Replicación del ADN
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Blgo. Carlos A. Fernández M.
Requisitos del material genético
• Ubicarse en el núcleo
• Control de las enzimas
• Capacidad de autorreplicación
Blgo. Carlos A. Fernández M.
DNA RNA Proteína
Dogma central de la biología molecular
Transcrip
ción
Traducción
Blgo. Carlos A. Fernández M.
Replicación del DNA
• En su artículo de 1953 Watson y Crick sugirieron que la replicación de la hélice podría tener lugar por desenrrollamiento.
• Una cadena actuaría como molde (Template) para la síntesis de la nueva cadena.
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Posibilidades de replicación
Replicación conservativa
Replicación dispersiva
Replicación semiconservativa
Blgo. Carlos A. Fernández M.
Gradiente de Cloruro de Cesio (CsCl)
Principio de la Centrifugación en Equilibrio
Centrifugación
El experimento de Meselson y Stahl
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El DNA es sintetizado por polimerasas
• Las polimerasas necesitan de un molde, La reacción de polimerización se realiza siguiendo las reglas de complementariedad establecidos por Watson y Crick.
• Es necesario un cebador (RNA, DNA o en casos especiales una proteína), que proporcione un extremo 3’ OH-
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Las DNA polimerasas necesitan de un cebador (iniciador, primer) para actuar
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Biosíntesis del DNA: Polimerización
• La reacción consta de un ataque nucleofílico del grupo 3’ hidroxilo del nucleótido en el extremo 3’ de la cadena en crecimiento sobre el fósforo 5’ – trifosfato del desoxinucleótido entrante, liberándose pirofosfato inorgánico.
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Biosíntesis del DNALa síntesis del DNA transcurre en dirección 5’ 3’
El extremo 3’ OH- libre se convierte en el punto de elongación de la cadena
La cadena se sintetiza de manera discontinua mediante los Fragmentos de Okazaki.
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El DNA es sintetizado por polimerasas
• Precisión de la replicación
En E. coli ocurre un error cada 109 o 1010 nucleótidos incorporados, esto es 1 nucleótido cada 1 000 000 000
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El DNA es sintetizado por polimerasas
• Precisión de la replicación
La precisión en la incorporación de nucleótidos se basa en:
• Direccionalidad de los enlaces puentes de hidrógeno.
• Geometría del sitio activo de la Polimerasa
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El DNA es sintetizado por polimerasas
• Actividad exonucleasa
•Cuando un nucleótido incorrecto es incorporado la DNA polimerasa retrocede, corta el nucleótido (actividad 3’ 5’), incorpora el nucleótido correcto y continúa su actividad.
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El DNA es sintetizado por polimerasas
• En E. coli existen alrededor de 5 DNA polimerasas.
• John Cairns aisló una cepa bacteriana con el gen de la DNA polimerasa I alterado, el cual producía una enzima inactiva. Increíblemente las bacterias eran viables.
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La DNA Polimerasa I de E. coli
•Posee actividad polimerasa 5‘- 3’
•Exonucleasa 3’ – 5’
•Exonucleasa 5‘- 3’ (Eliminación de primers)
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Exo 5-´3´
Fragmento Klenow Pol Exo 3-´5´
Pol Exo 3-´5´DNA pol I
La DNA Polimerasa I de E. coli
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Replicación en procariotas: E. coli
Etapas
Iniciación
Terminación
Elongación
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Replicación en procariotas: E. coli
• Sistema DNA replicasa ó REPLISOMA
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Replicación en procariotas: E. coli
Alrededor de 20 moléculas de proteína
DnaA, cada una con un ATP ligado se unen a una de las 4 repeticiones de 9
pb
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Luego, las tres secuencias de 13 pb se desnaturalizan de manera
secuencial
Replicación en procariotas: E. coli
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Replicación en procariotas: E. coli
Hexámeros de proteína DnaB se unen a cada hebra con ayuda de
la proteína DnaC
La actividad helicasa de la prot. DnaB ayuda a desenrollar aún
más la hélice
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Replicación en procariotas: E. coli
SSB Single Stranded Binding protein
•Impide la renaturalización
•Brinda protección
•Inespecífica
•Cooperativa
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Replicación en procariotas: E. coli
La Dna Primasa (DnaG) sintetiza el cebador
(primer)
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Replicación en procariotas: E. coli
Dna Helicasa (DnaB)
Dna primasa (DnaG)
Primosoma+ =
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•Replicación circular (Modo θ) E. coli
•Lazo D (D-loop) Mitocondrias, cloroplastos
•Círculo rodante (Modo σ) Plásmidos, fagos
Modelos de Replicación en Procariotas:
Blgo. Carlos A. Fernández M.
Replicación circular (Modo θ)
Es el modelo propuesto para la replicación del cromosoma circular de E. coli
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•Replicación circular (Modo θ) E. coli
•Lazo D (D-loop) Mitocondrias, cloroplastos
•Círculo rodante (Modo σ) Plásmidos, fagos
Modelos de Replicación en Procariotas:
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Lazo D (D-loop)
•Es el modelo propuesto para la replicación del DNA de mitocondrias y cloroplastos.
Se debe a que en estos DNAs circulares el origen de replicación está en puntos distintos en cada cadena parental.
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•Replicación circular (Modo θ) E. coli
•Lazo D (D-loop) Mitocondrias, cloroplastos
•Círculo rodante (Modo σ) Plásmidos, fagos
Modelos de Replicación en Procariotas:
Blgo. Carlos A. Fernández M.
Círculo rodante (Modo σ)
•Es el modelo propuesto para la replicación del DNA del plásmido Hfr de E.coli durante la conjugación.
•Este método también es usado por fagos que llenan sus cubiertas proteicas con DNA lineal que se replica a a partir de un DNA circular.
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Círculo rodante (Modo σ)
Para iniciar la replicación no es necesaria la
presencia de primers
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Círculo rodante (Modo σ)
Luego una Nucleasa separa las cadenas y una Ligasa llena las mellas
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Replicación del fago filamentoso M13 (ADN1C )
Genoma (DNA 1c) del fago que ha infectado la bacteria
Forma replicativa (DNA 2c)
Con las enzimas del hospedero
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Replicación del fago filamentoso M13 (ADN1C )
Genoma (ADN1C) del fago que ha infectado la bacteria
Replicación bidireccional
desde Ori
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Replicación del fago filamentoso M13 (ADN1C )
El Gen II corta la cadena
Replicación por el círculo
rodante
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Replicación del fago filamentoso M13 (ADN1C )
El Gen II completa y corta la cadena
Replicación por el círculo
rodante
Circularización de la cadena (+) completa
Empaquetamiento
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ENZIMA FUNCIÓN
ADN Pol α Síntesis Hélice retardada. Síntesis del cebador: 10 bases de ADN y 25 de ARN.
ADN Pol δ Síntesis de la Hélice conductora.
ADN Pol ε Polimerización de las Piezas de Okazaki.
ADN Pol β Unión de los fragmentos de Okazaki ( de aproximadamente 250 pb).
ADN Pol γ Síntesis ADN mitocondrial.