ReplicaciReplicacióón y mantenimiento de la informacin y ... · ReplicaciReplicacióón y...

2011 Enrique Castro 1

Replicación y mantenimiento de la informaciónReplicación y mantenimiento de la información

➢ Replicación del DNA Topología de las horquillas de replicación. Etapas genéricas del proceso Química de la polimerización de DNA DNA polimerasas eucarióticas: fidelidad y procesividad Maquinaria molecular en la horquilla replicativa eucariótica. Diferencias importantes en procariotas. Regulación de la replicación: Iniciación, sincronización con el ciclo celular Replicación de telómeros

➢ Recombinación del DNA Modelos topológicos del proceso. Enzimas participantes: RecA, DNA-PK

➢ Reparación del DNA Mutaciones y lesiones química y estructurales en el DNA. Reparación por excisión: MMR, BER, NER. Acoplamiento transcripcional. Bloqueos de polimerasa. Reparación de roturas de doble cadena. NHEJR

Para © Enrique Castro Los trabajos de terceros retienen su licencia original


Topología de la ReplicaciónTopología de la Replicación

● Semiconservativa● Origen interno, secuencial, bidireccional● Extensión 5' 3', semidiscontinua

Hebras molde intactasHebra nueva complementaria


Síntesis de la hebra retrasadaSíntesis de la hebra retrasada


Polimerización de DNA: características generalesPolimerización de DNA: características generales

Hebra molde

Hebra cebadora

3' OH

apareamiento estable

5'

3'

Liberación de PP

i

● Dependiente de molde● Cebador 3'OH● Direccional: 5'→3'● Sustrato dNTPs● Alta fidelidad● Alta procesividad

NTP + H2O NMP+ PPi

ΔG0= –31 kJ/mol

DNAn + NMP DNAn+1 + H20

ΔG0= +25 kJ/mol

DNAn + NTP DNAn+1 + PPi

ΔG0= –6 kJ/mol

PPi + H2O 2 Pi

ΔG0= –31 kJ/mol

sin errores

Continuasin interrupción


proceso actividad proteína

Reconocimiento del origen ORCcdc45

Dependiente de ciclinas

Desenrollamiento helicasas MCMs Estimulada por cdc45,RPA, DNApol α

unión monohebra RPA Unión polα, RFC

topoisomerasas Topo II

Cebado primasa DNApol α Unión RPA, cdc45

Elongación síntesis DNApol δ DNApol ε Unidas a PCNA

procesividad RFCPCNA

Cargadorandamiaje

MaduraciónEliminación del cebador Exonucleasas

helicasasRnasa H1, FEN1Dna2

Endonucleasa flap

Rellenado de huecos síntesis DNApol δ DNApol ε

Ligamiento DNA ligasa I

Elongación de telómeros telomerasa

Maquinaria de la replicación eucarióticaMaquinaria de la replicación eucariótica


DNA polimerasas eucarióticasDNA polimerasas eucarióticas

Análogos de nucleótidos2'-3'-didesoxi: AZTDe azúcar: AraC antitumoral AraA antiviral Aciclovir antiviral

aciclovir

DNApol α DNApol β DNApol γ DNApol δ DNApol εNº subunidades 4 hetero 1 4 homo 3 hetero 2 hetero

KM para dNTPs (μM) 2-5 10 0.5 2-4 2-5

Procesividad intrínseca Con PCNA

moderadamoderada

bajabaja

altaalta

bajaalta

altaalta

3' exonuclesa No No Si Si Si

Actividad primasa Si No No No No

Sensibilidad didesoxi-NTP baja alta alta baja moderada

Sensibilidad a AraCTP alta baja baja alta ?

Compartimento Núcleo Núcleo Mitocondria Núcleo Núcleo

Función Replicaciónprimasa

Reparación, BER

Replicación DNA mitocondrial

Rep. (retrasada) Rep. (conductora)Reparación

Homólogo bacteriano Primasa DnaG Pol I --- Pol III Pol III


DNA polimerasas: fidelidad de copiaDNA polimerasas: fidelidad de copia

Fidelidad ∝ diferencia energética

pol ≈ 10-6-10-7

ΔΔG≈4-15 kJ/mol

DNA pol I de E. ColiBien apareado mal apareado

Fusión local 4-5 pb

molde

Unión surco mayor

Sitio 3' exo

Sitio pol

● Inserción específicaafinidad KM

Error ≫ KMap

● extensión selectivavelocidad kcat

Error ≪ kcatap

● 3' exonucleasa≈1:10 correctos

Fidelidad x 103

Apareamiento deWatson-Crick

mal-apareamiento

Actividad dualDNApolimerasa3'-exonucleasa

Fidelidad replicativa

≈ 10-9


Fidelidad: Malapareamientos con igual geometríaFidelidad: Malapareamientos con igual geometría


Etapas de la replicaciónEtapas de la replicación

DNA ligasa

➢Cebado:•Reclutamiento de la primasa• Síntesis del cebador

➢Iniciciación•Reconocimiento del origen•Ensamblaje de la helicasa•Activación de la helicasa

➢Intercambio de polimerasa:•Reclutamiento de RFC•Ensamblaje de la arandela de procesividad•Reclutamiento de DNA polimerasa

➢Procesamiento de F. de Okazaki•Eliminación del cebador•Rellenado de huecos• Ligado

➢Elongación• Síntesis de DNA por polimerasaFEN1

RNasa H

Dna2

DNA pol δ

RFCPCNA

DNA pol α

DNA pol αRPA

Frag. Okazaki previo

RPA

Molde H. retrasada


Etapas de la replicaciónEtapas de la replicación


Licenciamiento: reconocimiento del origen y ensamblaje MCMLicenciamiento: reconocimiento del origen y ensamblaje MCM

Origen: secuencias ARS• Repeticiones ricas AT• Fusión fácil• Múltiples: 1 cada 3-300 kpb

ORC• Hexamérico• Unión permanente a ARS• Fosforilable

➢Reconocimiento del origen•Unión MCM

➢Ensamblaje de helicasa• CDT1 presenta MCM• Cdc6 ensambla en DNA

cdc6• Cargador de helicasa• ATPasa

MCM• Helicasa replicativa• Hexamérico toroidal• Desfosfolrilada, Unida a CDT1

Complejopre-replicativolicenciado (inactivo)

ensamblaje• Actividad ATPasa de cdc6• Cambio conformacional MCM• Enhebrado en hebra conductora

➢Activación de helicasa• Fosforilación por CDKs•Reclutamiento de cdc45

cdc45P

P

ADP

Pi

CDKs


Iniciación de la replicación: Activación de helicasaIniciación de la replicación: Activación de helicasa

Quinasas dependientes de ciclinas, CDKs

Complejo pre-replicativoHelicasa inactiva

Activada en fase Sdel ciclo celular

Fosforilación cdc6 marca para proteolisis

Helicasa 3'5' activaHebra molde conductora

➢Activación de helicasa• Fosforilación MCM por CDKs

•Reclutamiento de cdc45•Cdc45 estimula activ. helicasa

CDKs fosforilan múltiples dianas• ORC • cdc6• cdt1• MCM• otras

➢Sincronización con ciclo celular•Activación única por ciclo•Reconocimiento ORC sólo desfosfo-MCM• fosfo-Cdc-6 ubiquitinizado (degradado)


Replicación: Desenrollamiento del DNAReplicación: Desenrollamiento del DNA➢Actividad helicasa de MCM

•MCM enhebrado en molde de conductora• Actividad helicasa 3' 5' •Necesita unión de cdc45• Estimulada por RPA• ATPasa: 0,1-0,5 vueltas/ATP

Helicasa 3'5' Montada en molde hebra conductora

RPA• Heterotrimérica (p70, p34, p11)• 4 sitios de unión al DNA (diana 30 pb)• Previene reasociación de monohebras • Estimula helicasa MCM (feedback positivo)

Desenrollados 1-5 nucleótidos por ATP


Cebado: primasaCebado: primasa

➢Reclutamiento de primasa:•Primasa = DNApolα•Reclutada sobre helicasa/RPA

➢Síntesis del cebador•Cebador mixto RNA/DNA•Baja fidelidad (DNApolα sin correción errores 3' exo)

•Baja procesividad (salida espontánea = terminación cebador)

Interacciones de uniónsinérgicas entre RPA/MCM/DNApolα

DNA pol α

Cebador mixto: ≈30-40 nucleótidos(longitud limitada por baja procesividad)


Ensamblaje de la arandela de procesividadEnsamblaje de la arandela de procesividad

ATP

RPA

RFC

duplex

5’ 3’

DNA pol α

3’5’

3’

ATP+

PCNA

DNA pol δ / ε

ADP +Pi

Unión a fronteracebador dúplex – monohebra

RFC: •Unión de alta afinidad a DNAdúplex-RPA • ATPasa

Salida de primasaDNA pol α

Polimerasa replicativa

Hebra conductora: >10 kb DNApol ε Hebra retrasada: 0.2-0.5 kb DNApol δ

Baja procesividaddesligado espontáneo

PCNA es sitio de unión de máquinaria

replicativa

Síntesis de fragmentos de Okazaki

Ensamblaje PCNA: • RFC cargador• ATP-dependiente


Procariotas: DNA pol III β Eucariotas: PCNA

trímero p36

H2Op41

p41

3.5 nm

DNA

┴ a surcos

p21CIP1

Arandelas de procesividadArandelas de procesividad

Inhibidor ciclo celularInhibe replicación, no reparación


Eliminación del cebadorEliminación del cebador

➢RNasa H1•5' exonucleasa•Ribonucleasa•Elimina PPP

➢FEN 1•Endonucleasa flap•5' exonucleasa•No elimina PPP

terminal5'exo

Vía RNasa H1/ FEN1

Vía Dna2 / FEN1

reconocimiento

corte'flap'

Todas unidas aPCNA y DNApol

Máquina replicativa

Máquina replicativarellenado de huecos


Ligado de fragmentos de OkazakiLigado de fragmentos de Okazaki

PPi 2 P

i

irreversible

reutilización

• Hidrólisis PP: unidireccional• NMN acumulado en lesiones

DNA ligasa 1 unidaPCNA y DNApol

Máquina replicativa


Helicasa DnaB

primasa RNA pol

SSB

avance de la horquilla

Duplex parental

arandela β

arandela β

avance dehebra conductora

avance dehebra retrasada

cebador

primer

hebr

a co

nduc

tora

hebr

a re

zaga

da

núcleo pol III

núcleo pol III

DNA ligasa I

DNA pol I

complejo γ

DNA pol α 3’ exo ε

θ

γδδ’χψ

Cargador de β

Helicasa DnaB 5’---3’: hebra retrasada

Primosoma permanente

Cebador RNA

Sin cambio de polimerasa

Ensamblado en máquina molecular dimérica (subunidad τ)

Fragmentos de Okazaki largos

Maduración por DNA pol I

DNA pol 5’---3’exonucleasa 3’ 5’ corrección)exonucleasa 5’ 3’ (Okazaki)

Maquinaria de Replicación en ProcariotasMaquinaria de Replicación en Procariotas


Maquinarias de replicación: comparaciónMaquinarias de replicación: comparación

Procariotas Eucariotas


Reorganización de la cromatina en replicaciónReorganización de la cromatina en replicación

➢Detrás:•Re-ensamblaje de nucleosomas•Descarga de PCNA

Topo I humana: camptotecina(antitumoral)

DNA girasa bacteriana:Ác. Nalidíxico (sub A)novobiocina (sub B, ATPasa)

➢Delante: •Desensamblaje de nucleosomas•Tensiones de superenrollamiento positivo

•Alivio de tensión por topoisomerasas•Dianas de fármacos

Hebra conductora

Hebra rezagada

TetrámeroH3/H4

H1H2A/H2B

InteracciónCAF-1 / PCNA

• CAF-1 se une a PCNA• Se añaden H2A/H2B, H1• PCNA es descargado• Histonas desacetiladas

Desensamblaje nucleosómico• 1 Tetrámetro H3/H4• 2 Dímeros H2A/H2B

Ensamblaje cuasi-aleatorio• 1 Tetrámetro + 2 dímeros• Antiguos repartidos• De novo acetilados (y mezclados)

• CAF-1 presenta H3/H4

•re-ensamblaje en ambas hebras


Mantenimiento de TelómerosMantenimiento de Telómeros

➢Problema telómerico: • Imposible replicar extensión 3' (rezagada) •Acortamiento progresivo (daño en genes)• Senescencia replicativa

5' AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT AGGGTT 3'3' TCCCAA TCCCAA TCCCAA TCCCAA 5' 3' 5'

Stryer 6e Fig. 28-34

Translocación

Translocación

Elongación

Elongación

Ciclo repetido n veces

➢Telomerasa•2 subunidades + RNA•Molde intrínseco RNA (secuencia fija)•Transcriptasa inversa• Sólo embrión/stem, luego inducible

TERT, inducible

TEP1, constitutiva

RNA molde

Telómeros añadidos,no repliclados


Replicación DNA mitocondrialReplicación DNA mitocondrial

DNA mitocondrial16 kpb, dos hebrassuperenrrollado

Origen hebra H

Nuevahebra H Nueva

hebra H

Bucle de desplazamientoDNApolγ activa en molde L

Origen hebra L

Nuevahebra L

2 orígenes monohebraHorquillas unidireccionales

DNApolγ Alfa fidelidad (3'exo)







Recombinación Recombinación

Cruce de Holliday

Extremos desapareados disparan recombinación

➢Recombinación específica de sitio: • Secuencia específica / Enzimas específicas• Integración/escisión de virus

➢Transposición•Transposasa y secuencias de inserción• LINES / SINES• Integración/escisión retrovirus

➢Unión de extremos no homólogos • Sin homología secuencial: no recombinación•Reparación de roturas de doble hebra

➢Recombinación homóloga• Secuencia homóloga (complementaria)• Simetría de corte•Cruces de Holliday (4 cadenas)•Reparación (uniones de roturas)•Meiosis: variabilidad de ligamientos génicos

Recombinación: corte y cruce de información

de dos cromosomas

Gen A Gen B

Gen a Gen b

Gen A Gen b

Gen a Gen B

(NHEJ)

Secuencia complementaria

Ku/DNA-PK


Gen B Gen A

Gen a Gen b

Recombinación homóloga: mecanismo de HollidayRecombinación homóloga: mecanismo de HollidayExisten otros mecanismos• Meselson-Radding• Rotura de doble hebra

Intermediario de Holliday

Corte monohebra• inducido o prexistente

Invasión de hebra• Desenrollamiento local• Apareamiento complementario cruzado

(homología de secuencia)

Migración de rama• Desplazamiento de apareamiento

Religado

Corte de Holliday• Endonuclesa + ligasa

Gen A Gen B

Gen a Gen b

Gen A Gen B

Gen a Gen b

Gen A Gen B

Gen a Gen b

Gen A Gen B

Gen a Gen b

Gen B Gen A

Gen a Gen b

Gen A Gen B

Gen a Gen b

Giro90º Gen A Gen b

Gen a Gen B

Corte 1 (igual)

Corte 2 recombinación

Zonashíbridas


Mecanismos de recombinaciónMecanismos de recombinaciónRecA cataliza invasión de hebraRecBCD genera monohebras: helicasa+nucleasa

:GCTGGTGG

RecA une monohebrasRecBCD

une extremos


Recombinación en InmunoglobulinasRecombinación en Inmunoglobulinas

http://scienceblogs.com/webeasties/2011/08/the_god_of_b-cells.phpMatsuda and Hanjo, "Organization of the Human Immunoglobulin Heavy-Chain Locus" Advances in Immunology. Volume 62, 1996, Pages 1-29

The final piece of GoD is what we call "junctional diversity." When the DNA is severed durring V(D)J recombination, it's not always a clean cut, and some extra nucleotides must be added to fill the gap. In addition, there's an enzyme whose only job is to add in random nucleotides to the junction. This randomness can be extreme and it's here that GoD mangages to reach the 10 billion mark. This is also the reason that every individual has their own set of antibodies. The inherent randomness, from the selection of V's, D's and J's, to the jagged cuts to the random inserted nucleotides means that not even identical twins will have the same repertoire, or even similar repertoires.every individual has their own set of antibodies. The inherant randomness, from the selection of V's, D's and J's, to the jagged cuts to the random inserted nucleotides, means that not even identical twins will have the same repertoire.







Errores replicativos Mal-apareamientosinserciones y deleciones(patinado de polimerasa)bloqueo de polimerasa

Agentes intercalantes

Despurinaciónespontánea

Sitios AP (104/genoma/día)

Inducido por ácidos y bases

Desaminación espontánea Mal-apareamientos(100-500/genoma/día)

C→U nitrosaminasG→XA→H

Alquilaciones de bases Mal-apareamientos inducidosimpedimentos estéricos

Mostazas nitrogenadasAlquil sulfonatos

Oxidaciones de bases Mal-apareamientos inducidosentrecruzamientos

Estrés oxidativonitrosaminas

Aductos de bases Impedimentos estéricosentrecruzamientos

Carcinógenos químicosbenzopirenosaflatoxinas

Dímeros de timina Impedimentos estéricosbloqueo de polimerasa

Luz UV

Roturas de hebra Delecionesentrecruzamientostranslocaciones

Radiaciónes ionizantesestrés oxidativo

Mecanismos de daño al DNAMecanismos de daño al DNA


Daño por malapareamientos inducidosDaño por malapareamientos inducidos➢Tautomerización espontánea ➢Alquilación

➢Desaminación oxidativa➢Oxidación Estrés oxidativo

EspontáneaMuy frecuente

Agentesalquilantes

CU (A)AH (C)G X (A)


Tautómeros y errores de apareamientoTautómeros y errores de apareamiento

Purine and pyrimidine bases exist in different forms called tautomers.(A) A tautomeric shift occurs when a proton changes its position, resulting in a rare tautomeric form. (B) Standard and anomalous base-pairing arrangements that occur if bases are in the rare tautomeric forms. Base mispairings due to tautomeric shifts were originally thought to be a major source of errors in replication, but such structures have not been detected in DNA, and most evidence now suggests that other types of anomalous pairings are responsible for replication errors.

Pierce, Benjamin. Genetics: A Conceptual Approach, 2nd ed. (New York: W. H. Freeman and Company), 485.DNA Replication and Causes of Mutation. By: Leslie A. Pray, Ph.D. © 2008 Nature Education Citation: Pray, L. (2008) DNA replication and causes of mutation. Nature Education 1(1)


Agentes mutágenosAgentes mutágenos➢Agentes intercalantes

• Sustituyen pb en apilamiento• Inserciones/deleciones replicativas

➢Radiación UV•UVB, UVC•Radicales oxidantes (8oxoG)•Dímeros de pirimidina

➢Radiación ionizante•Fotones: X, •Partículas: , •Rotural de anillos•Roturas de doble hebra

➢Formadores de aductos•Grupos voluminosos unidos covalentemente•Defromaciones estructurales, impedimentos estéricos• Inserciones, deleciones•Entrecruzamientos de hebra•Bloqueos de polimerasa

Humo de tabaco:benzopireno

Contaminantes biológicos:AflatoxinaMitomicina CPsoraleno

Cancerígenosorgánicos


Lesión por radiación UV: dímeros de pirimidinaLesión por radiación UV: dímeros de pirimidina

➢Dímeros de pirimidina•Pir-Pir adyacentes (TT más frecuente)•Fotoreacción espontánea (UVA)•Daño estructural (deformación permanente)

Pirimidinas adyacentes

UV 260 nm

Dímero de ciclobutano

Fotoproducto 6-4

Luz solarUVB

Bloqueo de polimerasa

Hueco de ≈1 kpb

Deformaciónestructural


Mecanismos de Reparación del DNAMecanismos de Reparación del DNA● Nucleótido difosfohidrolasas

● Mantenimiento y control de calidad

MMR Rep. Malapareamientosdependiente de metilaciónpostreplicativo

BER Rep. por escisión de baseDNA-N-glucosilasas/PARP

NER Rep. Por escisión de nucleótidosexcinucleasas

NHEJR Rep. por unión de extremos no homólogosMMEJR Rep. por unión de extremos con microhomología

Ku/DNA-PK/PARP

● Reparación directafotorreactivación: DNA fotoliasa desalquilación: O6-alquil-guanina transferasa

● Mecanismos no específicosRep. Translesión

DNA pol ζ, η, ι

Rep. por recombinaciónIntermedios de Holliday, proteínas Rec

preventivo

Sistemas de detección de daños

especializadosSensores de daño al DNA

Fallosreplicativos

Uracil-DNAbases alteradas

sitios APmalapareamientos

Defectos estéricosdímeros de timinaaductos de base

Mod. voluminosas

Roturas dedoble hebra

Bloqueos de polimerasaRoturas de doble hebra

entrecruzamientos

Bloqueos de polimerasa Sin sistema dedetección dedicado


Prevención y Reparación directaPrevención y Reparación directa

Fotoliasa

➢Preventivos•Nucleótido difosfohidrolasas•Evitan incorporación incorrecta

dUTP + H2O dUMP + PP

i

d-oxoGTP + H2O d-oxoUMP + PPi

➢Reparación directa• Inversión del daño in situ•Fotoreactivación (no en mamíferos)•Desalquilación

Fotoreactivación: DNA fotoliasa

UV370 nm

dUTPasa

Degradacióntotal

Desalquilación: O6-alquilG transferasa

irreversible

O6mG induce mal-apareamientos


Reparación por escisión: MMRReparación por escisión: MMRMetilación 5mC, 6mA: marca hebra antigua

MutH•Reconocimiento de hebra•endonucleasa

MutS•Reconocimiento del error

MutL•Asociación ambos

Rellenado de huecosRPA, RFC, PCNADNApol δ/ε


Reparación por escisión de base: BERReparación por escisión de base: BER

DNA glucosilasas

BER también corrige sitios AP espontáneos

•UDG: uracilo•Malapareamientos G/T(U) A/G (oxoG)

•B. alquiladas 3mA, 06mG

•B. oxidadas 8oxoG

Sensor: PARP

dRPasa

DNApol βN- 8kDa

Reparación BER“hueco corto”

Reparación BER“hueco largo”

HidrólisisN-glucosídico

Sitio AP


Reparación por escisión de nucleótidos: NERReparación por escisión de nucleótidos: NER

ATP

⑥


Reparación por escisión de nucleótidos: NERReparación por escisión de nucleótidos: NER


Reparación de roturas dobles: NHEJR y MMEJRReparación de roturas dobles: NHEJR y MMEJR

➢No-homóloga•Reconoce extremos rotos•Une sin importar secuencia, con deleción• Salvaguardia, propenso a errores•Helicasa Ku / DNA-PK


Rep. de roturas de doble hebra por recombinaciónRep. de roturas de doble hebra por recombinación

Corte y empalme recombinatorio

Rellenado del hueco

Rellenado del hueco


Reparación de bloqueos de polimerasaReparación de bloqueos de polimerasa

➢Replicación translesión•Propensa a error: DNApol ζ, ι• Libre de error: DNApol η

Hueco crea rotura en cromosoma hijo

Útil si es zona no codificante

➢Recombinación• Libre de errores

Reparable NER escinucleasa


Reparación de bloqueos por recombinaciónReparación de bloqueos por recombinación

Corte y empalme recombinatorio

Rellenado del hueco

Reparable NER escinucleasa

Dímero Pir no aparea Pero sus vecinos si: hélice bien alineada

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