
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
A GU C
A GU CA
5’3’
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
A(#3)A(#2)
U(#1)U(#3)
10290
95
C
- - - -
3’
5’
5’
3’86
283
109
255
9685
A AG AG-CG-CG-UC-GC-GG(#7)
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
A GU C
A GU CA
5’3’
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
A(#3)A(#2)
U(#1)U(#3)
10290
95
C
- - - -
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’86
283
109
255
9685
Horquilla I Tetrabucle GAAARNA bicatenariopalindrómico
Bucle E
U
G
G
U 5’
3’
A(#3)
U(#5)A(#4)
C(#6)C(#7)
G
C
- - -
106
259
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
U
G
G
U 5’
3’
A(#3)
U(#5)A(#4)
C(#6)C(#7)
G
C
- - -
106
259
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-C G-
U A- 100A A90G A
U A-5’ 3’
95
(#7)G
80110
95
U(#1)G C-
G(#7)
G C-
A U-100
A G90A A
A U-G U-G C-U A-C G-C G-
G C-G C-
A U-
A(#3)
3’ 5’
U(#3)
A(#2)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
(#1)U(#3)U
(#3)A(#2)A
(#7)C(#6)C(#5)U(#4)A
80110
C G-
C G-
C G-G C-
G C-
95
C G-C G-
G C-G C-G C-G C-A U-A U-C G-C G-
U A-U A-U G-U G-
C G-C G-C G-C G-
U A-U A- 100A A90G AG A
U A-U A-5’ 3’
95
(#7)G
80110
95
U(#1)G C-G C-
G(#7)
G C-G C-
A U-100
A GA G90A AA A
A U-G U-G C-U A-C G-C G-
G C-G C-
A U-
A U-A U-G U-G U-G C-G C-U A-U A-C G-C G-C G-C G-
G C-G C-G C-G C-
A U-A U-
A(#3)
3’ 5’
U(#3)
A(#2)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
(#1)U(#3)U
(#3)A(#2)A
(#7)C(#6)C(#5)U(#4)A
80110
C G-C G-
C G-C G-
C G-C G-G C-G C-
G C-G C-
95
5’ 3’
U-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
(#7)G
U(#1)U(#3)
A(#2)A(#3)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
90
95
110
G AA A......
C-G
C-G
5’ 3’
U-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
(#7)G
U(#1)U(#3)
A(#2)A(#3)
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
90
95
110
G AA A......
G AA A......
C-G
C-GA AG AG-CG-CG-UC-GC-G
G(#7)
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
A GU C
A GU CA
5’3’
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
A(#3)A(#2)
U(#1)U(#3)
10290
95
C
- - - -
3’
5’
5’
3’86
283
109
255
9685
A AG AG-CG-CG-UC-GC-GG(#7)
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
A GU C
A GU CA
5’3’
C(#7)C(#6)U(#5)A(#4)
A(#3)A(#2)
U(#1)U(#3)
10290
95
C
- - - -
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’86
283
109
255
9685
Horquilla I Tetrabucle GAAARNA bicatenariopalindrómico
Bucle E
U
G
G
U 5’
3’
A(#3)
U(#5)A(#4)
C(#6)C(#7)
G
C
- - -
106
259
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
U
G
G
U 5’
3’
A(#3)
U(#5)A(#4)
C(#6)C(#7)
G
C
- - -
106
259
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
Bucle E
U
G
G
U 5’
3’
A(#3)
U(#5)A(#4)
C(#6)C(#7)
G
C
- - -
106
259
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
U
G
G
U 5’
3’
A(#3)
U(#5)A(#4)
C(#6)C(#7)
G
C
- - -
106
259
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
5’
3’
(#3)U(#1)U
A(#2)
(#7)G
- - - - -
91
276
Figura 45. Localización de las mutaciones que afectan a posiciones de la región central de la rama superior de la CCR en los motivos estructurales implicados en el procesamiento de los RNAs oligómericos de polaridad positiva del CEVd. A la izquierda se representa la HPI junto a la estructura de RNA bicatenario palindrómico que alternativamente pueden adoptar las secuencias que la componen en RNAs diméricos, en el centro la estructura ramificada previamente propuesta para dirigir el procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva del género Pospiviroide (Baumstark et al., 1997) y a la derecha la región de la estructura en horquilla que incluye el bucle E y la hélice con una U protuberante adyacente. Las letras en rojo y azul indican nucleótidos conservados en posiciones similares en todos los miembros de la familia Pospiviroidae y del género Pospiviroide, respectivamente, y en verde los nucleótidos característicos del bucle E por comparación al del PSTVd. La línea en forma de S y las puntas de flecha señalan las bases que se entrecruzan mediante irradiación con luz ultravioleta y el sitio de corte, respectivamente. Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas. Las flechas indican la posición y naturaleza de las mutaciones introducidas. Los símbolos iguales (círculos o estrellas) señalan las posiciones mutadas simultáneamente.
El correspondiente doble mutante #3 (C95→U y G96→A) no altera esencialmente la estabilidad
del tallo de la HPI ni el de la horquilla con el tetrabucle apical GAAA pero, a diferencia del mutante
simple #2, restablece la estabilidad de la estructura de RNA bicatenario palindrómico (dos pares
_______________________________________________________________________Resultados
93
G:C consecutivos se sustituyen por pares A:U) (Fig. 45). Sin embargo, la eficiencia del corte no se
recupera (Fig. 46), indicando una restricción en la secuencia de los dos nucleótidos que preceden al
sitio de corte, o en la estabilidad termodinámica de la estructura secundaria en la región próxima al
sitio de corte (en la que prevalecen los pares G:C).
ml
mc
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T,T1 y T2
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7Mutantes
wt
010203040
90100
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7Mutantes
Corte (% vs wt)
ml
mc
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
T,T1 y T2
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7Mutantes
wt
010203040
90100
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7Mutantes
Corte (% vs wt)
010203040
90100
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7Mutantes
Corte (% vs wt)
Figura 46. Análisis de RNAs procedentes de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan transcritos diméricos del CEVd mutados en posiciones centrales de la rama superior de la CCR mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1 X, urea 8 M) e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa. Carril 1, RNA de ginura infectada con el CEVd. Carril 2, RNA de plantas de A. thaliana no transformadas. Carriles 3-9, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con las construcciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente. Carril 10, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con un cDNA dimérico silvestre (wt) de polaridad positiva del CEVd. Las líneas indican la posición de los transcritos T, T1 y T2 (ver Fig. 44) y de los RNAs monoméricos circulares (mc) y lineales (ml). En la gráfica se representa la fracción (%) de transcrito primario cortado de cada mutante en relación al transcrito dimérico control.
Los mutantes #4 (G97→A), #5 (G97→U), y #6 (G97→C), no tienen efecto sobre la estabilidad
del tallo de la HPI o debilitan la del tallo de la horquilla con el tetrabucle apical GAAA (un par C:G
se rompe) (Fig. 45). En la estructura de RNA bicatenario palindrómico esta mutación afecta al
nucleótido inmediatamente anterior a los sitios de corte en las dos cadenas, que al igual que en el
mutante #2 no se encuentran ya situadas en una región de doble cadena (Fig. 45). Aunque la
reducción de la fracción de corte (inferior al 25% respecto al control, Fig. 46) también apoya la
implicación de la estructura de RNA bicatenario palindrómico en esta reacción, los datos anteriores
pueden alternativamente ser interpretados como el resultado de la desestabilización de la horquilla
con el tetrabucle apical GAAA. Sin embargo, en el doble mutante #7 (G97→C y C94→ G) en el que
la estabilidad de la estructura de RNA bicatenario palindrómico se restaura (de hecho esos son los
nucleótidos del CbVd-1 en las posiciones equivalentes) mientras que la horquilla con el tetrabucle
apical GAAA todavía se desestabiliza más, la fracción de corte se restituye al nivel de la
construcción control (Fig. 45 y 46), lo que refuerza el papel de la estructura de RNA bicatenario
palindrómico en la determinación del sitio de corte.
A pesar de que ninguno de los cambios de estos siete mutantes afecta a los nucleótidos
estrictamente conservados en el bucle E (Fig. 45), la fracción de moléculas ligadas en todos ellos se
_______________________________________________________________________Resultados
94
vio afectada notablemente, presentando valores inferiores al 3% respecto al transcrito control
(Fig. 47). Este resultado indica que los requerimientos de secuencia o de estructura secundaria que
controlan la segunda etapa del procesamiento (la ligación) no se restringen al bucle E y son mayores
que los de la primera (el valor de corte más bajo obtenido fue del 9%). La hélice con una U
protuberante adyacente, cuya estabilidad se ve afectada en muchos de estos mutantes, parece
particularmente relevante a este respecto (Fig. 45).
#7Mutantes
#1 #2 #3 #4 #5 #6 wt
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ml
mc
10
234
89
10
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7
Ligación (% vs wt)
Mutantes
#7Mutantes
#1 #2 #3 #4 #5 #6 wt
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ml
mc
10
234
89
10
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7
Ligación (% vs wt)
Mutantes Figura 47. Análisis de RNAs procedentes de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan transcritos diméricos del CEVd mutados en posiciones centrales de la rama superior de la CCR mediante doble PAGE e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa. Carril 1, RNA de ginura infectada con el CEVd. Carril 2, RNA de plantas de A. thaliana no transformadas. Carriles 3-9, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con las construcciones 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente. Carril 10, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con un cDNA dimérico silvestre (wt) de polaridad positiva del CEVd. Las líneas indican la posición de los RNAs monoméricos circulares (mc) y lineales (ml). En la gráfica se representa la fracción (%) de monómero lineal ligado de cada mutante en relación al monómero control.
2.2. Efecto de mutaciones que afectan a posiciones adyacentes de la rama superior de la CCR
sobre el procesamiento de un transcrito dimérico de polaridad positiva del CEVd
Este grupo de mutantes, además de cubrir posiciones alternativas de la rama superior de la CCR,
se anticiparon como muy informativos porque la mayoría afecta al tetrabucle apical GAAA de la
horquilla que de acuerdo a Baumstark et al. (1997) dirige el corte de los oligómeros de polaridad
positiva, y también porque la mayoría de los nucleótidos mutados forman parte del bucle E que
presumiblemente media la ligación de los monómeros lineales (Fig. 48) (Baumstark et al., 1997).
El doble mutante #8 (C92→G y G99→C, la explicación para la segunda sustitución se expone
más adelante), y los mutante simples #9 (A100→U), #10 (A100→C), #11 (A101→C), #12 (A102→U) y
#13 (A102→C) (Fig. 48), tienen por lo general poco efecto sobre el corte del transcrito primario
(Fig. 49). Excepto el mutante #9, donde la fracción de corte se reduce a un 34% respecto al
transcrito control, en los otros es superior al 68% alcanzando hasta un 88-92% en los mutantes #8,
#11, #12 y #13 (Fig. 49). Estos resultados no apoyan la funcionalidad del tetrabucle GAAA en la
reacción de corte, pues cambios en tres de sus cuatro nucleótidos (mutantes #8, #11, #12 y #13) no
_______________________________________________________________________Resultados
95
reducen significativamente la fracción de transcritos cortados. Sin embargo, los seis mutantes
inducen un pronunciado efecto negativo en la ligación, sosteniendo un papel crítico del bucle E en
esta etapa del procesamiento (Fig. 50).
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-C G-
U A- 100A A90G A
U A-
95
80110
95
G(#8)
G C-
C(#8)
G C-
A U-100
A G90A A
A U-G U-G C-U A-C G-C G-
G C-G C-
A U-
U(#14)
80110
C G-
...
...
U(#9)C(#10)
C(#11)U(#12)C(#13)
(#8)C
(#8)G(#14)U
(#9)U(#10)C
(#11)C ......
C G-G C-
G C-
C G-
3’ 5’
5’ 3’
(#12)U(#13)C
95
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-C G-
U A- 100A A90G A
U A-
95
80110
95
G(#8)
G C-
C(#8)
G C-
A U-100
A G90A A
A U-A U-G U-G U-G C-G C-U A-U A-C G-C G-C G-C G-
G C-G C-G C-G C-
A U-A U-
U(#14)
80110
C G-
...
...
U(#9)C(#10)
C(#11)U(#12)C(#13)
(#8)C
(#8)G(#14)U
(#9)U(#10)C
(#11)C ......
C G-G C-
G C-
C G-C G-
3’ 5’
5’ 3’
(#12)U(#13)C
95
U-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
5’ 3’
(#8)G(#14)U
90
95
110
U(#12)C(#13)
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)
G AA A......
C-G
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
5’ 3’
(#8)G(#14)U
90
95
110
U(#12)C(#13)U(#12)C(#13)
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)
G AA A......G A
A A......
C-G
C-G
G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)
U(#12)C(#13)
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - -
91
276
(#8)G(#14)U
5’
3’ 5’
3’G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)U(#9)C(#10)
U(#12)C(#13)U(#12)C(#13)
G
C
-
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
-
C
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - -
91
276
(#8)G(#14)U
5’
3’ 5’
3’
A AG AG-CG-CG-UC-GC-G
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
A GU C
A GU CA
10290
95
C
C(#8)
U(#9)C(#10)
C(#11)
U(#12)C(#13)
(#8)G(#14)U
- - - -
3’
5’
5’
3’
5’3’
283
86 109
255
9685
A AG AG-CG-CG-UC-GC-G
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
A GU C
A GU CA
10290
95
C
C(#8)
U(#9)C(#10)U(#9)C(#10)
C(#11)
U(#12)C(#13)U(#12)C(#13)
(#8)G(#14)U
- - - -
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’3’
283
86 109
255
9685
Tetrabucle GAAAHorquilla I RNA bicantenariopalindrómico
Bucle E
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-C G-
U A- 100A A90G A
U A-
95
80110
95
G(#8)
G C-
C(#8)
G C-
A U-100
A G90A A
A U-G U-G C-U A-C G-C G-
G C-G C-
A U-
U(#14)
80110
C G-
...
...
U(#9)C(#10)
C(#11)U(#12)C(#13)
(#8)C
(#8)G(#14)U
(#9)U(#10)C
(#11)C ......
C G-G C-
G C-
C G-
3’ 5’
5’ 3’
(#12)U(#13)C
95
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-C G-
U A- 100A A90G A
U A-
95
80110
95
G(#8)
G C-
C(#8)
G C-
A U-100
A G90A A
A U-A U-G U-G U-G C-G C-U A-U A-C G-C G-C G-C G-
G C-G C-G C-G C-
A U-A U-
U(#14)
80110
C G-
...
...
U(#9)C(#10)
C(#11)U(#12)C(#13)
(#8)C
(#8)G(#14)U
(#9)U(#10)C
(#11)C ......
C G-G C-
G C-
C G-C G-
3’ 5’
5’ 3’
(#12)U(#13)C
95
U-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
5’ 3’
(#8)G(#14)U
90
95
110
U(#12)C(#13)
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)
G AA A......
C-G
C-GU-A
C-GC G
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
80
100
5’ 3’
(#8)G(#14)U
90
95
110
U(#12)C(#13)U(#12)C(#13)
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)
G AA A......G A
A A......
C-G
C-G
G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)
U(#12)C(#13)
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - -
91
276
(#8)G(#14)U
5’
3’ 5’
3’G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
C(#8)
C(#11)
U(#9)C(#10)U(#9)C(#10)
U(#12)C(#13)U(#12)C(#13)
G
C
-
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G
-
C
G
--
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - -
91
276
(#8)G(#14)U
5’
3’ 5’
3’
A AG AG-CG-CG-UC-GC-G
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
A GU C
A GU CA
10290
95
C
C(#8)
U(#9)C(#10)
C(#11)
U(#12)C(#13)
(#8)G(#14)U
- - - -
3’
5’
5’
3’
5’3’
283
86 109
255
9685
A AG AG-CG-CG-UC-GC-G
G-C
G-U
C-G
C-G
C A
A G
U A
G-C
C A
C-G
C-G
C-G
U-A
A-U
G-C
G-C
A-UC-GA GA A
A GU C
A GU CA
10290
95
C
C(#8)
U(#9)C(#10)U(#9)C(#10)
C(#11)
U(#12)C(#13)U(#12)C(#13)
(#8)G(#14)U
- - - -
3’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’3’
5’3’
283
86 109
255
9685
Tetrabucle GAAAHorquilla I RNA bicantenariopalindrómico
Bucle E
Figura 48. Localización de las mutaciones que afectan a posiciones adyacentes a la región central de la rama inferior de la CCR en los motivos estructurales implicados en el procesamiento de los RNAs oligómericos de polaridad positiva del CEVd (para detalles ver pie de la Figura 45).
Por otra parte, los mutantes #11, #12 y #13 afectan mínimamente a la estabilidad de la HPI
(particularmente a su tramo superior, ya que las mutaciones se localizan más abajo de los tres pares
de bases adyacentes al tetrabucle terminal) y a la de la estructura de doble cadena (los cambios se
sitúan fuera de los 10 pares de bases centrales que contienen los sitios de corte) y, por lo tanto, sus
efectos son consistentes con la participación de este último motivo estructural en la etapa de corte
(Fig. 49). Los efectos negativos de los mutantes #9 y #10 en el corte son compatibles con esta
hipótesis, pues alteran la estabilidad de los tres pares de bases adyacentes al tetrabucle de la HPI y
los 10 pares de bases centrales de la estructura de doble cadena, aunque es difícil explicar por qué la
fracción de corte se reduce más significativamente en el #9 que en el #10 (Fig. 49).
Regresando al doble mutante #8, su elevada fracción de corte puede explicarse porque si bien
afecta a los nucleótidos C92 y G99 que forman un par conservado filogenéticamente en la HPI/RNA
bicatenario palindrómico de la familia Pospiviroidae, este par está justamente invertido (Fig. 48).
En el mutante #14 (C92→U) en el que el apareamiento entre G99 y C92 se sustituye por un par G:U,
la fracción de corte del transcrito primario es todavía relativamente significativa (63%). El efecto
diferencial de estos dos mutantes sobre la ligación es interesante: mientras que en el mutante #8
_______________________________________________________________________Resultados
96
esencialmente se anula, en el mutante #14 la fracción de moléculas ligadas respecto al control está
próxima al 10% (el valor más alto de todos los mutantes analizados en el presente trabajo) (Fig. 50).
Hay que destacar que el doble mutante #8 afecta al nucleótido de la rama superior de la CCR (G99)
que tras la irradiación del RNA con luz UV se entrecruza con la posición U266 de la rama inferior de
la CCR, y que también rompe el par G:C que flanquea la hélice con una U protuberante, mientras
que en el mutante simple #14 este último par es sustituido por un par G:U (Fig. 48). Estos
resultados sugieren que la ligación no sólo está influenciada por los nucleótidos conservados del
bucle E.
mc
ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Mutantes#8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 wt
0
1
2
3
10
9
8
#8 #9 #10#11#12#13#14
Ligación (% vs wt)
Mutantes
mc
ml
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Mutantes#8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 wt
0
1
2
3
10
9
8
#8 #9 #10#11#12#13#14
Ligación (% vs wt)
Mutantes
Figura 50. Análisis de RNAs de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan transcritos diméricos del CEVd mutados en posiciones adyacentes a la región central de la rama superior de la CCR mediante doble PAGE e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa. Carril 1, RNA de ginura infectada con el CEVd. Carril 2, RNA de plantas de A. thaliana no transformadas. Carriles 3-9, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con los mutantes, 8, 9, 10, 11, 12, 13, y 14, respectivamente. Carril 10, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con un cDNA cDNA dimérico silvestre (wt) de polaridad positiva del CEVd. Las líneas indican la posición de los RNAs monoméricos circulares (mc) y lineales (ml). En la gráfica se representa la fracción (%) de monómero lineal de cada mutante ligado en relación al monómero control.
T,T1 y T2
ml
mc
Mutantes#11 #12#8 #9 #10 #13 #14 wt
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Corte (% vs wt)
0102030405060708090100
#8 #9 #10#11#12#13#14Mutantes
T,T1 y T2
ml
mc
Mutantes#11 #12#8 #9 #10 #13 #14 wt
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Corte (% vs wt)
0102030405060708090100
#8 #9 #10#11#12#13#14Mutantes
Figura 49. Análisis de RNAs de plantas transgénicas de A. thaliana que expresan transcritos diméricos del CEVd mutados en posiciones adyacentes a la región central de la rama superior de la CCR mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa. Carril 1, RNA de ginura infectada con el CEVd. Carril 2, RNA de plantas de A. thaliana no transformadas. Carriles 3-9, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con los mutantes 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, respectivamente. Carril 10, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con un cDNA dimérico silvestre (wt) de polaridad positiva del CEVd. Las líneas indican la posición de los transcritos T, T1 y T2 (ver Fig. 44) y los RNAs monoméricos circulares (mc) y lineales (ml). En la gráfica se representa la fracción (%) de transcrito primario de cada mutante cortado en relación al transcrito dimérico control.
_______________________________________________________________________Resultados
97
2.3. Mutantes en la rama inferior de la CCR que afectan al bucle E tienen un marcado efecto
sobre la ligación pero no sobre el corte de un transcrito dimérico de polaridad positiva del
CEVd
Si únicamente los nucleótidos que forman parte de la rama superior de la CCR están implicados
en el corte, la extensión del mismo no debería verse influenciada por mutaciones en la rama inferior
de la CCR, que sí deberían reducir la ligación especialmente si afectan a nucleótidos del bucle E,
motivo que presumiblemente dirige esta reacción. Para verificar esta hipótesis se construyeron dos
mutantes en los que se sustituyó la U266, el nucleótido de la rama inferior de la CCR que se
entrecruza con la G99 de la rama superior de la CCR tras la irradiación con luz UV, por una A
(mutante #15) o por una C (mutante #16) (Fig. 51).
Bucle E
G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
A(#15)C(#16)
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - - -
91
276
5’
3’ 5’
3’G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
A(#15)C(#16)
G
C
-
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G-
C
G-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - - -
91
276
5’
3’
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - - -
91
276
5’
3’ 5’
3’Bucle E
G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
A(#15)C(#16)
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - - -
91
276
5’
3’ 5’
3’G
C
U
G
G
U
- - -
106
259
A(#15)C(#16)
G
C
-
G
C
-
A
G
UCAGA
A AACC
G-
C
G-
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - - -
91
276
5’
3’
C
G
C
G
G
C
U
A
C
G
C
GU
- - - - - -
91
276
5’
3’ 5’
3’
Figura 51. Localización de las mutaciones que afectan a la rama inferior de la CCR en la región de la estructura en varilla propuesta para el CEVd, que contiene el bucle E y la hélice con una U protuberante (bulged-U helix) adyacente. Las letras en verde indican los nucleótidos que forman el bucle E en comparación al descrito para el PSTVd. La línea en forma de S y la punta de flecha señalan las bases que se entrecruzan mediante irradiación con luz ultravioleta y el sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva, respectivamente. Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas. La flecha señala la posición y naturaleza de las mutaciones introducidas.
El análisis de las preparaciones obtenidas a partir de plantas transgénicas de cada una de las dos
líneas mediante hibridación Northern reveló que mientras el corte del transcrito primario
prácticamente no se veía afectado (la fracción de corte respecto al control fue del 90-95%), la
ligación de las formas monoméricas generadas fue prácticamente nula (Fig. 52). Estos resultados
sustentan la idea de que en la reacción de corte participan exclusivamente los nucleótidos de la rama
superior de la CCR y secuencias flanqueantes, mientras que en la ligación están implicados los
nucleótidos del bucle E y los flanqueantes de la rama superior e inferior de la CCR. En particular la
hélice con una U protuberante adyacente al bucle E (Fig. 51), puede desempeñar un papel crítico en
el alineamiento de los extremos del RNA antes de la ligación.
Así pues, el análisis del procesamiento en A. thaliana de transcritos diméricos del CEVd
mutados en posiciones específicas de la molécula, sugiere que el corte de los RNAs oligoméricos de
polaridad positiva de los viroides de la familia Pospiviroidae se produce en la zona central de una
_______________________________________________________________________Resultados
98
región de doble cadena formada por la interacción de las secuencias de dos HPI, mientras que la
ligación tiene lugar sobre la conformación en varilla. Además, tras el corte de las dos cadenas se
generarían extremos 3’ con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de las RNasas III.
Mutantes
mc
ml
#15 #16
1 2 3 4 5
wt
Mutantes
T, T1 y T2
ml
mc
1 2 3 4 5
#15 #16 wt
0102030405060708090
100Corte (% vs wt)
#15#16Mutantes
Ligación (% vs wt)
1
0
2
8
10
9
#15#16
Mutantes
A
B Mutantes
mc
ml
#15 #16
1 2 3 4 5
wt
Mutantes
T, T1 y T2
ml
mc
1 2 3 4 5
#15 #16 wt
0102030405060708090
100Corte (% vs wt)
#15#16Mutantes
Ligación (% vs wt)
1
0
2
8
10
9
#15#16
Mutantes
A
B
Figura 52. Procesamiento en A. thaliana de transcritos diméricos del CEVd con mutaciones en la rama inferior de la CCR. (A) Análisis de RNAs de plantas transgénicas de A. thaliana mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) e hibridación Northern con una ribosonda de polaridad negativa. Carril 1, RNA de ginura infectada con el CEVd. Carril 2, RNA de plantas de A. thaliana no transformadas. Carriles 3 y 4, RNA de plantas de A. thaliana transformadas con los mutantes 15 y 16, respectivamente. Carril 5, RNA de plantas transgénicas de A. thaliana transformadas con un cDNA dimérico de polaridad positiva del CEVd, utilizado como control. En la gráfica se representa la fracción (%) de transcrito primario cortado de cada mutante en relación al transcrito dimérico control. (B) Análisis de RNAs, los mismos que en el panel A, mediante doble PAGE e hibridación Northern con la ribosonda anterior. En la gráfica se representa la fracción (%) de monómero lineal ligado de cada mutante en relación al monómero control. Las líneas indican la posición de los transcritos T, T1 y T2 (ver Fig. 44) y de los RNAs monoméricos circulares (mc) y lineales (ml).
2.4. Ensayos de infectividad de cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones específicas
Con el propósito de correlacionar los valores de procesamiento de cada uno de los mutantes con
su infectividad, se llevó a cabo un ensayo biológico en el que se eligió la agroinoculación como
método de infección y ginura como huésped experimental. El bajo número de plantas infectadas
(Tabla 8) condujo a la repetición del análisis utilizando tomate como huésped experimental
_______________________________________________________________________Resultados
99
alternativo, teniendo en cuenta resultados previos en los que se observó que este segundo huésped
es más sensible a la infección por el CEVd. En los dos bioensayos se utilizaron bloques de cinco
plantas, incluyendo como controles negativos uno inoculado sólo con tampón y otro con el
plásmido de transformación sin inserto, y como control positivo un tercero con plantas inoculadas
mecánicamente con RNAs monoméricos circulares del CEVd purificados de ginura. A las tres
semanas, sólo las plantas inoculadas con el control positivo y las infiltradas con el cDNA dimérico
con la secuencia silvestre desarrollaron los síntomas característicos de clorosis, epinastia y
enanismo. Para promover la aparición de síntomas, que se observan mejor en brotes jóvenes, las
plantas se podaron y, dos semanas más tarde, algunas mostraron síntomas de la infección mientras
que los controles negativos permanecieron asintomáticos durante las seis semanas que duró el
estudio. Una vez concluidos los bioensayos las plantas se analizaron mediante impresión de tejido
sobre membranas de nylon que posteriormente se hibridaron con una ribosonda de polaridad
negativa (datos no mostrados).
Tabla 8. Efecto de mutaciones que afectan a la región central conservada del CEVd sobre el procesamiento y la infetividad de cDNAs diméricos
Ginura Tomate Construcción1 Corte 2 Ligación2 Infectividad Infectividad Síntomas3
#1 C95→U 38 2,4 0/5 0/5 #2 G96→A 18 2,9 0/5 3/5 0/3 #3 C95G96→U95A96 21 1,9 0/5 3/5 1/3 #4 G97→A 24 1,7 0/5 1/5 0/1 #5 G97→U 17 1 0/5 1/5 0/1 #6 G97→C 11 1,6 0/5 0/5 #8 C92G99→G92C99 88 0,5 0/5 0/5 #9 A100→U 34 2,7 1/5 1/5 0/1 #10 A100→C 68 0,8 0/5 0/5 #11 A101→C 92 0,5 0/5 5/5 4/5 #12 A102→U 94 0,1 0/5 2/5 1/2 #13 A102→C 92 0,4 1/5 4/5 0/4 #14 C92→U 63 9 1/5 0/5 #15 U266→A 90 0,9 0/5 5/5 5/5 #16 U266→C 95 0,7 1/5 5/5 3/5 Transcrito control 100 100 5/5 5/5
1 Las construcciones que presentan una infectividad mayor en tomate se han sombreado en gris. El mutante #7 no se incluyó en el estudio por no estar disponible.
2 Las fracciones de corte y ligación (en %) de los RNAs monoméricos generados se indican respecto al transcrito dimérico control.
3 Cinco semanas después de la inoculación.
Como puede verse en la Tabla 8, hay una correlación en el procesamiento de los RNAs
_______________________________________________________________________Resultados
100
viroidales expresados en plantas de A. thaliana y la infectividad en plantas de tomate. Aquellos
mutantes que presentaron una fracción de corte del transcrito primario superior al 90% respecto al
control, mostraron una infectividad mayor (#11, #13, #15, y #16), excepto el mutante #12
posiblemente a causa de su mínima ligación. No todas las plantas infectadas desarrollaron síntomas
pues su expresión depende, entre otros factores, del estadio de desarrollo de las mismas en que se
alcanza el nivel mínimo de RNA viroidal necesario para que estos se manifiesten. La progenie
viroidal de algunas plantas sintomáticas se examinó mediante clonaje y secuenciación,
encontrándose que los cambios introducidos revirtieron a la secuencia silvestre en todos los casos
analizados. Estos resultados resaltan las ventajas de A. thaliana para estudiar el efecto de
mutaciones en los motivos que determinan el procesamiento, un aspecto que no puede abordarse
mediante bioensayos en plantas huésped ya que muchas de las mutaciones dan lugar a variantes no
infecciosas.
33.. CCaarraacctteerriizzaacciióónn ddee llooss eexxttrreemmooss ddee RRNNAAss vviirrooiiddaalleess mmoonnoomméérriiccooss yy lliinneeaalleess
pprroocceessaaddooss iinn vviivvoo:: eennzziimmaass iimmpplliiccaaddaass eenn eell pprroocceessaammiieennttoo
3.1. Extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd aislados de plantas transgénicas
de A. thaliana
Los resultados obtenidos indican que la especificidad de las dos etapas que componen el
procesamiento de los oligómeros viroidales de polaridad positiva está determinada por la capacidad
del RNA para adoptar estructuras específicas. Aunque no existe un consenso, la idea generalmente
aceptada es que la reacción de corte en los miembros de la familia Pospiviroidae está mediada por
una enzima del huésped. Las endoribonucleasas se clasifican según la posición en que queda el
grupo fosforilo tras la ruptura del enlace fosfodiéster, por lo que la caracterización de los grupos
químicos presentes en los extremos de los RNAs viroidales monoméricos y lineales debería servir
para inferir la enzima implicada en su génesis. En trabajos previos no se ha podido determinar
inequívocamente la naturaleza química de los extremos de RNAs monoméricos lineales pues
mientras que los RNAs aislados de plantas infectadas por el CSVd presentaban mayoritariamente
un extremo 5’-P (Palukaitis y Symons, 1980), un estudio similar con los RNAs del PSTVd
identificó extremos 5’-OH y 2’,3’-fosfodiéster cíclico (Kikuchi et al., 1982; Branch et al., 1982;
Hashimoto et al., 1985; Palukaitis y Zaitlin, 1987), similares a los generados tras el autocorte
mediado por ribozimas de cabeza de martillo en la familia Avsunviroidae (Flores et al., 2000;
Tabler y Tsagris, 2004; Daròs et al., 2006).
_______________________________________________________________________Resultados
101
Lineales nativas
+
Lineales nativas tratadas con AP
Lineales nativas tratadas con PNK y ATP
+3’5’? 3’5’P 3’5’OH
5’
3’
5’ 3’OH
Rnl1
5’ 3’OH
X5’ 3’
PCR
Retrotranscripción
3’
5’
+5’ 3’OH
Rnl1
5’ 3’
?
Retrotranscripción?
PCR
3’
5’
?
5’
3’
Lineales nativas
+
Lineales nativas tratadas con AP
Lineales nativas tratadas con PNK y ATP
+3’5’? 3’5’P 3’5’OH
5’
3’
5’ 3’OH
Rnl1
5’ 3’OH5’ 3’OH
X5’ 3’
PCR
Retrotranscripción
3’
5’
+5’ 3’OH5’ 3’OH
Rnl1
5’ 3’
?
Retrotranscripción?
PCR
3’
5’
??
5’
3’
Figura 53. Caracterización del extremo 5’ de los RNAs viroidales monoméricos y lineales. En verde y naranja oscuro se han representado los RNAs y el adaptador sintético respectivamente, y en verde y naranja claros y con distinto grosor los cDNAs y los fragmentos de PCR. La posición de los cebadores, su color coincide con la región a la que anillan, se indica con flechas. Rnl1, PNK, AP y PCR son las abreviaturas de RNA ligasa 1 del fago T4, polinucleótido quinasa del fago T4, fosfatasa alcalina de ternera, y amplificación en cadena de la polimerasa.
En el presente trabajo, con el propósito de identificar el grupo químico existente en el extremo
5’ de los RNAs viroidales monoméricos y lineales resultantes del procesamiento en plantas
transgénicas, se diseñó una estrategia de RLM-RACE (RNA Ligase-Mediated Rapid Amplification
of cDNA Ends) (Fig. 53). El estudio se comenzó con el CEVd, por ser el que presenta una
acumulación mayor de formas monoméricas lineales en las plantas transgénicas. Con la RNA
ligasa 1 del fago T4 (Rnl1), que en presencia de ATP cataliza la unión de moléculas de RNA con
extremos 5’-P y 3’-OH, una preparación purificada de formas monoméricas lineales incorporaría un
adaptador de RNA sintético (P9) sólo si presenta un extremo 5’-P. Los RNAs viroidales se
dividieron en tres fracciones, la primera no recibió ningún tratamiento antes de la ligación, la
segunda se incubó con polinucleótido quinasa del fago T4 (PNK) que cataliza la fosforilación de
extremos 5’-OH en presencia de ATP, y la tercera con fosfatasa alcalina de ternera (AP) que
cataliza la desfosforilación de extremos 5’-P. A continuación de la ligación, los RNAs se
retrotranscribieron usando un cebador específico del viroide (P4) y los cDNAs se amplificaron
mediante una mezcla de Taq DNA polimerasa y Tgo DNA polimerasa y una pareja de cebadores
específicos del adaptador (P10) y del viroide (P2).
La Rnl1 catalizó la unión del adaptador al extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del
CEVd sin tratamiento previo (Fig. 54, carril 1) o tras su incubación con PNK y ATP
(Fig. 51, carril 2), pero no tras el pretratamiento con AP (Fig. 54, carril 3). El fragmento de RT-
_______________________________________________________________________Resultados
102
PCR de 115 pares de bases amplificado se clonó en el vector pTZ57R/T, y la secuenciación de
varios clones identificó el sitio de corte del transcrito dimérico entre las posiciones G96 y G97. Estos
resultados indican que las formas monoméricas lineales de CEVd procesadas en A. thaliana
presentan un extremo 5’-P, y confirman los datos obtenidos mediante extensión del cebador (Fig.
35). Aunque el análisis con esta metodología de los RNAs monoméricos lineales aislados de plantas
de ginura infectadas mostró una población heterogénea, entre los cDNAs amplificados sin
necesidad de tratamiento previo se encontró el de tamaño esperado (datos nos mostrados). La
clonación de dicho fragmento de PCR y la secuenciación de varios clones confirmó el resultado
anterior.
1 2 3 4 51 2 3 4 5
Figura 54. Estudio del extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd procesados en A. thaliana mediante RLM-RACE empleando la RNA ligasa 1 del fago T4 y un adaptador de RNA. Los productos de RT-PCR se fraccionaron mediante PAGE no desnaturalizante y tinción con bromuro de etidio. Carriles 1, 2 y 3, productos de la amplificación de las formas monoméricas lineales del CEVd sin tratamiento previo, tras su incubación con polinucleótido quinasa y ATP, o con fosfatasa alcalina de ternera, respectivamente. Carril 4, escalera de multímeros de DNA de 100 pb. Carril 5, control negativo. El asterisco indica el producto de tamaño esperado de 115 pares de bases.
3.2. Extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del HSVd y ASSVd aislados de plantas
transgénicas de A. thaliana
Con el fin de confirmar los resultados obtenidos con el CEVd, los RNAs monoméricos lineales
del HSVd y ASSVd purificados de plantas transgénicas se incubaron sin tratamiento previo con la
RNA ligasa 1 del fago T4 (Rnl1) y el adaptador en presencia de ATP. Los productos de la ligación
se retrotranscribieron con cebadores específicos de cada uno de los viroides (P6 para el HSVd y P8
para el ASSVd), y los cDNAs se amplificaron mediante PCR simple o doble (nested). En la primera
PCR se empleó un cebador específico del adaptador (P9) y otro complementario a parte de la
secuencia de cada uno de los viroides (P5 del HSVd y P7 del ASSVd), y en la segunda PCR se
utilizó el P9 y un segundo cebador específico del HSVd (P11). La clonación y secuenciación de los
_______________________________________________________________________Resultados
103
productos de PCR esperados, de 101 y 139 pares de bases para el HSVd y ASSVd respectivamente
(Fig. 55), confirmó la presencia de un extremo 5’–P en las posiciones previamente identificadas en
los dos viroides mediante extensión del cebador (Fig. 38 y 41).
ASSVdHSVd1 2 3 1 2 3
ASSVdHSVd1 2 3 1 2 3
Figura 55. Estudio del extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del HSVd y ASSVd procesados en A. thaliana mediante RLM-RACE empleando la RNA ligasa 1 del fago T4 y un adaptador de RNA. Los productos de RT-PCR se fraccionaron mediante PAGE no desnaturalizante y tinción con bromuro de etidio. Carril 1, productos de la amplificación de las formas monoméricas lineales del HSVd y ASSVd, sin tratamiento previo. Carril 2, escalera de multímeros de DNA de 100 pb. Carril 3, control negativo. El asterisco indica el producto de tamaño esperado de 101 y 139 pares de bases para el HSVd y ASSVd, respectivamente.
Esta metodología tiene respecto a la basada en la extensión del cebador la ventaja de que el
extremo 5’ de los cDNAs amplificados corresponde al extremo del RNA, y no a paradas prematuras
de la polimerasa inducidas por estructuras secundarias, ya que al utilizarse un cebador específico
del viroide y otro del adaptador es imprescindible la ligación de este último para la amplificación
por PCR. Sin embargo, tiene la desventaja de amplificar productos artefactuales que puedan
generarse incluso en cantidades mínimas en alguno de los pasos (Fig. 55).
Así pues, los datos obtenidos mediante RLM-RACE de los RNAs monoméricos y lineales del
CEVd, HSVd y ASSVd procesados en plantas transgénicas de A. thaliana indican la presencia de
un extremo 5’-P compatible con la actividad de una ribonucleasa III.
3.3. Extremo 3’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd aislados de plantas transgénicas
de A. thaliana
Para este fin se diseñó una estrategia basada en 3’ RACE (Rapid Amplification of cDNAs Ends)
(Fig. 56). Con poli(A) polimerasa, que en presencia de ATP cataliza la adición de residuos de AMP
a extremos 3’-OH de RNA, la preparación purificada de RNAs incorporó con o sin incubación
previa con fosfatasa alcalina de ternera (AP) una larga cola de poli(A). Los RNAs lineales
_______________________________________________________________________Resultados
104
poliadenilados se retrotranscribieron con el cebador P12 cuya región 3’ es complementaria a la cola
de poli(A) incorporada. Los cDNAs se amplificaron por PCR con una mezcla de Taq DNA
polimerasa y Tgo DNA polimerasa, el cebador anterior y otro específico del viroide (P13). Los
fragmentos de PCR de 409 y 363 pares de bases resultantes (Fig. 57) se clonaron en el vector
pTZ57R/T y la secuenciación de varios clones de la fracción de RNA sin tratar con AP puso de
manifiesto que el extremo 3’ del producto de mayor tamaño corresponde a la posición G96 del
CEVd, corroborando así el sitio de corte previamente identificado (Fig. 35). El producto de menor
tamaño, que corresponde a la posición G50 del CEVd, es consecuencia de la unión del cebador P12
a la región rica en As comprendida entre las posiciones 51 y 63 de la secuencia del viroide. Estos
resultados indican la presencia de extremos 3’-OH compatibles con la actividad de una RNasa III,
aunque no excluyen la participación de una ribonucleasa que genera un extremo 2’,3’-fosfosdiéster
que tras su apertura diera lugar a extremos 2’-P, 3’-OH.
A(17)
AA..
Sin tratamiento
Fosfatasa alcalinade ternera OH
5’ P2’
3’POH
5’
POH5’
5’OH
OH
5’ P2’
3’POH
5’
OHOH5’
5’OH
poli(A) polimerasa+ ATP
RT
PCR
3’
5’
5’ 3’
T(17)
X5’
OH
3’
X5’
A(n)OH
T(17)
Lineales nativas
T(17)A(17)
AA..
Sin tratamiento
Fosfatasa alcalinade ternera OH
5’ P2’
3’POH
5’
POH5’
5’OHOH
5’ P2’
3’POH
5’
POH5’
5’OH
OH
5’ P2’
3’POH
5’
OHOH5’
5’OHOH
5’ P2’
3’POH
5’
OHOH5’
5’OH
poli(A) polimerasa+ ATP
RT
PCR
3’
5’
5’ 3’
T(17)
X5’
OH
3’
X5’
A(n)OH
T(17)
Lineales nativas
T(17)
Fig. 56. Caracterización del extremo 3’ de los RNAs monoméricos y lineales del CEVd mediante 3’ RACE. En verde oscuro se han representado los RNAs, y en verde y rosa claro y con distinto grosor los cDNAs y los fragmentos de PCR. La posición del cebador, su color coincide con la región a la que anilla, se indica con una flecha. Las siglas PCR y RT quieren decir amplificación en cadena de la polimerasa y retrotranscripción, respectivamente.
_______________________________________________________________________Resultados
105
1 2 3 4
12
A
B
AGG AA
AAGAAA AA
AGAGGCG GCGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGCGGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACU
60 80100
260280
300320
P13AGG AA
AAGAAA AA
AGAGGCG GCGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGCGGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACU
60 80100
260280
300320
P13
220
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
20 40 60 80100 120
140 160 180
200240260280
300320340360
P13
220
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
20 40 60 80100 120
140 160 180
200240260280
300320340360
P13
1 2 3 4
12
A
B
AGG AA
AAGAAA AA
AGAGGCG GCGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGCGGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACU
60 80100
260280
300320
P13AGG AA
AAGAAA AA
AGAGGCG GCGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGCGGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACU
60 80100
260280
300320
P13
220
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
20 40 60 80100 120
140 160 180
200240260280
300320340360
P13
220
CGGGAUCUUUCU
UG AGGUUCC
U G UGGU
GCUC ACCU
G ACC CUG
CAGGC AG
G AAAAGA
AA AAAGAGGCG G
CGGGG
AAGAAG
U CCUUCAG
G G AUCCCCGGG
GAA A
CCUGGAGG AAGU
CGAGG
UCGG GGGGG
ACAG
CUGCUUCGG U
CGC
C GCGGAU
CACUGGCG
UCCAGCGGAGA AA
CAGGAGCU
CGUCUCCUU
CCUUUCGCUGCUGGCUCCA
CAUCCG
AU
CGU
CGCUGAAGCG
CCU
CGCCCCCUCG
CCC
GGAGCUU
CUCUCUGG
AGAC
UACCCGG
UGGA
AACA
ACUGAAGCUUC
AACCCC
AAACCGCUUUU
CUUG
UAUCUU
CACUGC
UCU
CCGGG
CGAGGGUGA
AAGCC
CUCGGAACC
CUAGA
UUGGGUCC
CU
20 40 60 80100 120
140 160 180
200240260280
300320340360
P13
Figura 57. Análisis mediante 3’- RACE del extremo 3’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd procesados en A. thaliana. (A) Los productos de RT-PCR se fraccionaron mediante PAGE no desnaturalizante y tinción con bromuro de etidio. Carriles 1 y 2, productos de la amplificación de las formas monoméricas lineales del CEVd, poliadeniladas en su extremo 3’ con poli(A) polimerasa sin tratamiento previo o tras su incubación con fosfatasa alcalina de ternera, respectivamente. Carril 3, escalera de multímeros de DNA de 100 pb. Carril 4, control negativo. La línea 1 señala el producto generado por la unión inespecífica del cebador a una región rica en As de la secuencia, y la número 2 el producto de tamaño esperado. (B) Estructura secundaria predicha para el CEVd. La secuencia y posición del cebador P13 se indican en negrita y con una flecha, y el sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva con una punta de flecha. En rojo y azul se indican los nucleótidos G96, y G50, que corresponden a los extremos 3’ de los RNAs, y en verde la región rica en As.
3.4. Ligación in vitro de los RNAs monoméricos lineales del CEVd procesados in vivo
Dos de las actividades enzimáticas identificadas capaces de catalizar la unión de moléculas de
RNA a través de la formación de un enlace fosfodiéster, difieren en su mecanismo de reacción y en
su especificidad. Las RNA ligasas del fago T4 (Rnl1 y Rnl2) ligan RNAs con extremos 5’-P y
3’-OH (2’-OH) (Silber et al., 1972; Ho y Shuman, 2002), y las tRNA ligasas RNAs con extremos
2’,3’-fosfosdiéster ó 2’-P, 3’-OH con independencia del grupo en 5’ (Konarska et al., 1982; Englert
y Beier, 2005) (Fig. 58). Con el propósito de confirmar la naturaleza de los extremos generados por
la RNasa que cataliza el procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva del CEVd se
llevaron a cabo estudios in vitro con la Rnl1 y la tRNA ligasa de A. thaliana actuando sobre los
RNAs monoméricos lineales del CEVd purificados de A. thaliana transgénicas o de ginuras
infectadas. Como RNA control se utilizó un transcrito monomérico del CEVd con los mismos
extremos que presumiblemente contienen los RNAs monoméricos procesados in vivo. Para este fin
_______________________________________________________________________Resultados
106
se sintetizó un cDNA monomérico bajo el control del promotor T7 mediante una reacción de PCR
sobre un cDNA dimérico (construcción pdBCEVP3, ver Tabla 1) empleando un cebador homólogo
(P14) con la secuencia de dicho promotor y otro complementario (P15) con el extremo 3’ del RNA,
utilizándose los cDNAs amplificados como molde de transcripción. Los transcritos se analizaron
mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M), y el de longitud unitaria se eluyó del gel y se
incubó con la pirofosfatasa ácida de tabaco (TAP) que cataliza la hidrólisis del grupo pirofosfato en
5’, generando un RNA con extremos 5’-P, 3’-OH. Los RNAs monoméricos lineales sintetizados
in vitro o procesados in vivo se dividieron en tres fracciones, cada una de las cuales se sometió a un
tratamiento distinto antes de su incubación con las RNA ligasas ensayadas. Una fracción se congeló
hasta su utilización posterior y las otras dos se trataron con la fosfatasa alcalina de ternera (AP) que
elimina grupos fosforilo de los extremos 5’ y 3’. Seguidamente, una de estas últimas fracciones se
congeló y la otra se incubó con polinucleótido quinasa (PNK) que en presencia de ATP cataliza la
fosforilación de grupos 5’-OH. Finalmente, cada una de las tres fracciones se dividió en dos
alícuotas que se incubaron con una u otra RNA ligasa. Los productos de las reacciones de ligación
se separaron mediante PAGE desnaturalizantes (TBE 1X, urea 8 M) y se analizaron por hibridación
Northern utilizando una ribosonda de polaridad negativa (Fig. 59).
tRNA ligasa A. thalianaRnl1
5 P P
2´
3´
OH P
PP
OH
OHP
OH
PP
OH
OHP
OH
POHOH
tRNA ligasa A. thalianaRnl1
5 P P
2´
3´
OH PP
PP
OH
OHP
OH
P
OH
PP
OH
P
OH
OHP
OH
P
OH
POHOH
Figura 58. Posibles extremos generados tras el corte de los RNAs oligoméricos de polaridad positiva del CEVd por una ribonucleasa del huésped. Junto a cada forma monomérica lineal, representada en verde, se indica si la Rnl1 del fago T4 o la tRNA ligasa de A. thaliana catalizarían su ligación.
Partiendo de los RNAs monoméricos lineales purificados de plantas transgénicas sólo se
detectaron moléculas circulares cuando se incubaron con la Rnl1 (Fig. 59A). Esta ligación se
_______________________________________________________________________Resultados
107
produjo sin necesidad de tratamiento previo (carril 6), se inhibió con incubación previa con AP
(carril 7), y se recuperó con tratamiento posterior con PNK (carril 8). Con el RNA sintetizado in
vitro se obtuvieron resultados idénticos (carriles 9, 10, y 11). Estos datos indican que los RNAs
monoméricos del CEVd procesados en plantas transgénicas constituyen una población
esencialmente homogénea con extremos 5’-P y 3’-OH (Fig. 60). Entre los productos de la ligación
de ambos sustratos con la Rnl1 se identificó un RNA viroidal que por su migración electroforética
podría corresponder a un dímero lineal o circular (Fig. 59A, carriles 6 y 9).
CEVdC
CEVdL
transcritoarabidopsis
Rnl1gynura transcritoarabidopsis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
tRNA ligasa A. thalianagynura
CEVdC
CEVdL
A B
AP
PNK -
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+ AP
PNK -
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
CEVdC
CEVdL
transcritoarabidopsis
Rnl1gynuragynura transcritoarabidopsis
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
tRNA ligasa A. thalianagynura
CEVdC
CEVdL
A B
AP
PNK -
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+AP
PNK -
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+ AP
PNK -
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+AP
PNK -
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
+
Figura 59. Análisis de los productos de la ligación in vitro de los RNAs monoméricos lineales del CEVd con la Rnl1(A) y la tRNA ligasa de A. thaliana (B) mediante PAGE desnaturalizante (TBE 1X, urea 8 M) e hibridación Northern, con una ribosonda de polaridad negativa. Carril 1, RNAs de ginuras infectadas usado como marcador. Carril 2, monómero de autocorte del ABSVd. Carriles 3, 4 y 5 productos de la ligación de RNAs purificados de ginuras infectadas. Carriles 6, 7 y 8 productos de la ligación de RNAs purificados de plantas transgénicas de A. thaliana. Carriles 9, 10 y 11 productos de la ligación de transcritos monoméricos con extremos 5’-P y 3’-OH usados como control. Los RNAs monoméricos lineales sintetizados in vitro o procesados in vivo, se dividieron en tres fracciones cada una de las cuales se sometió a un tratamiento previo. La primera se incubó directamente con cada una de las RNA ligasas (Ø) (carriles 3, 6 y 9), la segunda se incubó con la fosfatasa alcalina de ternera (AP) (carriles 4, 7 y 10) y la tercera se incubó con AP y luego con polinucleótido quinasa del fago T4 (PNK) (carriles 5, 8 y 11). Las flechas indican la posición de los RNAs monoméricos viroidales circulares (CEVdC) y lineales (CEVdL).
Una fracción de los RNAs monoméricos lineales purificados de ginuras infectadas se ligaron
tras incubarlos con la Rnl1 o con la tRNA ligasa sin necesidad de tratamiento previo (Fig. 59A y
59B, carril 3). Este resultado indica la presencia de una población heterogénea formada al menos
por moléculas con extremos compatibles con la actividad de ambas enzimas. La AP elimina grupos
fosforilo de extremos 5’ y 3’ pero no abre enlaces 2’,3’-fosfodiéster cíclico, por lo que la
incubación de los RNAs con esta enzima debería inhibir su ligación posterior con la Rnl1. La
presencia de una población resistente a este tratamiento sugiere una actuación parcial de la AP
sobre las formas lineales con extremos 5’-P y 2’-OH 3’-OH, ó 5’-P y 2’-OH 3’-P (Fig. 59A, carril 4
y Fig. 60). La tRNA ligasa es capaz de unir moléculas con extremos 2’,3’-fosfosdiéster ó 2’-P
3’-OH independientemente de si el extremo 5’ está o no fosforilado. Aunque el tratamiento previo
_______________________________________________________________________Resultados
108
con la AP no debía tener efecto sobre sus sustratos, la incubación previa de los RNAs monoméricos
lineales de ginura con esta enzima aumentó la fracción de moléculas circulares (Fig. 59B, carril 4).
Esta aparente paradoja se explicaría por una mayor eficiencia de ligación cuando la tRNA ligasa
actúa sobre extremos 5’-OH, tal y como se ha comprobado para la enzima de germen de trigo (Pick
y Hurwitz, 1986). Por otra parte, en las condiciones en las que se realizó el ensayo, la PNK
únicamente cataliza la fosforilación de extremos 5’-OH. La incubación de los RNAs con esta
enzima antes de su ligación con la Rnl1 aumentó la fracción de formas circulares, indicando la
existencia en la población inicial de moléculas lineales con extremos 5’-OH y 2’-OH 3’-P ó 5’-P y
2’-OH 3’-P (Fig 59A, carril 5 y 60). La ausencia de formas monoméricas circulares generadas a
partir de RNAs pretratados con la PNK confirma la mayor eficiencia de la tRNA ligasa cuando
actúa sobre sustratos con extremos 5’-OH (Fig. 59B, carril 5).
ØRnl1
5’ P2’
3’
P
POH
PP
OHP
OHOHOH
PPOH
OHPOH
POH
tRNAA.t.
POH
POH
POH
OHP
OHOHOH
OHOHOH
OHOHOH
OHOH
APRnl1
PP
PP
PP
OHP
POHOH
POHOH
POHOH
POH
PNKRnl1tRNA
A.t.tRNAA.t.Ø
Rnl1
5’ P2’
3’
P
POH
PP
OHP
OHOHOH
PPOH
OHPOH
POH
tRNAA.t.
POH
POH
POH
OHP
OHOHOH
OHOHOH
OHOHOH
OHOH
APRnl1
PP
PP
PP
OHP
POHOH
POHOH
POHOH
POH
PNKRnl1tRNA
A.t.tRNAA.t.
Figura 60. Posibles extremos generados tras el corte de los RNAs oligómericos del CEVd por una ribonucleasa del huésped. Junto a cada forma viroidal se indica si la Rnl1 o la tRNA ligasa de A. thaliana (tRNA A. t.) catalizarían su ligación sin necesidad de tratamiento previo (Ø), tras su incubación con fosfatasa alcalina de ternera (AP) seguida o no de un tratamiento con polinucleótido quinasa del fago T4 (PNK). Con una línea roja discontínua se enmarca a los RNAs monoméricos lineales originados por el procesamiento in vivo.
Así pues, los datos obtenidos en el análisis enzimático de los extremos de los RNAs
monoméricos lineales del CEVd procesados en plantas transgénicas de A. thaliana estableció la
presencia de extremos 5’-P y 3’-OH compatibles con la actividad de una RNasa III y de una RNA
ligasa que reconocería los mismos extremos que las RNA ligasas del fago T4. En consonancia con
estos resultados, se encontró una fracción con los mismos extremos en la población purificada de
ginuras infectadas. Nuestros resultados son compatibles con los obtenidos en trabajos previos en los
que se sugirió la presencia de extremos 5’-OH y 2’,3’–P cíclico en los RNAs monoméricos lineales
del PSTVd aislados de plantas huésped (Kikuchi et al., 1982; Branch et al., 1982; Hashimoto
_______________________________________________________________________Resultados
109
et al., 1985; Palukaitis y Zaitlin, 1987; Liu y Symons, 1998), ya que estos extremos están presentes
aunque no resultan del procesamiento de los oligómeros de polaridad positiva.
En resumen, los resultados obtenidos en el análisis de los RNAs monoméricos lineales
purificados de plantas transgénicas de A. thaliana y de ginuras infectadas son consistentes con la
presencia de extremos 5’-P, 3’-OH en los RNAs monoméricos lineales generados por el
procesamiento in vivo.
110
DDiissccuussiióónn
111
112
________________________________________________________________________Discusión
113
11.. SSiittiioo ddee pprroocceessaammiieennttoo ddee llooss oolliiggóómmeerrooss ddee ppoollaarriiddaadd ppoossiittiivvaa ddee llooss
mmiieemmbbrrooss ddee llaa ffaammiilliiaa PPoossppiivviirrooiiddaaee
El mecanismo de replicación de los miembros de esta familia fue propuesto hace más de 20
años (Branch y Robertson, 1984) y, aunque se han llevado a cabo diversos estudios, son pocos los
datos que se conocen sobre la reacción de corte de los oligómeros de polaridad positivay la
posterior ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. El modo más directo para
identificar el sitio de procesamiento es determinar el extremo 5’ de las formas monoméricas lineales
aisladas de plantas infectadas. Trabajos previos señalaron a la rama superior de la CCR como la
región que contiene el sitio de procesamiento, que está conservada en todos los miembros de la
familia Pospiviroidae y por lo tanto debía tener un papel relevante en el ciclo infeccioso de estos
RNAs. Esta hipótesis está sustentada por los resultados obtenidos mediante ensayos de infectividad
de DNAs o RNAs del PSTVd (Tabler y Sänger, 1984; Hashimoto y Machida, 1985), construcciones
del HSVd de tamaño superior a la unidad (Meshi et al., 1984), y construcciones monoméricas del
CEVd seguidas de una duplicación de parte de la rama superior de la CCR (Visvader et al., 1985).
En este último trabajo se propuso que el sitio de procesamiento se encuentra en una de las tres Gs
consecutivas presentes en la región duplicada, y se sugirió a la HPI o a un RNA bicatenario
palindrómico como los motivos estructurales que determinan el corte. Un análisis crítico de estos
resultados condujo a un modelo según el cual el corte se produce sobre un RNA bicatenario
palindrómico formado por el apareamiento de las secuencias que componen la HPI (Diener, 1986),
aunque no explica ni el mecanismo de corte y ligación, ni precisa los nucleótidos entre los que se
produciría el corte de los oligómeros de polaridad positiva. Los ensayos de infectividad se basan en
la premisa de que únicamente aquellas construcciones viroidales que contengan duplicado el sitio
de corte son capaces de generar monómeros lineales perfectos, y consecuentemente de infectar
plantas huésped. Sin embargo, esta metodología es sólo semicuantitativa por no existir una relación
lineal entre infectividad y cantidad de inóculo, razón que impide obtener conclusiones precisas
como reflejo de esta limitación, otro trabajo con el PSTVd siguiendo la misma metodología localizó
el sitio de procesamiento en la rama inferior de la CCR (Hammond et al., 1989b). Además,
transcritos del PSTVd con sólo una repetición de 4 nucleótidos de la CCR (Candresse et al., 1990),
o RNAs monoméricos exactos del PSTVd y CEVd, sin ninguna repetición, también son infecciosos
(Hashimoto et al., 1985; Rigden y Rezaian, 1992). En esta misma dirección, un trabajo posterior
propuso que el requerimiento para que transcritos monoméricos del CEVd, abiertos en distintos
puntos de la molécula, fueran infecciosos residía en que sus extremos (formados por secuencias del
viroide y del vector) adoptaran una estructura apareada (Rakowski y Symons, 1994). Por lo tanto,
________________________________________________________________________Discusión
114
en algunos casos la infectividad no se correlaciona con la duplicación de parte de la secuencia
viroidal, probablemente debido a la transcripción completa del RNA genómico viroidal por salto de
la RNA polimerasa II cuando los extremos de la forma lineal están próximos (Rakowski y Symons,
1994).
Por otro lado, estudios mediante extensión del cebador de los RNAs viroidales monoméricos y
lineales purificados de plantas infectadas tampoco han podido cartografiar el sitio de
procesamiento, ya que dicha población es heterogénea en sus extremos pues si bien una fracción de
los mismos proviene del corte de los oligómeros, otra deriva de la degradación de los RNAs
monoméricos circulares in vivo o in vitro. De ahí que en análisis de RNAs lineales del PSTVd
purificados de plantas infectadas se caracterizasen diversos extremos (Kikuchi et al., 1982;
Palukaitis y Zaitlin, 1987). Finalmente, las conclusiones de un trabajo en el que se estudia el
procesamiento in vitro de un RNA monomérico del PSTVd con una duplicación de 17 nucleótidos
de la rama superior de la CCR deben interpretarse con precaución, pues el complejo de
procesamiento in vitro no tiene por qué reproducir al existente in vivo. Además antes de su
incubación con el extracto nuclear el RNA fue calentado para promover la adopción de una
estructura secundaria específica que puede no coincidir con la existente in vivo.
Con la intención de abordar el estudio de esta cuestión en un contexto próximo al fisiológico, en
el presente trabajo se eligió como sistema experimental a A. thaliana tras comprobar que cuenta con
las enzimas necesarias para procesar correctamente transcritos diméricos de polaridad positiva de
distintos miembros de la familia expresados transgénicamente (Daròs y Flores, 2004), lo que
implica que es capaz de reconocer los dos sitios de corte y de ligar las formas monoméricas lineales
generadas. En este sistema heterólogo, al igual que ocurre en una planta huésped, la maquinaria de
corte y ligación actúa sólo sobre RNAs viroidales de polaridad positiva, tal y como muestran los
resultados obtenidos con plantas transgénicas que expresan un dímero de polaridad negativa del
CEVd (Fig. 28). Además, A. thaliana tiene las enzimas necesarias para completar la replicación, ya
que la expresión de un dímero de polaridad negativa del CEVd condujo a la síntesis de un
oligómero de polaridad complementaria que tras procesarse dió lugar a las correspondientes formas
viroidales monoméricas (Fig. 28), confirmando los resultados obtenidos previamente para el HSVd
con este mismo sistema (Daròs y Flores, 2004) y más recientemente con plantas transgénicas de
N. benthamiana (Gómez y Pallás, 2006). Así pues, estas características hacen a A. thaliana un buen
modelo para el estudio del procesamiento in vivo de los miembros de la familia Pospiviroidae.
La relevancia del procesamiento dentro del ciclo replicativo llevó a pensar que el
correspondiente sitio debía estar conservado en la estructura primaria y/o secundaria de todos los
miembros de la familia, por lo que el presente estudio se centró en tres viroides pertenecientes a
________________________________________________________________________Discusión
115
géneros distintos de la misma: el CEVd (Pospiviroide), HSVd (Hostuviroide), y
ASSVd (Apscaviroide). Los datos previos sugerían que el procesamiento es una característica
intrínseca de los RNA viroidales controlada por su capacidad para adoptar determinadas
conformaciones que los hacen accesibles a las enzimas implicadas (Daròs y Flores, 2004). La
mayor acumulación en A. thaliana de las formas monoméricas lineales del CEVd con respecto a las
circulares, podía indicar una ligación poco eficiente de las primeras o una labilidad alta de las
segundas. El análisis del extremo 5’ de los RNAs monoméricos lineales del CEVd procesados en
plantas transgénicas de A. thaliana reveló una población homogénea con un único extremo (G97)
presente también entre las formas monoméricas lineales aisladas de ginuras infectadas, localizando
el sitio de procesamiento en el tetrabucle terminal de la HPI después de un par CG conservado
(Fig. 35 y 36). Hay que destacar que este motivo está presente en todos los miembros de la familia,
ya que lo forman las secuencias que componen la rama superior de la CCR y las repeticiones
invertidas que la flanquean (Flores et al., 1997).
El análisis de las formas monoméricas lineales del HSVd y ASSVd, purificadas de A. thalina
transgénicas y de plantas de pepino y frutos de manzanos infectados con el HSVd y ASSVd
respectivamente, identificó una fracción cuyo extremo 5’ se corresponde con el nucleótido que en
sus HPI ocupa una posición estructuralmente equivalente a la determinada en el CEVd (Fig. 38, 41
y 42). El origen más plausible para los otros extremos identificados en las formas purificadas de
A. thaliana es la ruptura de los RNAs monoméricos circulares por sitios lábiles (Gast et al., 1996).
El sitio de procesamiento identificado en el presente trabajo coincide con el propuesto
previamente para el PSTVd a partir de experimentos in vitro (Baumstark et al., 1997), y está
incluido en la región propuesta para el CEVd mediante alguno de los ensayos de infectividad
(Visvader et al., 1985). Sin embargo, recientemente se ha sugerido que el procesamiento en el
CVd-III, del mismo género que el ASSVd, ocurre en el tallo de una estructura ramificada formada
por el apareamiento de parte de las secuencias de la rama superior de la CCR (Owens y Baumstark,
2007), aunque hay que señalar que las conclusiones de este trabajo se basan en predicciones
in silico, sin datos in vivo o in vitro que las sustenten.
Para concluir conviene destacar que sin la información proporcionada por el estudio de los
extremos de las formas monoméricas lineales de plantas transgénicas de A. thaliana, no habría sido
posible identificar el sitio de procesamiento debido a la heterogeneidad de estas formas aisladas de
plantas huésped. El análisis de estos últimos RNAs mediante experimentos de extensión del
cebador ha puesto de manifiesto que incluso eliminando los cDNAs probablemente debidos a
terminaciones prematuras inducidas por estructuras secundarias, siguen existiendo otros entre los
________________________________________________________________________Discusión
116
que no es posible discriminar el procedente del corte de los RNAs oligómericos de polaridad
positiva.
22.. MMoottiivvooss eessttrruuccttuurraalleess iimmpplliiccaaddooss eenn eell pprroocceessaammiieennttoo ddee llooss oolliiggóómmeerrooss ddee
ppoollaarriiddaadd ppoossiittiivvaa ddeell CCEEVVdd
2.1. Corte de los oligómeros
Inicialmente se propuso que el corte de los oligómeros de los miembros de la familia
Pospiviroidae tiene lugar en el centro de un RNA bicatenario palindrómico formado por el
apareamiento de las secuencias de dos HPI, aunque sin precisar ni el sitio ni el mecanismo por el
que se formaría dicha estructura (Diener, 1986) (Fig. 16). Este modelo se descartó más tarde tras
observar que un RNA monomérico del PSTVd con una repetición de 17 nucleótidos de la rama
superior de la CCR, aparentemente estabilizado en la conformación con el RNA bicatenario
palindrómico, no es procesado al incubarlo con un extracto nuclear de patata (Baumstark y
Riesner, 1995), proponiéndose que el corte de los oligómeros está dirigido por una estructura
ramificada con un tetrabucle GNRA y la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes
por un elemento de estructura terciaria denominado bucle E (ver más adelante) (Baumstark et al.,
1997; Schrader et al., 2003). En todo caso este modelo sería válido únicamente para los miembros
del género Pospiviroide, ya que la estructura ramificada con el tetrabucle GNRA no puede formarse
en RNAs oligómericos de otros miembros de la familia.
Sin embargo, los datos obtenidos en el presente trabajo sostienen el modelo propuesto por
Diener (1986) y lo amplían. En primer lugar, el sitio de procesamiento de los transcritos diméricos
del HSVd y ASSVd se localiza en una posición estructuralmente equivalente de sus HPI, que sí está
conservada en todos los miembros de la familia (Fig. 42). Esta horquilla se compone de un
tetrabucle terminal palindrómico seguido de un tallo de 3 pares de bases, un bucle interno simétrico
formado por 1-3 pares de bases presumiblemente mantenido por interacciones no canónicas (Gast et
al., 1998), y un segundo tallo de 9-10 pares de bases interrumpido o no por un bucle de 1 nucleótido
simétrico o asimétrico (Flores et al., 1997) (Fig. 61A). Hay que destacar en primer lugar que los
nucleótidos centrales del tetrabucle terminal y del tallo adyacente están conservados en todos los
miembros de la familia, lo que conlleva que las estructuras de doble cadena que alternativamente
pueden formarse en RNAs oligómericos y que contienen los sitios de corte son
termodinámicamente estables debido al alto número de pares GC (Fig. 61B). En segundo lugar, el
efecto que determinadas mutaciones tienen sobre el procesamiento de transcritos diméricos del
________________________________________________________________________Discusión
117
CEVd expresados en A. thaliana no es consistente con el modelo de la estructura ramificada con un
tetrabucle GAAA, ya que cambios en cuatro de sus tres posiciones (mutantes #8, #11, #12, y #13)
no reducen significativamente el corte respecto al transcrito control (Fig. 48 y 49). Y en tercer
lugar, el RNA monomérico del PSTVd con la repetición de 17 nucleótidos de la rama superior de la
CCR puede adoptar parcialmente la estructura de doble cadena propuesta por Diener (1986),
explicando así los resultados obtenidos en el estudio del procesamiento in vitro de este RNA
(Baumstark et al., 1997) (Fig. 62).
U-A
C-GC G
G AA A......
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
5’ 3’
C-G
C G
U-A
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
C-GC G
G AA A......
5’ 3’
C-G
C G
G-C
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C-GC G
G AA A......
C
5’ 3’
C-G
C G
U-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
G AA A......
5’ 3’
C-G
C G
C-G
U-A
G-CU A
C-GU-AC-G
C-GC-GU CG-CU-G
A-U
G A...
...
5’ 3’
C-G
C G
C-G
G-C
G C
U-AG-CG-C
C-G
G-U
C-G
U-AU-AC-G
A-U
G A...
C C...
5’ 3’
C G
U....A
CEVd PSTVd CCCVd ASSVd CbVd-1HSVdA
B
CEVd UCCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGG AUCCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGGA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AG
AG5’
3’
A
AG
G 5’
3’
PSTVdCGCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGC G
CGCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGCG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AA
AG5’
3’ AG
AA 5’
3’
HSVdGC
CCG G
CCGCG
AGCU
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G AGA A GAG CC GG AA CU U UCUCAC
CUGAGAAAGGAGCCGGAAUUCUCAG CAG
AC5’
3’ AC
AG 5’
3’
U G A C
UCUCACC GU C UCGU CG CA G A GGC GGUGA G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
CUCACCUGUCGCGUCGCAGAAGGCCGGUGAGASSVd
AA
AA5’
3’ AA
AA 5’
3’
UCGA GCGCUUGAGG GAUCCC CG GG G AAACCUCAAGC G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
CGCUUGAGGGACCCGGAACCUCAAGCGCCCVd
AA
GC5’
3’ GC
AA 5’
3’
UC CG G
CCGG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G GGUUCC CUGG A G CU CA
ACGGAAUC CAG
- -
CUGGGUUCCCUGGAGCCAACGGAAUCCAGCbVd-1
UG
AC5’
3’ AC
UG 5’
3’
U-A
C-GC G
G AA A...G A
A A......
U-AC-GC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
5’ 3’
C-G
C G
U-A
C-GG-CC-G
U-GC-GA-UG-CG-C
U-A
C-GC G
G AA A......
G AA A...G A
A A...
A A......
5’ 3’
C-G
C G
G-C
C-GU-AG-C
G-CA-UA-UA-UG-C
A-U
C-GC G
G AA A......
G AA A......
C
5’ 3’
C-G
C G
U-A
C-GC G
C-GG-CC-G
U-AG-CA-UG-CG-C
U-A
G AA A...G A
A A......
5’ 3’
C-G
C G
C-G
U-A
G-CU A
C-GU-AC-G
C-GC-GU CG-CU-G
A-U
G A...G A...
...
5’ 3’
C-G
C G
C-G
G-C
G C
U-AG-CG-C
C-G
G-U
C-G
U-AU-AC-G
A-U
G A...G A...
C C...C C...
5’ 3’
C G
U....AU....A
CEVd PSTVd CCCVd ASSVd CbVd-1HSVdA
B
CEVd UCCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGG AUCCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGGA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AG
AG5’
3’
A
AG
G 5’
3’CEVd UCCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGG A
UCCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGGA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AG
AG5’
3’
A
AG
G 5’
3’CEVd UCCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGG A
UCCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGGA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AG
AG5’
3’
A
AG
G 5’
3’CEVd UCCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGG A
UCCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGGA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AG
AG5’
3’
A
AG
G 5’
3’
UCCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGG AUCCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGGA
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AG
AG5’
3’
5’
3’
A
AG
GA
AG
G 5’
3’
5’
3’
PSTVdCGCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGC G
CGCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGCG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AA
AG5’
3’ AG
AA 5’
3’PSTVd
CGCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGC GCGCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGCG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AA
AG5’
3’ AG
AA 5’
3’PSTVd
CGCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGC GCGCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGCG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AA
AG5’
3’ AG
AA 5’
3’PSTVd
CGCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGC GCGCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGCG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AA
AG5’
3’ AG
AA 5’
3’
CGCUUCAGG GAUCCC CG GG G AAACCUGGAGC GCGCUUCAGGGAUCCCCGGGGAAACCUGGAGCG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
AA
AG
AA
AG5’
3’
5’
3’ AG
AA
AG
AA 5’
3’
HSVdGC
CCG G
CCGCG
AGCU
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G AGA A GAG CC GG AA CU U UCUCAC
CUGAGAAAGGAGCCGGAAUUCUCAG CAG
AC5’
3’ AC
AG 5’
3’HSVd
GCC
CG GCCG
CG
AGCU
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G AGA A GAG CC GG AA CU U UCUCAC
CUGAGAAAGGAGCCGGAAUUCUCAG CAG
AC5’
3’ AC
AG 5’
3’HSVd
GCC
CG GCCG
CG
AGCU
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G AGA A GAG CC GG AA CU U UCUCAC
CUGAGAAAGGAGCCGGAAUUCUCAG CAG
AC5’
3’ AC
AG 5’
3’HSVd
GCC
CG GCCG
CG
AGCU
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G AGA A GAG CC GG AA CU U UCUCAC
CUGAGAAAGGAGCCGGAAUUCUCAG CAG
AC
AG
AC5’
3’
5’
3’ AC
AG 5’
3’AC
AG
AC
AG 5’
3’
U G A C
UCUCACC GU C UCGU CG CA G A GGC GGUGA G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
CUCACCUGUCGCGUCGCAGAAGGCCGGUGAGASSVd
AA
AA5’
3’ AA
AA 5’
3’
U G A C
UCUCACC GU C UCGU CG CA G A GGC GGUGA G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
CUCACCUGUCGCGUCGCAGAAGGCCGGUGAGASSVd
AA
AA5’
3’ AA
AA 5’
3’
U G A C
UCUCACC GU C UCGU CG CA G A GGC GGUGA G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
CUCACCUGUCGCGUCGCAGAAGGCCGGUGAGASSVd
AA
AA5’
3’ AA
AA 5’
3’
U G A C
UCUCACC GU C UCGU CG CA G A GGC GGUGA G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
CUCACCUGUCGCGUCGCAGAAGGCCGGUGAGASSVd
AA
AA5’
3’U
CUCACC GU C UCGU CG CA G A GGC GGUGA G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ---
CUCACCUGUCGCGUCGCAGAAGGCCGGUGAGASSVd
AA
AA5’
3’ AA
AA
AA
AA5’
3’
5’
3’ AA
AA 5’
3’AA
AA
AA
AA 5’
3’
UCGA GCGCUUGAGG GAUCCC CG GG G AAACCUCAAGC G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
CGCUUGAGGGACCCGGAACCUCAAGCGCCCVd
AA
GC5’
3’ GC
AA 5’
3’UCGA G
CGCUUGAGG GAUCCC CG GG G AAACCUCAAGC G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
CGCUUGAGGGACCCGGAACCUCAAGCGCCCVd
AA
GC5’
3’ GC
AA 5’
3’UCGA G
CGCUUGAGG GAUCCC CG GG G AAACCUCAAGC GCGCUUGAGG GAUCCC CG GG G AAACCUCAAGC G
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
CGCUUGAGGGACCCGGAACCUCAAGCGCCCVd
AA
GC5’
3’ AA
GC
AA
GC5’
3’
5’
3’ GC
AA 5’
3’GC
AA
GC
AA 5’
3’
UC CG G
CCGG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G GGUUCC CUGG A G CU CA
ACGGAAUC CAG
- -
CUGGGUUCCCUGGAGCCAACGGAAUCCAGCbVd-1
UG
AC5’
3’ AC
UG 5’
3’U
C CG GCCGG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G GGUUCC CUGG A G CU CA
ACGGAAUC CAG
- -
CUGGGUUCCCUGGAGCCAACGGAAUCCAGCbVd-1
UG
AC5’
3’ AC
UG 5’
3’U
C CG GCCGG
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
C U G GGUUCC CUGG A G CU CA
ACGGAAUC CAG
- -
CUGGGUUCCCUGGAGCCAACGGAAUCCAGCbVd-1
UG
AC5’
3’ UG
AC
UG
AC5’
3’
5’
3’ AC
UG 5’
3’AC
UG
AC
UG 5’
3’
Figura 61. (A) Estructuras de la horquilla I (HPI) de cada una de las especies tipo de los cinco géneros que componen la familia Pospiviroidae. En un recuadro se representa la HPI del CEVd. (B) Estructura de RNA bicatenario palindrómico que alternativamente pueden adoptar las secuencias que componen las HPI en RNAs diméricos. El recuadro señala la región rica en pares GC que incluye los sitios de corte. En azul se indica la secuencia de las HPI, en rojo los nucleótidos conservados en posiciones similares en todas las estructuras, en negro las secuencias que flanquean la HPI y en gris los tetrabucles terminales y los bucles internos simétricos conservados. Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick, los puntos interacciones no canónicas y las puntas de flecha marcan el sitio de corte.
________________________________________________________________________Discusión
118
Los datos obtenidos en el presente trabajo indican que tanto la HPI como la estructura de RNA
bicatenario palindrómico son importantes en el corte de los oligómeros de polaridad positiva. Es
posible que en RNAs oligómericos la transición desde la estructura en horquilla hasta la estructura
de doble cadena se facilite in vivo por la interacción de dos tetrabucles terminales, aunque in vitro
no parece imprescindible a tenor de los resultados obtenidos en el procesamiento del PSTVd
(Baumstark et al., 1997). Esta interacción explicaría que la secuencia de los tetrabucles de la HPI
sea palindrómica en todos los miembros de la familia (Fig. 61A). Esta idea está sustentada por: i) la
recuperación del corte del transcrito dimérico cuando se restaura el palíndrome en el mutante doble
#7 (Fig. 46), ii) la presencia de un dominio de dimerización en la HPI del PSTVd (Gast et al., 1998)
y, iii) la observación de que este tipo de interacciones participan en el reconocimiento entre RNAs
(Brunel et al., 2002). De ser este el mecanismo que promueve la formación de la estructura de RNA
bicatenario, los cambios introducidos en los mutantes #2 a #6 disminuirían la intensidad de la
interacción entre los tetrabucles, explicando así la baja eficiencia observada en el corte del
transcrito dimérico en ambos casos (Fig. 46). Este mecanismo es similar a la dimerización de los
RNAs genómicos de los retrovirus, que es crítico en su ciclo infeccioso y está mediado por un bucle
palindrómico que puede dimerizar co- o postranscripcionalmente (Paillart et al., 2004).
RNA de doble cadena
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-G C-
U A-A AG A
C G-80
110
95
G C-A CA C
U AU U
3’
5’
C G-
96
96
C G-
C G-G C-
RNA de doble cadena
C G-
G C-G C-A U-C G-
U A-U G-
C G-G C-
U A-A AG A
C G-80
110
95
G C-A CA C
U AU U
3’
5’
C G-
96
96
C G-
C G-G C-
C G-C G-
G C-G C-G C-G C-A U-A U-C G-C G-
U A-U A-U G-U G-
C G-C G-G C-G C-
U A-U A-A AG A
C G-C G-80
110
95
G C-G C-A CA C
U AU U
3’
5’
C G-C G-
96
96
C G-C G-
C G-C G-G C-G C-
Figura 62. Estructura bicatenaria que puede formar un RNA del PSTVd con extremos BamHI sintetizado a partir de un cDNA monomérico seguido de una repetición de 17 nucleótidos de la CCR. Los guiones indican interacciones canónicas Watson-Crick, las líneas discontinuas interacciones no canónicos, y las puntas de flecha los sitios de corte. Las letras en rojo señalan nucleótidos conservados en todos los miembros de la familia Pospiviroidae.
________________________________________________________________________Discusión
119
En resumen, nuestros datos indican que una estructura de RNA bicatenario palindrómico
formada por el apareamiento de las secuencias que componen dos HPI dirige el corte de los RNAs
oligómericos de los miembros de la familia Pospiviroidae. Es interesante destacar que el sitio de
corte en ambas cadenas está desplazado dos posiciones, una característica de las RNasas III (Gan et
al., 2006; MacRae et al., 2006) de las que en A. thaliana se han descrito siete genes (Hiraguri et
al., 2005).
2.2. Ligación de los RNAs monoméricos lineales
Nuestros resultados indican que el sustrato de la reacción de ligación en los miembros del
género Pospiviroide es la conformación extendida con el bucle E, y por tanto que mientras que en la
reacción de corte está implicada únicamente la rama superior de la CCR, en la de ligación
participan la rama superior e inferior. La existencia de sustratos distintos para cada una de las dos
reacciones lleva implícito un cambio conformacional desde la estructura de corte a la de ligación,
que podría facilitar la actividad RNA helicasa asociada a algunas RNasas III (Hiraguri et al., 2005;
MacRae et al., 2006). Debido a que el bucle E sólo está presente en los géneros Pospiviroide y
Cocadviroide, en los miembros de los géneros restantes de la familia Pospiviroidae debe existir un
motivo alternativo que desempeñe un papel equivalente. Un posible candidato es la conformación
extendida de la CCR que incluye una hélice con una U protuberante (bulged-U helix) conservada en
todos los miembros de los géneros Pospiviroide, Hostuviroide y Cocadviroide (Keese y
Symons, 1985), y estructuras similares en los otros géneros de la familia (Fig. 63).
U
G
G
U
C
G
C
G
G
C
G
C
U
A
C
G
C
GU
“Bulged−U helix”
U
G
G
U
C
G
C
G
G
C
G
C
U
A
C
G
C
GU
“Bulged−U helix”
U
G
G
U
C
G
C
G
G
C
G
C
U
A
C
G
C
GU
“Bulged−U helix”
Figura 63. Estructura secundaria en varilla propuesta para la mayoría de los miembros de la familia Pospiviroidae. En la parte inferior se muestran la hélice con una U protuberante (bulged-U helix) presente en la CCR de los miembros de los géneros Pospiviroide, Hostuviroide y Cocadviroide, y el bucle E (indicado con letras huecas) conservado en los géneros Pospiviroide y Cocadviroide. La punta de flecha señala el sitio de ligación.
33.. NNaattuurraalleezzaa qquuíímmiiccaa ddee llooss eexxttrreemmooss ddee llooss RRNNAAss mmoonnoomméérriiccooss lliinneeaalleess ddeell
CCEEVVdd
La idea más aceptada es que la actividad enzimática implicada en el corte de los oligómeros de
________________________________________________________________________Discusión
120
polaridad positiva de los miembros de la familia Pospiviroidae no reside en el RNA viroidal
(Tsagris et al., 1987a; Tsagris et al., 1987b; Baumstark y Riesner, 1995; Baumstark et al., 1997;
Schrader et al., 2003; Owens y Baumstark, 2007). No obstante, algunos trabajos han defendido que
esta reacción está catalizada por ribozimas (Robertson et al., 1985; Symons, 1992; Liu y
Symons, 1998), como ocurre en los miembros de la familia Avsunviroidae, y atribuyen al alto
número de conformaciones que el RNA viroidal puede adoptar la dificultad para encontrar las
condiciones experimentales que permitan observar el autocorte in vitro (Symons, 1992).
El estudio de la naturaleza química de los extremos de los RNAs viroidales monoméricos y
lineales procesados in vivo puede aportar información acerca de las actividades enzimáticas
implicadas, ya que por un lado las ribonucleasas se clasifican por la posición del grupo fosforilo tras
la ruptura del enlace fosfodiéster y por otro se conocen tres RNA ligasas con distinta especificidad
de sustrato. Las RNA ligasas del fago T4 (Rnl1 y Rnl2) y la RNA ligasa de
Deinococcus radiodurans (DraRnl) actúan sobre RNAs con extremos 5’-P, 3’-OH, mientras que las
tRNA ligasas lo hacen sobre RNAs con extremos 2’,3’-fosfodiéster cíclico con independencia de
que el extremo 5’ esté o no fosforilado (Konarska et al., 1982; Uhlenbeck, 1983; Raymond y
Shuman, 2007).
La hipótesis que ha venido siendo aceptada es que en la familia Pospiviroidae los RNAs
monoméricos lineales presentan los mismos extremos que los generados por las ribozimas en la
familia Avsunviroidae (5’-OH, 2’,3’-fosfodiéster cíclico). Diversos trabajos defienden su presencia
en los RNAs monoméricos lineales del PSTVd aislados de plantas huésped infectadas, basándose
en los datos obtenidos mediante marcaje del extremo 5’ con polinucleótido quinasa (PNK) y [γ-32P]
ATP (Palukaitis y Zaitlin, 1987; Palukaitis y Symons, 1980), experimentos de ligación in vitro
(Kikuchi et al., 1982; Branch et al., 1982), y correlación de la infectividad con la presencia de
extremos 2’,3’-fosfodiéster cíclico (Hashimoto et al., 1985). Pero la heterogeneidad de la población
objeto de estos estudios representa un serio problema, pues no todos los procesos que dan lugar a
las formas monoméricas lineales necesariamente generan los mismos extremos. Esta es la razón por
la que ninguna de dichas estrategias ha podido resolver esta cuestión sin ambigüedad. Por ejemplo,
mientras que del análisis mediante marcaje radiactivo del extremo 5’ de los RNAs monoméricos
lineales del viroide del enanismo del crisantemo (CSVd, Chrysanthemun stunt viroid) se infirió que
presentaban un extremo 5’-P (Palukaitis y Symons, 1980), el estudio con la misma metodología de
los RNAs monoméricos lineales del PSTVd concluyó que presentaban extremos 5’-OH (Palukaitis
y Zaitlin, 1987). Por otro lado, bioensayos con transcritos monoméricos del CEVd cuestionaron la
necesidad de un extremo 2’,3’-fosfodiéster cíclico para que un RNA viroidal fuera infeccioso
(Rigden y Rezaian, 1992).
________________________________________________________________________Discusión
121
Las formas viroidales monoméricas y lineales procesadas en A. thaliana nos han permitido
abordar el estudio de sus extremos partiendo de una población homogénea. Las metodologías del
tipo RACE se eligieron porque proporcionan información sobre la naturaleza química de los
mismos y sirven para confirmar los extremos previamente identificados mediante experimentos de
extensión del cebador. Los resultados obtenidos con las formas monoméricas lineales del CEVd
mediante 5’ RLM-RACE, 3’-RACE y ligación in vitro, son consistentes entre sí e indican la
presencia de extremos 5’-P y 3’-OH (Fig. 54, 57 y 59). Es importante destacar que entre los RNAs
purificados de ginura se identificó una fracción con estos mismos extremos (Fig. 59), y que el
análisis del extremo 5’ de las formas del HSVd y ASSVd procesadas en plantas transgénicas
también identificó la presencia de un grupo fosforilo (Fig. 55). Estos extremos sugieren la
participación de una RNasa III (Robertson et al., 1968; MacRae y Doudna, 2007) y una RNA ligasa
que reconocería los mismos extremos que las del fago T4 y la de D. radiodurans (Uhlenbeck, 1983;
Ho y Shuman, 2002; Raymond y Shuman, 2007), aunque hasta la fecha no se ha descrito ninguna
actividad de esta clase. La reacción de circularización está favorecida frente a la ligación
intermolecular en Rnl1 y Rnl2, mientras que en DraRnl la situación es la contraria (Sugino et al.,
1977; Ho y Shuman, 2002). La Rnl1 está implicada en la reparación de pequeñas mellas en regiones
de simple cadena (Amitsur et al., 1987; Sidrauski et al., 1996; Abelson et al., 1998) en tanto que la
Rnl2 actúa sobre RNAs de doble cadena o híbridos DNA-RNA (Nandakumar et al., 2004). Estas
características hacen probable que la supuesta RNA ligasa implicada en el procesamiento de los
oligómeros viroidales pertenezca a la familia de la Rnl2.
Como se ha indicado en la Introducción, los oligómeros viroidales de polaridad positiva podrían
ser procesados en el nucleoplasma o en el nucleolo, lo que es consistente con la localización nuclear
de algunas ribonucleasas III (Hiraguri et al., 2005) y con su preferencia a actuar sobre RNAs con un
alto contenido de estructura secundaria. Por otra parte, una o varias de estas RNasas parecen
participar en la formación de pequeños RNAs viroidales similares a los pequeños RNA interferentes
que se acumulan en plantas infectadas (Itaya et al., 2001; Papaefthimiou et al., 2001; Martínez de
Alba et al., 2002; Itaya et al., 2007; Martín et al., 2007). En A. thaliana se han identificado siete
miembros de la familia de las RNasas III que se dividen en dos grupos. El primero está formado por
las enzimas DCL (Dicer like, DCL1-DCL4) y el segundo por las RTL (RNase three-like protein,
RTL1-RTL3). Estas últimas presentan características comunes a las RNasas III de levadura (Rnt1
de Saccharomyces cerevisiae y PacI de Schizosaccharomyces pombe) y a las proteínas DCL. Los
dominios endonucleasa (endoNs) y de unión a RNA de doble cadena (dsRBD) se parecen a los de
las RNasas de levadura, mientras que la región N-terminal a la de las RNasas DCL (Hiraguri et
al., 2005).
________________________________________________________________________Discusión
122
G NA/U N
W-C W-CW-CN-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’S-S’S-S’S-S’S-S’S-S’S-S’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’
N NN N G-C N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’
U UU CN-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’
9 pb
15 pb16 pb
14 pb
CEB
BSB
IBPBCPDB
CPPB
Pac1 Rnt1G N
A/U N W-C W-CW-CN-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’S-S’S-S’S-S’S-S’S-S’S-S’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’
N NN N G-C N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’
U UU CN-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’N-N’
9 pb
15 pb16 pb
14 pb
CEB
BSB
IBPBCPDB
CPPB
Pac1 Rnt1
Figura 64. La actividad de las RNasas de tipo III de levadura está modulada por elementos estructurales y de secuencia (adaptado de Lamontagne y Elela, 2004). Los sustratos típicos de las enzimas PacI de S. pombe y Rnt1 de S. cerevisiae, se representan con los elementos estructurales reconocidos por cada enzima recuadrados. Los determinantes que dirigen la actividad de la primera son un par GC y un bucle interno UU-UC situados en la caja de posicionamiento y corte distal (CPDB, Cleavage Positioning Distal Box), y en la caja de posicionamiento y corte proximal (CPPB, Cleavage Positioning Proximal Box), respectivamente. Rnt1 reconoce un tetrabucle A/UGNN en la caja de unión inicial y posicionamiento (IBPB, Initial Binding and Positioning Box). El corte de esta última también se encuentra regulado por las secuencias de la caja de unión y estabilidad (BSB, Binding and Stability Box) y por la caja de corte (CEB, Cleavage Efficency Box). En rojo, azul y verde se indican el dominio de unión a RNA de doble cadena, el dominio endonucleolítico y la región N-terminal, respectivamente. W-C representan pares Watson-Crick, y N-N’ ribonucleótidos complementarios. S equivale a C o a G, y S’ al nucleótido complementario.
Diversos trabajos han puesto de manifiesto que las RNasas III de levaduras, Rnt1 y PacI, cortan
a una distancia fija de entre 14 a 16 pares de bases a partir de ciertos determinantes estructurales, y
que su actividad se encuentra modulada por interacciones con secuencias específicas y elementos
estructurales (Lamontagne y Elela, 2004) (Fig. 64). La similitud entre las RNasas RTL de
A. thaliana y las RNasas Rnt1 y PacI hacen muy sugerentes las siguientes observaciones: i) en la
estructura de RNA bicatenario palindrómico los sitios de corte en los viroides estudiados se
encuentran a una distancia de 15-17 pares de bases desde el nucleótido que ocupa la posición 5’
proxima en la HPI, ii) a 4 nucleótidos del sitio de corte se encuentra un bucle interno simétrico de
1-3 nt, y iii) el análisis de las secuencias de las especies tipo de la familia Pospiviroidae y del
procesamiento en A. thaliana de transcritos diméricos del CEVd mutados en posiciones específicas,
________________________________________________________________________Discusión
123
sustentan la necesidad de un tallo formado por pares Watson-Crick con una región central rica en
pares GC (comparar Fig. 61 y 64). Puede que la interacción del dominio dsRBD de la RNasa III con
un elemento estructural adyacente al RNA bicatenario palindrómico, posicione al dominio endoNS
en su secuencia diana. Hay que destacar que en la estructura de RNA bicatenario palindrómico de
los cinco miembros tipo de la familia Pospiviroidae, la región central que contiene los sitios de
corte está flanqueada por bucles internos. Estos elementos estructurales y los nucleótidos
protuberantes podrían facilitar el reconocimiento a nivel de secuencia y de estructura entre el
dominio dsRBD y el RNA (Tian et al., 2004).
44.. MMooddeelloo ppaarraa eell pprroocceessaammiieennttoo ddee llooss oolliiggóómmeerrooss ddee ppoollaarriiddaadd ppoossiittiivvaa ddee llaa
ffaammiilliiaa PPoossppiivviirrooiiddaaee
El estudio del procesamiento in vivo nos ha conducido a formular un modelo general para todos
los miembros de la familia, a diferencia de los propuestos específicamente para el PSTVd y el CVd-
III (Baumstark et al., 1997; Schrader et al., 2003; Owens y Baumstark, 2007), que recupera la
importancia atribuida anteriormente a la HPI en esta etapa del ciclo replicativo (Diener, 1986).
Asimismo nuestro modelo responde a preguntas importantes planteadas en el modelo de Diener, a
la vez que abre nuevos e interesantes interrogantes.
Como ya se ha detallado en la Introducción, los miembros de esta familia pueden adoptar,
además de la conformación en varilla, estructuras metaestables alternativas con un papel potencial
en la replicación (Henco et al., 1979; Riesner et al., 1979). En este contexto se comprobó mediante
estudios termodinámicos que RNAs diméricos del PSTVd pueden plegarse en una estructura de
RNA bicatenario palindrómico formado por el apareamiento de las secuencias de dos HPI (Hecker
et al., 1988). Dicha estructura, que fue propuesta como el sustrato sobre el que tendría lugar la
reacción de corte de los oligómeros (Diener, 1986), divide la molécula oligomérica en unidades
monoméricas distinguibles (Hecker et al., 1988).
Según nuestro modelo, durante la síntesis de los RNAs oligómericos de polaridad positiva, dos
HPI interaccionarían por sus tetrabucles terminales promoviendo la formación de la estructura de
RNA bicatenario palindrómico (Fig. 65). Ésta sería reconocida por una RNasa III que catalizaría el
corte en posiciones específicas de ambas cadenas dando lugar a RNAs con extremos 3’
protuberantes en dos nucleótidos (Hiraguri et al., 2005; MacRae et al., 2006). Seguidamente se
produciría un segundo cambio conformacional, tal vez facilitado por la actividad RNA helicasa
asociada a estas ribonucleasas, conducente a la estructura secundaria en varilla con los extremos del
RNA físicamente próximos. Sobre esta estructura tendría lugar la reacción de ligación catalizada
________________________________________________________________________Discusión
124
por una RNA ligasa que reconocería los mismos extremos que la Rnl2 (Ho y Shuman, 2002). Los
requerimientos estructurales para la reacción de ligación son superiores a los de la de corte, pues en
todos los mutantes del CEVd ensayados la primera se vio más afectada que la segunda (Fig. 46, 47,
49,50 y 52).
Corte en las dos cadenas
1er cambio conformacional(“dimerización”)
2o cambio conformacional
Ligación
CG
5’
3’
GY
Y
R
RC
3’
5’
Horquilla I
Estructura de RNA de doble cadena
U
G
G
U
C
G
C
G
G
C
G
C
U
A
C
G
C
GU
Bulged−U helix
C
G
G
C
Y R
YR
3’
5’
5’
3’
C
G
G
C
Y R
YR
3’
5’
5’
3’
A
B
C
D
E
Corte en las dos cadenas
1er cambio conformacional(“dimerización”)
2o cambio conformacional
Ligación
CCGG
5’
3’
GGYY
YY
RR
RRCC
3’
5’
Horquilla I
Estructura de RNA de doble cadena
U
G
G
U
C
G
C
G
G
C
G
C
U
A
C
G
C
GU
Bulged−U helix
C
G
G
C
Y R
YR
3’
5’
5’
3’
C
G
C
G
G
C
G
C
Y R
Y
R
YR
3’
5’
5’
3’
C
G
G
C
Y R
YR
3’
5’
5’
3’
C
G
C
G
G
C
G
C
Y R
Y
R
YR
3’
5’
5’
3’
A
B
C
D
E
Figura 65. Modelo propuesto para el procesamiento in vivo de los RNAs oligómericos de polaridad positiva de la familia Pospiviroidae. La interacción de los tetrabucles terminales de dos HPI consecutivas (A) promovería la formación de una estructura de RNA bicatenario palindrómico formada por el apareamiento de las secuencias que los componen (B). Esta estructura sería reconocería por una RNasa III que cortaría en posiciones específicas en ambas cadenas (C). A continuación tendría lugar un segundo cambio conformacional que daría lugar a la estructura secundaria en varilla con el bucle E (indicado con letras huecas) y la hélice con una U protuberante (bulged-U helix) adyacente (D), sobre la que tendría lugar la reacción de ligación catalizada por una RNA ligasa que reconocería los mismos extremos de la Rnl2. R e Y indican bases púricas y pirimidínicas, respectivamente. La línea con forma de S y la punta de flecha señalan las bases que se entrecruzan mediante irradiación con luz ultravioleta y el sitio de procesamiento, respectivamente. Los guiones representan interacciones canónicas Watson-Crick y los puntos interacciones no canónicas.
Por último es interesante señalar que el modelo anterior: i) es válido para todos los miembros de
la familia debido a que los motivos estructurales implicados forman parte del dominio central
conservado en los cinco géneros (Keese y Symons, 1985), ii) define el sitio de procesamiento y
propone el mecanismo que daría lugar a la estructura sobre la que ocurriría la reacción de corte,
________________________________________________________________________Discusión
125
aspectos no resueltos en el modelo de Diener (1986), iii) plantea la existencia de dos únicas
conformaciones, una activa para el corte y otra para la ligación, ya que el corte en las dos posiciones
se produce sobre el mismo sustrato a diferencia del modelo propuesto previamente para el PSTVd
(Baumstark et al., 1997; Schrader et al., 2003), iv) explica los resultados obtenidos mediante
estudios de infectividad in vivo (Tabler y Sänger, 1984; Visvader et al., 1985; Meshi et al., 1985;
Hashimoto y Machida, 1985; Candresse et al., 1990) y de procesamiento in vitro (Baumstark et
al., 1997; Schrader et al., 2003), v) implica a una RNasa III en el corte de los oligómeros de
polaridad positiva, y vi) predice la existencia de una RNA ligasa capaz de unir extremos 5’-P,
3’-OH distinta a la descrita hasta ahora en plantas (Konarska et al., 1981; Englert y Beier, 2005).
55.. AA.. tthhaalliiaannaa ccoommoo mmooddeelloo ppaarraa eell eessttuuddiioo ddeell pprroocceessaammiieennttoo ddee llooss RRNNAAss
vviirrooiiddaalleess
Esta planta es un buen sistema experimental para el estudio de diversos aspectos generales en la
biología de plantas. Su cultivo resulta muy fácil y rápido debido al pequeño tamaño, ciclo de vida
corto, y ausencia de requerimientos especiales, aunque su principal ventaja deriva de la
disponibilidad de la secuencia completa de su genoma (Arabidopsis Genome Initiative, 2000) y del
elevado número de herramientas genéticas y genómicas disponibles.
Hace unos años se comprobó que a pesar de no ser un huésped natural, A. thaliana cuenta con la
maquinaria enzimática necesaria para el procesamiento de transcritos diméricos de polaridad
positiva de distintos miembros de la familia Pospiviroidae expresados transgénicamente (Daròs y
Flores, 2004). En dicho trabajo y en el aquí presentado se ha verificado que en esta planta, al igual
que ocurre en plantas huésped infectadas, las enzimas implicadas en la reacción de corte y ligación
actúan sólo sobre los RNAs viroidales de polaridad positiva (Fig. 28). Una situación similar se ha
descrito recientemente en plantas transgénicas de N. benthamiana transformadas con un transcrito
dimérico del HSVd (Gómez y Pallás, 2006). Además, los RNAs monoméricos lineales proceden
mayoritariamente del corte del transcrito primario, pues el análisis de líneas transgénicas que
expresan transcritos diméricos de polaridad negativa mostró niveles de replicación muy bajos
(Fig. 28). Esto da lugar a una población de formas monoméricas lineales homogénea en sus
extremos tanto en lo que se refiere a la identidad de los nucleótidos (Fig. 35, 38 y 41) como a los
grupos presentes en los mismos (Fig. 54, 55, 57 y 59), permitiendo así la caracterización de dichos
extremos, algo inabordable con las formas monoméricas lineales procesadas en plantas infectadas
debido a su heterogeneidad. La información obtenida ha resultado muy valiosa para la predicción de
las enzimas implicadas en el procesamiento (ver apartados previos). Por otra parte, la reacción de
________________________________________________________________________Discusión
126
ligación en A. thaliana da lugar a RNAs monoméricos circulares indistinguibles a los de una planta
huésped, tal y como indican los ensayos de infectividad de formas monoméricas circulares del
CEVd y HSVd aisladas de plantas transgénicas o de plantas infectadas (Fig. 29 y 31).
El transcrito primario de polaridad positiva expresado en plantas transgénicas de A. thaliana
equivale a los oligómeros de la misma polaridad de una planta huésped, pero tiene la ventaja de que
su síntesis es constante y su tamaño definido. Por lo tanto es posible cuantificar cada uno de los
RNAs que participan en el procesamiento (transcrito primario y formas viroidales monoméricas), y
estudiar el efecto que determinadas mutaciones de la secuencia viroidal tienen sobre cada una de las
reacciones (Fig. 45-52). Mediante esta estrategia se han podido analizar los motivos estructurales
implicados en el procesamiento, un estudio que no puede acometerse en plantas huésped porque la
mayoría de las mutaciones ensayadas no son viables (Tabla 7), y porque es muy difícil asociar los
resultados de los ensayos de infectividad con una etapa concreta del ciclo infeccioso. La infección
sistémica por un viroide conlleva: i) entrada al orgánulo dónde la replicación ocurre, ii) replicación,
iii) salida del orgánulo, iv) movimiento célula-célula, v) entrada al tejido vascular, vi) movimiento a
larga distancia dentro del mismo, y vii) salida del tejido vascular y entrada a células nuevas. Cada
uno de estos pasos implica interacciones específicas entre motivos viroidales y factores celulares,
por lo que los niveles de infectividad de distintas variantes no proporcionan información sobre qué
etapa está afectada.
A pesar de que hace 20 años que se propuso el mecanismo por el cual los viroides de la familia
Pospiviroidae llevaban a cabo su replicación, las características básicas del proceso siguen sin
conocerse. En este trabajo se da respuesta a preguntas importantes que no han podido resolverse
inequívocamente en este tiempo: el sitio de corte de los oligómeros de polaridad positiva, los
motivos estructurales que lo dirigen, y las enzimas del huésped implicadas. Quedan muchas
cuestiones pendientes y A. thaliana, por las razones enumeradas con anterioridad, puede servir para
contestar algunas. Esta planta modelo ha sido utilizada reiteradamente para el estudio de los
procesos desencadenados por RNAs virales y ha permitido la caracterización de factores del
huésped implicados en la replicación (Yamanaka et al., 2000; Lellis et al., 2002), movimiento
(Chisholm et al., 2000; Whitham et al., 2000), y silenciamiento génico post-transcripcional
(Mourrain et al., 2000; Dalmay et al., 2001; Kasschau et al., 2003).
CCoonncclluussiioonneess
127
128
_____________________________________________________________________Conclusiones
129
CCoonncclluussiioonneess 1. Arabidopsis thaliana, a pesar de no ser una planta huésped, es capaz de procesar correctamente
transcritos diméricos de polaridad positiva de distintos miembros de la familia Pospiviroidae
expresados transgénicamente. En este sistema heterólogo, al igual que ocurre en plantas huésped
infectadas, los transcritos diméricos de polaridad positiva son cortados y ligados a las
correspondientes formas viroidales monoméricas, mientras que un transcrito dimérico de polaridad
negativa del CEVd sirve únicamente de molde para la síntesis de un oligómero de polaridad
complementaria pero no es procesado.
2. Los RNAs monoméricos lineales del CEVd, HSVd y ASSVd resultantes del procesamiento de
los correspondientes dímeros en plantas transgénicas de A. thaliana forman una población
homogénea en cuanto a sus extremos, a diferencia de los generados en plantas huésped infectadas.
Esta observación sugiere que en A. thaliana dichas formas viroidales proceden mayoritariamente
del corte del transcrito primario.
3. Los RNAs monoméricos circulares del CEVd y HSVd aislados de plantas transgénicas de
A. thaliana presentan una infectividad similar a las purificadas de huéspedes típicos, indicando que
las reacciones de corte y ligación en ambos sistemas dan lugar al mismo producto final.
4. El análisis del extremo 5’ de los RNAs monoméricos y lineales del CEVd, HSVd y ASSVd,
aislados de plantas transgénicas o de plantas huésped infectadas, muestra que el sitio de
procesamiento se encuentra en un motivo conservado en la familia, la rama superior de la región
central conservada. Las secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean
pueden adoptar un plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario
palindrómico en RNAs oligómericos. En ambas estructuras el sitio identificado se localiza en
posiciones estructuralmente equivalentes, lo que por una parte sugiere la implicación de una de
estas estructuras en el procesamiento, y por otra cuestiona la validez del modelo previamente
propuesto para los miembros del género Pospiviroide a partir de experimentos in vitro. Según este
último modelo, la reacción de corte está dirigida por una estructura ramificada con un tetrabucle
GNRA que el ASSVd es incapaz de formar.
5. Los datos obtenidos en el análisis del procesamiento de 16 líneas transgénicas de A. thaliana que
expresan cDNAs diméricos del CEVd mutados en posiciones definidas de la región central
_____________________________________________________________________Conclusiones
130
conservada, han permitido concluir que las enzimas del huésped que catalizan las dos etapas del
procesamiento, corte y ligación, actúan sobre sustratos distintos. Mientras que el corte de los
oligómeros de polaridad positiva debe tener lugar sobre la estructura de RNA bicatenario
palindrómico, la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes debe estar mediada por una
estructura extendida que contiene el bucle E, aunque este motivo estructural no es el único
relevante.
6. Los sitios de corte en la estructura de RNA bicatenario palindrómico están desplazados dos
posiciones, generando así extremos 3’ con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de
los productos de las RNasas III.
7. El análisis mediante RLM-RACE, 3’-RACE y experimentos de ligación in vitro de los RNAs
monoméricos lineales del CEVd procesados en plantas transgénicas de A. thaliana indica que estos
RNAs presentan extremos 5’-P, 3’-OH, presentes también entre las formas purificadas de plantas
huésped infectadas. Este resultado es particularmente relevante porque refuerza la participación de
una RNasa III y predice la existencia en plantas de una RNA ligasa que reconocería dichos
extremos.
BBiibblliiooggrraaffííaa
131
132
______________________________________________________________________Bibliografía
133
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156
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El mundo
Un hombre del pueblo de Neguá, en la costa de Colombia, pudo subir al alto cielo.
A la vuelta, contó. Dijo que había contemplado, desde allá arriba, la vida humana. Y dijo
que somos un mar de fueguitos.
- El mundo es eso – reveló -. Un montón de gente, un mar de fueguitos.
Cada persona brilla con luz propia entre todas las demás. No hay dos fuegos iguales. Hay fuegos
grandes y fuegos chicos y fuegos de todos los colores. Hay gente de fuego sereno, que ni se entera
del viento, y gente de fuego loco, que llena el aire de chispas. Algunos fuegos, fuegos bobos, no
alumbran ni queman, pero otros arden la vida con tantas ganas que no se puede mirarlos sin
parpadear, y quien se acerca, se enciende.
“El libro de los abrazos”
Eduardo Galeano
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__________________________________________________________________Agradecimientos
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Por fin ha concluido una etapa en la que he tenido la suerte de conocer fuegos que me han
enriquecido como persona e investigadora, y han hecho posible que hoy esté escribiendo estas
líneas; a todos quiero daros las gracias.
En primer lugar a mis directores de tesis, Ricardo, Carmen y José Antonio, por darme la
oportunidad de trabajar con vosotros, por la confianza que habéis depositado en mí, y por todo lo
que me habéis enseñado.
A mis compañeros de laboratorio, a los que están y a los que se marcharon, por hacer que
todos los días valiesen la pena. Amparo siempre has estado ahí, has reído conmigo y has secado mis
lágrimas; esta tesis es de las dos. Laura me recibiste con los brazos abiertos y entre ellos me quedé.
Marcos, maestro y amigo, en todos estos años has estado sentado a mi lado enseñándome,
aconsejándome y haciéndome reir; gracias por valorar la opinión del pequeño saltamontes desde el
primer día. Miliu por ese “sino sale no es por ti”, por tu amistad y tu sentido del humor, pero
sobretodo por enseñarme quien es Leño. Sonia, cuyo espíritu nos ha hecho reír como nadie, me has
tendido tu mano en infinidad de ocasiones (y el hombro cuando fue necesario). Selma has sacado
tiempo de donde no lo había para resolver mis expedientes X y aconsejarme. Alberto facilitaste el
comienzo de mi aventura con los viroides. Douglas y Amine que han animado durante la étapa más
estresante de la tesis.
A todos mis compañeros del grupo de virus y viroides, que me han acompañado durante
estos años, en especial a los que han vivido este trabajo de un modo más directo: VPallas siempre
has vigilado que a mgas no le faltase gas, has confiado en mí, y has sobrellevado mis bromas; Pachi
tu amistad sincera e incondicional me ha ayudado a salvar los obstáculos que me he ido
encontrando; Leticia tu cariño e interés han sido un regalo en esta recta final; Jorge gracias por
todas las carcajadas que me has arrancado, conocerte ha sido un placer equiparable al jabón de
Marsella (o a una obra de teatro del ACTOR); Mari Carmen sencillamente por ser como eres, y por
la ayuda que me has dado desde el primer día; Ainhoa, por tu paciencia, tu sentido del humor y por
lograr que todos los días fuesen fáciles; Toni, por tus consejos (científicos y literarios), y por
transmitirme seguridad en mi misma.
A todos los de la salita por conseguir que los problemas quedasen al otro lado de la puerta,
pero sobretodo a: Carol, que día tras día se ha pasado por el laboratorio para ver como me iban las
cosas y ha evitado que me sintiese perdida; Dolores, cuyo cariño me ha reconfortado en muchas
ocasiones; Astrid con la que he tenido la suerte de compartir buenos momentos (muchos delante de
una copa de helado en Daniel); Pilar que tuvo la mala suerte de vivir sólo los momentos menos
__________________________________________________________________Agradecimientos
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dulces de la tesis; Angela, compañera de campana y aliada en las bromas, a la que tengo que
agradecer que me haya secuestrado cuando la ocasión lo requería; Stephanie y Lynne por echarme
un cable cuando lo he necesitado; Laura Huerta que siempre ha estado dispuesta a escucharme,
animarme y ayudarme, y por último, pero no menos importante, agradecer a mi amigo invisible
haberme ayudado cuando más lo necesitaba.
A Pepe León y a su grupo por adoptarme (realmente no he hecho ninguna PCR durante la
tesis). Silbia sólo puedo decirte que “es muy fuerte” que nos hayas hecho reír en todas las
ocasiones. Mari Cruz, la persona más extrovertida y alegre que he conocido, gracias por tu amistad,
tu ayuda y por enseñarnos a reírnos de nosotros mismos. Cris, mi niña, sabes que opino que tienes
muchísimo valor pero si lo comparas con el tamaño de tu corazón es ínfimo, gracias por cuidar de
mí.
A todos los compañeros (becarios, investigadores, y personal de administración y servicios)
del IBMCP porque siempre he encontrado en ellos una sonrisa y una palabra amable, en especial
agradecerle a Eugenio su interés (dos preguntas: ¿porqué no sabes secuenciar sin DNA? y ¿cuándo
van a estar mis muestras?) y a Ana Mira la organización de mis vacaciones.
A los miembros del departamento de Genética de la Universidad de Valencia con los que
tuve la suerte de coincidir, por enseñarme lo que significa e implica la investigación; a Rosa de
Frutos y a Lluís Pascual agradecerles que me brindaran la oportunidad de entrar en este mundo; y a
Javi su paciencia y su ayuda.
A mi familia, en el sentido más amplio de la palabra, por estar a mi lado en todos los
momentos decisivos y porque sin comprender este mundo apoyan mis decisiones, incluso cuando
éstas me alejan de su lado. Mis padres, por enseñarme a luchar por lo que quiero (no hay valla alta
todo es cuestión de impulso), por respetar mis decisiones, y por sacrificarse para darnos lo que ellos
no tuvieron. Mi abuela por inculcarme que todo se ve mejor detrás de una sonrisa. Mi abuelo por
mostrarme lo sencillo que es disfrutar de lo que uno hace (ojalá hubieses podido leer mi novela). Mi
hermano que fue el primero en apostar por mí. Ofelia que ha enriquecido nuestras vidas y me anima
a seguir con mi sueño. Daniel que me ha dado energía cuando las fuerzas flaqueaban. Mª Eugenia,
Sebastián y Marta, por ayudarme con sus juegos, risas y abrazos.
A mis amigos de la carrera que son lo mejor que la Biología y la Bioquímica me han dado.
José y Rebeca, sé que “puedo contar con vosotros, no hasta dos o hasta tres, sino contar con
vosotros”. Ester y Quique por abrime las puertas de vuestra familia. Ester, “No hagas nada. Tu
obra eres tú, nada más”. Manuel y Juan, por hacer que los días buenos sean geniales y los malos
__________________________________________________________________Agradecimientos
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buenos. Guacho, por esos pequeños detalles a los que tú no das valor pero que son increíbles.
Vicente, por las fotos hermosas que hemos hecho (y las que nos quedan). Carlos, la niña del sur
sabe que siempre puede contar con el chico del norte. Efra, por recordarme que estaba en el final del
camino cuando a mí se me olvidaba. JHH siempre que he silbado has acudido. Amparo, por los
momentos que he compartido con vosotros. Noelia la mejor de la promoción. Silvia no sé como
agradecerte que siempre camines a mi lado, en los buenos y en los malos momentos. Pepe y
Encarna contar con vosotros ha sido una tranquilidad para todos. Julia, la montaña no se ha movido
ni se moverá sola, ya que cuando siento que no voy a poder alcanzarla tu mano no sólo alivia la
carga sino que me la acerca. P fuiste un regalo desde el primer día, siempre recordaré esos años.
A todos los compañeros del IVIA que han compartido esta recta final, y en especial
agradecerles a Luis Navarro y Gema la oportunidad que me han dado, y a Rosa su ayuda y
paciencia.
A continuación quiero mencionar a unas personas que me han ayudado a concluir lo que
estaba empezado. Aquella noche en urgencias me pediste que no te expresara mi gratitud en ese
instante sino desde estas páginas pues ese dolor no iba a ser un punto final sino un simple
paréntesis; por fin puedo decirte GRACIAS por tus cuidados y tu interés, lamento no poner tu
nombre pero no te lo pregunté. A los doctores García Escrivá y López Hernández por intentar
acortar mis vacaciones. Y como no, agradecerle al doctor Martín su confianza, su interés, y su
esfuerzo; sin su ayuda nada de esto hubiese sido posible
Por último agradecer a todas las personas que durante mis vacaciones os interesasteis por mí
y nos arropasteis. Algunos compartisteis los días menos buenos, y lograsteis con vuestras palabras
que esos momentos que deberían ser recordados con un sabor amargo sean bellos por el calor que
nos disteis. A todos quiero deciros GRACIAS.
