replicacion-origen-ecoli

8/2/2019 replicacion-origen-ecoli

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P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S AV o l . 7 8 , N o . 1 2 , p p . 7 3 7 0 - 7 3 7 4 , D e c e m b e r 1 9 8 1B i o c h e m i s t r y

E n z y m a t i c r e p l i c a t i o n o f t h e o r i g i n o f t h e E s c h e r i c h i a c o l ichromosome( o r i C p l a s m i d s / d n a A g e n e / D N A r e p l i c a t i o n )R O B E R T S . F U L L E R , J O N M . K A G U N I , AND ARTHUR KORNBERGD e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , S t a n f o r d U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , S t a n f o r d , C a l i f o r n i a 9 4 3 0 5C o n t r i b u t e d b y A r t h u r K o r n b e r g , A u g u s t 2 4 , 1 9 8 1A B S T R A C T A n e n z y m e s y s t e m t h a t r e p l i c a t e s p l a s m i d s b e a r -i n g t h e o r i g i n o f t h e E s c h e r i c h i a c o l i c h r o m o s o m e ( o r i C ) h a s t h ef o l l o w i n g p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t f e a t u r e s . T h e s y s t e m ( i ) d e p e n d sc o m p l e t e l y o n l o w l e v e l s o f e x o g e n o u s l y f u r n i s h e d s u p e r c o i l e d o r i Cp l a s m i d s , ( i i ) u s e s o n l y t h o s e p l a s m i d s t h a t c o n t a i n t h e i n t a c t o r i Cr e g i o n o f a b o u t 2 4 5 b a s e p a i r s , ( i i i ) i n i t i a t e s r e p l i c a t i o n w i t h i n o rn e a r t h e o n i C s e q u e n c e a n d p r o c e e d s b i d i r e c t i o n a l l y , ( i v ) p r o c e e d sl i n e a r l y , a f t e r a 5 - m i n l a g , f o r 3 0 - 4 0 m i n t o p r o d u c e a s m u c h a sa 4 0 % i n c r e a s e o v e r t h e i n p u t D N A , ( v ) d e p e n d s o n RNA p o l y m -e r a s e a n d g y r a s e a s i n d i c a t e d b y t o t a l i n h i b i t i o n b y r i f a m p i c i n a n dn a l i d i x a t e , ( v i ) d e p e n d s o n r e p l i c a t i o n p r o t e i n s ( e . g . , d n a B p r o t e i na n d s i n g l e - s t r a n d e d DNA b i n d i n g p r o t e i n ) a s j u d g e d b y s p e c i f i ca n t i b o d y i n h i b i t i o n s , ( v i i ) o p e r a t e s i n d e p e n d e n t l y f r o m p r o t e i ns y n t h e s i s , a n d ( v i i i ) d e p e n d s o n d n a A a c t i v i t y , a s s u g g e s t e d b y t h ei n a c t i v i t y o f e n z y m e f r a c t i o n s f r o m e a c h o f t w o d n a A t e m p e r a t u r e -s e n s i t i v e m u t a n t s t r a i n s , a n d c o m p l e m e n t a t i o n ( w i t h a 1 5 - f o l do v e r p r o d u c t i o n o f c o m p l e m e n t i n g a c t i v i t y ) b y a f r a c t i o n f r o m as t r a i n c o n t a i n i n g t h e d n a A g e n e c l o n e d i n a m u l t i c o p y p l a s m i d .R e s o l u t i o n a n d a n a l y s i s o f f a c t o r s t h a t c o n t r o l t h e i n i t i a t i o n o f ac h r o m o s o m e c y c l e s h o u l d b e c o m e a c c e s s i b l e t h r o u g h t h i s e n z y m es y s t e m .

F I G . 1 . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e m a p o f p S Y 3 1 7 . T h i s 1 2 - k b o r i Cp l a s m i d c o n s t r u c t e d b y S . Y a s u d a c o n t a i n s t h e 5 . 0 5 - k b E c o R I E . c o l io r i C f r a g m e n t o f p S Y 2 2 1 a n d t h e 6 . 8 - k b E c o R I k a n a m y c i n r e s i s t a n c ef r a g m e n t o f p M L 2 1 ( 1 1 ) . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d a t a a r e t a k e n f r o mr e f . 1 2 . T h e s i t e o f t h e 2 4 5 - b a s e p a i r m i n i m a l o r i C s e q u e n c e ( 1 3 ) , s p a n -n i n g t h e BamHI s i t e b e t w e e n f r a g m e n t s F a n d B , i s m a r k e d .I n i t i a t i o n o f a n e w c y c l e o f c h r o m o s o m a l r e p l i c a t i o n i s t h e m o s tc r i t i c a l s t e p i n t h e c o n t r o l o f r e p l i c a t i o n , a n d a n e n o r m o u sa m o u n t o f e f f o r t h a s b e e n e x p e n d e d t o u n d e r s t a n d i t ( 1 , 2 ) . Y e tl i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e m e c h a n i s m o f t h e i n i t i a t i o n o f c h r o -m o s o m a l r e p l i c a t i o n b e c a u s e b i o c h e m i c a l d a t a a r e e x t r e m e l ys c a n t .I n E s c h e r i c h i a c o l i , s e v e r a l g e n e s , i n c l u d i n g d n a A , d n a I , a n dd n a P , h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s e s s e n t i a l f o r i n i t i a t i n g a c y c l e o fr e p l i c a t i o n ( 1 , 2 ) . T h e d e n a t u r e d d n a A p o l y p e p t i d e h a s b e e nd e t e c t e d ( e . g . , r e f . 3 ) , b u t n o t h i n g i s k n o w n a b o u t t h e p r o d u c t so f d n a l a n d d n a P . G e n e s d n a B a n d d n a C , w h o s e p r o d u c t s a r ee s s e n t i a l f o r o n g o i n g r e p l i c a t i o n , a r e a l s o n e e d e d a t o r n e a r t h eo u t s e t o f a c y c l e o f c h r o m o s o m e r e p l i c a t i o n ( 1 , 2 ) . T h e i n h i b i t o r ye f f e c t s o f r i f a m p i c i n a t t h i s s t a g e o f r e p l i c a t i o n h a v e a l s o i m p l i -c a t e d R NA p o l y m e r a s e ( 1 , 2 ) .O n c e i n i t i a t e d , p r o p a g a t i o n o f t h e r e p l i c a t i o n f o r k i s r e l a -t i v e l y w e l l u n d e r s t o o d t h r o u g h t h e a c t i o n s o f t h e m u l t i s u b u n i tDNA p o l y m e r a s e I I I h o l o e n z y m e ( 4 ) a n d a p r i m o s o m a l u n i tc o m p o s e d o f p e r h a p s s e v e n d i s c r e t e p r o t e i n s ( 5 ) . I s o l a t i o n o f t h i sc e l l u l a r m a c h i n e r y c a m e t h r o u g h t h e u s e o f s m a l l , s i n g l e -s t r a n d e d DNA p h a g e c h r o m o s o m e s a s p r o b e s t o i l l u m i n a t e t h ee n z y m a t i c c o m p o n e n t s a n d t h e i r d e t a i l e d o p e r a t i o n s . E n z y m es y s t e m s t h a t r e p l i c a t e p l a s m i d s h a v e a l s o m a d e i t p o s s i b l e t od e m o n s t r a t e d i r e c t p r i m i n g b y R NA p o l y m e r a s e a n d c o p y - n u m -b e r c o n t r o l b y s m a l l RNAs f o r C o l E l ( 6 ) , a n d a r e q u i r e m e n t f o rp o s i t i v e , t r a n s - a c t i n g , p l a s m i d - e n c o d e d p r o t e i n s f o r R6K ( 7 )a n d R 1 ( 8 ) .

T h e a v a i l a b i l i t y o f t h e c h r o m o s o m a l o r i g i n o f E . c o l i ( o r i C )i n a f u n c t i o n a l f o r m a s p a r t o f a s m a l l p l a s m i d ( 9 ) a n d e a r l i e rs u c c e s s i n t h e e n z y m a t i c r e s o l u t i o n o f p h a g e r e p l i c a t i o n h a v es u s t a i n e d o u r e f f o r t s f o r s e v e r a l y e a r s t o d i s c o v e r a n e n z y m es y s t e m f o r r e p l i c a t i o n o f o r i C p l a s m i d s .MATERIALS A ND M E T H O D S

E . c o l i S t r a i n s , P l a s m i d s , a n d P h a g e . T h e s t r a i n s a n d s o u r c e sw e r e : C 6 0 0 a n d H B 1 0 1 , l a b o r a t o r y s t o c k s ; WM301 ( d n a A + ) ,WM433 ( d n a A 2 0 4 ) , a n d WM493 ( d n a A 5 ) , f r o m W . M e s s e r ( 1 0 ) ;H B 1 0 1 ( p B F 1 0 1 ) , t h i s l a b o r a t o r y ; E R s m r e c A ( p S Y 3 1 7 ) ( o r i Cp l a s m i d - c o n t a i n i n g s t r a i n ) , f r o m S . Y a s u d a . T h e p l a s m i d s u s e dw e r e : p S Y 3 1 7 ( F i g . 1 ) ; p B F 1 0 1 , a 1 5 . 5 - k i l o b a s e ( k b ) p l a s m i dc o n s t r u c t e d b y l i g a t i o n o f a 5 . 7 - k b H i n d I I I / B a m H I f r a g m e n to f A d n a A S 1 0 0 ( S . Y a s u d a , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) c o n t a i n i n gt h e d n a A a n d d n a N g e n e s a n d t h e 1 0 - k b H i n d I I I / B a m H I f r a g -m e n t o f t h e r u n a w a y - r e p l i c a t i o n v e c t o r pMOB45 ( r e f . 1 4 ; u n -p u b l i s h e d d a t a ) . O t h e r p l a s m i d s w i l l b e d e s c r i b e d i n f i g u r e a n dt a b l e l e g e n d s . D u p l e x DNAs w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d ( 1 5 )e x c e p t t h a t l y s i s w a s e n h a n c e d w i t h p h a g e T 4 l y s o z y m e a t 0 . 1j z g / m l ( 1 6 ) .R e a g e n t s a n d B u f f e r s . S o u r c e s w e r e : s t a n d a r d r e a g e n t s f r o mc o m m e r c i a l s o u r c e s ; p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( P E G ) 2 0 , 0 0 0 a n dp o l y v i n y l a l c o h o l ( P V A ) 2 4 , 0 0 0 , D . J . D a w s o n ( D y n a p o l , P a l oA l t o , C A ) ; [ m e t h y l - 3 H ] d 1 T P ( 3 0 0 - 4 0 0 C i / m m o l ) a n d [ a - P ] d l T P( 6 0 0 C i / m m o l ) , Ne w E n g l a n d N u c l e a r a n d A m e r s h a m , r e s p e c -t i v e l y ( 1 C i = 3 . 7 x 1 0 ' b e c q u e r e l s ) . B u f f e r A w a s 2 5 mMA b b r e v i a t i o n s : k b , k i l o b a s e ( s ) ; P E G , p o l y e t h y l e n e g l y c o l ; P V A , p o l y -v i n y l a l c o h o l ; S S B , s i n g l e - s t r a n d e d DN A b i n d i n g p r o t e i n ; d d I T P , 2 ' , 3 ' -d i d e o x y t h y m i d i n e 5 ' - t r i p h o s p h a t e .

7 3 7 0

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e -m e n t " i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


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BFProc.a t d A c a d . S c i . U S A 7 8 ( 1 9 8 1 ) 7 3 7 1H e p e s , p H 7 . 6 / 1 mM E D T A . B u f f e r B wa s 2 5 mM H e p e s , p H7 . 6 / 0 . 1 mM E D T A / 2 mM d i t h i o t h r e i t o l .E n z y m e s a n d A n t i b o d i e s . S o u r c e s w e r e : s t a n d a r d enzyme sa n d p r o t e i n s , c o m m e r c i a l s o u r c e s ; E c o R I a n d B a m H I , J . C a r l -s o n a n d C . Mann ( t h i s d e p a r t m e n t ) ; T 4 l y s o z y m e , K . T a y l o r ;d n a B p r o t e i n a n d s i n g l e - s t r a n d e d DNA b i n d i n g p r o t e i n ( S S B )a n d t h e i r a n t i b o d i e s , a s d e s c r i b e d ( 1 7 - 1 9 ) ; a n t i b o d y a g a i n s t r e c Ap r o t e i n , C . P a o l e t t i .A s s a y f o r D NA R e p l i c a t i o n . T h e s t a n d a r d r e a c t i o n m i x t u r e ,2 5 A 1 l , c o n t a i n e d t h e f o l l o w i n g c o m p o n e n t s : H e p e s ( p H 7 . 6 ) , 4 0m M; A T P , 2 m M; G T P , C T P , a n d U T P , e a c h 5 0 0 A M ;b o v i n e s e r u m ' a l b u m i n , 5 0 . g / m l ; c r e a t i n e p h o s p h a t e , 2 1 . 6m M; d A T P , d G T P , d C T P , a n d d T T P , e a c h ' 1 0 0 p M , w i t h[ m e t h y l - 3 H ] d T T P a t 1 8 0 cpm p e r p m o l o f t o t a l d e o x y n u c l e o t i d e ;m a g n e s i u m a c e t a t e , 1 1 m M; c r e a t i n e k i n a s e , 100. O g / m l ; a n dp S Y 3 1 7 s u p e r c o i l e d D N A , 8 . 6 A g / m l . PE G 6 0 0 0 , PEG 2 0 , 0 0 0 ,o r PVA 2 4 , 0 0 0 w a s a d d e d t o f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 5 % o r 6%( w t / v o l ) as i n d i c a t e d i n f i g u r e a n d t a b l e l e g e n d s . T h e m i x t u r e sw e r e a s s e m b l e d a t 0 C . T h e r e a c t i o n s w e r e i n i t i a t e d b y a d d i t i o no f 2 0 0 - 2 8 0 A g o f p r o t e i n ( f r a c t i o n I I ) a n d i n c u b a t i o n a t 3 0 C .I n c u b a t i o n t i m e s a r e a s i n d i c a t e d i n f i g u r e a n d t a b l e l e g e n d s .T o t a l n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t i o n w a s m e a s u r e d b y d e t e r m i n i n gr a d i o a c t i v i t y a f t e r t r i c h l o r o a c e t i c a c i d p r e c i p i t a t i o n .

RESULTST h e E n z y m e F r a c t i o n a n d t h e o r i C T e m p l a t e . A l t h o u g h t h eh i g h - s p e e d s u p e r n a t a n t o f a n E . c o l i l y s a t e wa s i n a c t i v e , s u b -

s e q u e n t ammonium s u l f a t e f r a c t i o n a t i o n y i e l d e d a v i g o r o u sp r e p a r a t i o n . S u c h f r a c t i o n a t i o n wa s s u c c e s s f u l o n l y i n a r a t h e rn a r r o w range o f ammonium s u l f a t e a d d i t i o n s ( F i g . 2 ) a n d gen-e r a l l y wa s o p t i m a l w i t h a b o u t 0 . 2 8 g a d d e d p e r m l o f super-n a t a n t . B r i e f d i a l y s i s w a s n e e d e d t o r e d u c e i n h i b i t o r y e f f e c t so f s a l t . T h e s i g m o i d a l c h a r a c t e r o f t h e response t o t h e amounto f t h e a c t i v e ammonium s u l f a t e f r a c t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h am u l t i f a c t o r s y s t e m ; s a t u r a t i o n w a s a c h i e v e d a t a c o n c e n t r a t i o no f a b o u t 1 0 mg o f p r o t e i n p e r m l .T h e a c t i v i t y wa s e n t i r e l y d e p e n d e n t u p o n t h e a d d i t i o n o f s u -p e r c o i l e d p S Y 3 1 7 p l a s m i d DNA. N i c k e d DNA wa s i n a c t i v e( d a t a n o t s h o w n ) . A c t i v i t y wa s m a x i m a l a t a c o n c e n t r a t i o n o fa b o u t 8 - 1 0 p g o f p l a s m i d DNA p e r m l ( 1 nM i n p l a s m i d DNAm o l e c u l e s ) , w h i c h i s e q u i v a l e n t t o a b o u t 6 0 0 p m o l o f n u c l e o t i d er e s i d u e s i n t h e 2 5 - , l a s s a y . H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s w e r e l e s sa c t i v e , p r e s u m a b l y d u e t o t h e d i s s i p a t i o n o f c r i t i c a l r e p l i c a t i o np r o t e i n s b o u n d t o t h e DNA. S y n t h e s i s t o t h e e x t e n t o f 2 5 0 p m o l ,a b o u t 4 0 % o f t h e i n p u t D N A , w a s o f t e n o b s e r v e d .R e q u i r e m e n t s f o r R e p l i c a t i o n . D e t a i l e d e x a m i n a t i o n o f nu -c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e a n d o t h e r r e q u i r e m e n t s i s p r e m a t u r e w i t ha r e l a t i v e l y c r u d e enzym e f r a c t i o n , b u t s e v e r a l f e a t u r e s ar e n o t -a b l e . T h e o p t i m a l M g 2 + c o n c e n t r a t i o n wa s r a t h e r s h a r p a r o u n d1 0 m M, a 5 - f o l d d e p e n d e n c e o n a n A T P - r e g e n e r a t i n g s y s t e mwa s o b s e r v e d e v e n w i t h ATP a t a s t a r t i n g c o n c e n t r a t i o n o f 2m M, a n d t h e r e q u i r e m e n t f o r a f l e x i b l e , h y d r o p h i l i c p o l y m e rw a s a b s o l u t e ( d a t a n o t s h o w n ) . A n y o ne o f s e v e r a l p o l y m e r s ,s u c h a s p o l y e t h y l e n e g l y c o l , p o l y v i n y l a l c o h o l , a n d m e t h y l c e l -l u l o s e , w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g i n g f r o m 6 0 0 0 t o g r e a t e rt h a n 1 0 0 , 0 0 0 a n d a t c o n c e n t r a t i o n s near 6% s u f f i c e d . T h e p o l y -m e r s may i n c r e a s e t h e e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f m a c r o m o l e c -u l a r r e a c t a n t s b y a n " e x c l u d e d v o l u m e " e f f e c t ( 2 1 ) .I n h i b i t o r s o f R e p l i c a t i o n . T o t a l i n h i b i t i o n b y r i f a m p i c i n i m -p l i c a t e s a n o b l i g a t o r y - c o n t r i b u t i o n b y R NA p o l y m e r a s e ( T a b l e1 ) . When a d d i t i o n o f r i f a m p i c i n w a s d e l a y e d u n t i l t h e r e a c t i o nw a s u n d e r w a y ( d a t a n o t s h o w n ) , r e p l i c a t i o n was s u b s t a n t i a l , i m -p l y i n g t h a t r i f a m p i c i n a f f e c t s t h e i n i t i a t i o n r a t h e r t h a n t h e e l o n -g a t i o n s t a g e s o f t h e r e a c t i o n .I n h i b i t i o n b y n a l i d i x a t e a n d n o v o b i o c i n ( T a b l e 1 ) w a s o b -s e r v e d a t c o n c e n t r a t i o n s c o n s i s t e n t w i t h t h o s e t h a t a f f e c t gyrase

210075


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7 3 7 2 B i o c h e m i s t r y : F u l l e r e taLPT a b l e 2 . A n t i b o d y e f f e c t s o n o r i C r e p l i c a t i o n

DNAG a m m a s y n t h e s i s ,E x p . g l o b u l i n a d d e d P r o t e i n a d d e d p m o lA N o n e N o n e 1 4 4

A n t i - d n a B p r o t e i n N o n e 1 1N o n e d n a B 1 0 2A n t i - d n a B p r o t e i n d n a B 1 0 2

B N o n e N o n e 5 9A n t i - S S B N o n e 4N o n e S S B 6 1A n t i - S S B S S B 4 4

C N o n e N o n e 7 4A n t i - r e c A p r o t e i n N o n e 8 7D N o n e N o n e 8 7A n t i - p o l I N o n e 7 2A s s a y s w e r e a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s e n d M e t h o d s e x c e p t t h a t p u -r i f i e d p r o t e i n s a n d g am m a g l o b u l i n w e r e a d d e d a s i n d i c a t e d . E x p . A ,r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n w i t h 6% PVA 2 4 , 0 0 0 .A n t i - d n a B g am m a g l o b u l i n ( 3 p i g ) a n d d n a B p r o t e i n ( 0 . 5 , u g ) w e r ea dd e d w h e r e i n d i c a t e d . E x p . B , r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r2 0 m i n w i t h 5 % PEG 6 0 0 0 . A n t i - S S B gamma g l o b u l i n ( 3 . 6 p g ) a n d S S B( 2 u g ) w e r e a d d e d w h e r e i n d i c a t e d . E x p . C , r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e i n -c u b a t e d f o r 3 0 m i n w i t h 5% PEG 6 0 0 0 . A n t i - r e c k p r o t e i n g am m a g l o b -u l i n ( 4 . 6 l u g ) , s u f f i c i e n t t o i n h i b i t ( b y 7 0 % ) D N A - d e p e n d e n t A T P a s ea c t i v i t y o f 0 . 2 p L g o f r e c A p r o t e i n , w a s a d d ed w h e r e i n d i c a t e d . E x p . D ,r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n w i t h 6% PVA 2 4 , 0 0 0 .A n t i - D N A p o l y m e r a s e I ( p o l I ) g am m a g l o b u l i n ( 1 A g ) w a s a d d e d a ta l e v e l t h a t i n h i b i t e d C o l E l DNA r e p l i c a t i o n b y 9 0 % .

v i t r o r e p l i c a t i o n . T h e d e l e t i o n t e m p l a t e d i d n o t i n h i b i t p S Y 3 1 7r e p l i c a t i o n w h e n i n c u b a t e d i n t h e s a m e m i x t u r e ( d a t a n o ts h o w n ) .S u p e r c o i l e d p B E U 1 7 ( a n R 1 m i n i p l a s m i d w i t h a r u n a w a y -r e p l i c a t i o n m u t a t i o n ) , p S C 1 0 1 , a n d 4 X 1 7 4 r e p l i c a t i v e f o r mDNAs w e r e i n e r t a s t e m p l a t e s ( T a b l e 3 ) . T h e s l i g h t a c t i v i t y o fC o l E l w a s i n h i b i t e d b y a l e v e l o f a n t i b o d y a g a i n s t DNA p o l y -m e r a s e I t h a t h a d n o e f f e c t o n p S Y 3 1 7 r e p l i c a t i o n ( T a b l e 2 ) . T h ec a p a c i t y o f t h e p S Y 3 1 7 s y s t e m t o c o n v e r t 4 X 1 7 4 s i n g l e s t r a n d st o t h e d u p l e x f o r m a t t e s t s t o t h e p r e s e n c e o f a n a c t i v e s e t o fp r i m i n g a n d c h a i n e l o n g a t i o n p r o t e i n s .R e p l i c a t i o n B e g i n s a t o r n e a r t h e o r i C S e qu e n c e . T o l o c a l i z et h e a c t u a l s i t e o f i n i t i a t i o n o f r e p l i c a t i o n i n v i t r o o n p S Y 3 1 7 ,r e p l i c a t i v e i n t e r m e d i a t e s w e r e a n a l y z e d . I n t e r m e d i a t e s o f d e -c r e a s i n g e x t e n t s o f r e p l i c a t i o n w e r e g e n e r a t e d b y u s i n g a n i n -c r e a s i n g r a t i o o f t h e c h a i n t e r m i n a t o r 2 ' , 3 ' - d i d e o x y t h y m i d i n e5 ' - t r i p h o s p h a t e ( d d T T P ) t o d T T P i n a s e r i e s o f r e a c t i o n s ( 2 6 ) .T h e r e a c t i o n p r o d u c t s w e r e a n a l y z e d b y r e s t r i c t i o n e n d o n u -c l e o l y t i c c l e a v a g e a n d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( F i g . 3 ) . T h eo r d e r o f r e p l i c a t i o n o f t h e f r a g m e n t s m a y b e d e d u c e d f r o m t h eo r d e r o f d i s a p p e a r a n c e o f t h e f r a g m e n t s a s a f u n c t i o n o f t h e c o n -A d c I T T P W i M )

O ' i f0 5 1 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0.~~~~~~~~~~~~~0

B r e d d l T P W M )0 , + r i f0 5 1 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0

O r i g i n

- A -- B - D -

. W m lm i d r e p l i c a t i o n ( T a b l e 2 ) . R e p l i c a t i o n a c t i v i t y w a s r e s t o r e d t oa c o n s i d e r a b l e e x t e n t b y r e s p e c t i v e a d d i t i o n s o f p u r e d n a B p r o -t e i n o r S S B . A n t i b o d i e s a g a i n s t r e c A p r o t e i n a n d DNA p o l y m -e r a s e I f a i l e d t o i n h i b i t t h e r e a c t i o n ( T a b l e 2 ) .S p e c i f i c i t y o f R e p l i c a t i o n f o r o r i C S e q u e n c e s . I n a d d i t i o nt o p S Y 3 1 7 , a n o t h e r - t e m p l a t e , M 1 3 o r i C 2 6 r e p l i c a t i v e f o r m DNAc o n t a i n i n g o r i C w a s a l s o a c t i v e ( T a b l e 3 ) . M l 3 o r i C 2 6 i s a n i nv i t r o r e c o m b i n a n t c o n t a i n i n g t h e E . c o l i c h r o m o s o m a l o r i g i ni n s e r t e d i n t o a n M 1 3 v e c t o r , a n d i t h a s b e e n s h o w n i n v i v o t oc o n t a i n a f u n c t i o n a l o r i C s e q u e n c e ( 2 5 ) . I n c o n t r a s t , a n o r i C -d e r i v a t i v e o f M l 3 o r i C 2 6 , M l 3 o r i C 2 6 A 2 2 1 , w h i c h h a s a d e l e -t i o n o f t h e o r i C s e q u e n c e [ p o s i t i o n 2 1 t o 3 5 2 ( 2 5 ) ] i s i n e r t a s at e m p l a t e , i n d i c a t i n g t h a t t h e o r i C s e q u e n c e i s r e q u i r e d f o r i n

T a b l e 3 . S p e c i f i c i t y o f r e p l i c a t i o n t o o r i CDNA s y n t h e s i s ,T e m p l a t e p m o l

p S Y 3 1 7 8 7M 1 3 o r i C 2 6 r e p l i c a t i v e f o r m 7 7M 1 3 o r i C 2 6 A 2 2 1 r e p l i c a t i v e f o r m 3C o l E l 1 8p B E U 1 7 5p S C 1 0 1 34 X 1 7 4 r e p l i c a t i v e f o r m 44 i X 1 7 4 v i r a l s i n g l e s t r a n d 7 2N o n e 3R e a c t i o n s w e r e i n t h e p r e s e n c e o f PVA 2 4 , 0 0 0 a t 6% f o r 2 0 m i n . S u -p e r c o i l e d DNAs w e r e a d d e d t o s t a n d a r d r e a c t i o n m i x t u r e s t o 8 . 6 p g /m l . 4 X 1 7 4 s i n g l e - s t r a n d e d DNA w a s a d d e d t o 3 . 2 u g / m l . E a c h n u m b e r

i s a n a v e r a g e o f d u p l i c a t e s . A s t r a i n c o n t a i n i n g p B E U 1 7 , a 1 3 - k b r u n -a w a y - r e p l i c a t i o n m u t a n t p l a s m i d d e r i v e d f r o m p K N 4 0 2 ( i t s e l f d e r i v e df r o m R 1 ) a n d c o n t a i n i n g a g e n e f o r a m p i c i l l i n r e s i s t a n c e , w a s p r o v i d e db y B . E . U h l i n ( 2 4 ) . A s t r a i n c o n t a i n i n g p S C 1 0 1 w a s p r o v i d e d b y P .M e a c o c k .

- -C - E - F- C -_ D0-

E - F -- D y e -- EF - 4 . _ e ; - i ~ i h

F I G . 3 . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n a l y s i s o f i n i t i a t i o n o f r e p l i c a -t i v e i n t e r m e d i a t e s . R e a c t i o n s w e r e i n t h e p r e s e n c e o f PVA 2 4 , 0 0 0 a t6% f o r 3 0 m i n ; [ a - 3 2 P ] d T T P w a s i n c l u d e d a t 5 0 0 c p m / p m o l o f t o t a ln u c l e o t i d e . R i f a m p i c i n ( r i f ) , w h e n a d d e d , w a s 2 0 p g / m l . R e a c t i o n sw e r e t e r m i n a t e d w i t h 2 2 5 ; L 1 o f 2 5 mM E D T A ( p H 7 . 5 ) , t h e m i x t u r e sw e r e e x t r a c t e d t w i c e w i t h p h e n o l a n d f i v e t i m e s w i t h e t h e r , a n d p r o d -u c t s w e r e p r e c i p i t a t e d t w i c e w i t h e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f 3 0 0 mMs o d i u m a c e t a t e a n d 5 p g o f y e a s t tRNA a s c a r r i e r . P r e c i p i t a t e s w e r er e s u s p e n d e d i n 2 5 1 l - o f 1 0 mM T r i s H C l ( p H 7 . 5 ) / 1 mM EDTA c o n -t a i n i n g p a n c r e a t i c r i b o n u c l e a s e a t 1 y g / m l a n d i n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r3 0 m i n . S a m p l e s ( 1 0 p l ) w e r e d i g e s t e d f i r s t w i t h a 1 0 0 - f o l d e x c e s s ( 1 0u n i t s ) o f r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e B a m H l i n 5 0 mM T r i s - H C I ( p H 7 . 5 ) /1 mM d i t h i o t h r e i t o l / 2 0 mM M g C l 2 / 5 0 mM N a C l t h e n w i t h 1 0 u n i t so f E c o R I i n t h e s a m e b u f f e r e x c e p t w i t h 1 0 0 mMN a C l . F r a g m e n t s w e r es e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a h o r i z o n t a l 1 . 4 % a g a r o s e g e l i n 1 0 0mM T r i s b o r a t e / 1 mM E D T A ( p H 8 . 3 ) . G e l s w e r e d r i e d a n d a u t o r a -d i o g r a p h e d a t - 7 0 T C . T h e a u t o r a d i o g r a p h i c e x p o s u r e i n B i s a b o u t 1 0 -f o l d g r e a t e r t h a n i n A . S i z e s t a n d a r d s , a n E c o R I a n d a B a m H I / E c o R Id i g e s t o f p S Y 3 1 7 a n d H i n d M a n d E c o R P / H i n d l l M d i g e s t s o f b a c t e r i o -p h a g e A c I 8 5 7 d u p l e x D N A , w e r e u s e d t o i d e n t i f y r a d i o a c t i v e b a n d s ,i n c l u d i n g p a r t i a l f r a g m e n t s .

P r o c . Na d A c a d . S c i . U S A ' 7 8 , ( 1 9 8 1 )


4/5

P r o c . N at L A c a d . S c i . USA 7 8 ( 1 9 8 1 ) 7 3 7 3T a b l e 4 . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n a l y s i s o f i n i t i a t i o n o fr e p l i c a t i v e i n t e r m e d i a t e s

M o l a r r a t i o s o f f r a g m e n t sE+F C B D

d d T P , , u M A A A A0 1 . 0 1 . 5 1 . 4 1 . 15 1 . 1 2 . 1 1 . 6 1 . 21 0 3 . 4 6 . 7 4 . 2 2 . 32 5 2 7 2 3 1 3 3 . 87 5 4 8 NM NM NM0 , + r i f a m p i c i n NM 0 . 5 0 . 5 0 . 3

A u t o r a d i o g r a m s i n F i g . 3 a n d t h o s e o f a s i m i l a r e x p e r i m e n t ( d a t aa v e r a g e d ) w e r e s c a n n e d w i t h a Q u i c k S c a n J r . ( H e l e n a L a b o r a t o r i e s )d e n s i t o m e t e r . P e a k m a g n i t u d e s w e r e m e a s u r e d b y w e i g h t ; r a t i o s o fv a l u e s f o r f r a g m e n t s B , C , D , a n d E p l u s F t o t h a t o f f r a g m e n t A w e r ec a l c u l a t e d f o r e a c h l a n e . T h e s e r a t i o s w e r e n o r m a l i z e d b y d i v i d i n gt h e m b y t h e m o l e c u l a r s i z e r a t i o o f t h e f r a g m e n t s - e . g . , t h e m o l e c u l a rs i z e r a t i o o f B t o A = 2 . 1 k b / 6 . 8 k b = 0 . 3 1 ; t h e s e d a t a a r e p r e s e n t e di n t h e t a b l e . N M , n o t m e a s u r a b l e .c e n t r a t i o n o f d d T T P . * F r a g m e n t A ( F i g . 1 ) , m o s t r e m o t e f r o mo r i C , i s d e c r e a s e d i n i n t e n s i t y r e l a t i v e t o t h e o t h e r f r a g m e n t sa t 5 , u M d d T T P a n d v i r t u a l l y d i s a p p e a r s a t 2 5 A M d d I T P , a n ds o i s t h e l a s t t o b e r e p l i c a t e d . F r a g m e n t D d i s a p p e a r s n e x t , f o l -l o w e d b y B a n d C . A n i n t e n t i o n a l a u t o r a d i o g r a p h i c o v e r e x p o -s u r e ( F i g . 3 B ) a l l o w s v i s u a l i z a t i o n o f f r a g m e n t s E a n d F , t r e a t e dt o g e t h e r b e c a u s e t h e y r u n t o g e t h e r a h e a d o f t h e d y e , b r o m o -p h e n o l b l u e . L a b e l i n g o f t h e s e f r a g m e n t s p e r s i s t s u p t o t h eh i g h e s t c o n c e n t r a t i o n o f d d I T P ; t h u s t h e y a r e t h e f i r s t t o b ef u l l y r e p l i c a t e d .A q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s ( T a b l e 4 ) s h o w s t h e r e l a t i v e e x t e n t so f r e p l i c a t i o n o f t h e f r a g m e n t s , n o r m a l i z e d b y t h e r a t i o o f m o -

l e c u l a r s i z e . I n t h e a b s e n c e o f d d T T P , t h e s e r a t i o s a r e c l o s e t ou n i t y , i n d i c a t i n g t h a t m o s t i n i t i a t i o n s h a v e l e d t o c o m p l e t e r e p -l i c a t i o n . I n s p e c t i o n o f t h e d a t a a g a i n i n d i c a t e s t h e f o l l o w i n go r d e r o f r e p l i c a t i o n : E p l u s F , f o l l o w e d b y C , b y B , b y D , a n df i n a l l y b y A . T h i s i m p l i e s t h a t i n i t i a t i o n o c c u r s w i t h i n o r n e a rf r a g m e n t s E a n d F , t h a t i s , a t a s i t e c o n s i s t e n t w i t h t h e l o c a t i o no f t h e o r i C s e q u e n c e ( F i g . 1 ) . T h i s a l s o i m p l i e s t h a t e i t h e r r e p -l i c a t i o n i s b i d i r e c t i o n a l o r i t p r o c e e d s w i t h a p p r o x i m a t e l y e q u a lp r o b a b i l i t y i n b o t h d i r e c t i o n s f r o m t h e s i t e o f i n i t i a t i o n . E l e c -t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f r e p l i c a t i v e i n t e r m e d i a t e s s u p p o r t st h e c o n c l u s i o n t h a t r e p l i c a t i o n i s b i d i r e c t i o n a l i n a l a r g e p e r -c e n t a g e o f i n d i v i d u a l m o l e c u l e s ( d a t a n o t s h o w n ) .A s m a l l a m o u n t o f i n c o r p o r a t i o n o c c u r s i n t h e p r e s e n c e o fr i f a m p i c i n ( F i g . 3 ) , b u t t h i s i n c o r p o r a t i o n u n i f o r m l y l a b e l s t h ef r a g m e n t s a n d p r o b a b l y r e f l e c t s a b a c k g r o u n d o f r e p a i r - l i k eDNA s y n t h e s i s .D e p e n d e n c e o n d n a A A c t i v i t y . E n z y m e f r a c t i o n s p r e p a r e df r o m t w o d i f f e r e n t d n a A m u t a n t s w e r e i n a c t i v e i n o r i C r e p l i -c a t i o n , w h e r e a s t h e i s o g e n i c w i l d - t y p e ( d n a A + ) s t r a i n y i e l d e da n a c t i v e e n z y m e s y s t e m ( T a b l e 5 ) . T h e s m a l l a m o u n t o f a c t i v i t yo b s e r v e d w i t h t h e m u t a n t f r a c t i o n s w a s i n s e n s i t i v e t o r i f a m p i c i n* R a d i o a c t i v i t y i n a f r a g m e n t m e a s u r e s t h e e x t e n t t o w h i c h t h e r e p l i -c a t i o n o f t h a t f r a g m e n t h a s b e e n c o m p l e t e d . R e s t r i c t i o n o f p a r t i a l l yr e p l i c a t e d m o l e c u l e s g e n e r a t e s b r a n c h e d f r a g m e n t s ( e l e c t r o n m i c r o -s c o p i c e v i d e n c e , d a t a n o t s h o w n ) , w h i c h m i g r a t e a n o m a l o u s l y o r f a i lt o e n t e r t h e g e l ; s u c h a n o m a l o u s b a n d s a n d m a t e r i a l a t t h e ( g e l ) o r i g i nd o a p p e a r ( F i g . 3 ) i n t h e p r e s en c e o f d d T T P . H o w e v e r , t h e a n a l y s i si n T a b l e 4 t r e a t s o n l y f u l l y r e p l i c a t e d f r a g m e n t s , a n d t h e c o n t r i b u t i o no f m a t e r i a l t r a p p e d a t t h e o r i g i n h a s b e e n i g n o r e d . D i g e s t i o n o f s a m -p l e s f a i l e d t o r e a c h c o m p l e t i o n d e s p i t e p u r i f i c a t i o n o f t h e r e p l i c a t i v ep r o d u c t s a n d u s e o f excess r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e ( e . g . , B a m H I i nt h e 1 0 , u M ddTTP l a n e ) . W h e n e v e r p a r t i a l p r o d u c t s c o u l d b e i d e n -t i f i e d b y s i z e s ( e . g . , t h e B - D p a r t i a l p r o d u c t , t h e C - E p a r t i a l p r o d u c t ,e t c . ) , t h e i r c o n t r i b u t i o n w a s i n c l u d e d i n t h e a n a l y s i s i n T a b l e 4 .

T a b l e 5 . A c t i v i t y o f f r a c t i o n s f r o m d n a A m u t a n t s a n d t h ei s o g e n i c p a r e n t* D N A s y n t h e s i s

p S Y 3 1 7 , 4 X s s D N A ,p m o l / 3 0 m i n p m o l / 5 m i nW i t h o u t W i t h W i t hA l l e l e r i f r i f r i f

d n a A + 1 3 4 1 7 4 8d n a A 2 0 4 4 . 6 5 . 9 6 5d n a A 5 2 . 8 4 . 9 5 8WM301 ( d n a A + ) a n d i s o g e n i c m u t a n t s t r a i n s WM433 ( d n a A 2 0 4 )a n d WM493 ( d n a A 5 ) w e r e g r o w n i n L b r o t h ( p l u s t h y m i n e a t 2 5 p g /m l a n d 0 . 2 % g l u c o s e ) i n f l a s k s a t 3 2 C . T h e d o u b l i n g t i m e w a s 3 0 m i na n d h a r v e s t w a s a t O D 5 9 5 = 1 . 0 . E n z y m e f r a c t i o n s w e r e a s d e s c r i b e di n t h e l e g e n d t o F i g . 2 . R e a c t i o n s w e r e i n t h e p r e s e n c e o f PVA 2 4 , 0 0 0a t 6 % . R i f a m p i c i n ( r i f ) w a s a d d e d a t 2 0 j i g / m l w h e r e i n d i c a t e d . R e -a c t i o n m i x t u r e s w i t h 4 X 1 7 4 s i n g l e - s t r a n d e d DNA ( O X s s D N A ) c o n -t a i n e d 2 0 0 p m o l o f t e m p l a t e a n d 0 . 5 A g o f S S B i n 2 0 u l .

i n h i b i t i o n a n d t h e r e f o r e d o e s n o t r e p r e s e n t o r i C - s p e c i f i c r e p -l i c a t i o n . G r o w t h o f b o t h m u t a n t s t r a i n s f r o m w h i c h t h e e n z y m ef r a c t i o n s w e r e o b t a i n e d w a s r a p i d a n d i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o mt h a t o f t h e w i l d t y p e . F u r t h e r m o r e , c o n v e r s i o n o f 4 X 1 7 4 s i n g l es t r a n d s t o t h e d u p l e x f o r m w a s e q u a l l y a c t i v e i n t h e m u t a n t a n dw i l d - t y p e e n z y m e f r a c t i o n s , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e p l i c a t i o n p r o -t e i n s r e s p o n s i b l e f o r p r i m i n g a n d c h a i n e l o n g a t i o n w e r e n o tw a n t i n g i n t h e m u t a n t f r a c t i o n s ( T a b l e 5 ) a n d t h a t a n o v e l f a c t o r( o r f a c t o r s ) w a s n e e d e d .C o m p l e m e n t a t i o n o f t h e m u t a n t f r a c t i o n s b y f r a c t i o n s o f t h ed n a A + s t r a i n s WM301 o r C 6 0 0 w a s n o t c o n v i n c i n g ; g e n e r a l l y ,a c t i v i t i e s w e r e e s s e n t i a l l y a d d i t i v e , p r e s u m a b l y b e c a u s e t h ed n a A + a c t i v i t y w a s l i m i t i n g . H o w e v e r , c o m p l e m e n t a t i o n w a si m p r e s s i v e w i t h f r a c t i o n s f r o m s t r a i n s c o n t a i n i n g . t h e d n a A +g e n e c l o n e d i n a m u l t i c o p y p l a s m i d ( F i g . 4 ) . T h e c o m p l e m e n t -i n g d n a A a c t i v i t y w a s 1 5 - f o l d g r e a t e r t h a n t h a t o f t h e p l a s m i d l e s ss t r a i n , i n d i c a t i n g t h a t d e g r e e o f o v e r p r o d u c t i o n . T h e d n a A 5m u t a n t f r a c t i o n b e h a v e d m u c h l i k e d n a A 2 0 4 ( d a t a n o t s h o w n ) ,i n d i c a t i n g t h a t c o m p l e m e n t a t i o n i s n o t l i m i t e d t o a s i n g l e c l a s so f d n a A m u t a n t s ( 1 0 ) . T h e r i f a m p i c i n s e n s i t i v i t y o f t h e a c t i v i t i e so b s e r v e d b y c o m p l e m e n t a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e r e p l i c a t i o n i so r t C - s p e c i f i c .

DISCUSSIONC h r o m o s o m a l r e p l i c a t i o n h a s b e e n l i n k e d t o c e l l u l a r m e m -b r a n e s , a n d s o m e i n d i c a t i o n s o f i n i t i a t i o n o f c h r o m o s o m a l DNAs y n t h e s i s h a v e r e c e n t l y b e e n o b s e r v e d i n m e m b r a n e - c o n t a i n i n gc r u d e l y s a t e s o n c e l l o p h a n e d i s c s ( 2 8 ) . N e v e r t h e l e s s , f r o m t h ed a t a p r e s e n t e d i n t h i s i n i t i a l r e p o r t , i t i s c l e a r t h a t a s o l u b l ee n z y m e s y s t e m c a n s p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e t h e E . c o l i o r i g i n s e -q u e n c e f o r i n i t i a t i o n o f r e p l i c a t i o n .T h e s y s t e m d e p e n d s o n a t l e a s t t w o o f t h e e l e m e n t s a n t i c i -p a t e d f r o m i n v i v o s t u d i e s , RNA p o l y m e r a s e a n d d n a A . RNAp o l y m e r a s e f u n c t i o n c a n b e i n f e r r e d f r o m t h e t o t a l i n h i b i t o r ye f f e c t o f r i f a m p i c i n , b u t w h e t h e r t h e e n z y m e p r o d u c e s a p r i m e ro r p a r t i c i p a t e s i n s o m e l e s s d i r e c t w a y i s s t i l l u n k n o w n . D e -p e n d e n c e o n d n a A a c t i v i t y s e e m s c l e a r f r o m t h e i n a c t i v i t y o fe x t r a c t s o f t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t c e l l s , c o m p l e m e n t a -t i o n o f m u t a n t - c e l l e x t r a c t s b y t h o s e f r o m t h e c e l l s c o n t a i n i n gt h e c l o n e d d n a A g e n e , a n d t h e o v e r p r o d u c t i o n o f d n a A a c t i v i t yi n t h e d n a A p l a s m i d - c o n t a i n i n g c e l l s . T h e n e e d f o r a t l e a s t t w o

a d d i t i o n a l c o m p o n e n t s h a s b e e n p r e d i c t e d f r o m m u t a t i o n s i nd i s t i n c t l o c i ( d n a I a n d d n a P ) t h a t c a u s e a s l o w s t o p i n r e p l i c a t i o nu p o n e x p o s u r e o f m u t a n t c e l l s t o a r e s t r i c t i v e t e m p e r a t u r e .I d e n t i f i c a t i o n o f t h e p r o t e i n p r o d u c t s o f t h e s e g e n e s a n d p e r -h a p s o t h e r n o v e l p r o t e i n s s h o u l d e m e r g e f r o m f u t u r e e n z y m e

B i o c h e m i s t r y : F u l l e r e t a L


5/5

7 3 7 4 B i o c h e m i s t r y : F u l l e r e t a l .1 4 0

1 2 0

1 0 0 / H B 1 O 1 ( p B F 1 0 1 )8 0

~ 6 0z4 0

2 0 H B 1 0 1+ r i f { t I s0 0 4 8 0 , 1 0 0C o m p l e m e n t i n g f r a c t i o n , A g ~ o f p r o t e i n

F I G . 4 . . C o m p l e m e n t a t i o n . o f d n a A m u t a n t f r a c t i o n s .H B 1 0 1 ( p B F 1 0 1 ) a n d H B 1 0 1 w e r e g r o w n i n L b r o t h ( p l u s t h y m i n e a t2 5 . t g / m l a n d 0 . 2 % g l u c o s e ) i n f l a s k s a t 3 2 0 ; d o u b l i n g t i m e s w e r e 5 0a n d 3 5 m i n , r e s p e c t i v e l y . . E n z y m e f r a c t i o n s w e r e a s d e s c r i b e d i n l e g -e n d s t o T a b l e 5 a n d F i g . 2 , r e s p e c t i v e l y , e x c e p t t h a t n u c l e i c a c i d w a sr e m o v e d f r o m f r a c t i o n I w i t h a 3 % s t r e p t o m y c i n s u l f a t e p r e c i p i t a t i o np r i o r t o a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ( 2 7 ) , 0 . 2 5 ' g o f a m m o n i u ms u l f a t e wa s a d d e d p e r m l o f f r a c t i o n I , a n d t h e f r a c t i o n s w e r e n o t d i -a l y z e d . R e a c t i o n s w e r e i n t h e p r e s e n c e o f PVA 2 4 , 0 0 0 a t 6% f o r 3 0 m i n .W M 4 3 3 . ( d n a A 2 O 4 ) f r a c t i o n I I ( 2 5 0 j u g ) wa s a d d e d t o e a c h r e a c t i o n .H B 1 0 1 ( p B F 1 0 1 ) ( 9 5 l . t g ) a l o n e y i e l d e d 2 6 p m o l ; H B 1 0 1 ( 9 5 u g ) a l o n ey i e l d e d 1 0 - p m o l . W h e r e i n d i c a t e d , r i f a m p i c i n ( r i f ) wa s p r e s e n t a t 2 0p ~ g / m l i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g 9 5 u g o f H B 1 0 1 o rH B 1 0 1 ( p B F 1 0 1 ) .f r a c t i o n a t i o n a n d c o m p l e m e n t a t i o n s t u d i e s . . R e q u i r e m e n t s f o rt h e r e p l i c a t i o n p r o t e i n s n e e d e d f o r t h e p r i m i n g o f l a g g i n gs t r a n d s a n d e l o n g a t i o n o f c h a i n s a r e e x p e c t e d . T h u s f a r t h e n e e df o r d n a B p r o t e i n a n d S S B h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y s p e c i f i ca n t i b o d y i n h i b i t i o n , a n d D NA g y r a s e f u n c t i o n c a n b e i n f e r r e df r o m i n h i b i t o r y a c t i o n s o f n a l i d i x a t e - a n d n o v o b i o c i n i n v i t r o .T h e e x t e n s i v e a n a l y s i s o f t h e s t r u c t u r e a n d i n v i v o f u n c t i o no f t h e o r i C r e g i o n h a s d i s c l o s e d t h a t a 2 4 5 - b a s e p a i r s e q u e n c ei s r e q u i r e d a n d t h a t w i t h i n - t h i s r e g i o n c e r t a i n r e c o g n i t i o n a n ds p a c e r s e q u e n c e s m u s t b e s t r i c t l y m a i n t a i n e d ( 1 3 , 2 9 ) . W h e t h e rt h e s e r u l e s a p p l y i n v i t r o c a n no w b e , e x a m i n e d . S e v e r a l p r o -t e i n s may b e n e e d e d t o r e c o g n i z e a n d e x p l o i t t h e v a r i o u s f e a -t u r e s o f t h e 2 4 5 - b a s e p a i r . o r i C s e q u e n c e , w i t h R NA p o l y m e r a s eb e i n g m e r e l y one o f t h e c o m p o n e n t s . T h e r o l e , i f a n y , o f s e -q u e n c e s a d j a c e n t t o t h e m i n i m a l o r i C s h o u l d no w b e a m e n a b l et o s t u d y i n t h e i s o l a t e d i n v i t r o s y s t e m .U l t i m a t e l y , t h e e x p l o i t a t i o n o f t h i s s y s t e m s h o u l d a l l o w ad i r e c t b i o c h e m i c a l a p p r o a c h t o t h e r e g u l a t i o n o f r e p l i c a t i o n .A v a i l a b i l i t y o f a n a u t h e n t i c e n z y m e s y s t e m - f o r - r e p l i c a t i o n o f t h eE . c o l i c h r o m o s o m a l o r i g i n s h o u l d a l l o w t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o ff a c t o r s a n d - p r o c e s s e s t h a t c o n t r o l t h e f r e q u e n c y o f o r i g i n i n i -

t i a t i o n a n d c o u p l e t h e r a t e o f c h r o m o s o m a l d u p l i c a t i o n t o t h a to f t h e c e l l a s a w h o l e .We p a r t i c u l a r l y w i s h t o r e c o r d o u r i n d e b t e d n e s s t o D r . S e i i c h i Y a -s u d a , w h o ( w i t h D r . Y . H i r o t a ) c o n s t r u c t e d o u r f i r s t o r i C . p l a s m i d s a n dw h o s e e x t e n s i v e s t u d i e s o n t h e s e a n d C o l E l p l a s m i d s . a s a F e l l o w o f t h e

A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y ( C a l i f o r n i a D i v i s i o n ) i n o u r l a b o r a t o r y i n 1 9 7 8a n d 1 9 7 9 f a c i l i t a t e d t h e w o r k r e p o r t e d h e r e . T h e p r e s e n t w o r k w a s s u p -p o r t e d i n p a r t b y g r a n t s f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h a n d t h eN a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n . J . M . K . i s a F e l l o w o f t h e Damon R u n -y o n - W a l t e r W i n c h e l l C a n c e r F u n d .1 . K o l t e r , R . & H e l i n s k i , D . ( 1 9 7 9 ) A n n u . R e v . G e n e t 1 3 , 3 5 5 - 3 9 1 .2 . T o m i z a w a , J . & S e l z e r , G . ( 1 9 7 9 ) A n n u . R e v . B i o c h e m . 4 8 ,9 9 9 - 1 0 2 3 .3 . H a n s e n , F . G . & v o n M e y e n b u r g , K . ( 1 9 7 9 ) M o l . G e n . G e n e t .1 7 5 , 1 3 5 - 1 4 4 .4 . M c H e n r y , C . & K o r n b e r g , A . ( 1 9 7 7 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 2 ,6 4 7 8 - 6 4 8 4 .5 . L o w , R . L . , A r a i , K . & K o r n b e r g , A . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i .U S A 7 8 , 1 4 3 6 - 1 4 4 0 .6 . T o m i z a w a , J . , I t o h , T . , S e l z e r , G . & S o m , T . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l

A c a d . S c i . USA 7 8 , 1 4 2 1 - 1 4 2 5 .7 . K o l t e r , R . , I n u z u k a , M . & H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 7 8 ) C e l l 1 5 ,1 1 9 9 - 1 2 0 8 .8 . D i a z , R . , N o r d s t r o m , K . & S t a u d e n b a u e r , W. L . ( 1 9 8 1 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 8 9 , 3 2 6 - 3 2 8 .9 . Y a s u d a , S . & H i r o t a , Y . ( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 7 4 ,5 4 5 8 - 5 4 6 2 .1 0 . T i p p e - S c h i n d l e r , R . , Z a h n , G . & M e s s e r , W . ( 1 9 7 9 ) M o L G e n .G e n e t . 1 6 8 , 1 8 5 - 1 9 5 .1 1 . H e r s h f i e l d . V . , B o y e r , H . W . , Y a n o f s k y , C . , L o v e t t , M . A . &H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 7 4 ) P r o c . N a t i A c a d . S c i . U S A 7 1 , 3 4 5 5 - 3 4 5 9 .1 2 . S u g i m o t o , K . , O k a , A . , S u g i s a k i , H . , T a k a n a m i , M . , N i s h i m u r a ,A . , Y a s u d a , S . & H i r o t a , Y . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 7 6 ,5 7 5 - 5 7 9 .1 3 . O k a , A . , S u g i m o t o , K . , T a k a n a m i , M . & H i r o t a , Y . ( 1 9 8 0 ) M o lG e n . G e n e t . 1 7 8 , 9 - 2 0 .1 4 . B i t t n e r , M . & V a p n e k , D . ( 1 9 8 1 ) G e n e , i n p r e s s .1 5 . D a v i s , R . W . , B o t s t e i n , D . & R o t h , J . R . ( 1 9 8 0 ) A d v a n c e d B a c -t e r i a l G e n e t i c s ( C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n gH a r b o r , N Y ) , p p . 1 1 6 - 1 1 7 .1 6 . T s u g i t a , A . , I n o u y e , M . , T e r z a g h i , E . & S t r e i s i n g e r , G . ( 1 9 6 8 ) J .B i o l C h e m . 2 4 3 , 3 9 1 - 3 9 7 .1 7 . A r a i , K . , Y a s u d a , S . & K o r n b e r g , A . ( 1 9 8 1 ) J . B i o l C h e m . 2 5 6 ,5 2 4 7 - 5 2 5 2 .1 8 . W e i n e r , J . H . , B e r t s c h , L . L . & K o r n b e r g , A . ( 1 9 7 5 ) J . B i o lC h e m . 2 5 0 , 1 9 7 2 - 1 9 8 0 .1 9 . U e d a , K . , M c M a c k e n , R . & K o r n b e r g , A . ( 1 9 7 8 ) J . B i o l C h e m .2 5 3 , 2 6 1 - 2 7 0 .2 0 . B r a d f o r d , M . M . ( 1 9 7 6 ) A n a l . B i o c h e m . 7 2 , 2 4 8 - 2 5 4 .2 1 . T a n f o r d , C . ( 1 9 6 1 ) P h y s i c a l C h e m i s t r y o f M a c r o m o l e c u l e s ( W i l e y ,New Y o r k ) .2 2 . S u g i n o , A . , P e e b l e s , C . L . , K r e u z e r , K . N . & C o z z a r e l l i , N . R .( 1 9 7 7 ) P r o c . N a t l A c a d . S c i . U S A 7 4 , 4 7 6 7 - 4 7 7 1 .2 3 . S u g i n o , A . , H i g g e n s , N . P . , B r o w n , P . O . , P e e b l e s , C . L . & C o z -z a r e l l i , N . R . ( 1 9 7 8 ) P r o c . N a t i . A c a d . S r i . U S A 7 5 , 4 8 3 8 - 4 8 4 2 .2 4 . U h l i n , B . E . & N o r d s t r 6 m , K . ( 1 9 7 8 ) M o l G e n . G e n e t . 1 6 5 ,1 6 7 - 1 7 9 .2 5 . K a g u n i , L . S . , K a g u n i , J . M . & R a y , D . S . ( 1 9 8 1 ) J . , B a c t e r i o l1 4 5 , 9 7 4 - 9 7 9 .2 6 . C o n r a d , S . E . , W o l d , M . & C a m p b e l l , J . L . ( 1 9 7 9 ) P r o c . N a t lA c a d . S c i . U S A 7 6 , 7 3 6 - 7 4 0 .2 7 . C o n r a d , S . E . & C a m p b e l l , J . L . ( 1 9 7 9 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 6 ,3 2 8 9 - 3 3 0 4 .2 8 . P r o j a n , S . J . & W e c h s l e r , J . A . ( 1 9 8 1 ) M o l G e n . G e n e t . 1 8 2 ,2 6 3 - 2 6 7 .2 9 . H i r o t a , Y . , O k a , A . , A s a d a , K . , S a s a k i , H . & T a k a n a m i , M . ( 1 9 8 1 )i n S t r u c t u r e a n d D N A - P r o t e i n I n t e r a c t i o n s o f R e p l i c a t i o n O r i g i n s ,ICN-UCLA S y m p o s i a o n M o l e c u l a r a n d C e l l u l a r B i o l o g y , e d s .R a y , D . S . & F o x , C . F . ( A c a d e m i c , Ne w Y o r k ) , V o l . 2 1 , i n p r e s s .

P r o c . N a d A c a d . S c i . U S A 7 8 ( 1 9 8 1 )

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