Reporte de Laboratorio 3 Grupo 2

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 REPORTE DE LABORATORIO PRACTICA 3: EXTRACCION DE ARN INTRODUCCION Para la extracci ón de ARN a partir de leuco citos obte nidos de sangre perifér ica exist en varios métodos con diferentes principios, características, ventajas y desventajas que influyen en la calidad y cantidad del A RN recuperado, y consecuenteme nte en el estudio molecular a efectu arse OBJETIVOS 1. Emplea r téc!ca" #e la$%ra t%r!% ca "era" & c%mer c!al e" para la c%rr ecta e'tracc!( & p)r!*cac!( #e ARN a p art!r #e "a+re per!,ér!ca. -. am!l!ar!/ar al e"t)#!a te c% l%" pa"%" $0"!c%" #e la e'tracc!( #e ARN. 3. V al%ra r el pr% ce"% # e la e't racc!( #el RNA. . Deter m!ar la !te+r!#a# #el ARN p%r electr %,%r e"!" e +el #e a+ar%"a. 2. Real!/ar ) a0l!"!" c%mparat! % #e téc!ca" c%merc !ale" & ca"era "4 a"5 c%m% #eterm!ar la" #!,erete" eta6a" & #e"eta6a". 7ETODOLO8IA La e'tracc!( #e ARN "e real!/( me#!ate #%" téc!ca". La téc!ca c%merc!al $a"a#a e la met%#%l%+5a #e Chir gwin et al., 197 9; & Chomczynski&Sacchi, 19874 la c)al c%"!"te e la r)pt)ra #e la" cél)la" )t !l!/a#% )a "%l )c!( 9)e c%t!ee T!%c!aat% #e +)a!#!!%4 c%m% a+ete #e"at)ral!/ate. Se lle( a ca$% la r)pt) ra #e la" cél) la" a+re +a#% la "%l )c!( #e l!" !" a la m)e"tra & emplea #% ! +%r %"amete la ,)er/a #el a+! ta#%r (r te' 4 par a pr% ce#er a me/clarl% c% )a "%l)c!( #e ; eta%l. La me/cla l!"a#%<eta%l "e apl!c( a ) *ltr%4 #%#e el ARNm & ARNr "e )!er% "elect!amete= l)e+%4 tra" ar!%" pa"%" #e laa#% para rem%er re"t%" #e ADN4 pr%te5a" #e"at)ral!/a#a" & %tr%" c%tam!ate"4 el ARN ,)e el)5#% e a+)a l!$re #e )clea"a"4 l!"t% para "er )t!l!/a#%. Se real!/( el tratam!et% %pc!%al #el ARN c% la DNa"a 1 para +arat!/ar la c%mpleta el!m! ac!( #e ADN 9)e >)$!e"e permaec!#% e la m)e"tra #e !teré". La téc!ca ca"era4 al !+)al 9)e la téc!c a c%merc!al4 "e $a"( e el mét%#% #e pa" % ?!c% #e" ar r%lla#% p%r Chomczyns ki&Sacchi, 1987. Se real!/( ) pa"% ?!c% #e e'tracc!( 9)e c%m$!a la acc!( #el Tr!%c!at% #e +)a!#!!% & el e%l@C l%r %,%r m%4 "%l)$!l!/a #% el mater!al $!%l(+!c% & #e"at )ral!/a#% la" pr%te5a". De"p)é" #e la "%l)$!l!/ac!(4 "e a#!c!%( cl%r%,%rm% +eera#% tre" parte"4 )a ,a"e ac)%"a4 )a , a"e % r+0!ca & )a !ter,a"e= al$er+a#% ARN4 pr%te5a" & ADN4 re"pect!amete.

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reporte 2 de bioquimica facultad de agronomia universidad de san carlos

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REPORTE DE LABORATORIOPRACTICA 3: EXTRACCION DE ARN

INTRODUCCIONPara la extraccin de ARN a partir de leucocitos obtenidos de sangre perifrica existen varios mtodos con diferentes principios, caractersticas, ventajas y desventajas que influyen en la calidad y cantidad del ARN recuperado, y consecuentemente en el estudio molecular a efectuarse.

OBJETIVOS 1. Emplear tcnicas de laboratorio caseras y comerciales para la correcta extraccin y purificacin de ARN a partir de sangre perifrica. 2. Familiarizar al estudiante con los pasos bsicos de la extraccin de ARN. 3. Valorar el proceso de la extraccin del RNA.4. Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de agarosa.5. Realizar un anlisis comparativo de tcnicas comerciales y caseras, as como determinar las diferentes ventajas y desventajas.

METODOLOGIALa extraccin de ARN se realiz mediante dos tcnicas. La tcnica comercial basada en la metodologa de Chirgwin et al., 1979; y Chomczynski&Sacchi, 1987, la cual consiste en la ruptura de las clulas utilizando una solucin que contiene Tiocianato de guanidinio, como agente desnaturalizante. Se llev a cabo la ruptura de las clulas agregando la solucin de lisis a la muestra y empleando vigorosamente la fuerza del agitador vrtex, para proceder a mezclarlo con una solucin de 64% etanol. La mezcla lisado/etanol se aplic a un filtro, donde el ARNm y ARNr se unieron selectivamente; luego, tras varios pasos de lavado para remover restos de ADN, protenas desnaturalizadas y otros contaminantes, el ARN fue eludo en agua libre de nucleasas, listo para ser utilizado. Se realiz el tratamiento opcional del ARN con la DNasa 1 para garantizar la completa eliminacin de ADN que hubiese permanecido en la muestra de inters.

La tcnica casera, al igual que la tcnica comercial, se bas en el mtodo de paso nico desarrollado por Chomczynski&Sacchi, 1987. Se realiz un paso nico de extraccin que combina la accin del Triocinato de guanidinio y el Fenol-Cloroformo, solubilizando el material biolgico y desnaturalizando las protenas. Despus de la solubilizacin, se adicion cloroformo generando tres partes, una fase acuosa, una fase orgnica y una interfase; albergando ARN, protenas y ADN, respectivamente.

La integridad y distribucin en base al tamao molecular del ARN fue determinada por medio de la electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante, cuya preparacin fue similar al mtodo convencional, pero agregando formaldehido para observar Las bandas correspondientes al ARN ribosomal, 28S y 18S en Eucariotas, de manera intensa y definida en el gel, con una movilidad aproximada de 5kb y 2kb, respectivamente. Se realiz adems, la cuantificacin del ARN a travs del mtodo de fluorometra para verificar la presencia del producto obtenido y su concentracin dentro del rango ideal, que indica una buena integridad del ARN para proceder a la utilizacin del mismo en otros procesos como una amplificacin.

Objetivos 1 y 2

Existen varios mtodos para extraer e identificar un ARN en particular, dentro de la poblacin total de RNA de la clula, lo cual tiene como objetivo la utilizacin del ARN para una determinacin posterior especfica, como la realizacin de una PCR, la construccin de cDNA library, entre otros.

Para la extraccin de ARN tanto con la tcnica casera como con la tcnica comercial, se tuvo en cuenta algunas consideraciones especiales, como el hecho de que el RNA es degradado por ARNsas, que estn presentes en una diversidad de lugares, como superficiens, en las manos; adems las ARNsas son mucho ms poderosas que las ADNAsas: Son termorresistentes, no requieren cationes divalentes (as que EDTA no tiene efecto, a diferencia de lo que pasa con DNAsas). Por esta razn lo primero que se realiz en el laboratorio antes de iniciar la extraccin, fue realizar una cuidadosa limpieza de superficies y asegurar en todo momento la utilizacin de guantes.

Para ambas tcnicas, se procedi a homogeneizar la muestra para obtener ARN, ya que la lisis libera ARNasa endgenas y las pone en contacto con ARN endgenos. Adems, hay ARNasas exgenas, este paso fue crtico para el rendimiento y la integridad del ARN obtenido. As que se busc hacer una lisis rpida y completa. Una lisis lenta habra permitido que ARNasas endgenas se contactaran con ARN endgeno, mientras que una lisis incompleta habra provocado que mucho ARN quedara atrapado lo cual habra disminuido el rendimiento final.

En la metodologa comercial, despus de la elucin del ARN en agua libre de nucleasas, se realiz el tratamiento opcional del ARN con la DNasa 1 para garantizar la completa eliminacin de ADN que hubiese permanecido en la muestra de inters y as obtener un producto con la mayor pureza posible. En la metodologa casera, la realizacin de un paso nico de extraccin (Triocinato de guanidinio + el Fenol-Cloroformo), solubiliz el material biolgico y desnaturaliz las protenas. Luego, con la adicin del cloroformo se gener una fase acuosa que permiti visualizar el ARN y una fase orgnica, que alberg las protenas desnaturalizadas; el ADN qued en una especie de interfase.

Objetivo 3

El ARN es un molcula compuesta por solamente una cadena, lo cual le proporciona menor estabilidad en comparacin con el ADN, que este ltimo por poseer doble hlice los puentes de hidrogeno que forman entre bases complementarias, lo hacen mucho mas estable. El ARN es un moleculalabil, que fcilmente se degrada si no se tiene cuidado en su manipulacin. Existen tres formas de ARN en las clulas nucleadas, ARN ribosomal, mensajero, transferencia.Existen numerosos mtodos de extraccin de ARN, en la practica de laboratorio se llevaron a cabo por medio de extraccin orgnica, y extraccin en fase slida.

Cuantificacin del ARN extrado (no tengo estos clculos)Se obtuvo 112. 25 ng/L por medio de la metodologa casera, y 68.1 ng/L por medio de la metodologa comercial por membrana. Una buena concentracin para posteriores tcnicas de biologa molecular como PCR, se considera 40ng/L en un rango de 40 80 ng/L, es importante la cuantficacin del ARN extraido, ya que si se procede a una amplificacin, no habr inconveniente, pero si no se cuantifica se corre el riesgo que no se amplifique ya que necesitara masDNTPs para todo el ARN en la muestra.

Se diluy por la linealidad del equipoAl igual que la tcnica comercial, la tcnica casera tambin se basa en el mtodo de paso nico desarrollado por Chomczynski&Sacchi, 1987. La claver de la purificacin del ARN radica en evitar su degradacin por accin de las ribonucleasas, las cuales son abundantes en las muestras biolgicas y se encuentran presentes en las manos y en general por toda la superficie de nuestros cuerpos.

El mtodo consiste en un paso +nico de extraccin que combina la accin del Triocianato de guanidinio y el Fenol-Cloroformo, solubilizando el material biolgico y desnaturalizando las protenas. Despus de la solubilizacin, la adicin del cloroformo genera una fase acuosa, que contiene ARN y una fase orgnica, que alberga las protenas desnaturalizadas; el ADN queda en una especie de interfase. El mtodo de extraccin con TRIzol es altamente efectivo para el aislamiento de pequeos ARNs, como los microARNs

La pureza del ARN un parmetro fundamental en el momento de elegir un mtodo de extraccin. Se discuten tambin otros parmetros relacionados a las caractersticas inherentes de cada mtodo pero que deben ser tomados en cuenta, como son: el mximo volumen de sangre permitido, directamente relacionado con la cantidad de glbulos blancos del paciente al momento de la toma de muestra y la presencia de ARN carrieren algunos mtodos de extraccin, ambos factores crticos en la optimizacin y aplicacin de los mtodos de extraccin.

Objetivo 4Para determinar la integridad el ARN se utiliz la electroforesis en gel de agarosa. El marcador de peso molecular que se utiliz fue de 1000 pb, mientras que las bandas de eucariotas que esperamos son bandas correspondientes al ARN ribosomal, 28S y 18S en eucariotas debern presentarse como bandas intensas y definidas en el gel con una movilidad aproximada de 5kb y 2kb, respectivamente, que corresponden a 5000 pb y 2000 pb, por lo que con el marcador de peso molecular, determinar la medicin. Sin embargo se observaron las bandas tanto por la metodologa comercial como por la metodologa casera.

En la parte superior del ARN extrado con la metodologa comercial se observa una banda bien definida (posicin 1 y 2), a diferencia del ARN extrado a travs de la metodologa casera; esto probablemente a la mayor manipulacin a la que fue sometida la muestra con la ltima metodologa, en la cual el proceso de extraccin suele ser ms violento y por lo tanto tiende a comprometer la integridad del material gentico, ya que el RNA puede degradarse por accin de las ribonucleasas, las cuales son abundantes en las muestras biolgicas y se encuentran presentes en las manos y en general por toda la superficie de nuestros cuerpos.

FALTA AGREGAR LA FOTOGRAFIA DE LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Bibiliografa: Respuesta9_Lisis amonio1

La integridad y distribucin en base al tamao molecular del ARN fue determinada por medio de la electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante, cuya preparacin fue similar al mtodo convencional, pero agregando formaldehido para observar Las bandas correspondientes al ARN ribosomal, 28S y 18S en Eucariotas, de manera intensa y definida en el gel, con una movilidad aproximada de 5kb y 2kb, respectivamente. Se realiz adems, la cuantificacin del ARN a travs del mtodo de fluorometra para verificar la presencia del producto obtenido y su concentracin dentro del rango ideal, que indica una buena integridad del ARN para proceder a la utilizacin del mismo en otros procesos como una amplificacin.

Objetivo 5Cuadro 1. Diferencias entre las tcnicas de laboratorio caseras y comerciales para la correcta extraccin y purificacin de ARN a partir de sangre perifricaDiferenciasExtraccin de RNA fase slida

Extraccin orgnica de RNA

Protocolo para desarrollo del procedimientoKit comercialPrueba casera

Tipo de muestra para la pruebaSangre perifrica

Sangre perifrica

Condiciones para la utilizacin de la muestra

Mtodo para la extraccin Fase slida

Contaminantes / interferentes en el material biolgico

Pasos para la realizacin de la pruebaPocos pasos ya que es un reactivo listo para su utilizacinMayor cantidad de pasos lo cual lo convierte en un proceso bastante laborioso

Tiempo de procesamientoAlrededor de 15 minutosAlrededor de una hora

CONCLUSIONES 1. Emplear tcnicas de laboratorio caseras y comerciales para la correcta extraccin y purificacin de ARN a partir de sangre perifrica. 2. Se logr extraer ARN a partir de las dos tcnicas empleadas para extraccin de ARN, con la tcnica comercial se obtuvo ng/L y con la casera ng/L.3. Familiarizar al estudiante con los pasos bsicos de la extraccin de ARN. 4. Se adquirieron los conocimientos bsicos para el manejo y cuidado del ARN, durante la realizacin de las dos tcnicas de extraccin.5. Valorar el proceso de la extraccin del RNA.

6. Determinar la integridad el ARN por electroforesis en gel de agarosa.7. La integridad del ARN solo se observ en la extraccin con el mtodo comercial.8. Realizar un anlisis comparativo de tcnicas comerciales y caseras, as como determinar las diferentes ventajas y desventajas.9. Aunque se logr extraer ARN empleando las dos tcnicas, la tcnica comercial posee mas ventajas para obtener un ARN con mejor integridad.

REFERENCIAS1. https://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/practica-no-3-extraccion-de-arn.pdf2. https://www.google.com.gt/search?q=ARN&espv=2&biw=1517&bih=741&source=lnms&sa=X&ei=9gJVVauXHZbfsASrqoGADw&ved=0CAUQ_AUoAA&dpr=0.9#q=arn+definicion&tbm=bks Libro gentica Humana.3. EVALUACIN DE DIFERENTES MTODOS DE EXTRACCIN DE RNA PARA LA DETECCIN DEL TRANSCRIPTO BCR-ABL EN LA LEUCEMIA MIELOIDE CRNICA4. Snchez, S1; Jolly, V1; Martnez de Nuez, I2,3; Molas, C3, Quiroz, A3; Rodrguez, S1; Ayala-Lugo, A1. email de contacto: [email protected]. 1. Laboratorio de Gentica. Departamento de Biologa Molecular y Gentica. Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud. Universidad Nacional de Asuncin. Asuncin, Paraguay6. 2. Departamento de Hematologa de la Segunda Ctedra de Clnica Mdica. Hospital de Clnicas. FCM-UNA. Asuncin, Paraguay.7. 3. Departamento de Hematologa. Hospital Central Del Instituto de Previsin Social. Asuncin, Paraguay.8.